KR102019997B1

KR102019997B1 - 돈육의 육질 예측용 조성물 및 이를 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법

Info

Publication number: KR102019997B1
Application number: KR1020180020788A
Authority: KR
Inventors: 조인철; 박희복; 신문철; 성필남; 김남영; 손준규; 우제훈; 박설화; 신상민; 양병철; 박남건
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2018-02-21
Publication date: 2019-09-10
Also published as: KR20190100798A

Abstract

본 발명은 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭 후 제한효소 처리과정이 필요없이 전기영동만으로 돈육의 육질을 신속, 정확하고 경제적으로 예측할 수 있는 돈육의 육질 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 돈육의 육질 예측 방법에 관한 것이다.

Description

돈육의 육질 예측용 조성물 및 이를 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법{Composition for predicting meat quality of pork and method for simple and rapid predicting of meat quality using thereof}

본 발명은 돈육의 육질 예측용 조성물 및 이를 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭 후 제한효소 처리과정이 필요 없이 전기영동만으로 돈육의 육질을 신속, 정확하고 경제적으로 예측할 수 있는 돈육의 육질 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법에 관한 것이다.

돼지 산업은 주로 고기의 양(quantity)과 관련된 생산성 향상과 신선육 유통에 초점이 맞춰져 왔으며, 이는 돼지고기 품질의 감소를 수반하여 왔다(Cameron, 1990, Cliplef and McKay, 1993). 우리나라의 경우 돼지고기 소비 패턴은 구이와 수육이 대부분을 차지하고 있어 신선육을 많이 소비하고 있다.

기본적으로, 육질의 소비자 인식은 고기 구입에 중요한 선택 기준이다. 그러나 불균일한 고기품질은 소비자 신뢰도를 떨어뜨리고 좋은 고기를 선택하고자 하는 소비자의 의지를 감소시킨다(Jung et al., 2011). 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해, 산업 분야에서는 최상의 돼지고기 품질에 대한 소비자의 요구를 만족하는 육질 형질 개량 시스템을 개발하였다(Lee et al., 2012).

최근에는, 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵다.

한편, 돼지에서 대부분의 경제형질은 다양한 유전자의 영향을 통해 나타나는 양적 형질로 알려져 있으며 이러한 형질에 관여하는 원인 유전자 발굴 및 유전적 위치를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질관련 유전자 마커 발굴을 위하여 기능 유전자를 대상으로 단일염기다형성(SNP; single nucleotidepolymor phism) 발굴 및 형질 관련성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 다양한 형질관련 SNP들이 발굴되었다.

그러나 SNP 마커를 이용하여 돈육의 육질 형질을 예측하는 기존 분석방법은 PCR 증폭 후 제한효소 처리하여 유전자형을 진단하는 과정을 거쳐야 하므로 분석에 2일 정도 소요되어 현장 분석에 적용할 수 없었다. 또한, 기존의 분석방법은 제한효소를 이용하므로 이에 따른 분석비용이 증가된다.

본 발명의 배경기술로는 한국공개특허 제10-2013-0045113호는 근육 특이적 마이크로 RNA-1 영역의 SNPs를 이용한 돼지의 육질 향상 여부 확인용 DNA 단편 표지 인자에 대해 기재되어 있다.

본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 돈육의 육질을 신속, 정확하고 경제적으로 예측할 수 있는 돈육의 육질 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돈육의 육질 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 간이 신속한 돈육의 육질 예측 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 육질은 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 및 지방산 조성으로부터 선택되는 1종 이상의 육질 형질과 관련된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는, 돈육의 육질 예측용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; b) 상기 추출된 핵산을 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 c) 증폭 산물을 전기영동하여 증폭 산물의 크기에 의해 유전자형을 확인하여 돈육의 육질을 예측하는 단계를 포함하는, 돈육의 육질 예측 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 b)에서 증폭은 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하고, 단계 c)에서 2% 초과의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자형을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 c)에서 20 ~ 30분 동안 전기영동할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 b)에서 증폭은 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하고, 단계 c)에서 1.5 ~ 2.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자형을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 c)에서 25 ~ 35분 동안 전기영동할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 c)에서 유전자형 qq, Qq, QQ 중 QQ인 경우 qq 및 Qq에 비해 고육질형으로 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법에서 상기 육질은 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 및 지방산 조성으로부터 선택되는 1종 이상의 육질 형질과 관련된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, PCR 증폭 후 전기영동만으로 유전자형을 판독할 수 있어 돈육의 육질을 신속, 정확하고 경제적으로 예측할 수 있다. 특히, 본 발명에 의하면 분석시간을 2일에서 최대 3시간으로 단축할 수 있어, 현장 분석 적용이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 제한효소를 처리할 필요가 없어 분석 비용을 절감할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 돈육의 육질을 정확하게 예측할 수 있어 육질이 개량된 종돈의 선발이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 돈육의 육질을 정확하게 예측할 수 있어 돈육의 투명한 유통체계를 확립하는 데 일조할 수 있다.

