CN113186301B - 一种与肉牛肉质性状相关联的bbs2分子标记及其检测试剂盒 - Google Patents

一种与肉牛肉质性状相关联的bbs2分子标记及其检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与肉牛肉质性状相关的BBS2分子标记、检测试剂盒及其应用，该分子标记位于BBS2基因编码区的g.24223562G/A位点、g.24226239C/T位点和g.24227851G/A位点，与肉牛眼肌面积、眼肌深度、肌间脂肪含量肉质性状显著相关。是一个潜在的秦川牛为代表的地方黄牛肉用选育遗传标记。基于这一发现，研制了快速检测BBS2基因型预测肉牛肉质性状的试剂盒，可用于秦川牛为代表的地方黄牛早期选种，加快肉牛遗传进展，节约生产成本。实现肉牛早期选种留种，加快肉牛肉用选育进程。

Description

一种与肉牛肉质性状相关联的BBS2分子标记及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于动物分子标记技术领域，具体地说，涉及一种与肉牛肉质性状相关的BBS2分子标记、检测试剂盒及其应用。
背景技术
畜禽良种是畜牧业的“芯片”，对畜牧业发展的贡献率超过40％。我国有55个地方黄牛品种，是世界上牛品种资源最为丰富的国家之一。然而，由于受长期以役用为主，肉用选育起步较晚等影响，目前支撑我国肉牛产业发展的地方黄牛与国外专门化肉牛品种相比，普遍存在着生长速度慢、胴体产肉少、牛肉品质低等诸多不足。通过引进国外优良肉牛品种改良地方黄牛品种尽管取得了一定的成效，但也存在着引种——退化——再引种的不良局面，导致我国肉牛良种长期以来依赖于进口，不利于我国肉牛产业健康可持续发展。因此，如何提高我国地方黄牛本品种选育力度，加快地方黄牛品种肉用选育进程，是肉牛产业发展中急需解决的问题。
肉牛生长、肉质等经济性状均为数量性状，常规育种通过基于外貌评定、性能测定和谱系记录等表型和估计育种值的方法进行选择，在肉牛育种中获得了一定的进展。然而，由于肉牛世代间隔长，繁殖率低等问题的存在，导致肉牛常规育种方法选育进展相对缓慢。近年来，随着分子遗传学的发展，在定位肉牛数量性状相关基因座(quantitative traitlocus，QTL)和挖掘性状相关主效基因基础上，基于单核苷酸多态性(SNP)进行肉牛分子标记辅助育种(marker-assisted selection，MAS)，实现了肉牛早期选种，提高了肉牛目标性状的选育速度和准确度。常规选育和分子标记辅助选择育种的联合，对于加快我国畜禽种业发展，培育具有自主知识产权的地方畜禽新品种，摆脱对国外优良畜禽品种的依赖具有重要意义。
BBS2基因属Bardet-Biedl综合征(BBS)基因家族的成员。Bardet-Biedl综合征是一种常染色体隐性遗传病，以严重的肥胖、视网膜病变等为主要特征。有研究表明，BBS2基因敲除导致了小鼠的肥胖。进一步研究发现，BBS2的突变导致了瘦素蛋白(Leptin)受体的膜定位异常，阻断了瘦素信号通路，进而导致肥胖。BBS1、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS8、BBS9、BBS18等家族蛋白通过组装形成BBS复合体(BBSome)发挥作用。BBS2基因突变与人类肥胖性状显著相关，BBS2单核苷酸多态性与成人肥胖相关(P＝0.0005)，BBS4和BBS6单核苷酸多态性与早发性儿童肥胖(P＝0.0003)。进一步研究发现，BBS2R632P突变可能通过影响BBS2与BBS9蛋白互作面结合，影响了BBSome复合体结构与功能，导致了人类肥胖。
对我国秦川牛为代表的地方黄牛及国外专门化肉牛品种和牛、安格斯牛等基因组重测序分析发现，BBS2基因在和牛群体中受到了强烈的选择，这可能是导致和牛肌内脂肪沉积丰富的一个重要原因。上述研究表明，BBS2可能是肉牛肉质性状相关的重要候选功能基因。然而，目前关于该基因SNPs研究及其与肉牛生长、肉质性状相关性分析未见报道。
发明内容
为了解决肉牛产业及选育技术中存在的肉牛选育周期长、育种进展缓慢的技术问题，本发明的目的在于，提供一种与肉牛肉质性状相关的BBS2分子标记及其快速检测试剂盒，可用于肉牛肉用早期选种。
为了实现上述任务，本发明采取以下的技术解决方案：
一种与肉牛肉质性状相关联的BBS2分子标记，其特征在于，该分子标记位于BBS2基因编码区的g.24223562G/A位点、g.24226239C/T位点和g.24227851G/A位点，与肉牛眼肌面积、眼肌深度、肌间脂肪含量肉质性状显著相关。
根据申请人的研究表明，上述与肉牛肉质性状相关联的分子标记可以用于制备检测BBS2基因试剂盒的应用，所述试剂盒包含以下三个引物对：
第一引物对：用于检测g.24223562G/A位点基因型
5’-GGTGTTACTGACACACGGCT-3’；
