KR20070104085A

KR20070104085A - 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법

Info

Publication number: KR20070104085A
Application number: KR1020060036238A
Authority: KR
Inventors: 박용현; 박수민; 정성수; 이시흥; 장원철; 박상범; 남윤형; 이재식; 강원
Original assignee: 박용현
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2007-10-25
Also published as: KR100813996B1

Abstract

본 발명은 육우의 MC1R 유전자의 변이 부위를 염기특이-중합효소연쇄반응(Sequence Specific-PCR, ssPCR)을 이용하여 특이적으로 증폭하고, 이를 전기영동함으로써, 별도의 제한효소의 사용없이 한우육과 비한우육 및 교잡육 등을 판별하는 분석 방법에 관한 것이다.

이는 종래의 PCR-RFLP 방법에 의한 한우육의 판별방법에 비해 제한효소를 사용할 필요가 없으므로, 제한효소의 활성에 의한 판정의 오류를 방지할 수 있다. 나아가, 교잡육에 대한 판별을 정성적으로 수행할 수 있다.

ss-PCR, 프라이머, 한우육, 교잡육, 비한우육, 판별방법

Description

염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법{METHOD OF DETECTING HANWOO USING SEQUENCE SPECIFIC-PCR(ssPCR)}

도 1은 본 발명의 특이적인 프라이머들을 이용한 ss-PCR 산물의 전기영동 결과에 대한 사진으로, 1a는 한우육의 전기영동 결과이고, 1b는 비한우육(비한우육)의 전기영동 결과이며, 1c는 교잡육의 전기영동 결과이다.

도 2는 ss-PCR법을 이용한 육우에 대한 판별 결과를 나타내는 전기영동 결과에 대한 사진이다.

본 발명은 염기특이-중합효소연쇄반응(Sequence Specific-PCR)을 이용한 한우육 판별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 육우의 MC1R 유전자의 변이 부위를 염기특이-중합효소연쇄반응(Sequence Specific-PCR, ssPCR)을 이용하여 특이적으로 증폭하고, 이를 전기영동함으로써, 별도의 제한효소의 사용없이 한우육과 비한우육 및 교잡육 등을 판별하는 분석 방법에 관한 것이다.

종래의 소 품종은 뿔, 모색, 및 골격 등 외관적인 차이에 의해 구분되었으나, 도축된 상태에서의 쇠고기의 판별은 외관상의 차이가 없기 때문에 소 품종의 식별은 거의 불가능하다. 한편, 최근 외국의 광우병의 발생 등 외국 육우에 대한 불안감, 국민소득 증대와 식생활 개선으로 많은 소비자가 안전한 식탁과 고품질의 쇠고기를 선호하는 경향이 늘어감에 따라 한우육에 대한 수요가 증가되어 한우육과 비한우육의 가격차도 점차 커지고 있다.

그러나 소의 품종 구별은 외형적 특징인 모색, 체형 등에 의존하는 것이 지금까지의 방법이어서 표현형으로 구별되는 소의 품종이라 하더라도 도축하여 쇠고기 형태로 전환되면 품종별 식별이 거의 불가능하다.

이에 수입육과 국내산 비한우육을 한우육으로 불법 둔갑시키는 사례가 빈번하게 발생하고 있으며, 이러한 부정육 불법 유통은 소비자 및 생산농가에 큰 피해를 줄뿐만 아니라 국내 한우 사업의 육성계획에 큰 차질을 초래하여 한우 산업의 경쟁력을 약화시키는 원인이 되고 있다. 따라서 쇠고기 품종 구별은 쇠고기 시장의 유통질서의 확립과 한우 사육농가의 보호를 위해 필요한 과제로 대두되고 있다.

종래의 한우 판별 방법으로서 면역 효소 측정법(ELISA)과 등전점 전기영동법 (Isoelectric focusing; IEF) 등이 사용되었다. 그러나 상기 방법들은 축종간의 단백질 조성 및 구조적 차이에 따른 특이적 단백질을 검출했기 때문에 축종별 식별은 가능하나 동종내 품종간의 판별은 불가능하였다.

