KR20230073564A - 육질형질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 육질형질 연관 유전자를 분자마커로 이용하여 난축맛돈 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 개량종의 우수한 특징인 생산성이 향상되면서도, 제주재래돼지의 우수한 고육질인자를 가진 난축맛돈의 특이적인 표현형질을 정확하게 구분할 수 있으며, 고육질인자가 고정된 난축맛돈 품종의 생산에 기여할 수 있다.
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Description
본 발명은 육질형질 연관 유전자를 분자마커로 이용하여 난축맛돈 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
돼지 산업은 주로 고기의 양(quantity)과 관련된 생산성 향상과 신선육 유통에 초점이 맞춰져 왔으며, 이는 돼지고기 품질의 감소를 수반하여 왔다(Cameron, 1990, Cliplef and McKay, 1993). 우리나라의 경우 돼지고기 소비 패턴은 구이와 수육이 대부분을 차지하고 있어 신선육을 많이 소비하고 있다. 기본적으로, 육질의 소비자 인식은 고기 구입에 중요한 선택 기준이다. 그러나 불균일한 고기품질은 소비자 신뢰도를 떨어뜨리고 좋은 고기를 선택하고자 하는 소비자의 의지를 감소시킨다(Jung et al., 2011). 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해, 산업 분야에서는 최상의 돼지고기 품질에 대한 소비자의 요구를 만족하는 육질형질 개량 시스템을 개발하였다(Lee et al., 2012).
흑돼지 고기에 대한 선호도는 부분적으로 고품질의 돼지고기에 대한 소비자의 수요 증가에 기인한다. 그러나, 불충분한 공급은 현재 소비를 증가시키는 장애물이 되고 있다. 이러한 소비자 기대 상승은 궁극적으로 개선된 돼지고기의 생산성과 품질에 대한 사육 및 관리 기술을 개선하기 위해 활발한 유전학 기반의 연구를 촉발시키고 있다.
본 발명자들은 앞서, 제주재래흑돼지와 개량종을 교배하여 생산한 자손과개량종간 누진교배하여, 육질형질, 육량형질 및 흑모형질 연관 유전자의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 고정하는 단계를 포함하는 개발방법으로 육질과 육량이 향상된 전신흑모색 난축맛돈을 독자적으로 개발하였다.
상기 난축맛돈의 품종을 육질형질 연관 유전자를 이용하여 유전자 진단으로 수입개량종과 구분하여 정확하게 판별할 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트; 및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는, 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 키트와 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트; 및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는, 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트이다.
상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 염기 결손(delection) 변이를 특이적으로 검출하고, 상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 HpyCH4Ⅳ 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 7로 표시되는 MYH1 유전자의 BspHI 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 10으로 표시되는 MYH4 유전자의 TaqⅠ제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,상기 제 5 프라이머 세트는 서열번호 13으로 표시되는 GAS7 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 돼지 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 1 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계; (c) 상기 단계(b)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계; (d) 상기 단계(c)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계; (e) 상기 단계(d)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;및 (f) 상기 단계(e)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 5 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 대립유전자형을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계(b)의 고육질인자는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 염기 결손에 의한 변이를 검출하는 것일 수 있다.
상기 단계(c)의 고육질인자는 상기 염기결손 변이를 가진 DNA 서열을 포함하는 MYH3 유전자를 증폭한 산물에서 HpyCH4Ⅳ 제한효소로 처리하고 상기 HpyCH4Ⅳ 제한효소에 의해 절단된 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 단계(d)의 고육질인자는 서열번호 7로 표시되는 MYH1 유전자를 증폭한 산물에서 BspHI 제한효소로 처리하고 상기 BspHI 제한효소에 의해 절단되지 않은 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 단계(e)의 고육질인자는 서열번호 10으로 표시되는 MYH4 유전자를 증폭한 산물에서 TaqⅠ 제한효소로 처리하고 상기 TaqⅠ 제한효소에 의해 356bp에서 밴드가 확인되는 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 단계(f)의 고육질인자는 서열번호 13으로 표시되는 GAS7 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호 16 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 GG형인 산물을 구분하는 것일 수 있다.
상기 GAS7 유전자의 SNP는 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 138번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 138번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는 고율직형 난축맛돈 판별용 키트이다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 조성물이다.