도 1은 육질 형질 결정 유전자의 QTL(quantitative trait locus) 영역 확인에 따른 LDLA(linkage-linkage disequilibrium analysis) 결과를 보여주는 그래프이다. a는 제주재래돼지와 랜드레이스 돼지를 교배하여 얻어진 자손(LK축군), b는 제주재래돼지와 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손(DK축군)에 관한 것이다.
도 2는 육질 형질 결정 유전자의 QTL 영역에 존재하는 유전자를 나타내고 있는 LALD mapping 결과이다.
도 3은 QTL 영역에 존재하는 유전자의 mRNA 발현양을 비교한 그래프이다. a는 등심(최장근, longissimus), b는 후지(대퇴사두근, quadriceps)에 관한 것이다.
도 4는 QTL 영역 내 MYH3 유전자의 유전자형별 발현량을 비교한 그래프이다. a는 mRNA 발현량, b는 단백질 발현량에 관한 것이다.
도 5는 돈육의 육질 형질 결정 원인 염기서열 변이를 나타내는 도면이다.
도 6은 PCR-RFLP 방법으로 돈육의 육질 형질 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 비교예 1로서 돈육의 육질 인자 확인을 위해 개별 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 비교예 2로서 돈육의 육질 인자 확인을 위해 2개의 포워드 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 본 발명의 비교예 3으로서 돈육의 육질 인자 확인을 위해 6bp 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 본 발명의 비교예 4로서 돈육의 육질 인자 확인을 위해 9bp 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예로서 돈육의 육질 인자 확인을 위해 12bp 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 일 실시예로서 아가로스겔의 농도에 따른 돈육의 육질 인자 확인을 위해 12bp 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예로서 돈육의 육질 인자 확인을 위해 24bp 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 한 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명자들은 유전 형질을 통해 돈육의 육질을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자임을 규명하였으며, 이를 이용하면 유전적으로 결정되는 돈육의 육질 형질을 예측할 수 있음을 확인한 바 있다.

본 발명에 있어, "MYH3 유전자"는 동물의 근육을 구성하는 마이오신에 포함된 중쇄단백질의 하나인 myosin heavy chain 3을 코딩하는 유전자를 의미하며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(GenBank Accession No. KX549311(LAND), KX549312(KNP)).

본 발명자들은 MYH3 유전자에 의해 돼지의 근내지방함량 및 적색도의 육질 형질이 결정됨을 확인하였으며, 육질 형질이 우수한 재래종과 우수하지 않은 외래종 간에는 상기 유전자에 변이가 존재하므로, 상기 변이를 포함하는 유전자 마커를 검출함으로써 돼지 육질 형질을 판단할 수 있다.

보다 구체적으로 살펴보면, 제주 재래돼지와 랜드레이스 또는 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손을 대상으로 돼지의 육질 형질에 대해 QTL 분석 및 Linkage and linkage disequilibrium (LALD) mapping을 수행한 결과, 돼지의 육질 형질에 관여하는 유전자는 12번 염색체에 존재하는 MYH3 유전자임을 확인하였다(도 1 내지 4).

또한, MYH3 유전자의 유전형을 분석한 결과, 육질이 좋지 않은 외래종인 랜드레이스와 육질이 좋은 재래종인 제주 재래돼지 사이에 염기 변이(QTN: i.e., MYH3-1805_-1810delGGACTG)가 존재함을 확인하였으며(도 5), HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 상기 원인 염기 변이를 절단한 결과, 두 돼지의 유전자 절단 양상이 다름을 확인하였다(도 6).

