KR20230073565A - 흑모형질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 흑모형질 연관 유전자를 분자마커로 이용하여 난축맛돈 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 외형적으로 흑모색을 띄는 이형접합체 흑돼지 개체와 구분할 수 있으며, 전신흑모색 유전자형이 고정된 난축맛돈 품종을 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 외형적으로 흑모색을 띄는 이형접합체 흑돼지 개체와 구분할 수 있으며, 전신흑모색 유전자형이 고정된 난축맛돈 품종을 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 흑모형질 연관 유전자를 분자마커로 이용하여 난축맛돈 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
돼지 산업은 주로 고기의 양(quantity)과 관련된 생산성 향상과 신선육 유통에 초점이 맞춰져 왔으며, 이는 돼지고기 품질의 감소를 수반하여 왔다(Cameron, 1990, Cliplef and McKay, 1993). 우리나라의 경우 돼지고기 소비 패턴은 구이와 수육이 대부분을 차지하고 있어 신선육을 많이 소비하고 있다. 기본적으로, 육질의 소비자 인식은 고기 구입에 중요한 선택 기준이다. 그러나 불균일한 고기품질은 소비자 신뢰도를 떨어뜨리고 좋은 고기를 선택하고자 하는 소비자의 의지를 감소시킨다(Jung et al., 2011). 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해, 산업 분야에서는 최상의 돼지고기 품질에 대한 소비자의 요구를 만족하는 육질형질 개량 시스템을 개발하였다(Lee et al., 2012).
흑돼지 고기에 대한 선호도는 부분적으로 고품질의 돼지고기에 대한 소비자의 수요 증가에 기인한다. 그러나, 불충분한 공급은 현재 소비를 증가시키는 장애물이 되고 있다. 이러한 소비자 기대 상승은 궁극적으로 개선된 돼지고기의 생산성과 품질에 대한 사육 및 관리 기술을 개선하기 위해 활발한 유전학 기반의 연구를 촉발시키고 있다.
본 발명자들은 앞서, 제주재래흑돼지와 개량종을 교배하여 생산한 1세대 자손 및 1세대 자손과 개량종간 누진교배하여, 육질형질, 흑모형질 및 육량형질 연관 유전자의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 형질을 고정하는 단계를 포함하는 개발방법으로 육질과 육량이 향상된 전신흑모색 난축맛돈을 독자적으로 개발하였다.
상기 난축맛돈의 품종을 흑모형질 연관 유전자를 이용하여 유전자 진단으로 수입개량종과 구분하여 정확하게 판별할 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는, 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 키트와 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 제 4 프라이머 세트를 포함하는, 전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트이다.
상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 KIT 유전자 인트론17(intron17) 영역의 NlaⅢ 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MC1R 유전자의 HhaI 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 7로 표시되는 KIT 유전자 엑손2(exon2) 영역의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하고, 상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 12로 표시되는 KIT 유전자 엑손3(exon2) 영역의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 돼지 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 1 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 유색인자 유무를 판단하는 단계; (c) 상기 단계(b)에서 얻은 유색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 흑모색인자 유무를 판단하는 단계; (d) 상기 단계(c)에서 얻은 흑모색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 전신흑모색인자 대립유전자형을 결정하는 단계;및 (e) 상기 단계(d)에서 얻은 전신흑모색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 제주재래돼지 특이인자대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법이다.
상기 단계(b)의 유색인자는 서열번호 1로 표시되는 KIT_intron17 유전자를 증폭한 산물에서 NlaⅢ 제한효소로 처리하고 상기 NlaⅢ 제한효소에 의해 절단되지 않은 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 단계(c)의 흑모색인자는 서열번호 4로 표시되는 MC1R 유전자를 증폭한 산물에서 HhaI 제한효소로 처리하고 상기 HhaI 제한효소에 의해 절단된 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 단계(d)의 제주재래돼지 특이인자는 서열번호 7로 표시되는 KIT_exon2 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호10 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 GG형인 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 KIT_exon2 유전자의 SNP는 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 214번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 214번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 단계(e)의 전신흑모색인자는 서열번호 12으로 표시되는 KIT_exon3 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 AA형인 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 KIT_exon3 유전자의 SNP는 서열번호 12으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 224번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 224번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 제 4 프라이머 세트를 포함하는 전신흑모색 난축맛돈 판별용 키트이다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 제 4 프라이머 세트를 포함하는 전신흑모색 난축맛돈 판별용 조성물이다.
