JP5281775B2 - ウシ脂肪交雑形成に関わる一塩基多型およびその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、ウシ脂肪交雑形成に関わる一塩基多型およびその利用に関する。さらに詳しくは、ウシ脂肪交雑形成に関わる新規な一塩基多型に基づいてウシの遺伝子型を判定し、ウシの脂肪交雑形成能力を予測する方法およびキットに関する。
「霜降り」や「サシ」と称されるウシの脂肪交雑は牛肉の肉質を評価、判定する上で重要な因子であり、脂肪交雑形成能力の高い個体とそうでない個体をウシの肥育の早期に判別し、それらの能力に合った肥育計画を立てることができれば、肉用牛の生産において非常に望ましい。さらに、その能力を早期に判定できれば、世代間隔を短縮することができ、育種改良に多大の貢献をする。
このような事情に鑑み、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判定すべく、従来から、ウシの脂肪交雑形成に関与する責任遺伝子の探索、同定が試みられている。例えば、特許文献１ではウシの脂肪細胞分化のマスターキーといわれているウシＰＰＡＲγ遺伝子の１つであるウシＰＰＡＲγ２の変異体が開示されている。
また、ウシの脂肪交雑形成に影響する遺伝子を特定することを目的として、系統的に脂肪交雑形成能力の異なることが判明しているウシ群間で、脂肪交雑形成が始まる前後８〜１４ヶ月齢の時期に発現するｍＲＮＡ量を調べ、配列既知の５つの候補遺伝子を選抜した報告（平成１７年３月２７日〜２９日開催の日本畜産学会第１０４回大会発表）や、これらの遺伝子のゲノム配列を決定し、いくつかの遺伝子において一塩基多型（ＳＮＰ）が存在するとの報告（平成１７年９月１１日、１２日開催の日本動物遺伝育種学会第６回大会ポスター発表）がある。
さらに、血管伸長に関連すると推測されるウシＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐ部位と、＋３６９８ｂｐ部位にＳＮＰが存在し、それらがウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定に利用できることが判明しており、特許出願されている（特願２００６−０８０７２０号）。
特開２００１−８６８８号公報
このような事情に鑑み、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判定すべく、従来から、ウシの脂肪交雑形成に関与する責任遺伝子の探索、同定が試みられている。例えば、特許文献１ではウシの脂肪細胞分化のマスターキーといわれているウシＰＰＡＲγ遺伝子の１つであるウシＰＰＡＲγ２の変異体が開示されている。
また、ウシの脂肪交雑形成に影響する遺伝子を特定することを目的として、系統的に脂肪交雑形成能力の異なることが判明しているウシ群間で、脂肪交雑形成が始まる前後８〜１４ヶ月齢の時期に発現するｍＲＮＡ量を調べ、配列既知の５つの候補遺伝子を選抜した報告（平成１７年３月２７日〜２９日開催の日本畜産学会第１０４回大会発表）や、これらの遺伝子のゲノム配列を決定し、いくつかの遺伝子において一塩基多型（ＳＮＰ）が存在するとの報告（平成１７年９月１１日、１２日開催の日本動物遺伝育種学会第６回大会ポスター発表）がある。
さらに、血管伸長に関連すると推測されるウシＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐ部位と、＋３６９８ｂｐ部位にＳＮＰが存在し、それらがウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定に利用できることが判明しており、特許出願されている（特願２００６−０８０７２０号）。
本発明の主な目的は、新たなＳＮＰを見出し、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判別するウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法およびそれに使用するキットを提供することである。
本発明者らは、ウシの各種遺伝子について、ＰＣＲダイレクトシーケンスによる多型検出を行った結果、新たに、ＳＮＰがウシＥＤＧ１遺伝子（GenBank NW_001494759）中に２部位、ウシＴＴＮ（titin）遺伝子（GenBank NW_001494581）中に５部位および機能未知遺伝子で、本発明者らがＭＢＬ１と命名したウシ遺伝子（GenBank NW_001495576）中で２部位存在することを見出した。これらのＳＮＰについて、ホルスタイン種去勢肥育牛２頭および黒毛和種（種雄牛「糸福」の体細胞クローン）去勢肥育牛２頭の試料を用いて詳細に検討したところ、ＳＮＰタイプにより特定の制限酵素で切断可能な場合と不可能な場合があること、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析でタイプ分けできること、さらに、各遺伝子中の１部位のＳＮＰが、当該ＳＮＰタイプとウシ個体の脂肪交雑形成能力との間に統計的に有意な相関関係があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）ウシのＥＤＧ１遺伝子であって、第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位の塩基がＴ／Ｇホモまたはヘテロ型、ウシのＴＴＮ遺伝子であって、第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位の塩基がＣ／Ｔホモまたはヘテロ型またはウシのＭＢＬ１遺伝子であって、第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の塩基がＡ／Ｇホモまたはヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型、