이를 개선하기 위해, PCR을 이용한 RAPD (random amplified polymorphic DNA)기법이 개발되었다. 상기 PCR-RAPD는 국내에서 쇠고기 품종 구별 및 각종 육류의 축종 판별, 및 한우와 구별되는 홀스타인 젖소 품종의 특이적인 RAPD 마커 검출 등에 사용되었고, 국외에서는 동물의 유전 분석 및 품종 식별에 폭 넓게 응용되어 왔다.

상기 PCR-RAPD는 10bp 정도의 짧은 프라이머를 이용하여 PCR을 할 경우, 프라이머가 게놈상에 여러 군데 결합하여 여러 단편들을 생성시키는 것을 이용한다. 이렇게 만들어진 여러 단편들을 전기 영동을 사용해서 확인하면 동물 품종마다 각각 독특한 밴드를 형성하게 되며 이것을 품종 특이적 RAPD 마커로 이용하여 품종을 구별할 수 있다.

그러나 RAPD 기법은 PCR 증폭 조건에 대한 민감성이 매우 높고 결과의 재현성과 정확성이 낮기 때문에 한우 품종 구별을 위한 실용화에는 문제가 있다

한편, 소를 비롯한 포유동물에서 모색 발현에 관여하는 것으로 밝혀진 MSH 수용체(Melanocyte-stimulating Hormonereceptor 1; MC1R) 유전자는 멜라닌의 합성 및 확산을 자극하는 호르몬 수용체이다. 포유동물의 모색을 결정하는 티로신이 유도된 멜라닌에는 두 가지 색소 즉, 적색/노란색을 나타내는 페오멜라닌(phaeomelanin)과 갈색/검정색을 나타내는 유멜라닌(eumelanin)이 있는데, 이들의 합성, 색소 세포 내의 상대적 양을 조절하는 데에 확장(Extention) (E) 및 아구티(Agouti) (A) 좌위가 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며 확장 좌위에 의해 암호되는 MC1R에 의해 타이로시나제 활성이 조절되고 타이로시나제 효소 농도에 따 라 페오멜라닌과 유멜라닌 생성이 조절됨이 밝혀졌다.

또한, 포유동물에서 MC1R 돌연변이가 모색변이를 일으킨다는 사실이 발견되어, 색소 합성에 관여하는 MC1R 유전자의 돌연변이를 검출하기 위해 PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism)분석 방법을 이용하여 말에서 MSH 수용체의 염기 서열 분석 결과 이 유전자의 단일 미스센스(missense) 돌연변이가 체스터넛(chestnut) 빛깔의 모색과 관련이 있음이 밝혀졌다. 또한 돼지에서 돼지 품종 및 모색별로 특징있는 MSH 수용체 유전자형이 제시되는 등 여러 축종을 대상으로 모색변이에 관한 연구가 이루어졌다.

소의 품종 판별을 위해 지금까지 수행된 MC1R 유전자의 PCR-RFLP 방법을 사용한 실험에서, 김태헌 등(김태헌, 윤두학, 박응우, 이혜영, 오성종, 정일정, 탁태영, 김경남, 한재용. 2000. 소 품종별 Melanocortin Receptor 1(MC1R) 유전자의 유전자형 빈도에 관한 연구. 한국동물자원과학회지 42:735-744)은 한우와 젖소 유전자를 판별하는데 있어 제한 효소처리 후 4% 메타포어(Metaphore) 아가로즈 젤을 사용하여 전기영동을 하였고, 이 등(이성수, 양영훈, 강승률, 오운용, 양보석, 고서봉, 오성종, 김규일. 2000. 한우, 제주재래흑우, 흑모화우와 갈모화우에서의 MSH Receptor(MC1R) 유전자의 유전자형 및 빈도 비교. 한국동물자원과학회지 42:253-260)과 정 등(정의룡, 김우태, 김연수, 한상기. 2000. 소 모색관련 유전자MC1R의 PCR-RFLP 마커를 이용한 한우육 판별. 한국동물자원과학회지 42:379-390)은 각각 8%, 13% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동을 한 후 실버 염색(silver stain)을 사 용했다. 이는 제한 효소 처리 후 생성된 저분자량의 DNA 밴드검출을 목적으로 한 것이다.

이러한, PCR-RFLP법은 PCR-RADP법에 비해 재현성 및 정확도가 높은 장점을 가지지만, 분석단계가 복잡하여 분석시간 및 비용이 많이 소요될 뿐 아니라, 분석을 위해 반드시 제한 효소를 사용하여야 하기 때문에 제한 효소의 활성이 품종 구별 시 오류를 범할 수 있게 되어 유전자 증폭 반응 후 다른 효소의 처리 없이 바로 품종을 구별할 수 있는 분석 방법이 절실하게 필요하게 되었다.