상기와 같이, PCR-RFLP 방법에 의하면, 돈육의 육질 형질을 정확하게 예측할 수 있다.

본 발명에서, "PCR-RFLP" 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation)부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.

한편, 상기 방법에 의하면, 유전자의 증폭에서 유전자형의 판독까지 2일이 소요되어 현장 분석에 적용할 수 없다. 또한, 기존의 분석방법은 제한효소를 이용하므로 이에 따른 분석비용이 증가한다.

이에 본 발명자들은 미스매치 프라이머를 이용하여 정확하면서 현장 분석 적용이 가능한 간이 신속 분석용 돈육의 육질 예측용 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 유전자 마커 증폭에 사용되는 프라이머, 적절한 버퍼 등의 적절한 성분(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있는데, 구체적인 예로, 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 발명에 있어, "미스-매치 프라이머(mis-match primer)"는 기존 염기 서열에 특정 염기 서열을 포워드 프라이머에 붙인 것으로 이를 이용하면 PCR 증폭 후 전기영동만으로 유전자형을 용이하게 판독할 수 있다.

본 발명에 의하면, 돼지 염기서열에 포워드 방향에 12bp(ggg-ccc-ggg-ccc)를 붙인 미스-매치 프라이머 서열(서열번호 5), 또는 24bp(ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc)를 붙인 미스-매치 프라이머 서열(서열번호 6)을 이용시 PCR 증폭 후 전기영동 시 유전자형을 용이하게 판독할 수 있다.

본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 육질 형질과 관련된 염기 변이 부분을 증폭한 뒤 전기영동을 하여, 유전자형에 따라 발현 양상이 확연히 구분됨을 확인하였다(도 11).

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 육질 형질과 관련된 염기 변이 부분을 증폭한 뒤 전기영동을 하여, 유전자형에 따라 발현 양상이 확연히 구분됨을 확인하였다(도 13).

따라서 본 발명에 의한 돈육 육질 예측용 조성물은 PCR 증폭 후 전기영동만으로 육질 형질을 정확하게 예측할 수 있다. 특히, 본 발명에 의하면 분석시간을 2일에서 최대 3시간으로 단축할 수 있어, 현장분석 적용이 가능하다. 또한, 본 발명에 의하면 제한효소를 처리할 필요가 없어 분석 비용을 절감할 수 있다.

본 발명에 있어, "육질 형질"은 돼지로부터 얻어진 뼈를 제외한 도축물의 상태를 나타내는 다양한 표현 형질을 의미하는데, 상기 표현 형질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 근내지방함량, 육색, 보수력, 전단력 등이 될 수 있다. 근내지방함량은 근육 내 포함된 지방의 함량, 육색은 육안으로 판단되는 고기의 색, 보수력은 축육이 수분을 유지하는 능력, 전단력은 고기의 찢었을 때 질긴 정도로서, 근내지방함량은 높을수록, 육색은 적색을 나타낼수록, 보수력 및 전단력은 낮을수록 육질의 품질이 높은 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 근내지방함량이 높을수록 육질의 품질이 우수한 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 키트는 본 발명의 유전자 마커를 증폭을 통해 확인하거나, 상기 유전자 마커의 mRNA 발현 수준을 확인함으로써 돼지의 육질 형질 수준을 판단할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 유전자 마커에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