（２）ウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位、ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位から選ばれる少なくとも１部位における一塩基多型（ＳＮＰ）タイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法、
（３）ウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位、ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の３部位におけるＳＮＰタイプを判定する上記（２）記載の方法、
（４）ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により行う上記（２）記載の方法、
（５）ウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー、ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーおよびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーから選ばれる少なくとも１組のプライマーを含む上記（２）記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用キット、
（６）制限酵素を含む上記（５）記載のキット、
（７）配列番号４および配列番号５に示す配列からなるウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー、
（８）配列番号６および配列番号７に示す配列からなるウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー、
（９）配列番号８および配列番号９に示す配列からなるウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーなどを提供するものである。
（１）ウシのＥＤＧ１遺伝子であって、第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位の塩基がＴ／Ｇホモまたはヘテロ型、ウシのＴＴＮ遺伝子であって、第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位の塩基がＣ／Ｔホモまたはヘテロ型またはウシのＭＢＬ１遺伝子であって、第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の塩基がＡ／Ｇホモまたはヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型、
（２）ウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位、ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位から選ばれる少なくとも１部位における一塩基多型（ＳＮＰ）タイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法、
（３）ウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位、ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の３部位におけるＳＮＰタイプを判定する上記（２）記載の方法、
（４）ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により行う上記（２）記載の方法、
（５）ウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー、ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーおよびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーから選ばれる少なくとも１組のプライマーを含む上記（２）記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用キット、
（６）制限酵素を含む上記（５）記載のキット、
（７）配列番号４および配列番号５に示す配列からなるウシのＥＤＧ１遺伝子の第１エキソン開始点から−１７３６ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー、
（８）配列番号６および配列番号７に示す配列からなるウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー、
