CN106244719B - 一种鉴别香猪品种的结构变异sv141分子标记及其应用 - Google Patents

一种鉴别香猪品种的结构变异sv141分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记，其特征在于：结构变异SV141位于猪参考基因组(Ssc 10.2)的chr14：81642733‑81643165，在MCU基因的内含子1内；该结构变异命名为D或A两种基因，三种基因型分别命名为DD、DA和AA型，香猪中D基因的频率显著高于其它6个猪品种，可以作为鉴别香猪品种的分子标记。

Description

一种鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种鉴别香猪品种的分子标记和应用技术。
背景技术
从江香猪，是我国珍贵的地方猪种，产区位于贵州省从江县月亮山区。1980年被列入中国地方猪种；1982年编入《中国猪种》第二集；1993年被国家农业部列为国家二级保护畜种。香猪体型矮小，基因较为纯和，肉质醇香，营养价值高，是加工制作高品质肉品的优质原材料，同时也是生命科学研究领域难得的实验动物(张艺等，2006)。
结构变异(structural variations，SVs)通常是指基因组中大于1kb的DNA片段的插入、缺失、重复、倒位、易位以及DNA拷贝数变异(CNVs)。我们应用Illumina公司Hiseq2000测定了香猪的基因组序列，从中发现了结构变异SV141。
结构变异(SVs)广泛存在于哺乳动物基因组中，Wanhong Li等(Liwanhong.et al，2015)采用PCR技术检测大白猪基因组DNA中抑制素α亚基基因片段，发现在抑制素α亚基基因中存在283bp的结构变异，283bp存在时，会增加母猪发生卵泡囊肿的风险。JuliaBrinkmann等(2015)了解到马αS2-酪蛋白有两种类型，产生原因是αS2-酪蛋白基因中存在1.3kb的结构变异，位于两个编码外显子中，其中一种基因结构中含有马科动物特异性的重复片段。基因的结构变异可调控畜禽的生产性状及抗病力，例如，引起牛流产和死胎的MIMT1基因内有110kb的片段缺失，决定猪白毛色的KIT基因有450kb发生复制性插入，与鸡羽毛生长速度相关的包含PRLR和SPEF2基因的176kb的片段呈现多拷贝(赵鹏举，2015)。
本发明所述的结构变异SV141处于线粒体钙离子单向转运体(mitochondrialcalcium uniporter,MCU)基因的内启子1中。MCU蛋白参与线粒体钙离子的摄取过程，位于线粒体内膜上，具有两个跨膜的α-螺旋结构，该结构在不同物种间高度保守(徐斌，2015)。猪的MCU基因定位于14号染色体，编码351个氨基酸残基。生理情况下，MCU将Ca2+从细胞质转运到线粒体基质中，对于调节线粒体内外钙离子的平衡起重要的作用(赵芹，2013)。在促凋亡因子的刺激下，MCU过表达会加强细胞对凋亡的敏感性(张坤，2015)，提示MCU基因的结构变化与线粒体的功能有关。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种鉴别香猪结构变异SV141的分子标记及其应用技术。
本发明的技术方案是：一种在香猪群体中以缺失(D)为主的结构变异SV141，缺失片段长度为433bp，位于猪参考基因组Sscrofa10.2的chr14：81642734-81643166区段，处于MCU基因内含子1中，将结构变异SV141的两种等位基因命名为D或A，相应地，三种基因型命名为DD、AA和DA。
本发明还提供用于检测结构变异SV141的一组引物，所述的引物分别为：上游引物F：5’-AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC-3’，下游引物R：5’-GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC-3’，扩增片段的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2
本发明还提供所述结构变异SV141在不同猪品种群体中的检测方法。
该方法包括以下步骤：
(1)提取待测猪品种的基因组DNA；
(2)以待测猪品种基因组DNA为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，据凝胶成像系统检测到的条带判断基因型，并统计分析结构变异SV141在猪群体中的分布情况。
步骤(2)中PCR扩增体系为20μL，即：2×Taq PCR Master Mix10μL，10μmol/L上游引物F 0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH2O 8.2μL，10ng/μL基因组DNA 1μL；进行AS-PCR采用的反应条件：1)预变性：94.0℃5min；2)扩增反应：变性：94.0℃30sec，退火：64℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min，4℃保存。
本发明进一步提供所述结构变异SV141鉴别香猪群体的分子标记的应用技术。
前述的应用包括以下步骤：
(1)采用PCR技术检测结构变异SV141在不同猪品种群体中的基因型分布；
(2)应用SPSS v20.0进行基因频率的差异显著性检验，分析该结构变异在香猪与其它猪品种之间的差异大小；
(3)根据结构变异SV141缺失或正常的基因型辅助鉴别香猪品种。
本发明针对7个猪品种群体中结构变异SV141的基因型进行了检测(表2)，得出香猪群体以DD和DA为主，其它6个猪品种以AA基因型占优势，经SPSS v20.0软件进行χ2检验，得出香猪群体中D的基因频率明显高于其它6个猪品种(P<0.01)，其它猪品种群体之间的D基因频率的差异不大(P>0.05)。