5’-ACTGTCCTCTCAGTGTTGCC-3’；
第二引物对：用于检测g.24226239C/T位点基因型
5’-AGTAGTGTTTTCTTGGTGGGGA-3’；
5’-TGAGATTGGTGTCACTCGCC-3’；
第三引物对：用于检测g.24227851G/A位点基因型
5’-AAACAGGGCCTCGGTACAAA-3’；
5’-TCAAATGCCTAAGGCCAGCA-3’。
将试剂盒用于预测肉牛肉质性状的方法是：检测BBS2基因SNPs位点g.24223562G/A、g.24226239C/T和g.24227851G/A；其中，g.24223562G/A位点GG、GA基因型个体眼肌面积显著高于AA基因型个体，GG、GA基因型个体肌间脂肪含量极显著高于AA基因型个体；g.24226239C/T位点CC基因型个体眼肌深度显著高于TT基因型个体；g.24227851G/A位点GG、GA基因型个体肌间脂肪含量显著高于AA基因型个体；
具体步骤如下：
第一步：采集肉牛的血液或组织样进行全基因组DNA的提取，利用琼脂糖凝胶电泳检查DNA的质量；
第二步：以全基因组DNA为模板，用试剂盒扩增并检测BBS2基因多态性位点，PCR的反应程序为95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，32个循环；延伸72℃5min，最后4℃保存；
第三步：对PCR样品进行测序，根据测序结果判定g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A位点基因型；
第四步：选留g.24223562G/A位点GG，GA基因型个体，g.24226239C/T位点CC基因型个体，g.24227851G/A位点GG，GA基因型个体，该肉牛个体在眼肌面积、眼肌深度、肌间脂肪含量方面具有优势。
将试剂盒用于肉牛肉质性状早期选择的方法包括如下步骤：
1)检测BBS2基因SNPs位点g.24223562G/A、g.24226239C/T和g.24227851G/A的基因型；
2)对检测的基因型进行牛早期选种，其中g.24223562G/A位点GG、GA基因型眼肌面积、肌间脂肪含量优于AA基因型个体；g.24226239C/T位点CC基因型眼肌深度优于TT基因型个体；g.24227851G/A位点GG、GA基因型肌间脂肪含量优于AA基因型个体；选留g.24223562G/A位点GG、GA基因型个体，g.24226239C/T位点CC基因型个体，g.24227851G/A位点GG、GA基因型个体留种。
本发明的与肉牛肉质性状相关联的BBS2分子标记，通过对肉牛BBS2基因SNPs筛选、基因分型及与生长性状、肉质性状关联分析，发现了BBS2基因编码区g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A三个错义SNPs突变是三个新的SNPs分子标记，与秦川牛肉质性状显著相关，是一个潜在的秦川牛为代表的地方黄牛肉用选育遗传标记。基于这一发现，研制了快速检测BBS2基因型预测肉牛肉质性状的试剂盒，可用于秦川牛为代表的地方黄牛早期选种，加快肉牛遗传进展，节约生产成本。同时，本发明提供了用于上述三个SNPs位点检测的易用的试剂盒和操作方法，可实现对肉牛群体快速检测并判定个体基因型，用于早期选种留种。将极大地加快我国地方黄牛肉用选育进程。
附图说明
图1为本发明实施例中的秦川牛BBS2基因引物对1、2、3的PCR产物1.2％琼脂糖凝胶电泳图。
第一位点：g.24223562G/A；第二位点：g.24226239C/T；第三位点：g.24227851G/A。
图2为BBS2基因1个突变位点测序检测图。
图3为BBS2基因在秦川牛和和牛背最长肌和内脏脂肪两个组织中的相对表达。
图4为预测突变对BBS2蛋白结构稳定性的影响。其中，(a)图为BBS2蛋白突变导致的蛋白灵活性分析。(b)图为BBS2蛋白的原子间相互作用—野生型和突变型氨基酸的分子结构，同时也介绍了与野生型和突变型残基密切接触的周围残基。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
具体实施方式
本实施例给出一种与肉牛肉质性状相关联的分子标记。位于牛基因组(参考基因组Bos_taurus_UMD_3.1.1)g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A区域存在三个导致BBS2氨基酸改变的SNPs错义突变，上述3个位点与肉牛眼肌面积、眼肌深度、肌间脂肪含量肉质性状显著相关。
本实施例将上述与肉牛肉质性状相关联的分子标记制备了快速检测BBS2基因试剂盒，该试剂盒包含检测肉牛g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A位点基因型的试剂和以下引物对：