본 발명에 따른 전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 외형적으로 흑모색을 띄는 이형접합체 흑돼지 개체와 구분할 수 있으며, 전신흑모색 유전자형이 고정된 난축맛돈 품종을 판별할 수 있다.
도 1은 흑모형질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 KIT_intron17 유전자의 염기서열(서열번호 1) 및 G/A 변이위치를 나타낸 것이다.
도 3은 KIT_intron17 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MC1R 유전자의 프로모터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 7)및 적색형질 유전변이 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 MC1R 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 KIT_exon2 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 7)을 나타낸 것이다.
도 7은 KIT_exon2 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 유전자형별 피크를 나타낸 것이다.
도 8은 KIT_exon3 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 12)을 나타낸 것이다.
도 9는 KIT_exon3 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 유전자형별 피크를 나타낸 것이다.
도 2는 KIT_intron17 유전자의 염기서열(서열번호 1) 및 G/A 변이위치를 나타낸 것이다.
도 3은 KIT_intron17 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MC1R 유전자의 프로모터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 7)및 적색형질 유전변이 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 MC1R 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 KIT_exon2 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 7)을 나타낸 것이다.
도 7은 KIT_exon2 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 유전자형별 피크를 나타낸 것이다.
도 8은 KIT_exon3 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 12)을 나타낸 것이다.
도 9는 KIT_exon3 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 유전자형별 피크를 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 제 4 프라이머 세트를 포함하는, 전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
"프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.
프라이머는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 10 내지 100bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 “전신흑모색”은 돼지의 털색에 영향을 주는 흑모형질 연관유전자에서 특정 SNP를 고정하여 백색 또는 적색 등의 유색의 털을 가진 개량종과 교배하였을 때 흑색의 털을 가진 개체를 선발하고, 외형적으로 흑색을 나타내는 이형접합체 흑돼지와 구분되어 전신흑모색 유전자형이 고정된 개체가 가진 표현형을 의미한다.
상기 흑모형질에 영향을 주는 연관 유전자는 KIT(Mast/Stem Cell Growth Factor Receptor KIT) 유전자 및 MC1R(Melanocortin 1 Receptor) 유전자일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
“KIT 유전자”는 사이토카인 KITLG/SCF에 대한 세포 표면 수용체로 작용하고 티로신-단백질 키나제를 암호화하여 멜라닌 생성의 조절에 필수적인 역할을 한다. 상기 KIT 유전자의 인트론17번 영역의 시작부위에서 G(유색) 또는 A(백색)의 유전변이를 확인할 수 있다. 또한, 백색돼지의 KIT 유전자는 2개 이상의 유전자가 중복되는 특성(CNV, copy number variation)을 갖고 있으나, 흑색과 적색 등 유색을 나타내는 돼지는 한 개의 KIT 유전자만 보유하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 전신흑모색 난축맛돈은 KIT 유전자 mRNA 서열기준으로 개시코돈(ATG)으로부터 엑손2 영역 120번째 T/G 변이 중 G 유전자형을 고정하고, 개시코돈(ATG)으로부터 엑손3 영역 518번째 G/A 변이 중 A 유전자형으로 고정하면, 돼지의 전신에 흑모색 털의 표현형을 나타낼 수 있다.
“MC1R 유전자”는 멜라노코르틴 1 수용체(Melanocortin 1 Receptor) 단백질을 암호화하며, 상기 MC1R 유전자 mRNA 서열기준으로 개시코돈(ATG)으로부터 727번째 G/A 변이 중 G 유전자형이 고정될 때, 전신의 흑모색 털을 나타낼 수 있다.