본 발명에 따른 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 개량종의 우수한 특징인 생산성이 향상되면서도, 제주재래돼지의 우수한 고육질인자를 가진 난축맛돈의 특이적인 표현형질을 정확하게 구분할 수 있으며, 고육질인자가 고정된 난축맛돈 품종의 생산에 기여할 수 있다.
도 1은 육질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 난축맛돈과 랜드레이스의 염기결손 유무의 차이를 나타낸 것이다.
도 3은 MYH3 유전자 내 다형성 부위(g.-1805_-1810)의 염기 결손에 따른 밴드 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 MYH3 유전자 내 육질형질 연관 유전변이 위치 확인용 염기서열 해독(a) 및 MYH3 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(b)을 나타낸 것이다.
도 5는 MYH3 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 MYH1 유전자 내 육질형질 연관 유전변이 위치 확인용 염기서열 해독(a) 및 MYH1 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(b)을 나타낸 것이다.
도 7은 MYH1 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 MYH4 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 10)을 나타낸 것이다.
도 9는 MYH4 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 GAS7 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 13)을 나타낸 것이다.
도 11은 GAS7 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 난축맛돈과 랜드레이스의 염기결손 유무의 차이를 나타낸 것이다.
도 3은 MYH3 유전자 내 다형성 부위(g.-1805_-1810)의 염기 결손에 따른 밴드 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 MYH3 유전자 내 육질형질 연관 유전변이 위치 확인용 염기서열 해독(a) 및 MYH3 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(b)을 나타낸 것이다.
도 5는 MYH3 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 MYH1 유전자 내 육질형질 연관 유전변이 위치 확인용 염기서열 해독(a) 및 MYH1 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(b)을 나타낸 것이다.
도 7은 MYH1 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 MYH4 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 10)을 나타낸 것이다.
도 9는 MYH4 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 GAS7 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 13)을 나타낸 것이다.
도 11은 GAS7 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는, 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
"프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형이 가능하다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제작하여 사용할 수 있다.
프라이머는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 10 내지 500bp의 길이로 사용할 수 있다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 “고육질형”은 돼지로부터 얻어진 도축물의 상태를 나타내는 다양한 표현형질 중 우수한 육질형질을 나타냄을 의미한다. 육질형질은 예를 들어 마블링, 육색, 보수력, 전단력, 근내지방함량, 적색근, 등심단면적, 지방산 조성, 경지방 조성 등과 같은 육품질일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 근내지방함량이 증가하고 적색근 비율이 증가하여 등심단면적이 축소되며 붉은 육색을 띄면서 포화지방산은 감소하고 불포화지방산 함량이 증가된 것을 고육질형으로 구분할 수 있다.
상기 육질형질에 영향을 주는 연관 유전자는 MYH3(Myosin Heavy chain 3) 유전자, MYH1(Myosin Heavy chain 1) 유전자, MYH4(Myosin Heavy chain 4) 유전자 및 GAS7(Growth Arrest Specific 7) 유전자일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제 1 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 염기 결손(delection) 변이를 특이적으로 검출하고, 제 2 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 HpyCH4Ⅳ 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 제 3 프라이머 세트는 서열번호 7로 표시되는 MYH1 유전자의 BspHI 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 제 4 프라이머 세트는 서열번호 10으로 표시되는 MYH4 유전자의 TaqⅠ제한효소 인지부위 서열을 증폭하고, 제 5 프라이머 세트는 서열번호 13으로 표시되는 GAS7 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하는 것일 수 있다.
“MYH3 유전자”, “MYH1 유전자” 및 “MYH4 유전자”는 수축성 단백질의 일종인 미오신을 암호화하는 유전자로 각각 미오신 중쇄3(Myosin Heavy chain 3) 단백질, 미오신 중쇄1(Myosin Heavy chain 1) 및 미오신 중쇄4(Myosin Heavy chain 4) 단백질을 암호화하며, 근육 발달 중에 발현되는 골격근 특이적 수축에 관여한다.
상기 MYH3 유전자의 프로모터 영역에서 개시코돈(ATG)으로부터 상류(upstream)로 1805번째부터 1810번째(g.-1805_-1810)의 6개 염기서열이 결손(delection)되면 고육질형인자를 포함하고 있는 것으로 판단할 수 있다. 그런데, 랜드레이스, 두록, 버크셔 등의 수입 개량종에서도 MYH3 유전자 내에 6bp 염기결손을 가진 개체가 20-30% 존재하기 때문에, 해당 -6bp 결손영역에서 제한효소로 처리하였을 때 절단양상을 통해 고육질형과 저육질형을 구분할 수 있다.