对扩增片段进行序列测定，与猪参考基因组(Sscrofa 10.2)序列进行比对，确定SV141(433bp)位于MCU内含子1中。采用Promoter Scan和TRANSFAC软件进行启动子和转录因子结合位点分析，找到3个TFBS区域。
MCU基因编码的蛋白是线粒体钙离子单向转运体，位于线粒体的内膜上，参与线粒体对钙离子的摄取。MCU与因子MICU1、MICU2、MCUB以及EMRE/SMDT1在线粒体内膜组成一个大分子的复合物，发挥功能。MCU具有两个跨膜结构域和两个卷曲螺旋结构域，两个跨膜螺旋被一个高度保守的连接蛋白所分隔开，此蛋白中有一段短氨基酸，面向线粒体膜的间隙，在钙转运通路中发挥着关键性作用(张坤，2015)。在低Ca2+水平下，MCU的活性受MICU2下调；高Ca2+水平下，MICU1增强MCU活性。使MCU基因沉默条件下，心肌细胞中的Ca2+浓度将显著上升，并与心肌收缩的加强相对应(Santulli G，et al，2015)。MCU基因参与Ca2+、cAMP和Lipid等信号通路，在人的MCU基因中含有3个转录变异体。MCU基因中的SV141缺失可能通过调节钙离子的分布，影响香猪的行为或生理过程。
本发明检测了结构变异SV141在7个猪品种群体中的分布类型，并对结构变异区的序列进行了生物信息学分析。统计学分析显示香猪群体中D基因的频率高于其它猪品种的相应值(P<0.01)，结构变异SV141可作为鉴别香猪群体的分子标记，为香猪品种的辅助选择提供科学依据。
本发明的有益效果：(1)本发明提供的香猪结构变异不受香猪的年龄、性别和饲养环境条件等因素的限制。
(2)本发明建立的检测香猪结构变异SV141的方法准确可靠，操作简便。
(3)本发明所技术的结构变异SV141的检测技术，可为香猪纯种的分子标记辅助选育技术奠定理论和技术基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中结构变异SV141的基因分型结果；
图2为本发明实施例2中香猪结构变异SV141基因频率与其它猪品种的比较。
具体实施方式
以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。
实施例1猪结构变异SV141的检测技术，步骤如下：
1、提取基因组DNA
采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或耳组织中提取基因组DNA，具体方法如下：
(1)处理材料
提取材料为血液时，可直接取200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL时加入缓冲液GA补足体积。
提取材料为耳组织时，可取50mg样品，剪碎，置于1.5mL EP管中，加入200μl缓冲液GA，震荡充分悬浮组织颗粒。
(2)加入20μL蛋白酶K，漩涡混匀，如为血液样品，即可继续进行步骤(3)；如为耳组织，置于56℃水浴直至组织碎块全部溶解，瞬时离心去除管盖内壁的水珠。
(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心；
(4)加入200μl无水乙醇，充分震荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心；
(5)将上步所得溶液和絮状沉淀都全部加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前需加入无水乙醇)，12000rmp离心1min，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前需加入无水乙醇)，12000rmp离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
(8)重复操作步骤7)一次；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rmp离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rmp离心2min，基因组DNA于离心管中；
(11)为增加基因组DNA的得率，将离心收集的溶液再返回入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液，进行下一步实验或于-20℃保存。
2、目标序列的扩增
本发明中结构变异SV141位于chr14：81642733-81643165，参考NCBI Genbank收录的相应序列，使用Primer Premier 5.0软件设计两条引物，上游引物F：5’-AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC-3’，下游引物R：5’-GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC-3’，目的片段分别为992bp或559bp。
PCR扩增体系为20μL，计为：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L上游引物F0.4μL，10μmol/L下游引物F 0.4μL，ddH2O 8.2μL，10ng/μL基因组DNA 1μL；进行PCR采用的反应条件：1)预变性：94.0℃5min；2)扩增反应：变性：94.0℃30sec，退火：64℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min；4℃保存。
3、结构变异SV141的基因型分析