상기 a) 및 b) 단계에서 돼지 시료로부터 핵산을 추출하고 SNP 마커의 다형성을 부위를 증폭하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 핵산을 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 시료는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 c)에서 유전자형 qq, Qq, QQ 중 QQ인 경우 qq 및 Qq에 비해 고육질형으로 예측할 수 있다(도 11 내지 도 13).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 b)에서 증폭은 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하고, 단계 c)에서 2% 초과의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자형을 확인할 수 있다(도 12). 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 전기영동할 경우 2% 이하의 아가로즈 겔에서는 유전자형의 식별이 모호할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 c)에서 20 ~ 30분 동안 전기영동할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 전기영동할 경우 상기 범위의 시간동안 전기영동하면 유전자형의 식별이 명확하게 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 b)에서 증폭은 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하고, 단계 c)에서 1.5 ~ 2.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자형을 확인할 수 있다(도 13). 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 전기영동할 경우 상기 범위의 아가로즈 겔에서는 유전자형의 식별이 명확하게 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 돈육의 육질 예측 방법의 단계 c)에서 25 ~ 35분 동안 전기영동할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 전기영동할 경우 상기 범위의 시간동안 전기영동하면 유전자형의 식별이 명확하게 될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돼지의 육질 형질 양적형질좌위 ( quantitativetrait locus; QTL ) 분석

실시예 1-1. 육질 유전자의 QTL 영역 확인

돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자를 규명하기 위하여, 제주 재래돼지와 랜드레이스 돼지를 교배하여 얻어진 자손(LK축군), 및 제주재래돼지와 듀록 돼지를 교배하여 얻어진 자손(DK축군)을 대상으로 돼지의 육질 형질(적색도(a*), 근내지방함량(IMF))에 대해 양적형질좌위(quantitative trait locus; QTL) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 1의 a에서 볼 수 있듯이, LK축군에서 수직 점선은 12번 염색체의 661 kb 영역 상에 위치함을 확인하였고, 또한, 도 1의 b에서 볼 수 있듯이, KD축군에서도 수직 점선은 12번 염색체의 661 kb 영역 상에 위치함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 적색육(적색도)과 근내지방함량을 결정하는 유전자는 돼지의 품종에 상관없이 동일한 위치에 존재함을 확인하였고, 이는 12번 염색체의 661kb 영역 내에 존재함을 알 수 있었다.

실시예 1-2. 돼지 육질 형질 유전자 규명

상기 실시예 1-1을 통해 돼지 육질 형질을 결정하는 유전자는 12번 염색체의 661kb 영역 내에 존재함을 확인함에 따라, 상기 영역 내에 존재하는 유전자를 LALD mapping을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, MYH3, MYH1, MYH2, MYH13, ADPRM, SCO1, TMEM220, ENSSSCG00000029441, ENSSSCG00000018006의 9개 유전자가 상기 육질 형질 유전자 영역 내에 존재함을 확인하였다.

실시예 1-3. 돼지 육질 형질 관련 유전자 선발

상기 실시예 1-2를 통해 육질 형질을 결정하는 9개 유전자를 확인함에 따라, 상기 유전자 중에서도 육질 형질의 결정에 가장 관련성이 높은 유전자를 선발하고자 하였다.

랜드레이스(LANDRACE)와 재래돼지(KNP)의 등심(최장근, longissimus) 및 후지(대퇴사두근, quadriceps)에서, 상기 9개 유전자의 상대적인 mRNA 발현양을 연쇄중합반응 결과 산물을 실시간에 정량적으로 보여 주는 실시간 역전사 연쇄중합반응 (Real-time RT-PCR) 실험법을 통하여 분석하였다.

그 결과, 도 3의 a 및 b에서 볼 수 있듯이, 랜드레이스에 비하여, 재래돼지의 등심 및 후지에서 MYH3 유전자의 mRNA 발현이 월등히 높음을 확인하였다.

상기 결과를 통해, MYH3 유전자가 돼지의 육질 형질을 결정하는 주요 유전자임을 알 수 있었다.

실시예 1-4. QTL 영역내 MYH3 유전자의 유전자형별 발현량 분석

QTL 영역 내 MYH3 유전자의 유전자형별 발현량을 분석하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 유전자형은 qq, Qq, QQ로 구분되고 qq는 저육질형, Qq는 이형접합체, QQ는 고육질형을 나타낸다.