（９）配列番号８および配列番号９に示す配列からなるウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマーなどを提供するものである。
本発明の方法により、上記の新規ＳＮＰの１部位以上、好ましくは、３部位についてＳＮＰタイプを判定することにより、遺伝子型が判定でき、それに基づいて脂肪交雑形成能力が予測できる。
以下の実施例に示すごとく、黒毛和種種雄牛１０１頭について、遺伝子ＳＮＰと脂肪交雑の度合との相関を分散分析により解析したところ、ＥＤＧ１遺伝子のプロモーター領域である、第１エキソンから−１７３６ｂｐ部位の塩基（以下、ＥＤ−１７３６と称する）がＴアリルであるものとＧアリルであるものでは、危険率２．９９％でＴアリルの方が、脂肪交雑に関する遺伝的能力、すなわち育種価が高いことが示された。
また、これらの１０１頭について、肉の脂肪交雑度が高い（評点が高い）上位１７頭のグループと、交雑度の低い（評点の低い）下位１７頭のグループとで、遺伝子ＳＮＰと脂肪交雑度合との相関を解析したところ、ＴＴＮ遺伝子のプロモーター領域である、第１エキソンから−６５２ｂｐ部位の塩基（以下、ＴＴ−６５２と称する）がＴアリルであるものと、Ｃアリルであるものとでは、上位群と下位群の独立性検定で危険率１１．０３％で有意な差があり、１０１頭全ての分散分析での危険率２．５５％でＴアリルの方が育種価が高いことが示された。
さらに、上位群と下位群とで、遺伝子ＳＮＰと脂肪交雑度合いとの相関を独立性検定により解析したところ、ＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の塩基（以下、ＭＢ１＋２２２２０と称する）がＡアリルであるものとＧアリルであるものとでは、χ２検定での危険率０．０６％で有意な差があった。また、１０１頭全ての分散分析では、危険率０．２３％でＡアリルの方の育種価が高かった。さらにまた、このＳＮＰ部位がＡＧヘテロである福鶴土井の後代半きょうだい肥育牛５４６頭（ＡＡ型、ＡＧ型、ＧＧ型それぞれの遺伝子型を持つ）について解析したところ、危険率０．９７％でＡＡ型およびＡＧ型の方が、ＧＧ型より有意に育種価が高かった。
以下の実施例に示すごとく、黒毛和種種雄牛１０１頭について、遺伝子ＳＮＰと脂肪交雑の度合との相関を分散分析により解析したところ、ＥＤＧ１遺伝子のプロモーター領域である、第１エキソンから−１７３６ｂｐ部位の塩基（以下、ＥＤ−１７３６と称する）がＴアリルであるものとＧアリルであるものでは、危険率２．９９％でＴアリルの方が、脂肪交雑に関する遺伝的能力、すなわち育種価が高いことが示された。
また、これらの１０１頭について、肉の脂肪交雑度が高い（評点が高い）上位１７頭のグループと、交雑度の低い（評点の低い）下位１７頭のグループとで、遺伝子ＳＮＰと脂肪交雑度合との相関を解析したところ、ＴＴＮ遺伝子のプロモーター領域である、第１エキソンから−６５２ｂｐ部位の塩基（以下、ＴＴ−６５２と称する）がＴアリルであるものと、Ｃアリルであるものとでは、上位群と下位群の独立性検定で危険率１１．０３％で有意な差があり、１０１頭全ての分散分析での危険率２．５５％でＴアリルの方が育種価が高いことが示された。
さらに、上位群と下位群とで、遺伝子ＳＮＰと脂肪交雑度合いとの相関を独立性検定により解析したところ、ＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の塩基（以下、ＭＢ１＋２２２２０と称する）がＡアリルであるものとＧアリルであるものとでは、χ２検定での危険率０．０６％で有意な差があった。また、１０１頭全ての分散分析では、危険率０．２３％でＡアリルの方の育種価が高かった。さらにまた、このＳＮＰ部位がＡＧヘテロである福鶴土井の後代半きょうだい肥育牛５４６頭（ＡＡ型、ＡＧ型、ＧＧ型それぞれの遺伝子型を持つ）について解析したところ、危険率０．９７％でＡＡ型およびＡＧ型の方が、ＧＧ型より有意に育種価が高かった。
本明細書における、ＥＤ−１７３６についての「Ｔ／Ｇホモまたはヘテロ型」なる用語は、遺伝子型がＴＴ型、ＴＧ型およびＧＧ型のいずれかであることを示す。同様に、ＴＴ−６５２についての「Ｃ／Ｔホモまたはヘテロ型」なる用語は、遺伝子型がＣＣ型、ＣＴ型およびＴＴ型のいずれか、ＭＢ１＋２２２２０についての「Ａ／Ｇホモまたはヘテロ型」なる用語は、遺伝子型がＡＡ型、ＡＧ型およびＧＧ型の何れかであることを示す。
また、「ウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法」なる用語は、ウシの遺伝子型の判定方法およびウシの遺伝子型を判定し、それにより脂肪交雑形成能力を予測する方法の両方を意味する。
また、「ウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法」なる用語は、ウシの遺伝子型の判定方法およびウシの遺伝子型を判定し、それにより脂肪交雑形成能力を予測する方法の両方を意味する。
配列表の配列番号１には、ＥＤＧ１遺伝子のＥＤ−１７３６を含むGenBank NW_001494759の1067761〜1068360の塩基配列を示す。第１エキソンの開始点は1069858に相当し、本発明のＳＮＰの−１７３６ｂｐ部位は1068122（配列番号１中３６２番目）に相当し、その塩基ｋはＴまたはＧである。
配列番号２には、ＴＴＮ遺伝子のＴＴ−６５２を含むGenBank NW_001494581の230641〜231660の塩基配列を示す。第１エキソンの開始点は231706に相当し、本発明の別のＳＮＰの−６５２ｂｐ部位は231054（配列番号２中４１４番目）に相当し、その塩基ｙはＣまたはＴである。