PCR扩增结束后，取5μL PCR产物经1.5％的琼脂糖电泳检测，0.5μg/mL溴乙锭染色，凝胶成像系统照像记录条带。
如果一个样品，只扩增出559bp的一种条带，将基因型定义为DD型；当扩增出559bp和992bp的两种条带，将基因型定义为DA型；如只扩增出992bp一种条带，将基因型定义为AA型(图1)。将DD和AA基因型获得的条带分别克隆测序，正常的AA基因型对应992bp的核苷酸序列即SEQ ID No.1，缺失的DD基因型559bp的核苷酸序列即SEQ ID No.2，缺失的433bp序列列于SEQ ID No.3。
实施例2分子标记SV141的应用
按照实施例1的方法，试验材料如表1所示，以chr14：81642734-81643166为候选结构变异，利用PCR技术检测该结构变异的基因型在7个猪品种群体中的分布情况，应用SPSSv20.0软件中的χ2检验分析该结构变异的基因频率在香猪与其它猪品种间的差异显著性。结果显示，该结构变异在香猪群体中以“缺失”型(D)为主，而在其它猪品种中以“正常”型(A)为主，香猪与其它猪品种间基因频率差异极显著(P<0.01)，如表2和图2所示。
表1试验材料及其来源统计表
猪品种 样本数 血液/组织采集来源
香猪 695 贵州省从江县
可乐猪 36 贵州省毕节市
江口萝卜猪 44 贵州省江口县
糯谷猪 29 贵州省纳雍县
黔北黑猪 61 贵州省桐梓县
荣昌猪 37 重庆市荣昌县
大白猪 74 贵州省毕节市
表2结构变异chr14：81642734-81643166的基因型及基因频率
(备注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)
序列表
SEQ ID No.1：
<110>贵州大学
<120>一种鉴别香猪和其它猪品种的结构变异分子标记
<210> 1
<211> 992
<212> DNA
<213>结构变异SV141的AA基因型扩增序列
<400> 1
AAGGGAAAACGGTACAGGAGAACCAACCCAGATGAGATTTGGAGCAGTGATCATCTGTGA 60
ACCATCAGAGTCAGCCAGCCAGCTTCTCAGAAGCCCAAACATAGTTTTCATGAAAGAGAA 120
AAATTAAAGCGAATAGATCATACCTCGAAGAGATTAAAAAATTAAAATTGGGAGTTCCCG 180
TCGTGGCGCAGTGGTTAACGAATCTGACTAGGAACCATGAGGTTGCGGGTTCGGTCCCTG 240
CCCTTGCTCAGTGGGTTAACGATCCGGCGTTGCCGTGAGCTGTGGTGTAGGTTGCAGACG 300
CGGCTCGGATCCCGCGTTGCTGTGGCTCTGGCGTAGGCTGGCAGCTACAGCTCCGATTCG 360
ACCCCTAGCCTGGGAACCTCCATATGCCGCGGAAGCGGCCCAAGAGATAGCAACAACAAC 420
AACAACAAAAAAGACAAAAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTAAAATTGACTTTA 480
ACTTTTAAATACATTTCATATAAATTATGGCCACTGGAACACAGATCTTCTATCAGATAC 540
ATGTCTTTAACAATCTTTGTGTCAGAAACCTCTGTCTCAAATTTAAACACCTATCTAGTT 600
TAAGAAAAAAATCATTGTTTACTTTCTGCCTTCTGACAATTTGCATACTGTTTCGTTGTA 660
TTTTATGGACTGAATATGTTCTTTGATAAATTCAAATTGGTCATGCATTTCAGCAGCTGA 720
AACATTTAGTGTTTTAAAACCAAATCAGCATTTACTTCCTCTGAAGGCCTCATATCTAGA 780
TGAGCAGAATTTTAAACTTGTGGTATATCATCTCAATGTTGCCATTCATTGTTAGCAAAA 840
TATCGGACCATTGACAACACATACTTGTTCATTACATAGTGCACAAGTGTTTAACTTTGG 900
AAATAAAAATTTTGAACTACTCTTGTGTTTCTGACTTTATCCTAGTCATCCTTCAATGCC 960
ACTTTTAGGTGGCTGTGTTATTTCTTAGTGGC 992
SEQ ID No.2：
<210> 2
<211> 559
<212> DNA
<213>结构变异SV141的DD基因型扩增序列
<400> 2
AAGGGAAAACGGTACAGGAGAACCAACCCAGATGAGATTTGGAGCAGTGATCATCTGTGA 60
ACCATCAGAGTCAGCCAGCCAGCTTCTCAGAAGCCCAAACATAGTTTTCATGAAAGAGAA 120
AAATTAAAGCGAATAGATCATACCTCGAAGAGATTAAAAAATTAAAATTGGGAGTTCCCG 180
TCGTGGCGCAGTGGTTAACGAATCCGACTAGGATTCGTTTCGTTGTATTTTATGGACTGA 240
ATATGTTCTTTGATAAATTCAAATTGGTCATGCATTTCAGCAGCTGAAACATTTAGTGTT 300
TTAAAACCAAATCAGCATTTACTTCCTCTGAAGGCCTCATATCTAGATGAGCAGAATTTT 360
AAACTTGTGGTATATCATCTCAATGTTGCCATTCATTGTTAGCAAAATATCGGACCATTG 420
ACAACACATACTTGTTCATTACATAGTGCACAAGTGTTTAACTTTGGAAATAAAAATTTT 480