본 발명의 제 1 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 KIT 유전자 인트론17 영역의 NlaⅢ 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MC1R 유전자의 HhaI 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 7로 표시되는 KIT 유전자 엑손2 영역의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하고, 상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 12로 표시되는 KIT 유전자 엑손3 영역의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하는 것 수 있다.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele) 가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게 는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입 을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5' 또는 3' 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.
본 발명에 있어서, 돼지의 전신흑모색 형질에 영향을 미치는 SNP를 증폭 또는 검출할 수 있는 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 프라이머쌍을 포함할 수 있으며, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 15 및 서열번호 16로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는 전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 대요크셔, 랜드레이스, 두록, 버크셔 등의 수입개량종과 난축맛돈 품종을 유전자 진단에 의해 완벽하게 판별할 수 있으며, 구체적인 방법은 하기와 같다.
(a) 돼지 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 1 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 유색인자 유무를 판단하는 단계; (c) 상기 단계(b)에서 얻은 유색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 흑모색인자 유무를 판단하는 단계; (d) 상기 단계(c)에서 얻은 흑모색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 전신흑모색인자 대립유전자형을 결정하는 단계;및 (e) 상기 단계(d)에서 얻은 전신흑모색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 제주재래돼지 특이인자대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법이다.
본 발명의 증폭된 산물을 분석하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, AffymetrixGeneChip), 및 BeadArrayTechnologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
PCR-RFLP 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.
본 발명에서는 증폭 산물 확인을 위해 겔 전기영동법을 이용하여 수행하였으나, 이에 한정되지 않고, 증폭 표적 서열에 검출 가능한 표지 물질을 표지하여 검출할 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 돼지의 흑모형질 연관 유전자를 통해 난축맛돈을 판단하는 데 사용되는 돼지는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 제주재래돼지 및 수입개량종(대요크셔, 두록, 버크셔, 랜드레이스 등) 교잡종일 수 있다.
상기 단계(b)의 유색인자는 서열번호 1로 표시되는 KIT 유전자를 증폭한 산물에서 NlaⅢ 제한효소로 처리하고 상기 NlaⅢ 제한효소에 의해 절단되지 않은 산물을 구분하는 것으로, 절단된 밴드가 확인된 품종은 백색 품종이고 절단되지 않은 밴드가 확인된 품종은 유색품종으로 판별할 수 있다.
상기 단계(c)의 흑모색인자는 서열번호 4로 표시되는 MC1R 유전자를 증폭한 산물에서 HhaI 제한효소로 처리하고 상기 HhaI 제한효소에 의해 절단된 산물을 구분하는 것으로, 절단된 밴드가 확인되면 유색 품종인 버크셔, 한국재래돼지, 난축맛돈으로 판별하고, 절단되지 않은 밴드가 확인되면 적색의 두록 품종으로 판별할 수 있다. 적색은 타품종과 교배시 완전 열성으로 작용하므로 외형적으로 흑모색을 나타내더라도 흑모색이 고정된 개체인지 이형접합체 개체인지 판별이 가능하다.
상기 단계(d)의 제주재래돼지 특이인자는 서열번호 7로 표시되는 KIT_exon2 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호10 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 GG형인 산물을 구분하는 것으로, G 유전자형을 가지면 전신흑모색을 가진 재래돼지의 특이SNP 가 고정된 것으로 판별할 수 있다.
상기 KIT_exon2 유전자의 SNP는 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 214번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 214번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 단계(e)의 전신흑모색인자는 서열번호 12으로 표시되는 KIT_exon3 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 AA형인 산물을 구분하는 것으로, A 유전자형을 가지면 전신흑모색을 가진 재래돼지의 특이SNP 가 고정된 것으로 판별할 수 있다
상기 KIT_exon3 유전자의 SNP는 서열번호 12으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 224번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 224번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 키트에 관한 것이다. 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 PCR 키트는, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레 오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하고, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 : GWAS 분석에서 확인된 흑모형질 연관 유전자
제주재래흑돼지와 랜드레이스 교배 참조축군 및 제주재래흑돼지와 두록 교배 참조축군에서 대용량 SNP chip을 이용하여 흑모형질에 대한 GWAS(Genome-wide association study) 및 유전자영역(QTL)을 분석하였다.