配列番号３には、ＭＢＬ１遺伝子のＭＢ１＋２２２２０を含むGenBank NW_001495576の446701〜447420の塩基配列を示す。第１エキソンの開始点は424917に相当し、本発明のさらに別のＳＮＰの＋２２２２０ｂｐ部位は447136（配列番号３中４３６番目）に相当し、その塩基ｒはＡまたはＧである。
配列番号２には、ＴＴＮ遺伝子のＴＴ−６５２を含むGenBank NW_001494581の230641〜231660の塩基配列を示す。第１エキソンの開始点は231706に相当し、本発明の別のＳＮＰの−６５２ｂｐ部位は231054（配列番号２中４１４番目）に相当し、その塩基ｙはＣまたはＴである。
配列番号３には、ＭＢＬ１遺伝子のＭＢ１＋２２２２０を含むGenBank NW_001495576の446701〜447420の塩基配列を示す。第１エキソンの開始点は424917に相当し、本発明のさらに別のＳＮＰの＋２２２２０ｂｐ部位は447136（配列番号３中４３６番目）に相当し、その塩基ｒはＡまたはＧである。
本発明の方法は、ウシ個体から採取した検体から抽出した試料ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０の少なくとも１つのＳＮＰタイプを、例えば、制限酵素を用いてＲＦＬＰ分析により判定するものである。
検体としては、血液、精液等の生物体の一部を使用でき、これらから、常法により試料ＤＮＡを抽出して判定を行う。
ＳＮＰタイプの判定は、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０のいずれか１つでもよいが、複数組み合わせることにより、脂肪交雑形成能力の予測の精度を上げることができ、３つ全てを判定することが好ましい。
用いる制限酵素としては、例えば、ＥＤ−１７３６については、Ｔｓｐ５０９Ｉ（ＮＥＢＪ）、ＴＴ−６５２については、ＨｐｙＣＨ４III（ＮＥＢＪ）、ＭＢ１＋２２２２０については、ＦｏｋＩ（Takara）を用いることができる。
検体としては、血液、精液等の生物体の一部を使用でき、これらから、常法により試料ＤＮＡを抽出して判定を行う。
ＳＮＰタイプの判定は、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０のいずれか１つでもよいが、複数組み合わせることにより、脂肪交雑形成能力の予測の精度を上げることができ、３つ全てを判定することが好ましい。
用いる制限酵素としては、例えば、ＥＤ−１７３６については、Ｔｓｐ５０９Ｉ（ＮＥＢＪ）、ＴＴ−６５２については、ＨｐｙＣＨ４III（ＮＥＢＪ）、ＭＢ１＋２２２２０については、ＦｏｋＩ（Takara）を用いることができる。
ＰＣＲは公知の方法に従って行うことができる。
ＰＣＲに使用するプライマーは、各遺伝子のＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０を含む領域、例えば、ＥＤＧ１遺伝子およびＴＴＮ遺伝子のＯＲＦより上流の該当する領域、ＭＢＬ１遺伝子の第５エキソン内の該当する領域を増幅するための配列を適宜設計すればよい。
例えば、ＥＤ−１７３６を含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号４、アンチセンスプライマーとして配列番号５で示す配列が挙げられる。ＴＴ−６５２を含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号６、アンチセンスプライマーとして配列番号７で示す配列が挙げられる。ＭＢ１＋２２２２０を含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号８、アンチセンスプライマーとして配列番号９で示す配列が挙げられる。
ＰＣＲに使用するプライマーは、各遺伝子のＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０を含む領域、例えば、ＥＤＧ１遺伝子およびＴＴＮ遺伝子のＯＲＦより上流の該当する領域、ＭＢＬ１遺伝子の第５エキソン内の該当する領域を増幅するための配列を適宜設計すればよい。
例えば、ＥＤ−１７３６を含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号４、アンチセンスプライマーとして配列番号５で示す配列が挙げられる。ＴＴ−６５２を含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号６、アンチセンスプライマーとして配列番号７で示す配列が挙げられる。ＭＢ１＋２２２２０を含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号８、アンチセンスプライマーとして配列番号９で示す配列が挙げられる。
また、ＲＦＬＰ分析も公知の方法に従って行うことができる。
ＥＤ−１７３６におけるＳＮＰのＴアリルは制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉで切断されるが、Ｇアリルは切断されない。ＴＴ−６５２におけるＳＮＰのＣアリルは制限酵素ＨｐｙＣＨ４IIIで切断されるが、Ｔアリルは切断されない。ＭＢ１＋２２２２０におけるＳＮＰのＧアリルは制限酵素ＦｏｋＩで切断されるが、Ａアリルは切断されない。