즉, MYH3 유전자 내에 6bp 염기결손이 있으면서 제한효소에 의해 절단되어 해당 결손영역에 ACGT서열의 C/G 변이 중 C 유전자형으로 고정되는 경우 고육질형 난축맛돈으로 판별할 수 있다.
또한, MYH1 유전자 및 MYH4 유전자 내 제한효소 인지부위를 증폭하는 프라이머를 제작하고, 증폭 산물을 제한효소 처리하였을 때 절단양상을 통해 고육질형과 저육질형을 구분할 수 있다.
“GAS7 유전자”는 성장정지특이단백질7(Growth Arrest Specific protein 7)를 암호화하며 지방산 조성 및 불포화지방산의 합성에 관여한다. 수입개량종과 난축맛돈의 지방산 조성 차이는 상기 GAS7 유전자 변이에 의한 것일 수 있다.
상기 GAS7 유전자의 변이영역은 제한효소 인지부위가 없어 파이로시퀀싱(pyro-sequencing) 방법으로 변이영역의 유전자형을 분석한 결과 AA, AG 및 GG 3개의 유전자형이 확인되었으며 수입개량종은 AA 유전자형, 난축맛돈은 GG 유전자형일 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 15 및 서열번호 16로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트를 이용하여 대요크셔, 랜드레이스, 두록, 버크셔 등의 수입개량종과 난축맛돈 품종을 유전자 진단에 의해 완벽하게 판별할 수 있으며, 구체적인 방법은 하기와 같다.
(a) 돼지 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 1 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계; (c) 상기 단계(b)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계; (d) 상기 단계(c)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계; (e) 상기 단계(d)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;및 (f) 상기 단계(e)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 5 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;를 포함하는, 고육질형 난축맛돈의 판별 방법이다.
본 발명의 증폭된 산물을 분석하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, AffymetrixGeneChip), 및 BeadArrayTechnologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
PCR-RFLP 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.
본 발명에서는 증폭 산물 확인을 위해 겔 전기영동법을 이용하여 수행하였으나, 이에 한정되지 않고, 증폭 표적 서열에 검출 가능한 표지 물질을 표지하여 검출할 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 돼지의 흑모형질 연관 유전자를 통해 난축맛돈을 판단하는 데 사용되는 돼지는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 제주재래돼지 및 수입개량종(대요크셔, 두록, 버크셔, 랜드레이스 등) 교잡종일 수 있다.
상기 단계(b)의 고육질인자는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 염기 결손에 의한 변이를 검출하고, 6bp 염기결손을 나타내는 것일 수 있다. 상기 6bp 염기결손은 상술한 바와 같다.
상기 단계(c)의 고육질인자는 상기 염기결손 변이를 가진 DNA 서열을 포함하는 MYH3 유전자를 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물에서 HpyCH4Ⅳ 제한효소로 처리하고 상기 HpyCH4Ⅳ 제한효소에 의해 절단된 산물을 구분하여 고육질인자를 가진 난축맛돈을 판별할 수 있다. 이는 수입개량종의 일부 개체는 6bp 염기결손을 가지고 있으나, HpyCH4Ⅳ 제한효소에 의해 절단되지 않음을 의미한다.
상기 단계(d)의 고육질인자는 서열번호 7로 표시되는 MYH1 유전자를 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물에서 BspHI 제한효소로 처리하고 상기 BspHI 제한효소에 의해 절단되지 않은 산물을 구분하여 고육질인자를 가진 난축맛돈을 판별할 수 있다.
상기 단계(e)의 고육질인자는 서열번호 10으로 표시되는 MYH4 유전자를 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물에서 TaqⅠ 제한효소로 처리하고 상기 TaqⅠ 제한효소에 의해 356bp에서 밴드가 확인되는 산물을 구분하여 고육질인자를 가진 난축맛돈을 판별할 수 있다.
상기 단계(f)의 고육질인자는 서열번호 13으로 표시되는 GAS7 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호 16 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 GG형인 산물을 구분하여 고육질인자를 가진 난축맛돈을 판별할 수 있다.