또한, 종래의 PCR-RFLP법은 한우육과 다른 육우의 교잡종에 대해서는 효과적으로 판별하기 어려웠다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 육우의 MC1R 유전자의 변이 부위를 염기특이-중합효소연쇄반응(Sequence Specific-PCR, ssPCR)을 이용하여 특이적으로 증폭하고, 이를 전기영동함으로서, 별도의 제한효소의 사용없이 한우육과 비한우육 및 교잡육 등을 판별하는 분석 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 육우의 ssPCR 분석에 적합한 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법은, 육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분을 프라이머쌍을 이용하여 증폭시키는 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR) 및 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함한다.

상기 MC1R 유전자의 변이부분은 바람직하게는 99 번째 또는 104번째 코돈부위를 포함하며, 더욱 바람직하게는 99 번째 코돈부위를 포함한다.

상기 프라이머쌍으로서, 바람직하게는 염기서열 2로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있다.

상기 프라이머쌍으로서, 바람직하게는 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있다.

상기 프라이머쌍으로서, 바람직하게는 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염 기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있다.

상기 프라이머쌍으로서, 바람직하게는 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부와 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있다.

상기 방법에 사용되는 프라이머쌍으로서, 본 발명은 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머 및 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머로 구성되는 프라이머쌍을 제공한다.

상기 방법에 사용되는 프라이머쌍으로서, 본 발명은 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머 및 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머로 구성되는 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명의 다른 특징에 따른, 육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분에 대하여 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 한우육을 판별하는 방법 은,

a)한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방 프라이머, b)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제1 ss-PCR 산물을 얻는 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR);

c)비한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방프라이머, d)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제2 ss-PCR 산물을 얻는 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR); 및 상기 제1 ss-PCR 산물 및 제2 ss-PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함한다.

상기 MC1R 유전자의 변이부분의 코돈부위는 바람직하게는 제99번째 또는 제104번째 코돈을 포함하며, 더욱 바람직하게는 99번째 코돈부위를 포함한다.

상기 a)에서 사용되는 전방 프라이머는 바람직하게는 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 포함한다.

상기 c)에서 사용되는 전방 프라이머는 바람직하게는 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 포함한다.

상기 b) 및 d)에서 사용되는 역 프라이머는 바람직하게는 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함한다.

상기 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계와 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계 중 어느 하나 이상의 단계에, 바람직하게는 대조군으로서 한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위 모두에 상보적으로 결합하는 전방 프라이머를 더 첨가할 수 있으며, 이 경우 상기 전방 프라이머는 바람직하게는 염기서열 2로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 육우의 MC1R 유전자의 변이 부위를 염기특이-중합효소연쇄반응(Sequence Specific-PCR, ssPCR)을 이용하여 특이적으로 증폭하고, 이를 전기영동함으로서, 별도의 제한효소의 사용없이 한우육과 비한우육 및 교잡육 등을 판별하는 한우육 판별방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법은, 육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분을 프라이머쌍을 이용하여 증폭시키는 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR) 및 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함한다.

한우육 판별을 위해, 기존에 사용하는 방법은 한우와 비한우(예, 홀스타인 종 또는 앵거스 종) MC1R 유전자를 위한 적합한 프라이머쌍을 이용하여 한우와 비한우 MC1R 유전자를 PCR에 의해 증폭시키는 단계; PCR 산물을 적합한 제한 효소로 처리하는 단계; 및 제한 효소 처리된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계로 구성되는 PCR-RFLP 방법을 이용하였다.

보다 구체적으로, 한우의 MC1R 유전자(서열 번호:1)상에는 특정한 제한효소의 절단 부위가 없는 반면, 비한우의 MC1R 유전자 상에는 이들 제한효소의 절단 부위가 있다. 이러한 제한 효소절단 부위의 존재 여부의 차이로 인해, 한우와 비한우의 MC1R 유전자의 일부를 PCR에 의해 증폭한 뒤, 상기 특정 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리하게 되면, 한우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되지 않은 크기의 밴드를 형성하게 되는 한편, 비한우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되어 단편들을 생성하여 둘 이상의 밴드를 형성하게 되므로 한우와 다른 품종의 구별이 가능해지는 현상을 이용한 것이다.