これにより、電気泳動で切断の有無を調べることによりＳＮＰタイプが判定できる。
ＥＤ−１７３６におけるＳＮＰのＴアリルは制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉで切断されるが、Ｇアリルは切断されない。ＴＴ−６５２におけるＳＮＰのＣアリルは制限酵素ＨｐｙＣＨ４IIIで切断されるが、Ｔアリルは切断されない。ＭＢ１＋２２２２０におけるＳＮＰのＧアリルは制限酵素ＦｏｋＩで切断されるが、Ａアリルは切断されない。
これにより、電気泳動で切断の有無を調べることによりＳＮＰタイプが判定できる。
本発明のキットは、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０を含む領域の配列の少なくとも１つを増幅するプライマーを含む。好ましくは、これらのプライマーと所定の制限酵素を含むＰＣＲ−ＲＦＬＰキットとする。当該キットにはこれ以外に検体からのゲノムＤＮＡの抽出試薬や、必要な器具、判定用の説明書等が含まれていてもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる遺伝子型判定
（１）試料の採取
種雄牛については血液あるいは精液を採取、肥育牛については食肉市場で屠殺された個体から脂肪組織を採取して用いた。これらの検体から常法によりゲノムＤＮＡを抽出した。
血液からの抽出にはReadyAmpTM Genomic DNA Purification System(Promega)を、精液および脂肪組織からの抽出にはWizard SV Genomic DNA Purification System(Promega)を用いた。
（２）ＤＮＡの増幅
下記プライマーを使用し、下記反応液を、９４．０℃で２分間の加熱１サイクルと、９４．０℃で３０秒、下記最適アニーリング温度で３０秒、ついで７２．０℃で１分の加熱を３５サイクル繰り返し、最後に７２．０℃で５分間加熱してＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ用プライマー配列および最適アニーリング温度
ＥＤ−１７３６
GTGTTAATATGTATGAAGCTTGATAGTCAGGAAATAAAT（配列番号４）
CCACTGTATCGCTGAGCTAGGT（配列番号５）
最適アニーリング温度６０℃
ＴＴ−６５２
TCATCTCCTAACTACTTCCCA（配列番号６）
ACAAAATCTGAACCTGGCTT（配列番号７）
最適アニーリング温度５５℃
ＭＢ１＋２２２２０
TCTTAGGCAGCAACCGGATT（配列番号８）
GAAGGGCATGTTCTTAGAATACCAG（配列番号９）
最適アニーリング温度５６℃
ＰＣＲ反応液
ゲノムDNA溶液 3.0μl
プライマーミックス（最終） 0.5μM
5×Go taq buffer 4.0μl
Go taq（最終） 0.5 U
dNTPs（最終） 0.2 mM
全量 20.0μl
（３）制限酵素処理
下記反応液を表１に示す所定温度で所定時間インキュベーションして制限酵素処理した後、制限酵素処理反応液を３％Nusieve GTGアガロースゲルで電気泳動した。
ＲＦＬＰ反応液
PCR反応液 2.00μl
10x添付buffer 1.00μl
制限酵素 最適酵素量
全量 10.00μl
図１〜図３にＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２、ＭＢ１＋２２２２０各々についての電気泳動パターンの例を示す。各図中の左端レーンは１００ｂｐラダーマーカーである。図中二本バンドはヘテロ型、長い方の一本バンドは切断されないホモ型、短い方は切断片のホモ型である。
（１）試料の採取
種雄牛については血液あるいは精液を採取、肥育牛については食肉市場で屠殺された個体から脂肪組織を採取して用いた。これらの検体から常法によりゲノムＤＮＡを抽出した。
血液からの抽出にはReadyAmpTM Genomic DNA Purification System(Promega)を、精液および脂肪組織からの抽出にはWizard SV Genomic DNA Purification System(Promega)を用いた。
（２）ＤＮＡの増幅
下記プライマーを使用し、下記反応液を、９４．０℃で２分間の加熱１サイクルと、９４．０℃で３０秒、下記最適アニーリング温度で３０秒、ついで７２．０℃で１分の加熱を３５サイクル繰り返し、最後に７２．０℃で５分間加熱してＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ用プライマー配列および最適アニーリング温度
ＥＤ−１７３６
GTGTTAATATGTATGAAGCTTGATAGTCAGGAAATAAAT（配列番号４）
CCACTGTATCGCTGAGCTAGGT（配列番号５）
最適アニーリング温度６０℃
ＴＴ−６５２
TCATCTCCTAACTACTTCCCA（配列番号６）
ACAAAATCTGAACCTGGCTT（配列番号７）
最適アニーリング温度５５℃
ＭＢ１＋２２２２０
TCTTAGGCAGCAACCGGATT（配列番号８）
GAAGGGCATGTTCTTAGAATACCAG（配列番号９）
最適アニーリング温度５６℃
ＰＣＲ反応液
ゲノムDNA溶液 3.0μl
プライマーミックス（最終） 0.5μM
5×Go taq buffer 4.0μl