실시예 2. MYH3 유전자의 유전형 분석

MYH3 유전자의 유전형을 분석하기 위하여, 돼지 MYH3 유전자의 전사시작지점(transcription start site; TSS)으로부터 5'-UTR 3kb, 및 종결코돈(stop codon)으로부터 3'-UTR 1kb 까지의 염기서열을 해독하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 육질에 영향을 미치는 MYH3 유전자에서 QTN(i.e., MYH3-1805_-1810delGGACTG)을 확인하였다(적색점으로 표시). 또한, 랜드레이스(LANDLACE)와 제주재래돼지(KNP) 사이에 염기 변이가 존재하며, 이는 엑손(exon) 3에 있는 개시코돈(ATG)으로부터 5'-UTR에 위치함을 확인하였다. 제주재래돼지의 경우 -1805 bp ~ -1810 bp의 부위가 결손되었음을 확인하였으며, 이는 근육형성 조절 인자(myogenesis regulatory factor; MRF)의 결합 부위임을 확인하였다.

실시예 3. MYH3 유전자의 유전형 확인을 통한 돼지의 육질 판단

상기 실시예 2를 통해 랜드레이스 및 제주재래돼지의 MYH3 유전자 간에 염기 변이가 존재함을 확인함에 따라, 상기 염기 변이를 이용하여 돼지의 육질을 판단하고자 하였다.

구체적으로, 프라이머(forward: 5'-TGG TCT TTC CTA ATT GGT GAC AT-3', reverse: 5'-AGT TTT GAG CAA GGC TTT TGT T-3')를 이용하여 상기 염기 변이를 포함한 부분을 증폭한 뒤, HpyCH4IV 제한효소를 이용하여 상기 원인 염기 변이의 염기서열 중에서 'A▼CGT' 부분을 절단하였다. 이후, 제한효소에 의한 랜드레이스 및 제주재래돼지 MYH3 유전자의 절단 양상을 확인하였다.

실시예 3-1. 돼지 MYH3 프로모터 영역 유전자 증폭 조건

혈액으로부터 분리한 DNA를 주형으로 한 PCR 증폭은 10×반응 완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM primer, 1.5 units Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이온수를 첨가하여 25 ㎕ 용량으로 반응하였다. 혈액에서 추출한 100 ng/㎕의 DNA를 PCR 주형으로 이용하였다. PCR 증폭은 PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 총 30 cycle을 수행하였다. 프라이머의 어닐링(annealing) 온도는 60℃에서 진행하였다. 증폭 산물은 브롬화 에티듐(ethidium bromide)이 함유된 2% 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 유전자 증폭 여부를 확인하였다.

실시예 3-2. 돼지 MYH3 프로모터 영역 제한효소 절단 방법

PCR 산물은 제한효소(HpyCH4Ⅳ)를 이용하여 절단하였고, 제한효소반응 조건은 공급자의 매뉴얼에 따라 PCR 산물 3㎕와 10X buffer 1㎕, 제한효소 0.3㎕, DW 5.7㎕를 혼합하여 37℃에서 overnight 반응하였다. 제한효소 절단 양상은 브롬화 에티듐이 함유된 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 육질이 좋지 않은 랜드레이스(LANDLACE) 돼지는 유전자가 절단되지 않아 한 개의 밴드로 나타남을 확인하였고(레인 1, 2), 육질이 우수한 제주 재래돼지(KNP)는 유전자가 절단되어 두 개의 밴드로 나타남을 확인하였다(레인 5, 6). 또한, 랜드레이스와 제주 재래돼지의 교배 품종은 세 개의 밴드로 나타냄을 확인하였다(레인 3, 4).

상기 결과를 통해, 돼지의 육질 형질을 결정하는 유전자인 MYH3의 변이를 확인함으로써 외래돼지와 토종돼지를 구별할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 돼지의 육질을 판단할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 돼지 육질 인자 유무 확인용 간이 진단용 프라이머 세트 제작

돼지 육질 인자 유무 확인용 간이 진단을 수행하여 하기와 같이 프라이머를 제작하였다.