백색과 유색, 적색과 나머지 색, 전신흑모색 및 제주재래돼지 특이서열의 결정과 관련된 SNP 유전자의 좌위를 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.
실시예 2 : 전신흑모색 난축맛돈 판별
도 1은 흑모형질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별 방법을 나타낸 모식도이다.
2-1. KIT_intron17 의 SNP 발현분석
돼지의 게놈DNA 상에 위치하는 모색관련 유전자 중 KIT는 돼지의 백색과 유색을 조절하는 유전자이며, 이 유전자의 인트론17(intron17)에서 나타나는 스플라이싱(splicing) 변이와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다.
도 2는 KIT_intron17 유전자의 염기서열(서열번호 1) 및 G/A 변이위치를 나타낸 것이다. 도 2를 참고하면, KIT_intron17 유전자 서열에서 인트론 17번 시작부위에서 염기서열이 G(유색) 또는 A(백색)의 유전변이를 확인할 수 있다.
상기 KIT_intron17 의 SNP(KIT_int17_1G>A) 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.
서열번호 2: KIT_int17_1F(21mer): GTA-TTC-ACA-GAG-ACT-TGG-CGG
서열번호 3: KIT_int17_1R(26mer): AAA-CCT-GCA-AGG-AAA-ATC-CTT-CAC-GG
상기 서열번호 2를 정방향 프라이머, 서열번호 3을 역방향 프라이머로 이용하는 제 1 프라이머 세트를 제작하고, PCR 증폭(PCR 조건 : 94℃ 45sec, 58℃ 45sec, 72℃ 60sec / 30 cycles)에 이용하였다.
두록(D) 2두, 버크셔(B) 2두, 랜드레이스(L) 1두, 대요크셔(Y) 1두, 난축맛돈(N) 1두, 재래돼지(K) 1두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 1.5% 아가로스겔에서 20분간 전기영동을 수행하여 PCR 산물 크기를 166bp로 증폭하였다.
상기 증폭산물에 제한효소 NlaⅢ 을 처리하고 3.0% 아가로스겔에서 30분간 다시 전기영동하였다.
도 3은 KIT_intron17 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 3을 참고하면, 절단된 밴드가 확인된 품종은 백색 품종인 랜드레이스 및 대요크셔로 확인되고, 절단되지 않은 밴드가 확인된 품종은 두록, 버크셔, 난축맛돈, 재래돼지 등의 유색품종으로 확인되었다.
따라서, KIT_intron17 유전자를 증폭하고 NlaⅢ 제한효소에 의해 절단되지 않으면 적색, 흑색 등의 유색품종으로 판별할 수 있다.
2-2. MC1R 유전자내 SNP 발현분석
실시예 2-1에서 KIT_intron17 유전자 내 SNP를 증폭하여 제한효소에 의해절단되지 않은 유색품종을 선발해 내고, 전신흑모색을 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 PCR-RFLP 방법으로 MC1R 유전자의 발현을 분석하였다.
도 4는 MC1R 유전자의 프로모터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 4)및 적색형질 유전변이 위치를 나타낸 것이다. 도 4를 참고하면, MC1R 유전자 내 다형성 부위(c.727G>A))에 제한효소 인지부위인 GCG/C 서열에서 G/A 변이를 확인하였다.
상기 MC1R 유전자의 프로포터 영역 내 GCG/C 서열의 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.
서열번호 5: PMC1R_1F(21mer): GCT-CCA-CAA-GAC-GCA-GCA-CCC
서열번호 6: PMC1R_1F(23mer): GCC-AGA-AAG-AGG-TTG-ACG-TTC-TT
상기 서열번호 5를 정방향 프라이머, 서열번호 6을 역방향 프라이머로 이용하는 제 2 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 68℃ 1min, 72℃ 30sec / 30 cycles)에 이용하였다.
재래돼지 2두, 이형접합체 2두, 두록 2두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 68℃에서 1분, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여, PCR 산물 크기를 186bp로 증폭하였다. 상기 증폭산물에 제한효소 HhaI 을 처리하고 2.0% 아가로스겔에서 25분간 다시 전기영동하였다.
