KR101278268B1 - 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별방법 - Google Patents

염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 육우의 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1; MC1R) 유전자의 변이 부위에 관한 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 황우, 비황우 및 이들의 교잡우를 판별하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 통해 PCR 산물을 정제하거나 제한효소를 사용하지 않고도 1회의 PCR을 통해 육우의 털 색깔에 따른 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별이 가능하기에, 노동력과 시간을 현저하게 절약하면서도 황우, 특히 한우의 감별이 기존보다 용이하다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면 육우의 성별도 동시에 확인할 수 있어, 육우의 성별에 따른 소고기의 품질을 보다 쉽게 구별할 수 있다.

Description

염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별방법 {Method of detecting yellow cattle, non-yellow cattle and their hybrid cattle using sequence specific polymerase chain reaction}
본 발명은 염기특이-중합효소연쇄반응(sequence specific polymerase chain reaction, ss-PCR)을 이용한 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 육우의 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1; MC1R) 유전자의 변이 부위에 관한 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 황우, 비황우 및 이들의 교잡우를 판별하는 방법에 관한 것이다.
종래의 소 품종은 뿔, 모색, 및 골격 등 외관적인 차이에 의해 구분되었으나, 도축된 상태에서의 쇠고기의 판별은 외관상의 차이가 없기 때문에 소 품종의 식별은 거의 불가능하다.
한우는 소의 한 품종으로서, 털빛이 누런 갈색이다. 체질이 강하고 성질이 온순하며, 우리나라의 재래종으로, 고기 맛이 좋아서 육우로 사용되기에 가장 으뜸인 것으로 알려져 있다. 한편, 최근 외국의 광우병의 발생 등 외국 육우에 대한 불안감, 국민소득 증대와 식생활 개선으로 많은 소비자가 안전하면서도 품질이 좋은 쇠고기를 선호하는 경향이 늘어감에 따라 한우육에 대한 수요가 증가되어 한우육과 비한우육(교잡우육, 젖소육, 수입육 등)의 가격차도 점차 커지고 있다.
그러나 소의 품종 구별은 외형적 특징인 모색, 체형 등에 의존하는 것이 지금까지의 방법이어서 표현형으로 구별되는 소의 품종이라 하더라도 도축하여 쇠고기 형태로 전환되면 품종별 식별이 거의 불가능하다.
이에 수입육과 국내산 비한우육을 한우육으로 불법 둔갑시키는 사례가 빈번하게 발생하고 있으며, 이러한 부정육 불법 유통은 소비자 및 생산농가에 큰 피해를 줄뿐만 아니라 국내 한우 사업의 육성계획에 큰 차질을 초래하여 한우 산업의 경쟁력을 약화시키는 원인이 되고 있다. 따라서 쇠고기 품종 구별은 쇠고기 시장의 유통질서의 확립과 한우 사육농가의 보호를 위해 필요한 과제로 대두되고 있다.
종래의 한우 판별 방법으로서 면역 효소 측정법(ELISA)과 등전점 전기영동법(Isoelectric focusing; IEF) 등이 사용되었다. 그러나 상기 방법들은 축종간의 단백질 조성 및 구조적 차이에 따른 특이적 단백질을 검출했기 때문에 축종별 식별은 가능하나 동종내 품종간의 판별은 불가능하였다.
이를 개선하기 위해, PCR-RAPD(polymerase chain reaction random amplified polymorphic DNA) 기법이 개발되었다. 상기 PCR-RAPD 기법은 국내에서 쇠고기 품종 구별 및 각종 육류의 축종 판별에 사용되거나, 한우와 구별되는 홀스타인 젖소 품종의 특이적인 RAPD 마커 검출 등에 사용되었고, 국외에서는 동물의 유전 분석 및 품종 식별에 폭 넓게 응용되어 왔다.
상기 PCR-RAPD는 10bp(base pairs) 정도의 짧은 프라이머를 이용하여 PCR을 할 경우, 프라이머가 게놈상에 여러 군데 결합하여 여러 단편들을 생성시키는 것을 이용한다. 이렇게 만들어진 여러 단편들을 전기영동을 사용해서 확인하면 동물 품종마다 각각 독특한 밴드(band)를 형성하게 되며 이것을 품종 특이적 RAPD 마커로 이용하여 품종을 구별할 수 있다.