第一引物对：用于检测g.24223562G/A位点基因型
5’-GGTGTTACTGACACACGGCT-3’；
5’-ACTGTCCTCTCAGTGTTGCC-3’；
第二引物对：用于检测g.24226239C/T位点基因型
5’-AGTAGTGTTTTCTTGGTGGGGA-3’；
5’-TGAGATTGGTGTCACTCGCC-3’；
第三引物对：用于检测g.24227851G/A位点基因型
5’-AAACAGGGCCTCGGTACAAA-3’；
5’-TCAAATGCCTAAGGCCAGCA-3’
将试剂盒用于预测肉牛肉质性状的方法是：检测BBS2基因SNPs位点g.24223562G/A、g.24226239C/T和g.24227851G/A；其中，g.24223562G/A位点GG、GA基因型个体眼肌面积显著高于AA基因型个体，GG、GA基因型个体肌间脂肪含量极显著高于AA基因型个体；g.24226239C/T位点CC基因型个体眼肌深度显著高于TT基因型个体；g.24227851G/A位点GG、GA基因型个体肌间脂肪含量显著高于AA基因型个体；
具体步骤如下：
第一步：采集肉牛的血液或组织样进行全基因组DNA的提取，利用琼脂糖凝胶电泳检查DNA的质量；
第二步：以全基因组DNA为模板，用试剂盒扩增并检测BBS2基因多态性位点，PCR的反应程序为95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，32个循环；延伸72℃5min，最后4℃保存；
第三步：对PCR样品进行测序，根据测序结果判定g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A位点基因型；
第四步：选留g.24223562G/A位点GG，GA基因型个体，g.24226239C/T位点CC基因型个体，g.24227851G/A位点GG，GA基因型个体，该肉牛个体在眼肌面积、眼肌深度、肌间脂肪含量方面具有优势。
试剂盒用于肉牛肉质性状早期选种的方法包括如下步骤：
1)检测BBS2基因SNPs位点g.24223562G/A、g.24226239C/T和g.24227851G/A的基因型；
2)对检测的基因型进行牛早期选种，其中g.24223562G/A位点GG、GA基因型眼肌面积、肌间脂肪含量优于AA基因型个体；g.24226239C/T位点CC基因型眼肌深度优于TT基因型个体；g.24227851G/A位点GG、GA基因型肌间脂肪含量优于AA基因型个体；选留g.24223562G/A位点GG、GA基因型个体，g.24226239C/T位点CC基因型个体，g.24227851G/A位点GG、GA基因型个体留种。
以下是发明人给出的具体实施例。需要说明的是，以下的实施例仅用于本领域技术人员更清楚的理解本发明，本发明不限于该实施例。本领域技术人员在本发明技术方案的基础上，对技术方案所进行的简单替换、增加，在不偏离本发明精神的基础上，均属于本发明的保护范围。
实施例1：试验材料与方法
1、试验材料
1.1试验动物
以我国地方黄牛代表秦川牛群体为检测对象，通过静脉采血的方式进行血液样本的采集。
1.2试验试剂
琼脂糖(BIOWEST)；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；血液基因组提取试剂盒。
1.3DNA分析软件
PCR引物设计软件：Primer Premier 5
序列分析软件：DNAman、Chromas
数据分析软件：IBM SPSS statistics 19
2、基因多态性的检测
基因组DNA的提取，按照TIANGEN公司血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量，提取的基因组DNA置于-80℃保存备用。
考虑到通过SNP检测秦川牛相关性状时，所选择的SNP单倍型出现的比例不能过低，本实验随机选择了5个样本的DNA来检测秦川牛BBS2基因外显子中的基因突变或基因多态性。
根据NCBI数据库中牛BBS2基因序列(GenBank号：AC_000175.1)设计引物，通过PCR技术扩增外显子片段，进行测序，筛选发现了g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A 3个SNPs位点。
3、SNPs基因分型及秦川牛肉质性状关联分析
用试剂盒第一引物对(图1中的引物对1)扩增包含g.24223562G/A位点的片段；第二引物对(图1中的引物对2)扩增包含g.24226239C/T位点的片段；第三引物对(图1中的引物对3)扩增包含g.24227851G/A位点的片段。
第一引物对：
5’-GGTGTTACTGACACACGGCT-3’；
5’-ACTGTCCTCTCAGTGTTGCC-3’；
第二引物对：
5’-AGTAGTGTTTTCTTGGTGGGGA-3’；