그러나, 상기 PCR-RFLP 방법을 통한 한우육 판별방법은 종래의 PCR-RADP법에 비해 재현성 및 정확도가 높은 장점을 가지지만, 분석단계가 복잡하여 분석시간 및 비용이 많이 소요될 뿐 아니라, 분석을 위해 반드시 제한 효소를 사용하여야 하기 때문에 제한 효소의 활성이 품종 구별 시 오류가 발생할 우려가 있다.

이에 본 발명자들은 상기 PCR-RFLP 방법에 비해 보다 간편하게 한우를 판별하는 방법을 연구하던 중 ssPCR 방법을 적용하면 PCR 산물을 정제하거나 제한효소를 사용하지 않고 바로 분석이 가능하기 때문에 노동력과 시간을 절약할 수 있다는 사실을 발견하게 되었다.

상기 ssPCR은 Taq 폴리머라제의 특징을 이용한 것으로 프라이머의 3' 말단의 염기서열을 다르게 하여 상보적인 결합이 이루워질 때는 PCR 반응이 진행되고 상보적인 결합이 이루워지지 않을 때는 PCR 반응이 진행되지 않는 것을 이용하는 방법으로서 제한효소를 필요로 하지 않는다. 단 하나의 염기서열의 삽입 그리고 치환 형태의 돌연변이까지 검출할 수 있으며 통상의 PCR 기기에서도 분석이 가능하다.

결국, 본 발명의 한우육 판별방법은 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법으로서, 육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분을 프라이머쌍을 이용하여 증폭시키는 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR) 및 상기 PCR 반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함한다.

본 발명의 ss-PCR 분석을 위한 MC1R 유전자의 변이부분은 바람직하게는 상기 MC1R 유전자의 변이부분은 99 또는 104번째 코돈부위 중 어느 하나 이상의 코돈부위를 포함하며, 더욱 바람직하게는 99번째 코돈부위를 포함하는 MC1R 유전자의 변이부분을 사용한다. 상기 99 또는 104번째 코돈부위는 MC1R 유전자 중 한우와 비한우가 다른 염기서열을 갖는 부위로서, 보다 구체적으로 상기 99번째 코돈부위는 한 우는 CTG이나 젖소의 경우 CCG이며, 104번째 코돈부위는 한우는 GGT이나 젖소는 GTG이다. 따라서 한우육의 판별을 위해 ss-PCR 분석을 실시할 경우 상기 MC1R 유전자의 변이부분은 99 또는 104번째 코돈부위 중 어느 하나 이상의 코돈부위를 포함하여야 판별이 가능하다.

이름	염기서열	서열번호
Forward	5'-GGTGAGTCTCGTGGAGAAC-3'	2
S1-Forward	5'-TGGAGACGGCAGTCATGC T -3'	3
S2-Forward	5'-GGAGACGGCAGTCATGC C -3'	4
Reverse	5'-CTATGAAGAGGCCAACGAG-3'	5

상기 표 1의 염기서열에서 볼드체는 ss-PCR이 진행되지 않는 부분을 의미한다.

상기 표 1은 본 발명에 사용가능한 프라이머의 종류를 표시한 것이다. 그 중 서열번호 2 ~ 4는 전방 프라이머이고, 서열번호 5는 역 프라이머이다. 보다 구체적으로, 상기 서열번호 2로 표시되는 전방 프라이머는 ss-PCR 반응이 제대로 수행되고 있는지 확인하기 위한 대조군의 기능을 수행하는 것으로, 한우, 비한우(예: 비한우육) 및 이들의 교잡육의 99번째 코돈부위에 모두 특이적으로 결합한다.