도 5는 MC1R 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 5a를 참고하면, A유전자형을 나타내는 두록은 HhaI 제한효소에 의해 절단되지 않았으며, G유전자형을 가진 나머지 유색 품종은 HhaI 제한효소에 의해 절단된 양상을 나타냈다.
랜드레이스, 대요크셔, 두록, 버크셔, 재래돼지, 난축맛돈 각각 40두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 상기 증폭산물에 제한효소 HhaI 을 처리하고 2.0% 아가로스겔에서 25분간 다시 전기영동하였다.
도 5b를 참고하면, 두록은 제한효소 HhaI 에 의해 절단되지 않은 186bp의 밴드를 생성하고, 나머지 품종은 137bp의 절단된 밴드를 생성하였다.
MC1R 유전자는 엑손이 한 개인 유전자로 개시코돈(ATG)으로부터 727번째 염기변이는 적색을 식별하는 위치이고, 제주재래돼지와 두록을 교배하여 나온 2세대 자손에서 전신흑모색을 나타내는 윈인에 해당하는 변이이다. 이는 적색은 타품종과 교배시 완전 열성으로 작용하므로 외형적으로 흑모색을 나타내더라도 흑모색이 고정된 개체인지 이형접합체 개체인지 판별이 가능함을 나타낸다.
2-3. KIT_exon2 유전자내 SNP 발현분석
KIT_exon2 유전자 내 다형성 부위(c.120T>G)에서 전신흑모색을 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 Pyro-sequencing 방법으로 발현을 분석하였다.
도 6은 KIT_exon2 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 7)을 나타낸 것이다. 도 6을 참고하면, 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 214번째 염기에서 T/G 변이를 확인하였다. 이는 KIT 유전자 mRNA 서열기준으로 개시코돈(ATG)으로부터 120번째 T/G 변이와 동일하다.
상기 변이영역에는 제한효소 인지부위가 없어 Pyro-sequencing 방법으로 변이영역에 대한 대립유전자형을 분석하였다. KIT_exon2 유전자의 프로포터 영역 내 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 하기와 같이 제작하였다.
서열번호 8: KIT_ex2_pyro_1F: CAC-AGA-ACC-CTT-GCA-CCA-TA
서열번호 9: KIT_ex2_pyro_1R: biotin-CTC-TGC-TTT-CTC-CAC-GAT-CC
서열번호 10: KIT_ex2_MINI1: ACT-GTC-TCC-ACC-ATC-CAT-CC
서열번호 11: 입력1 A[T/G]CCAGCAAAATCAGAGTTAAT
상기 서열번호 8을 정방향 프라이머, 서열번호 9를 역방향 프라이머로 이용하는 제 3 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 58℃ 45sec, 72℃ 30sec / 30 cycles)에 이용하였다.
PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 63℃에서 30초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여 PCR 산물을 346bp로 증폭하였다. 증폭산물을 대상으로 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 유전자형을 검출하였다.
도 7은 KIT_exon2 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 유전자형별 피크를 나타낸 것이다. 도 7을 참고하면, 유전자형이 GG, GT 및 TT로 확인되며, 전신흑모색을 가진 품종은 GG 유전자형으로 나타남을 확인하였다.
KIT 유전자 mRNA 서열기준으로 개시코돈(ATG)으로부터 120번째 T/G 변이는 흑색의 제주재래돼지와 백색의 랜드레이스 품종을 교배한 2세대 이후 자손에서 전신흑모색을 나타내는 원인 SNP에 해당한다. 즉, GG 유전자형이면 전신흑모색을 나타내며 백색의 랜드레이스를 비롯한 다른 유색의 수입개량종과도 확연히 구분할 수 있다. 난축맛돈은 제주재래돼지의 전신흑모색 유전자형을 도입하여 제조되었기 때문에 상기 KIT_exon2 유전자의 SNP를 특이적으로 검출하여 난축맛돈 품종의 판별이 가능하다.
2-4. KIT_exon3 유전자내 SNP 발현분석
KIT_exon3 유전자 내 다형성 부위(c.518G>A)에서 전신흑모색을 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 Pyro-sequencing 방법으로 발현을 분석하였다.