5’-TGAGATTGGTGTCACTCGCC-3’；
第三引物对：
5’-AAACAGGGCCTCGGTACAAA-3’；
5’-TCAAATGCCTAAGGCCAGCA-3’。
PCR试剂盒反应体系如下表：
Figure GDA0003678912280000081
PCR反应条件：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，32个循环；延伸72℃5min，最后4℃保存。
秦川牛BBS2基因引物对1、2、3的PCR产物1.2％琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
对PCR产物进行测序，对肉牛群体g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A位点SNPs进行基因分型。结果发现：
对于g.24223562G/A突变位点，秦川牛群体中GG基因型有152头，GA基因型148头，AA基因型5头。G等位基因占优势，以GG为主要的基因型，且处于Hardy-Weinberg平衡状态。
对于g.24226239C/T突变位点，秦川牛群体中CC基因型有334头，CT基因型9头，TT基因型25头。C等位基因占优势，以CC为主要的基因型，且处于Hardy-Weinberg平衡状态。
对于g.24227851G/A突变位点，秦川牛群体中GG基因型有213头，GA基因型139头，AA基因型21头。G等位基因占优势，以GG为主要的基因型，且处于Hardy-Weinberg平衡状态。
表1：g.24223562G/A与秦川牛生长性状及肉质的相关性
Figure GDA0003678912280000091
注：同一个性状在平均数±标准误一栏里用不同字母标注表示具有显著性差异(P<0.05)，同一个性状在平均数±标准误一栏里用相同字母标注表示差异不显著(P>0.05)。不同的小写字母表示有显著差异(P<0.05)，不同的大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
对于g.24223562G/A位点，在生长性状方面，各等位基因之间不存在显著差异。在肉质性状方面，GG、GA基因型个体的眼肌面积显著高于AA基因型个体(P<0.05)；GG、GA基因型个体的肌间脂肪含量极显著高于AA基因型个体(P<0.01)，其他性状在各等位基因之间不存在显著差异。
表2：g.24226239C/T与秦川牛生长性状及肉质的相关性
Figure GDA0003678912280000101
注：同表1。
对于g.24226239C/T位点，在肉质性状方面，CC基因型个体的眼肌深度显著高于TT基因型个体(P<0.05)。其他性状在各等位基因之间不存在显著差异。
表3：g.24227851G/A与秦川牛生长性状及肉质的相关性
Figure GDA0003678912280000111
注：同表1。
对于g.24227851G/A位点，在肉质性状方面，GG、GA基因型个体的肌间脂肪含量显著高于AA基因型个体(P<0.05)。其他性状在各等位基因之间不存在显著差异。
本实施例还比较了肉质性状差异明显的秦川牛、和牛背最长肌和内脏脂肪组织BBS2基因表达量(图3)。结果表明：BBS2基因在和牛背最长肌和内脏脂肪组织的表达量均低于秦川牛。而和牛中BBS2低表达水平可能导致其对瘦素调节不敏感，进而导致和牛肌内脂肪沉积等肉质性状优于秦川牛。
另一方面，利用Dynamut在线软件(http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/)预测了SNPs位点突变对于BBS2蛋白质结构的影响(图4)。结果表明，g.24223562G>A突变导致了BBS2蛋白氨基酸由缬氨酸转变为异亮氨酸(V441I)；g.24227851G>A突变导致了BBS2蛋白氨基酸由谷氨酰胺转变为精氨酸(Q627R)。两个位点的错义突变均导致了BBS2蛋白分子振动熵下降，表明这两个点突变可能影响蛋白质分子灵活性进而影响其功能。此外，还分析了突变对BBS2氨基酸的近距离相互作用的影响，发现突变体取代野生氨基酸会影响这些氨基酸所在结构的分子内键。
上述结果表明，BBS2两个错义突变可能通过影响BBS2蛋白结构和功能，进而影响了肉牛肉质性状。
核苷酸和氨基酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种与肉牛肉质性状相关联的BBS2分子标记及其检测试剂盒
<140>
<141>
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对1上游引物
<220>
<400>1
5’ -GGTGTTACTGACACACGGCT-3’