Go taq（最終） 0.5 U
dNTPs（最終） 0.2 mM
全量 20.0μl
（３）制限酵素処理
下記反応液を表１に示す所定温度で所定時間インキュベーションして制限酵素処理した後、制限酵素処理反応液を３％Nusieve GTGアガロースゲルで電気泳動した。
ＲＦＬＰ反応液
PCR反応液 2.00μl
10x添付buffer 1.00μl
制限酵素 最適酵素量
全量 10.00μl
図１〜図３にＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２、ＭＢ１＋２２２２０各々についての電気泳動パターンの例を示す。各図中の左端レーンは１００ｂｐラダーマーカーである。図中二本バンドはヘテロ型、長い方の一本バンドは切断されないホモ型、短い方は切断片のホモ型である。
統計解析
各種のウシ個体について、実施例１と同様にしてＳＮＰタイプを判定し、分散分析により脂肪交雑形成能力との相関関係を統計的に調べた。
分散分析には最小二乗分散分析法を用いて、計算はＳＡＳのＧＬＭプロシジャを用いた。独立性検定にはFisherの直接検定またはχ２検定を用いて、計算にはＦＲＥＱプロシジャを用いた。
（１）大分県種雄牛を用いた予備的相関解析
検出されたＳＮＰと脂肪交雑との相関解析を行う予備的な解析として、脂肪交雑に関する育種価が得られている大分県黒毛和種種雄牛１０１頭について、肉の脂肪交雑に関する育種価の低い下位群１７頭と、高い上位群１７頭についてＳＮＰ遺伝子型を調べた。
その結果を表２に示す。
各種のウシ個体について、実施例１と同様にしてＳＮＰタイプを判定し、分散分析により脂肪交雑形成能力との相関関係を統計的に調べた。
分散分析には最小二乗分散分析法を用いて、計算はＳＡＳのＧＬＭプロシジャを用いた。独立性検定にはFisherの直接検定またはχ２検定を用いて、計算にはＦＲＥＱプロシジャを用いた。
（１）大分県種雄牛を用いた予備的相関解析
検出されたＳＮＰと脂肪交雑との相関解析を行う予備的な解析として、脂肪交雑に関する育種価が得られている大分県黒毛和種種雄牛１０１頭について、肉の脂肪交雑に関する育種価の低い下位群１７頭と、高い上位群１７頭についてＳＮＰ遺伝子型を調べた。
その結果を表２に示す。
つぎに、各ＳＮＰについて、遺伝子頻度を用いた独立性検定により相関解析を行った。
その結果を表３に示す。
この結果、ＥＤ−１７３６では、統計的に有意ではないが、Ｔアリルの方が、ＴＴ−６５２では、危険率１１．０３％でＴアリルの方が、ＭＢ１＋２２２２０では、危険率０．０６％でＡアリルの方が、いずれも上位群で高いことが示された。
その結果を表３に示す。
この結果、ＥＤ−１７３６では、統計的に有意ではないが、Ｔアリルの方が、ＴＴ−６５２では、危険率１１．０３％でＴアリルの方が、ＭＢ１＋２２２２０では、危険率０．０６％でＡアリルの方が、いずれも上位群で高いことが示された。
（２）大分県種雄牛１０１頭についての相関解析
上記の種雄牛１０１頭について、各ＳＮＰとの相関を分散分析により解析した。また、これら１０１頭については、脂肪交雑と同じく脂肪蓄積に関連する形質である皮下脂肪厚の育種価も得られており、皮下脂肪厚の育種価についても同様に解析を行った。
ＥＤ−１７３６について
結果を表４および表５に示す。
表４に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表５に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＴＴ型とＧＧ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
上記の種雄牛１０１頭について、各ＳＮＰとの相関を分散分析により解析した。また、これら１０１頭については、脂肪交雑と同じく脂肪蓄積に関連する形質である皮下脂肪厚の育種価も得られており、皮下脂肪厚の育種価についても同様に解析を行った。
ＥＤ−１７３６について
結果を表４および表５に示す。
表４に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表５に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＴＴ型とＧＧ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
ＴＴ−６５２について
結果を表６および表７に示す。
表６に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表７に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＣＴ型とＣＣ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
結果を表６および表７に示す。
表６に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表７に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＣＴ型とＣＣ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
ＭＢ１＋２２２２０について
結果を表８および表９に示す。