상기 서열번호 3로 표시되는 전방 프라이머는 한우 특이적인 프라이머로서, 한우 또는 한우의 특질을 갖고 있는 헤테로 형의 교잡육의 99번째 코돈에만 상보적으로 결합하여 ss-PCR을 수행할 경우 정상적으로 증폭이 일어나게 된다. 그러나, 젖소의 99번째 코돈에는 상기 서열번호 3의 프라이머의 3' 말단 부위가 결합하지 못하여 그 부분이 버블형상을 가지게 되며, 이를 ss-PCR로 증폭시킬 경우 Taq 폴리머라제가 해당 버블부위에는 작용하지 못하여 그 부분의 증폭이 일어나지 않게 된다. 따라서 이들을 각각 전기영동하여 보면, 정상적인 증폭이 일어난 한우와 교잡육은 315bp에서 밴드가 발생하고, 버블이 발생한 비한우육은 정상적인 증폭이 일어나지 않아 상기 위치에서 밴드가 생성되지 않는다. 도 1a는 서열번호 3로 표시되는 전방 프라이머르 이용한 한우육의 전기영동 결과에 대한 사진으로, 한우육 및 교잡육의 경우 315bp에서 하나의 밴드가 형성되는 것을 알 수 있다.

상기 서열번호 4로 표시되는 전방 프라이머는 비한우 특이적인 프라이머로서, 비한우 또는 비한우의 특질을 갖고 있는 헤테로 형의 교잡육의 99번째 코돈에만 상보적으로 결합하여 ss-PCR을 수행할 경우 정상적으로 증폭이 일어나게 된다. 그러나, 한우의 99번째 코돈에는 상기 서열번호 3의 프라이머의 3' 말단 부위가 결합하지 못하여 그 부분이 버블형상을 가지게 되며, 이를 ss-PCR로 증폭시킬 경우 Taq 폴리머라제가 해당 버블부위에는 작용하지 못하여 그 부분의 증폭이 일어나지 않게 된다. 따라서 이들을 각각 전기영동하여 보면, 정상적인 증폭이 일어난 비한우와 교잡육은 314bp에서 밴드가 생성되나, 버블이 발생한 한우육은 정상적인 증폭이 일어나지 않아 상기 위치에서 밴드가 생성되지 않는다. 도 1b는 서열번호 4로 표시되는 전방 프라이머를 이용한 비한우육의 전기영동 결과에 대한 사진으로, 비한우육 및 교잡육의 경우 314bp에서 하나의 밴드가 형성되는 것을 알 수 있다.

상기 서열번호 5로 표시되는 역 프라이머는 한우, 비한우(예: 젖소육) 및 이들의 교잡육의 99번째 코돈부위에 모두 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 서열번호 2, 3 및 4의 전방 프라이머들 모두와 쌍을 이루어 반응을 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 프라이머쌍으로서, ss-PCR 반응이 제대로 수행되고 있는지 확인하기 위하여 바람직하게는 염기서열 2로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 한우육와 비한우육(교잡육은 제외)을 판별하기 위하여 바람직하게는 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있다. 즉 한우육은 상기 프라이머와 상보적으로 결합하여 ss-PCR과정에서 정상적인 증폭이 수행되어 전기영동 시 밴드가 발생하나, 비한우육은 상기 서열번호 3의 프라이머의 3' 말단 부위가 결합하지 못하여 그 부분이 버블형상을 가지게 되며 그 결과 ss-PCR과정에서 정상적인 증폭이 수행되지 못하여 전기영동 시 밴드가 발생하지 않는다.

한우육과 비한우육(교잡육은 제외)을 판별하기 위한 다른 방법으로서, 본 발명은 상기 프라이머쌍으로서, 바람직하게는 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용할 수 있으며 그 원리는 상술한 바와 같다.

한편, 상기 염기서열 3 및 4로 표시되는 전방 프라이머를 개별적으로 사용할 경우에는 한우육과 비한우육(교잡육은 제외)을 판별하는 데는 유용하나, 한우와 비한우육의 교잡육을 판별하기 곤란한 문제가 있다.

이에 상기 프라이머쌍으로서, 바람직하게는 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부와 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 용하면 한우육과 비한우육 및 교잡육까지도 모두 판별할 수 있다. 구체적으로, 염기서열 3과 4로 표시되는 전방 프라이머를 모두 넣고, 염기서열 5로 표시되는 후방 프라이머를 넣은 후 ss-PCR과정을 수행하면, 한우육은 상기 한우육을 나타내는 위치의 밴드 하나만 나타나고, 비한우육은 상기 비한우육을 나타내는 위치의 밴드 하나만 나타나며, 교잡육은 상기 한우육과 비한우육을 나타내는 위치 모두에서 밴드를 형성하게 된다. 도 1c는 서열번호 3 및 4로 표시되는 전방 프라이머를 이용한 교잡육의 전기영동 결과에 대한 사진으로, 교잡육의 경우 314bp 및 315bp에서 모두 밴드가 형성되는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따른 한우육의 판별방법은, 육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분에 대하여 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 한우육을 판별하는 방법을 통하여,

c)비한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방프라이머, d)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제2 ss-PCR 산물을 얻는 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR); 및

상기 제1 ss-PCR 산물 및 제2 ss-PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함한다.