Hap1_145QF: ACG-TGT-GTT-CCC-CAC-ACA-AGT-TG(서열번호 1)

Hap1_156qF: AGC-AGG-AGG-ACT-GCT-GTT-GTT-CC(서열번호 2)

Hap1_6bpF: ggg-ccc-AGC-AGG-AGG-ACT-GCT-GTT-GTT-CC(서열번호 3)

Hap1_9bpF: ccc-ggg-ccc-AGC-AGG-AGG-ACT-GCT-GTT-GTT-CCC(서열번호 4)

Hap1_12bpF: ggg-ccc-ggg-ccc-AGC-AGG-AGG-ACT-GCT-GTT-GTT-CCC-C(서열번호 5)

Hap1_24bp-qF:ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc-AGC-AGG-AGG-ACT-GCT-GTT-GTT-CCC-C(서열번호 6)

Hap1_QqR: ACC-TAG-AAT-CTC-GGC-CTG-TG(공통 리버스 프라이머, 서열번호 7)

비교예 1. 돼지의 육질 인자 유무 확인을 위한 증폭(개별 PCR 증폭)

돼지의 육질 인자 유무 확인을 위하여, Hap1_145QF(서열번호 1)와 Hap1_QqR(서열번호 7) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 하여 분석하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 돼지의 육질 인자 유무 진단은 가능하나, 육질 인자 보유 개체의 경우 동형접합체와 이형접합체의 구분이 되지 않아, Hap1_156qF(서열번호 2)와 Hap1_QqR(서열번호 7) 프라이머를 이용하여 재차 유전자를 증폭해야 진단이 가능하다.

비교예 2. 돼지의 육질 인자 유무 확인을 위한 증폭( PCR 증폭)

돼지의 육질 인자 유무 확인을 위하여, 2개의 포워드 프라이머(Hap1_145QF: 서열번호 1, Hap1_156qF: 서열번호 2)와 1개의 리버스 프라이머(Hap1_QqR: 서열번호 7)를 이용하여 PCR 증폭 후 분석하였다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, lane 1,2: 저육질형; 3,4: 이형접합체; 5,6: 고육질형이었으나, 유전자형 간에 구분이 모호하여 진단할 수 없었다.

비교예 3. 6bp ( ggg -ccc) 미스매치 프라이머를 이용한 육질 진단

포워드 프라이머로 Hap1_145QF(서열번호 1) 및 Hap1_6bpF(6bp(ggg-ccc) 미스매치 프라이머: 서열번호 3), 및 리버스 프라이머로 Hap1_QqR(서열번호 7)를 이용하여 PCR 증폭 후 분석하였다.

이때 Gradient PCR(58~70℃) 조건을 표 1에 나타내었다.

또한, 전기영동 조건은 하기와 같았다.

3% agarose gel, 25min loading

M : Generuler 50bp DNA Ladders(Thermo)

그 결과 도 9에 나타난 바와 같이, lane 1,2: 저육질형; 3,4: 이형접합체; 5,6: 고육질형이었으나, 유전자형 간에 구분이 모호하여 진단할 수 없었다.

비교예 4. 9bp (ccc- ggg -ccc) 미스매치 프라이머를 이용한 육질 진단

비교예 3과 비교해서 포워드 프라이머로 Hap1_145QF(서열번호 1) 및 Hap1_9bpF(9bp(ccc-ggg-ccc) 미스매치 프라이머: 서열번호 4)를 이용한 것을 제외하고 동일한 조건으로 PCR 증폭 후 분석하였다.

그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, lane 1,2: 저육질형; 3,4: 이형접합체; 5,6: 고육질형이었으나, 유전자형 간에 구분이 모호하여 진단할 수 없었다.

실시예 5. 12bp (ccc- ggg -ccc) 미스매치 프라이머를 이용한 육질 진단

포워드 프라이머로 Hap1_145QF(서열번호 1) 및 Hap1_12bpF(12bp(ggg-ccc-ggg-ccc) 미스매치 프라이머: 서열번호 5), 및 리버스 프라이머로 Hap1_QqR(서열번호 7)를 이용하여 PCR 증폭 후 분석하였다.

이때 PCR 조건을 표 2 및 표 3에 나타내었다.

또한, 전기영동 조건은 하기와 같았다.

3% agarose gel, 25min loading

M : Generuler 50bp DNA Ladders(Thermo)

그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, lane 1,2: 저육질형; 3,4: 중간육질형: 5,6: 고육질형이었고, 유전자형 간에 구분이 명확하여 정확한 유전자형 진단을 할 수 있었다.