도 8은 KIT_exon3 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 12)을 나타낸 것이다. 도 8을 참고하면, 서열번호 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 224번째 염기에서 G/A 변이를 확인하였다. 이는 KIT 유전자 mRNA 서열기준으로 개시코돈(ATG)으로부터 518번째 G/A 변이와 동일하다.
상기 변이영역에는 제한효소 인지부위가 없어 Pyro-sequencing 방법으로 변이영역에 대한 대립유전자형을 분석하였다. KIT_exon3 유전자의 프로포터 영역 내 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 하기와 같이 제작하였다.
서열번호 13: KIT_ex3_pyro_1F(20mer): biotin-GGC-CAT-TCA-AAC-TCC-TGA-TT
서열번호 14: KIT_ex3_pyro_1R(20mer): CAG-AAG-CAA-GCC-AGC-AAG-AG
서열번호 15: KIT_ex3_MINI(20mer): GAT-ACT-CGC-GCT-TCA-CGT-TT
서열번호 16: 입력: [C/T]TGATGGTGATGCC
상기 서열번호 13을 정방향 프라이머, 서열번호 14를 역방향 프라이머로 이용하는 제 4 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 58℃ 45sec, 72℃ 30sec / 30 cycles)에 이용하였다.
PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 58℃에서 45초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여 PCR 산물을 344bp로 증폭하였다. 증폭산물을 대상으로 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 유전자형을 검출하였다.
도 9는 KIT_exon3 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물 및 유전자형별 피크를 나타낸 것이다. 도 9를 참고하면, 유전자형이 AA, AG 및 GG로 확인되며, 제주재래돼지의 전신흑모색을 나타내는 특이 SNP를 가진 난축맛돈 품종은 AA 유전자형으로 나타남을 확인하였다.
KIT 유전자 mRNA 서열기준으로 개시코돈(ATG)으로부터 엑손3 영역 518번째 A/G 변이는 한국재래돼지를 식별할 수 있는 특이 서열이다. 난축맛돈은 재래돼지에서 유래한 품종으로 상기 KIT_exon3 유전자의 SNP를 특이적으로 검출하여 난축맛돈 품종의 판별이 가능하다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Primer set for discriminating Nanchukmacdon using a black coat
colour gene and use thereof
<130> DP20210278
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 191
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_intron17
<400> 1
cctaacagtg tattcacaga gacttggcgg ccagaaatat cctccttact catggtcgaa 60
tcacaaagat ttgtgatttt ggtctagcca gagacatcaa gaatgattct aattacgtgg 120
tcaaaggaaa cntgagtacc cacgctctcc tgacagtccc gtgaaggatt ttccttgcag 180
gttttcttaa g 191
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_int17_1F
<400> 2
gtattcacag agacttggcg g 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_int17_1R
<400> 3
aaacctgcaa ggaaaatcct tcacgg 26
<210> 4
<211> 214
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MC1R
<400> 4
catcgcccgg ctccacaaga cgcagcaccc cacccgccag ggctgcggcc tcaagggcnc 60
ggccaccctc accatcctgc tgggcgtctt cctcctctgc tgggcaccct tcttcctgca 120
cctctccctc gtcgtcctct gcccccagca ccccacctgc ggctgcgtct tcaagaacgt 180
caacctcttt ctggccctcg tcatctgcaa ctcc 214
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PMC1R_1F
<400> 5
gctccacaag acgcagcacc c 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PMC1R_1F
<400> 6
gccagaaaga ggttgacgtt ctt 23
<210> 7
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_exon2
<400> 7
ttagaaactt tacacagaac ccttgcacca taaatagctg gacagctttg tcctattttt 60
attgtcgagt acacagaaga tggaaatcaa tattggaaga aatgctttat ttcgccagag 120
aaaaagatca tgttcaacac gattttcctc tttcttggca ggctcttctc agccatctgt 180
gagtccagag gaactgtctc caccatccat ccanccagca aaatcagagt taatcgtcag 240
tgctggcgat gagattaggc tgttctgcac cgatccagga tctgtcaaat ggacttttga 300
gaccctgggt cagctgagtg agaatacaca cgcagagtgg atcgtggaga aagcagaggc 360
catgaataca 370
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex2_pyro_1F
<400> 8
cacagaaccc ttgcaccata 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex2_pyro_1R
<400> 9
ctctgctttc tccacgatcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex2_MINI1
<400> 10
actgtctcca ccatccatcc 20
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex2_INSERT
<400> 11
anccagcaaa atcagagtta at 22
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_exon3
<400> 12
ctgtgaccgg ccattcaaac tcctgattgt tgatatgctg cagatcctga gaagcttttc 60
ctcgtcgacc ctcccttgta tgggaaggag gacaatgacg cgctggtccg atgtcctctg 120