상술한 염기서열 3, 4 및 5로 표시되는 프라이머를 모두 혼합하여 한 단계의 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR)를 거쳐 한우육을 판별하는 경우, 조작이 간편한 장점은 있지만, 염기서열 3 및 4로 표시되는 전방 프라이머 간의 경쟁 및 상호작용으로 인하여 전기영동의 결과가 분명하지 않은 경우가 있다. 특히ssPCR 반응 진행시 염기서열 2, 3, 4 및 5로 표시되는 프라이머를 동시에 첨가하여 PCR을 반응을 진행하면 전기영동에서 한우 젖소에 상관없이 밴드가 관찰되어 한우 젖소를 구분하기 힘든 문제가 발생할 수 있다.

이에 본 발명에서는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응단계를 2단계로 분리하여, 한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방 프라이머, b)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제1 ss-PCR 산물을 얻는 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR)와 c)비한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방프라이머, d)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제2 ss-PCR 산물을 얻는 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR)로 구분한다.

이를 통해, 한우육에만 특이적인 전방 프라이머와 비한우육에만 특이적인 전방 프라이머를 분리하여 이들을 동시에 첨가하는 것에 의해 발생하는 문제점을 해결할 수 있다.

결국, 본 발명은 종래의 PCR-RFLP 방법에 의한 한우육의 판별방법에 비해 제한효소를 사용할 필요가 없으므로, 제한효소의 활성에 의한 판정의 오류를 방지할 수 있다. 나아가, 교잡육에 대한 판별을 정성적으로 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 : 조직에서 DNA 추출>

가. 재료

DNA를 얻기 위한 근육 조직은 도축장에서 한우육 1개체와 홀스타인 2개 그리고 시장에 유통중인 흑소(앵거스 종), 한우, 젖소, 육우를 구입하여 채취하였다.

나. DNA 추출

조직에서 DNA를 추출은 스핀-컬럼 방식을 이용하여 실시하였다. 구체적으로 조직(50mg)을 잘게 부순 후 용해 완충액 (Tris-EDTA) 400㎕와 10% SDS 50㎕와 프로테이나제 K (20㎎/㎖) 10㎕를 넣고 충분히 섞은 후 50℃에서 조직이 완전히 용해 될 때까지 반응시킨다. 완전히 용해되면 결합 완충액(구아니딘-HCl, Triton X-100, Tris-HCl) 400㎕를 첨가하고 이소프로판올 200㎕를 첨가한 후 잘 섞어주었다.

상기 혼합용액을 스핀-컬럼에 옮기고 8,000rpm에서 1분간 원심분리한 후 스핀-컬럼을 새로운 튜브에 옮긴다. 그 뒤 80% 에탄올 500㎕를 첨가하여 8,000rpm에서 원심분리하고 상기 스핀-컬럼을 새로운 튜브로 옮긴다. 이 과정을 2회 반복한 후 400㎕에 용출 완충액(Tris-HCL, pH8.5) 200㎕를 첨가하고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 추출하였다. 그 뒤 추출된 DNA는 전기영동으로 확인하였다.

< 실시예 2 : 중합효소연쇄반응( PCR )>

가. 프라이머

상기 추출된 DNA를 증폭시키기 위하여 MC1R 유전자의 GenBank(AF445642)에 등록된 Bos taurus melanocortin 1 receptor(MC1R) 유전자 부위에서 99번 코돈 부위를 포함하는 염기서열 2, 3, 4로 표시되는 전방 프라이머와 염기서열 5로 표시되는 역 프라이머를 합성(Bioneer. Korea)하였다.

나. ss-PCR 증폭

1) 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계를 위해 반응액은 주형 DNA 2㎕, 염기서열 2, 3 및 5로 표시되는 10pM 프라이머 1㎕, 10X 반응버퍼2㎕, 10mM dNTP 2㎕, Taq DNA 폴리머라제 (5U) 0.2㎕를 첨가하고 멸균 증류수를 첨가하여 총 20㎕로 부피를 조정하였다.