表８に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が１％水準で有意であった。また、表９に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＡＡ型とＧＧ型との間では１％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
結果を表８および表９に示す。
表８に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が１％水準で有意であった。また、表９に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＡＡ型とＧＧ型との間では１％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
（３）３つのＳＮＰの寄与率についての解析
上記種雄牛１０１頭の脂肪交雑育種価について、各ＳＮＰの脂肪交雑の育種価に対する寄与率を推定した。
結果を表１０に示す。
表１０に示すごとく、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２、ＭＢ１＋２２２２０は、脂肪交雑の育種価に対して、それぞれ５％、２．４％、６．３％の寄与率を持ち、３つのＳＮＰを合わせると、１４％に達した。
以上の結果から、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０は、いずれも脂肪交雑と相関があり、ＥＤ−１７３６ではＴアリルが、ＴＴ−６５２ではＴアリルが、ＭＢ１＋２２２２０ではＡアリルが脂肪交雑形成にプラスに働いていることが判明し、これらのＳＮＰの少なくとも１つ、好ましくは３つ全てをタイピングすることにより、ウシの脂肪交雑形成能力を予測することができる。
上記種雄牛１０１頭の脂肪交雑育種価について、各ＳＮＰの脂肪交雑の育種価に対する寄与率を推定した。
結果を表１０に示す。
表１０に示すごとく、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２、ＭＢ１＋２２２２０は、脂肪交雑の育種価に対して、それぞれ５％、２．４％、６．３％の寄与率を持ち、３つのＳＮＰを合わせると、１４％に達した。
以上の結果から、ＥＤ−１７３６、ＴＴ−６５２およびＭＢ１＋２２２２０は、いずれも脂肪交雑と相関があり、ＥＤ−１７３６ではＴアリルが、ＴＴ−６５２ではＴアリルが、ＭＢ１＋２２２２０ではＡアリルが脂肪交雑形成にプラスに働いていることが判明し、これらのＳＮＰの少なくとも１つ、好ましくは３つ全てをタイピングすることにより、ウシの脂肪交雑形成能力を予測することができる。
上記と同様に、種雄牛「糸治」の後代去勢肥育牛１９９頭の脂肪交雑および皮下脂肪厚の育種価について、ＥＤ−１７３６との相関を解析した。
結果を表１１および表１２に示す。
表１１に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表１２に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＴＴ型とＧＧ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
結果を表１１および表１２に示す。
表１１に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表１２に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＴＴ型とＧＧ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
上記と同様に、種雄牛「糸福」の後代去勢肥育牛２２１頭の脂肪交雑および皮下脂肪厚の育種価について、ＴＴ−６５２との相関を解析した。
結果を表１３および表１４に示す。
表１３に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表１４に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＴＴ型とＣＣ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
結果を表１３および表１４に示す。
表１３に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、表１４に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＴＴ型とＣＣ型との間では５％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
上記と同様に、種雄牛「福鶴土井」の後代去勢肥育牛５４６頭の脂肪交雑および皮下脂肪厚の育種価について、ＭＢ１＋２２２２０との相関を解析した。
結果を表１５および表１６に示す。
表１５に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が１％水準で有意であった。また、表１６に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＡＡ型とＧＧ型との間では１％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
結果を表１５および表１６に示す。