GAACTACTCTTGTGTTTCTGACTTTATCCTAGTCATCCTTCAATGCCACTTTTAGGTGGC 540
TGTGTTATTTCTTAGTGGC 559
SEQ ID No.3：
<210> 3
<211> 433
<212> DNA
<213>香猪MCU基因中缺失片段的核苷酸序列
<400> 3
ATGAGGTTGCGGGTTCGGTCCCTGCCCTTGCTCAGTGGGTTAACGATCCGGCGTTGCCGT 60
GAGCTGTGGTGTAGGTTGCAGACGCGGCTCGGATCCCGCGTTGCTGTGGCTCTGGCGTAG 120
GCTGGCAGCTACAGCTCCGATTCGACCCCTAGCCTGGGAACCTCCATATGCCGCGGAAGC 180
GGCCCAAGAGATAGCAACAACAACAACAACAAAAAAGACAAAAGACAAAAAAAAAAAAAA 240
AAAAAAAAATTAAAATTGACTTTAACTTTTAAATACATTTCATATAAATTATGGCCACTG 300
GAACACAGATCTTCTATCAGATACATGTCTTTAACAATCTTTGTGTCAGAAACCTCTGTC 360
TCAAATTTAAACACCTATCTAGTTTAAGAAAAAAATCATTGTTTACTTTCTGCCTTCTGA 420
CAATTTGCATACT 433
SEQ ID No.4：
<210> 4
<211> 433
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 4
AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC 23
SEQ ID No.5：
<210> 5
<211> 433
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 5
GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC 24

Claims (5)

1.一种鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记，其特征在于：该结构变异长度为433bp，序列为SEQ ID No.3，位于猪参考基因组Sscrofa 10.2的chr14：81642734-81643166，在基因MCU内含子1中，将结构变异SV141存在的两种基因命名为缺失型D或正常型A，对应的相应基因型为DD、AA和DA，如果一个样品，只扩增出559bp的一种条带，将基因型定义为DD型；当扩增出559bp和992bp的两种条带，将基因型定义为DA型；如只扩增出992bp一种条带，将基因型定义为AA型，香猪群体以DD和DA为主，香猪群体中D的基因频率明显高于其它6个猪品种，其它猪品种群体之间的D基因频率的差异不大，所述的其它猪品种为可乐猪、江口萝卜猪、糯谷猪、黔北黑猪、荣昌猪和大白猪。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记，其特征在于：结构变异SV141通过一组特异性引物进行检测，所述的引物分别为：上游引物F：5’-AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC-3’，下游引物R：5’-GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC-3’，这对引物得到两种序列，分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
3.一种检测如权利要求2所述的一种鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)以基因组DNA为模板，利用引物R：5’-GCCACTAAGAAATAACACAGCCAC-3’和F：5’-AAGGGAAAACGGTACAGGAGAAC-3’，进行PCR扩增；(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断基因型。
4.根据权利要求3所述的一种检测鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记的方法，其特征在于：步骤(3)中进行普通PCR的扩增体系为20μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L引物F取0.4μL，10μmol/L引物R取0.4μL，ddH2O 8.2μL，10ng/μL基因组DNA 1μL；进行PCR采用的反应条件：1)预变性：94.0℃5min；2)扩增反应：变性：94.0℃30sec，退火：64℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min，4℃保存。
5.如权利要求1或2所述的一种鉴别香猪品种的结构变异SV141分子标记在鉴别香猪品种的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用普通PCR技术检测该结构变异在不同猪品种群体中的分布情况；(2)根据结构变异SV141是否为缺失基因型辅助鉴别香猪品种，该结构变异在香猪群体中以“缺失”型D为主，而在其它猪品种中以“正常”型A为主，香猪与其它猪品种间基因频率差异极显著P<0.01，所述的其它猪品种为可乐猪、江口萝卜猪、糯谷猪、黔北黑猪、荣昌猪和大白猪。
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