상기 GAS7 유전자의 SNP는 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 138번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 138번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 증폭 산물 확인을 위해 겔 전기영동법을 이용하여 수행하였으나, 이에 한정되지 않고, 증폭 표적 서열에 검출 가능한 표지 물질을 표지하여 검출할 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 키트에 관한 것이다. 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 PCR 키트는, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레 오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트; 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및 서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하고, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 : GWAS 분석에서 확인된 육질형질 연관 유전자
제주재래흑돼지와 랜드레이스 교배 참조축군 및 제주재래흑돼지와 두록 교배 참조축군에서 대용량 SNP chip을 이용하여 육질형질에 대한 GWAS(Genome-wide association study) 및 유전자영역(QTL)을 분석하였다.
근내지방함량, 적색육, 등심단면적, 육색 및 지방산 조성의 결정과 관련된 SNP 유전자의 좌위를 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.
실시예 2 : 난축맛돈 판별
도 1은 육질 연관 유전자를 이용한 난축맛돈 판별 방법을 나타낸 모식도이다.
2-1. MYH3
6bp 결손(deletion) 유무 확인
난축맛돈은 MYH3 유전자의 프로모터 영역으로 개시코돈 ATG를 기준으로 1805번째부터 1810번째(g.-1805_-1810)에서 6염기가 결손되어 있고, 해당 결손 영역에서 제한효소에 의해 ACGT서열로 절단된 형태로 C/G변이 중 C 유전자형을 가지고 있는 것으로 확인하였다(도 2).
도 2는 난축맛돈과 랜드레이스의 염기결손 유무의 차이를 나타낸 것이다.
상기 난축맛돈의 SNP(g.-1805_-1810) 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.
서열번호 1: Hap1_145QF: ACG-TGT-GTT-CCC-CAC-ACA-AGT-TG
서열번호 2: Hap1_156qF: ggg-ccc-ggg-ccc-ggg-ccc-AGC-AGG-AGG-ACT-GCT-GTT-GTT-CC
서열번호 3: Hap1_QqR: ACC-TAG-AAT-CTC-GGC-CTG-TG
상기 서열번호 1을 정방향 프라이머, 서열번호 3을 역방향 프라이머로 이용하는 제 1 프라이머 세트를 제작하고, PCR 증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 64℃ 30sec, 72℃ 30sec / 35 cycles)에 이용하였다.
고육질형, 이형접합체 및 저육질형 각각 40두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 64℃에서 30초간, 전기영동은 2.0% 아가로스겔에서 수행하였다.
도 3은 MYH3 유전자 내 다형성 부위(g.-1805_-1810)의 염기 결손에 따른 밴드 양상을 나타낸 것이다. 고육질형 개체는 기본적으로 6bp 염기결손을 가지고 있어야 하기 때문에 도 3의 결과에 따라 염기결손이 되지 않은 개체는 조기 판정에서 제외하였다.
2-2. MYH3 유전자내 SNP 발현분석
실시예 2-1에서 MYH3 유전자 내 다형성 부위(g.-1805_-1810)에 염기 결손을 가진 개체를 선발해 내고, 고육질인자를 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 PCR-RFLP 방법으로 발현을 분석하였다.
도 4a은 육질형질 연관 유전변이 위치 확인용 염기서열 해독을 나타낸 것이다. 도 4a을 참고하면, 난축맛돈의 MYH3 유전자 내 다형성 부위(g.-1805_-1810)의 6bp 염기결손 내 제한효소 인지부위가 존재하므로, 상기 인지부위에서 ACGT 서열로 절단된, 절단형인 QQ는 고육질형, 비절단형인 qq는 저육질형, 이들의 중간형은 이형접합체로 구분됨을 확인하였다.
도 4b는 MYH3 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 4)을 나타낸 것이다.
상기 MYH3 유전자의 프로포터 영역 내 ACGT 서열의 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.
서열번호 5: X5U-hair_F Primer(23mer): ATA-AGA-ATG-GGC-AAA-CGC-TTC-AG
서열번호 6: X5U-hair_R Primer(22mer): GAA-AGC-TGG-AAG-TTT-GGG-ATG-C
상기 서열번호 5를 정방향 프라이머, 서열번호 6을 역방향 프라이머로 이용하는 제 2 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 64℃ 30sec, 72℃ 30sec / 35 cycles)에 이용하였다.