acggacccag aggtgaccaa ttactccctc acgggctgcg aggggaaacc ccttcccaag 180
gatttgacct tcgtcgcgga ccccaaggcc ggcatcacca tcanaaacgt gaagcgcgag 240
tatcatcggc tctgtctcca ctgctccgcc aaccaggggg gcaagtccgt gctgtcgaag 300
aaattcaccc tgaaagtgag ggcaggtacg agctcttgct ggcttgcttc tgggagctgg 360
360
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex3_pyro_1F
<400> 13
ggccattcaa actcctgatt 20
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex3_pyro_1R
<400> 14
cagaagcaag ccagcaagag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex3_MINI
<400> 15
gatactcgcg cttcacgttt 20
<210> 16
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KIT_ex3_INSERT
<400> 16
ntgatggtga tgcc 14
Claims (11)
- 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트;
서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트;
서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 및
서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 제 4 프라이머 세트를 포함하는,
전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트. - 제 1항에 있어서,
상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 KIT 유전자 인트론17 (intron17) 영역의 NlaⅢ 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,
상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MC1R 유전자의 HhaI 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,
상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 7로 표시되는 KIT 유전자 엑손2(exon2) 영역의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하고,
상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 12로 표시되는 KIT 유전자 엑손3(exon3) 영역의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하는 것을 특징으로 하는,
전신흑모색 난축맛돈 판별용 프라이머 세트. - (a) 돼지 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 1 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 유색인자 유무를 판단하는 단계;
(c) 상기 단계(b)에서 얻은 유색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 흑모색인자 유무를 판단하는 단계;
(d) 상기 단계(c)에서 얻은 흑모색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 전신흑모색인자 대립유전자형을 결정하는 단계;및
(e) 상기 단계(d)에서 얻은 전신흑모색인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 제주재래돼지 특이인자대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(b)의 유색인자는 서열번호 1로 표시되는 KIT_intron17 유전자를 증폭한 산물에서 NlaⅢ 제한효소로 처리하고 상기 NlaⅢ 제한효소에 의해 절단되지 않은 산물을 구분하는 것인,
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(c)의 흑모색인자는 서열번호 4로 표시되는 MC1R 유전자를 증폭한 산물에서 HhaI 제한효소로 처리하고 상기 HhaI 제한효소에 의해 절단된 산물을 구분하는 것인,
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(d)의 제주재래돼지 특이인자는 서열번호 7로 표시되는 KIT_ exon2 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호10 및 서열번호 11로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 GG형인 산물을 구분하는 것인,
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 6항에 있어서,
상기 KIT_exon2 유전자의 SNP는 서열번호 7로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 214번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 214번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인,
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(e)의 전신흑모색인자는 서열번호 12으로 표시되는 KIT_exon3 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 AA형인 산물을 구분하는 것인,
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 8항에 있어서,
상기 KIT_ exon3 유전자의 SNP는 서열번호 12으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 224번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 224번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인,
전신흑모색 난축맛돈의 판별 방법. - 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 전신흑모색 난축맛돈 판별용 키트.
- 제 1항의 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 전신흑모색 난축맛돈 판별용 조성물.
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|---|---|---|---|---|
| KR101686438B1 (ko) | 2014-11-13 | 2016-12-15 | 대한민국 | 육질 및 스트레스에 대한 내성이 강화된 흑돼지 및 그의 제조방법 |
-
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