PCR 반응은 94℃에서 5분간 예비 변성을 시킨후 94℃에서 20초, 65℃에서 20초, 72℃에서 30초씩 10 사이클을 반응한 후 다시 94℃에서 20초, 57℃에서 20초, 72℃에서 30초씩 25 사이클을 반응하였다. 그 뒤 72℃에서 5분간 최종 신장반응을 수행하였다. 그 뒤 증폭된 PCR 산물을 1.8% 아가로즈 겔에서 확인하였다.

2) 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계를 위해 반응액은 주형 DNA 2㎕, 염기서열 2, 4 및 5로 표시되는 10pM 프라이머 1㎕, 10X 반응버퍼2㎕, 10mM dNTP 2㎕, Taq DNA 폴리머라제 (5U) 0.2㎕를 첨가하고 멸균 증류수를 첨가하여 총 20㎕로 부피를 조정하였다.

그 뒤 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계와 동일한 PCR 반응단계를 수행하였다.

라. 결과해석에 따른 한우육, 비한우육 및 교잡육의 판별

도 2는 한우육, 비한우육 및 교잡육에 대한 ss-PCR 분석결과로서 이를 통해 한우육과 비한우육의 판별은 물론 교잡육에 대한 정성적인 판별도 가능하다.

본 발명은 종래의 PCR-RFLP 방법에 의한 한우육의 판별방법에 비해 제한효소를 사용할 필요가 없으므로, 제한효소의 활성에 의한 판정의 오류를 방지할 수 있다. 나아가, 교잡육에 대한 판별을 정성적으로 수행할 수 있다.

Claims

육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분을 프라이머쌍을 이용하여 증폭시키는 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR); 및

상기 PCR 반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제1항에 있어서,

상기 MC1R 유전자의 변이부분은 99 번째 또는 104번째 코돈부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제1항에 있어서,

상기 프라이머쌍으로서,

염기서열 2로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제1항에 있어서,

상기 프라이머쌍으로서,

염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제1항에 있어서,

상기 프라이머쌍으로서,

염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제1항에 있어서,

상기 프라이머쌍으로서,

염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부와 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 3' 말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 전방 프라이머로 이용하고, 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 역 프라이머로 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제1항의 방법에 사용되는 프라이머쌍으로서,

염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머 및 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머로 구성되는 프라이머쌍.
제1항의 방법에 사용되는 프라이머쌍으로서,

염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머 및 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머로 구성되는 프라이머쌍.
육우의 모색유전에 관여하는 MC1R 유전자의 변이부분에 대하여 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 한우육을 판별하는 방법에 있어서,

a)한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방 프라이머, b)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제1 ss-PCR 산물을 얻는 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR);

c)비한우의 변이부분의 코돈부위에만 상보적으로 결합하는 전방프라이머, d)한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위에 모두 상보적으로 결합하는 역프라이머를 이용하여 제2 ss-PCR 산물을 얻는 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계(ss-PCR); 및

상기 제1 ss-PCR 산물 및 제2 ss-PCR 산물을 전기 영동하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제9항에 있어서,

상기 MC1R 유전자의 변이부분의 코돈부위는 제99번째 또는 제104번째 코돈인 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제10항에 있어서,

상기 MC1R 유전자의 변이부분의 코돈부위는 제99번째 코돈인 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제9항에 있어서,

상기 a)에서 사용되는 전방 프라이머는 염기서열 3으로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제9항에 있어서,

상기 c)에서 사용되는 전방 프라이머는 염기서열 4로 표시되는 서열부분 중 적어도 3'말단 부위를 포함하는 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제9항에 있어서,

상기 b) 및 d)에서 사용되는 역 프라이머는 염기서열 5로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제9항에 있어서,

상기 제1 염기특이-중합효소연쇄반응단계와 제2 염기특이-중합효소연쇄반응단계 중 어느 하나 이상의 단계에, 대조군으로서 한우와 비한우의 변이부분의 코돈부위 모두에 상보적으로 결합하는 전방 프라이머를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.
제15항에 있어서,

상기 전방 프라이머는 염기서열 2로 표시되는 서열부분의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법.