실시예 6. LE 아가로스 % 수준에 따른 12bp ( ggg -ccc- ggg -ccc- ggg -ccc- ggg -ccc) 미스매치 프라이머를 이용한 육질 진단

실시예 5와 비교해서 2% 또는 2.5% LE 아가로스를 이용한 것을 제외하고 동일한 조건으로 PCR 수행 후 분석을 하였다.

그 결과 도 12a에 나타난 바와 같이, 2%의 LE 아가로스인 경우, lane 1,2: 저육질형; 3,4: 이형접합체; 5,6: 고육질형이었으나, 유전자형 간에 구분이 모호하여 진단할 수 없었다.

반면, 도 12b에 나타난 바와 같이, 2.5%의 LE 아가로스인 경우 유전자형 간에 구분이 명확하여 정확한 유전자형 진단을 할 수 있었다.

실시예 7. 24bp ( ggg -ccc- ggg -ccc- ggg -ccc- ggg -ccc) 미스매치 프라이머를 이용한 육질 진단

포워드 프라이머로 Hap1_145QF(서열번호 1) 및 Hap1_24bpF(24bp(ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc) 미스매치 프라이머: 서열번호 6), 및 리버스 프라이머로 Hap1_QqR(서열번호 7)를 이용하여 PCR 증폭 후 분석하였다.

이때 PCR 조건을 표 4 및 표 5에 나타내었다.

또한, 전기영동 조건은 하기와 같았다.

2% agarose gel, 30min loading

M : Generuler 100bp DNA Ladders(Thermo)

그 결과 도 13에 나타난 바와 같이, lane 1, 4, 7: 저육질형; 2, 5, 8: 중간육질형; 3, 6, 9: 고육질형이었고, 유전자형 간에 구분이 명확하여 정확한 유전자형 진단을 할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 미스매치 프라이머를 이용하여 PCR 증폭 후 제한효소 처리과정이 필요없이 전기영동만으로 돈육의 육질을 신속, 정확하고 경제적으로 예측할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Composition for predicting meat quality of pork and method for simple and rapid predicting of meat quality using thereof <130> NPF31847 <160> 7 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 acgtgtgttc cccacacaag ttg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 agcaggagga ctgctgttgt tcc 23 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 gggcccagca ggaggactgc tgttgttcc 29 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 cccgggccca gcaggaggac tgctgttgtt ccc 33 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 gggcccgggc ccagcaggag gactgctgtt gttcccc 37 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 gggcccgggc ccgggcccgg gcccagcagg aggactgctg ttgttcccc 49 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 7 acctagaatc tcggcctgtg 20

Claims

서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 돈육의 육질 예측용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 육질은 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 및 지방산 조성으로부터 선택되는 1종 이상의 육질 형질과 관련된 것인, 돈육의 육질 예측용 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 조성물을 포함하는, 돈육의 육질 예측용 키트.
a) 돼지 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 핵산을 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계; 및
c) 증폭 산물을 전기영동하여 증폭 산물의 크기에 의해 유전자형을 확인하여 돈육의 육질을 예측하는 단계를 포함하는, 돈육의 육질 예측 방법.
제4항에 있어서,
단계 b)에서 증폭은 서열번호 1, 5, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하고,
단계 c)에서 2% 초과의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자형을 확인하는, 돈육의 육질 예측 방법.
제5항에 있어서,
단계 c)에서 20 ~ 30분 동안 전기영동하는, 돈육의 육질 예측 방법.
제4항에 있어서,
단계 b)에서 증폭은 서열번호 1, 6, 및 7로 표시되는 프라이머 세트를 이용하고,
단계 c)에서 1.5 ~ 2.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자형을 확인하는, 돈육의 육질 예측 방법.
제7항에 있어서,
단계 c)에서 25 ~ 35분 동안 전기영동하는, 돈육의 육질 예측 방법.
제4항에 있어서,
단계 c)에서 유전자형 qq, Qq, QQ 중 QQ인 경우 qq 및 Qq에 비해 고육질형으로 예측하는, 돈육의 육질 예측 방법.
제4항에 있어서,
상기 육질은 근내지방함량, 육색, 전단력, 보수력, 및 지방산 조성으로부터 선택되는 1종 이상의 육질 형질과 관련된 것인, 돈육의 육질 예측 방법.