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对1下游引物
<220>
<400>2
5’-ACTGTCCTCTCAGTGTTGCC-3’
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对2上游引物
<220>
<400>3
5’-AGTAGTGTTTTCTTGGTGGGGA-3’
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对2下游引物
<220>
<400>4
5’-TGAGATTGGTGTCACTCGCC-3’
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对3上游引物
<220>
<400>5
5’-AAACAGGGCCTCGGTACAAA-3’
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对3下游引物
<220>
<400>6
5’-TCAAATGCCTAAGGCCAGCA-3

Claims (4)

1.一种与肉牛肉质性状相关联的BBS2分子标记，其特征在于，根据NCBI数据库中牛BBS2基因序列GenBank号：AC_000175.1，该分子标记位于BBS2基因编码区的g.24223562G/A位点、g.24226239C/T位点和g.24227851G/A位点；其中，g.24223562G/A位点与眼肌面积、肌间脂肪含量性状显著相关，g.24226239C/T位点与眼肌深度性状显著相关，g.24227851G/A位点与肌间脂肪含量性状显著相关。
2.检测权利要求1所述的与肉牛肉质性状相关联的分子标记的引物对用于制备检测BBS2基因型试剂盒的应用，所述引物对分别为：
第一引物对：用于检测g.24223562G/A位点基因型
5’-GGTGTTACTGACACACGGCT-3’；
5’-ACTGTCCTCTCAGTGTTGCC-3’；
第二引物对：用于检测g.24226239C/T位点基因型
5’-AGTAGTGTTTTCTTGGTGGGGA-3’；
5’-TGAGATTGGTGTCACTCGCC-3’；
第三引物对：用于检测g.24227851G/A位点基因型
5’-AAACAGGGCCTCGGTACAAA-3’；
5’-TCAAATGCCTAAGGCCAGCA-3’。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，试剂盒用于预测肉牛肉质性状的方法是：检测BBS2基因SNPs位点g.24223562G/A、g.24226239C/T和g.24227851G/A；其中，g.24223562G/A位点GG、GA基因型个体眼肌面积显著高于AA基因型个体，GG、GA基因型个体肌间脂肪含量极显著高于AA基因型个体；g.24226239C/T位点CC基因型个体眼肌深度显著高于TT基因型个体；g.24227851G/A位点GG、GA基因型个体肌间脂肪含量显著高于AA基因型个体；
具体步骤如下：
第一步：采集肉牛的血液或组织样进行全基因组DNA的提取，利用琼脂糖凝胶电泳检查DNA的质量；
第二步：以全基因组DNA为模板，用试剂盒扩增并检测BBS2基因多态性位点，PCR的反应程序为95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，32个循环；延伸72℃5min，最后4℃保存；
第三步：对PCR样品进行测序，根据测序结果判定g.24223562G/A、g.24226239C/T、g.24227851G/A位点基因型；
第四步：选留g.24223562G/A位点GG，GA基因型个体，g.24226239C/T位点CC基因型个体，g.24227851G/A位点GG，GA基因型个体，该肉牛个体在眼肌面积、眼肌深度、肌间脂肪含量方面具有优势。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，试剂盒用于肉牛肉质性状早期选择的方法包括如下步骤：
1)检测BBS2基因SNPs位点g.24223562G/A、g.24226239C/T和g.24227851G/A的基因型；
2)对检测的基因型进行牛早期选种，其中g.24223562G/A位点GG、GA基因型眼肌面积、肌间脂肪含量优于AA基因型个体；g.24226239C/T位点CC基因型眼肌深度优于TT基因型个体；g.24227851G/A位点GG、GA基因型肌间脂肪含量优于AA基因型个体；选留g.24223562G/A位点GG、GA基因型个体，g.24226239C/T位点CC基因型个体，g.24227851G/A位点GG、GA基因型个体留种。
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