表１５に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が１％水準で有意であった。また、表１６に示すごとく、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＡＡ型とＧＧ型との間では１％水準で有意な差が認められた。皮下脂肪厚の育種価では、遺伝子型の効果は有意でなかった。
以上記載したごとく、本明細書に開示する遺伝子型を判定することにより、肥育牛の早期段階において脂肪交雑能力の高い個体とそうでない個体を判別し、それらの能力に合った肥育計画を立てることができると考えられる。また、雄牛および雌牛の脂肪交雑に関する遺伝的能力を成長の早期に判定することができ、脂肪交雑の改良を著しく促進できる。
脂肪交雑は肥育牛の価格を決める重要な因子であり、肉用牛産業に多大な貢献ができ、さらに、肥育技術への貢献のみならず、種牛雄選抜を含めた育種改良への応用も期待できる。
脂肪交雑は肥育牛の価格を決める重要な因子であり、肉用牛産業に多大な貢献ができ、さらに、肥育技術への貢献のみならず、種牛雄選抜を含めた育種改良への応用も期待できる。
配列番号４：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing ED-1736
配列番号５：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing ED-1736
配列番号６：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine TTN gene
region containing TT-652
配列番号７：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine TTN gene
region containing TT-652
配列番号８：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine MBL1 gene
region containing MB1+22220
配列番号９：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine MBL1 gene
region containing MB1+22220
region containing ED-1736
配列番号５：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing ED-1736
配列番号６：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine TTN gene
region containing TT-652
配列番号７：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine TTN gene
region containing TT-652
配列番号８：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine MBL1 gene
region containing MB1+22220
配列番号９：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine MBL1 gene
region containing MB1+22220
Claims (6)
- ウシのＴＴＮ遺伝子であって、第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位の塩基がＣ／Ｔホモまたはヘテロ型またはウシのＭＢＬ１遺伝子であって、第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位の塩基がＡ／Ｇホモまたはヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型を有するウシのＴＴＮ遺伝子またはウシのＭＢＬ１遺伝子。
- ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位から選ばれる少なくとも１部位における一塩基多型（ＳＮＰ）タイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測および遺伝子型判定方法。
- ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位におけるＳＮＰタイプを判定する請求項２記載の方法。
- ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により行う請求項２記載の方法。
- ウシのＴＴＮ遺伝子の第１エキソン開始点から−６５２ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー対およびウシのＭＢＬ１遺伝子の第１エキソン開始点から＋２２２２０ｂｐ部位を含む領域を増幅するプライマー対から選ばれる少なくとも１組のプライマー対を含む請求項２記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測および遺伝子型判定用キット。
- さらに、制限酵素を含む請求項５記載のキット。
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