고육질형, 이형접합체 및 저육질형 각각 40두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 64℃에서 30초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여, 분석이 용이하도록 PCR 산물 크기를 597bp로 증폭하였다. 상기 증폭산물에 제한효소 HpyCH4Ⅳ을 처리하고 2.0% 아가로스겔에서 25분간 다시 전기영동하였다.
도 5는 MYH3 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 5를 참고하면, 근내지방함량 및 적색육을 높은 수준으로 나타내는 고육질인자를 가진 개체(QQ)는 HpyCH4Ⅳ 제한효소에 의해 절단되어 324bp 및 273bp의 절단된 밴드를 생성하고, 저육질형 돼지(qq)는 절단되지 않아 597bp의 밴드를 생성하였다. 이형접합체(Qq)는 절단되거나 절단되지 않은 밴드 양상을 보여 중간육질형을 나타내는데, 난축맛돈의 중간육질형 개체는 일반 돼지품종에 비해 월등히 우수한 육질을 가진다.
2-3. MYH1 유전자내 SNP 발현분석
MYH1 유전자 내 다형성 부위(c.4980A>G)에서 고육질인자를 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 PCR-RFLP 방법으로 발현을 분석하였다.
도 6a은 MYH1 유전자 내 육질형질 연관 유전변이 위치 확인용 염기서열 해독을 나타낸 것이다. 도 6a을 참고하면, 난축맛돈의 MYH3 유전자 내 다형성 부위(c.4980A>G)에 제한효소 인지부위인 T/CATGA 서열에서 A/G 변이를 확인하였다.
도 6b는 MYH1 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 7)을 나타낸 것이다.
상기 MYH3 유전자의 프로포터 영역 내 T/CATGA 서열의 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기에 앞서, BspHI 제한효소를 인지할 수 있도록 하기와 같이 변형을 유도하였다.
- mismatch primer
~~~~~~~TCAGGA → ~~~~~~~TCATGA [G→T로 변형]
~~~~~~~TCAGGG → ~~~~~~~TCATGG [G→T로 변형]
제작된 변형 프라이머는 하기와 같다.
서열번호 8: MYH1 Primer F(43mer): CAT-CCC-ACA-GGA-CAC-CCA-GAT-CCA-CCT-GGA-TGA-CGC-TCT-CAt-G
서열번호 9: MYH1 Primer R(25mer): AGT-GGA-CTG-AAG-GTG-AAA-TTC-TTG-C
상기 서열번호 8을 정방향 프라이머, 서열번호 9를 역방향 프라이머로 이용하는 제 3 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 55℃ 30sec, 72℃ 30sec / 35 cycles)에 이용하였다.
고육질형, 이형접합체 및 저육질형 각각 40두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 55℃에서 30초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여, 분석이 용이하도록 PCR 산물 크기를 271bp로 증폭하였다. 상기 증폭산물에 제한효소 BspHI 을 처리하고 2.0% 아가로스겔에서 25분간 다시 전기영동하였다.
도 7은 MYH1 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 7a를 참고하면, 등심단면적을 높은 수준으로 나타내는 고육질인자를 가진 개체(QQ)는 BspHI 제한효소에 의해 절단되지 않아 271bp의 밴드를 생성하지만, 저육질형 돼지(qq)는 절단되어 232bp의 절단된 밴드를 생성하였다. 중간육질(Qq) 개체는 절단된 밴드와 절단되지 않은 밴드 두 양상을 모두 보였다.
이에, 프라이머 서열을 일부 변형하여 여러 품종을 PCR 증폭하였을 때, BspHI 제한효소로 절단한 밴드 양상은 확연히 달라 보다 명확하게 구분할 수 있다. 도 7b를 참고하면, 대요크셔(Y), 랜드레이스(L), 두록(D) 및 버크셔(B)는 절단되어 232bp의 밴드를 생성하였고, 제주재래돼지(K)와 난축맛돈(N)은 절단되지 않아 271bp의 밴드를 생성하였다.
따라서, 제주재래돼지를 포함하여 난축맛돈은 고육질인자를 가진 개체로 수입개량종과 확연히 차이가 있으며 완벽하게 유전자 진단에 의한 구분이 가능하였다.
2-4. MYH4 유전자내 SNP 발현분석
MYH4 유전자 내 다형성 부위(c.3378C>T)에서 고육질인자를 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 PCR-RFLP 방법으로 발현을 분석하였다.
도 8은 MYH4 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 10)을 나타낸 것이다. 도 8을 참고하면, 난축맛돈의 MYH4 유전자 내 다형성 부위(c.3378C>T)에 제한효소 인지부위인 T/CGA 서열에서 C/T 변이를 확인하였다.
상기 MYH4 유전자의 프로포터 영역 내 T/CGA 서열의 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 하기와 같이 제작하였다.
서열번호 11: MYH4 Primer F(20mer): TCC-ATC-AGT-CTG-GCT-CAA-AG
서열번호 12: MYH4 Primer R(20mer): CAC-GGT-TTA-TAC-AGC-GCA-CT
상기 서열번호 11을 정방향 프라이머, 서열번호 12를 역방향 프라이머로 이용하는 제 4 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 60℃ 30sec, 72℃ 30sec / 35 cycles)에 이용하였다.
고육질형, 이형접합체 및 저육질형 각각 40두를 샘플로 하여 상기 PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 60℃에서 30초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여 534bp로 증폭하고, 상기 증폭산물에 제한효소 TaqⅠ을 처리하고 2.5% 아가로스겔에서 25분간 다시 전기영동하였다.
도 9는 MYH4 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 9를 참고하면, 재주제래돼지 특이 SNP를 나타내는 고육질인자를 가진 개체(QQ)와 저육질형 돼지(qq)는 절단된 밴드의 양상에 차이를 나타내었다. 대요크셔(Y), 랜드레이스(L), 두록(D) 및 버크셔(B)는 절단되어 255bp의 밴드를 생성하여 서로 일치하는 밴드의 양상을 나타냈고, 제주재래돼지(K)와 난축맛돈(N)이 서로 일치하여 356bp의 밴드를 생성함을 확인하였다.
상기 증폭산물 534bp의 염기서열에서 TaqⅠ 인지부위가 3개 존재하며, 기본적으로 2군데서 절단이 된다. 고육질형은 356bp에서 저육질형은 255bp에서 밴드가 확인됨에 따라 고육질형과 저육질형의 식별이 가능하다.
따라서, 이러한 밴드 양상을 구분하여 고육질형과 저육질형을 구분할 수제주재있으며 제주재래돼지를 포함하여 난축맛돈은 고육질인자를 가진 개체로 수입개량종과 확연히 차이가 있으며 완벽하게 유전자 진단에 의한 구분이 가능하다.
2-5. GAS7 유전자내 SNP 발현분석
GAS7 유전자 내 다형성 부위(g.-18482T>C)에서 고육질인자를 나타내는 대립유전자형을 식별하기 위해 Pyro-sequencing 방법으로 발현을 분석하였다.
도 10은 GAS7 유전자의 프로포터 영역 분석에 이용된 염기서열(서열번호 13)을 나타낸 것이다. 도 10을 참고하면, 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 138번째 염기에서 A/G 변이를 확인하였다.
상기 변이영역에는 제한효소 인지부위가 없어 Pyro-sequencing 방법으로 변이영역에 대한 대립유전자형을 분석하였다. GAS7 유전자의 프로포터 영역 내 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 하기와 같이 제작하였다.
서열번호 14: GAS7_1F: TCT-GTT-GTT-TCT-GGA-GGG-CT
서열번호 15: GAS7_1R: Biotin ACT-CAG-GTT-GTA-GGA-GGA-CA
서열번호 16: GAS7_mini: ACG-TCT-CCC-AGG-GAG-TGG-CA
서열번호 17: 입력: [A/G]GTTTCCTGTTAACTGG
상기 서열번호 14를 정방향 프라이머, 서열번호 15를 역방향 프라이머로 이용하는 제 5 프라이머 세트를 제작하고 PCR증폭(PCR 조건 : 94℃ 30sec, 63℃ 30sec, 72℃ 30sec / 35 cycles)에 이용하였다.
PCR 조건에 따라 증폭하고, 최종 연장은 63℃에서 30초간, 전기영동은 1.5% 아가로스겔에서 20분 수행하여 PCR 산물을 218bp로 증폭하였다. 증폭산물을 대상으로 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열을 이용하여 SNP의 유전자형을 결정하였다.
도 11은 GAS7 유전자 내 SNP의 PCR 증폭산물에 제한효소를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 11을 참고하면, 유전자형이 AA, AG 및 GG로 확인되며, 대요크셔(Y), 랜드레이스(L), 두록(D) 및 버크셔(B)는 AA유전자형을 나타내고 제주재래돼지(K)와 난축맛돈(N)이 GG 유전자형으로 나타남을 확인하였다.
GAS7 유전자는 지방산 조성에 영향을 주는 유전자로, 난축맛돈과 수입개랴종의 불포화지방산 조성 차이는 상기 GAS7 유전자의 변이에 의해 나타난다. 따라서, SNP의 유전자형이 GG형으로 확인된 경우, 불포화지방산이 증가된 고육질인자를 가진 난축맛돈으로 판별할 수 있다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hap1_145QF
<400> 1
acgtgtgttc cccacacaag ttg 23
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hap1_156qF
<400> 2
gggcccgggc ccgggcccag caggaggact gctgttgttc c 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hap1_QqR
<400> 3
acctagaatc tcggcctgtg 20
<210> 4
<211> 638
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH3
<400> 4
gaataagaat gggcaaacgc ttcagccata cccctctgtg ctcctaaggc tttatttttc 60
taaccctgat ttagaaacag ccatgctcgt tagacgcccc ctcacccccc tttctctgca 120
ggccctgcca tccccccacc cccgccccgg ccagcagctg gtctttccta attggtgaca 180
tgtcttaata actacaggtc cttgagcagc tgtcactgtg gctcctggct ggtgggctac 240
ctccctctca gtcatttact cgttggtcct actggcgctt aagacagagg tttagttaat 300
gacgatccta atgagacagc aggangtgtg ttccccacac aagttgtaca atcacacatt 360
cctgccacaa ccctgtgttg taacaaaagc cttgctcaaa actccaagag ggtttaaact 420
tttccgtcct tggcttcatc cctttgccca caggccgaga ttctaggtcc ccgctgtccc 480
agagaccagg ctcatctcca gccgtgtggc gcctgtggga tggagcgagg gcccccggca 540
aggctgtccc atcactgagc cgccggttca gagaaaggca tcccaaactt ccagctttct 600
ccagctagga tcctgtcatt tctatatata cctctctc 638
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> X5U-hair_F Primer
<400> 5
ataagaatgg gcaaacgctt cag 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> X5U-hair_R Primer
<400> 6
gaaagctgga agtttgggat gc 22
<210> 7
<211> 346
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1
<400> 7
gccctgagaa cagggcgtct caatgaccgt tcatcccaca ggacacccag atccacctgg 60
atgacgctct caggngccaa gaggacctga aggagcagct ggccatggtg gagcgcagag 120
ccaacctgct gcaggctgag attgaggagc tgcgggccac gctggagcag acagagagga 180
gtaggaaagt cgcagaacag gagctcctgg atgccagtga gcgtgtccag ctcctgcaca 240
cccaggtgag tgagtataac agaagagtaa aaactacagt ggactgaagg tgaaattctt 300
gctcaaattt tagtactagc taaaaattaa ttcatagtgt cttatg 346
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1 Primer
<400> 8
catcccacag gacacccaga tccacctgga tgacgctctc atg 43
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH1 Primer R
<400> 9
agtggactga aggtgaaatt cttgc 25
<210> 10
<211> 535
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH4
<400> 10
tccatcagtc tggctcaaag aggcacagac gtgacataaa gaagctaatt ttgggcattc 60
ccccactgcc aggcccgcat tgaggagctg gaggaagaga tngaggcaga gcgggcctcc 120
agggccaaag cagagaagca gcgctccgac ctctcccggg aactggagga gatcagcgag 180
aggctggaag aagccggcgg ggcgacgtca gcccagattg agatgaacaa gaagcgcgag 240
gctgagttcc agaagatgcg ccgggacctg gaggaggcca ccctgcagca cggggccaca 300
gcggccgcgt tgaggaagaa gcacgcggac agcgtggctg agctggggga gcagatcgac 360
aacctgcaga gggtcaagca gaagctggag aaggagaaga gtgagatgaa gatggagagt 420
cgacgacctt gctagcaaca tggagaccgt ctccaaagcc aaggtaccac agagtctggg 480
aaattgttat tcacaatgat cctttacgta catatcacgg tttatacagc gcact 535
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH4 Primer F
<400> 11
tccatcagtc tggctcaaag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MYH4 Primer R
<400> 12
cacggtttat acagcgcact 20
<210> 13
<211> 344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS7
<400> 13
cccgtgccct tggccttctc ctggcttgtg ggggaggggg gaggaggacg gtctgttgtt 60
tctggagggc tggaccccaa gggggaaggc tggagggagg tggttggaaa gtggctgacg 120
tctcccaggg agtggcangt ttcctgttaa ctggcttcct agtcaatatc cctgtgttcc 180
agctgagcca gggaccccag gcttggggct ggagtcccac acttcctagc ctcgcgtggc 240
cctccacggt gtcctcctac aacctgagtc ctatggagcc atctccactg gctccccact 300
gtcccgagag tcgggctgct ccttgctggg ggacaggggc cttc 344
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS7_1F
<400> 14
tctgttgttt ctggagggct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS7_1R
<400> 15
actcaggttg taggaggaca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS7_mini
<400> 16
acgtctccca gggagtggca 20
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAS7_INSERT
<400> 17
ngtttcctgt taactgg 17
Claims (11)
- 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 제 1 프라이머 세트;
서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 제 2 프라이머 세트;
서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 제 3 프라이머 세트;
서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 제 4 프라이머 세트;및
서열번호 14 및 서열번호 15로 표시되는 제 5 프라이머 세트를 포함하는, 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트. - 제 1항에 있어서,
상기 제 1 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 염기 결손(delection) 변이를 특이적으로 검출하고,
상기 제 2 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 HpyCH4Ⅳ 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,
상기 제 3 프라이머 세트는 서열번호 7로 표시되는 MYH1 유전자의 BspHI 제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,
상기 제 4 프라이머 세트는 서열번호 10으로 표시되는 MYH4 유전자의 TaqⅠ제한효소 인지부위 서열을 증폭하고,
상기 제 5 프라이머 세트는 서열번호 13으로 표시되는 GAS7 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 증폭하는 것을 특징으로 하는,
고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트. - (a) 돼지 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 1 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;
(c) 상기 단계(b)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;
(d) 상기 단계(c)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 3 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;
(e) 상기 단계(d)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 4 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 유무를 판단하는 단계;및
(f) 상기 단계(e)에서 얻은 고육질인자를 가진 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 제 5 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 산물의 고육질인자 대립유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는
고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(b)의 고육질인자는 서열번호 4로 표시되는 MYH3 유전자의 염기 결손에 의한 변이를 검출하는 것인,
RFLP 분석법을 이용한 고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항 및 제 4항에 있어서,
상기 단계(c)의 고육질인자는 상기 염기결손 변이를 가진 DNA 서열을 포함하는 MYH3 유전자를 증폭한 산물에서 HpyCH4Ⅳ 제한효소로 처리하고 상기 HpyCH4Ⅳ 제한효소에 의해 절단된 산물을 구분하는 것인,
RFLP 분석법을 이용한 고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(d)의 고육질인자는 서열번호 7로 표시되는 MYH1 유전자를 증폭한 산물에서 BspHI 제한효소로 처리하고 상기 BspHI 제한효소에 의해 절단되지 않은 산물을 구분하는 것인,
RFLP 분석법을 이용한 고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(e)의 고육질인자는 서열번호 10으로 표시되는 MYH4 유전자를 증폭한 산물에서 TaqⅠ 제한효소로 처리하고 상기 TaqⅠ 제한효소에 의해 356bp에서 밴드가 확인되는 산물을 구분하는 것인,
RFLP 분석법을 이용한 고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 단계(f)의 고육질인자는 서열번호 13으로 표시되는 GAS7 유전자를 증폭한 산물에서 서열번호 16 및 서열번호 17로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 SNP의 대립유전자형이 GG형인 산물을 구분하는 것인,
고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 8항에 있어서,
상기 GAS7 유전자의 SNP는 서열번호 13으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 138번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 138번째 염기를 포함하는 5 내지 500개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인,
고육질형 난축맛돈의 판별 방법. - 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 고육질형 난축맛돈 판별용 키트.
- 제 1항의 고육질형 난축맛돈 판별용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 고육질형 난축맛돈 판별용 조성물.
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| KR101686438B1 (ko) | 2014-11-13 | 2016-12-15 | 대한민국 | 육질 및 스트레스에 대한 내성이 강화된 흑돼지 및 그의 제조방법 |
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2021
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