그러나 RAPD 기법은 PCR 증폭 조건에 대한 민감성이 매우 높고 결과의 재현성과 정확성이 낮기 때문에 한우 품종 구별을 위한 실용화에는 문제가 있다.
한편, 소를 비롯한 포유동물에서 모색 발현에 관여하는 것으로 밝혀진 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1) 유전자는 멜라닌의 합성 및 확산을 자극하는 호르몬 수용체로서, PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism)분석 방법을 이용하여 말의 털에서 MC1R의 염기 서열 분석 결과, 이 유전자의 단일 미스센스(missense) 돌연변이가 체스터넛(chestnut) 빛깔의 모색과 관련이 있음을 확인한 바 있다. 한편, 소의 경우, 한우처럼 털색깔이 노란 황우 품종은 MC1R 유전자의 99번째 코돈부위가 CTG이나, 젖소나 수입육같은 비황우는 CCG이다. 또한, MC1R 유전자의 104번째 코돈부위는 황우가 GTG, 비황우가 GGT이다. 이 때, 황우의 104번째 코돈은, 비황우의 104번 코돈인 GGT에서 1개의 G가 결실되어 있는 구조로서, 이후의 코돈의 서열이 전부 바뀌기 때문에 모색이 달라진다(도 1 참조).
이러한 결과는 소나 말 뿐만 아니라, 돼지나 각종 포유동물에서도 MC1R의 단일 미스센스 돌연변이가 각 품종별 모색 변화와 관련이 있는 것으로 확인되었다.
소의 품종 판별을 위해 지금까지 수행된 MC1R 유전자의 판독방법은 주로 PCR-RFLP 방법을 사용하였는데, 김태헌 등(한국동물자원과학회지 42:735-744, 2000)은 한우와 젖소 유전자를 판별하는데 있어 제한 효소처리 후 4% 메타포어(Metaphore) 아가로즈 젤을 사용하여 전기영동을 하였고, 이 등(한국동물자원과학회지 42:253-260, 2000)과 정 등(한국동물자원과학회지 42:379-390, 2000)은 각각 8%, 13% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동을 한 후 실버 염색(silver stain)을 사용했다. 이는 제한 효소 처리 후 생성된 저분자량의 DNA 밴드검출을 목적으로 한 것이다.
상기 PCR-RFLP 방법은 황우(예:한우)의 MC1R 유전자(GenBank accession number JQ004020)상에는 특정한 제한효소의 절단 부위가 없는 반면, 젖소나 수입우와 같은 비황우의 MC1R 유전자(GenBank accession number Y19103)상에는 이들 제한효소의 절단 부위가 있는 점을 이용해, 황우와 비황우의 MC1R 유전자의 일부를 PCR에 의해 증폭한 뒤, 상기 특정 제한효소를 이용하여 PCR 산물을 처리하게 되면, 황우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되지 않은 크기의 밴드를 형성하게 되는 한편, 비황우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되어 단편들을 생성하여 둘 이상의 밴드를 형성하게 되므로 황우와 다른 품종의 구별이 가능해지는 현상을 이용한 것이다.
그러나 이러한 PCR-RFLP법은 PCR-RADP법에 비해 재현성 및 정확도가 높은 장점을 가지지만, 분석단계가 복잡하여 분석시간 및 비용이 많이 소요될 뿐 아니라, 분석을 위해 반드시 제한 효소를 사용하여야 하기 때문에 제한 효소의 활성이 품종 구별 시 오류를 범할 수 있어, 유전자 증폭 반응 후 다른 효소의 처리 없이 바로 품종을 구별할 수 있는 분석 방법이 절실하게 필요하게 되었다. 또한, 종래의 PCR-RFLP법은 황우와 비황우의 교잡우에 대해서는 효과적으로 판별하기가 어렵기도 하다.
이에, 본 발명자들은 상기 PCR-RFLP 방법에 비해 보다 간편하게 육우의 품종, 이중에서도 황우인 한우를 다른 품종의 육우와 판별하는 방법을 연구하던 중SS-PCR(sequence specific polymerase chain reaction) 방법을 이용하여, MC1R 유전자를 인식하여 황우, 교잡우 및 비황우를 식별함으로써, 한우를 비롯한 육우의 품종 판별을 용이하게 하였다. 뿐만 아니라, 상기 SS-PCR를 수행할 때, 추가적으로 SRY(sex-determining region Y) 유전자를 동시에 인식할 수 있도록 하여 소의 성별 판별까지도 동시에 가능한 방법을 도출하였다. 상기 SS-PCR은 Taq 폴리머라제의 특징을 이용한 것으로 프라이머의 3′ 말단의 염기서열을 다르게 하여 상보적인 결합이 이루어질 때는 PCR 반응이 진행되고 상보적인 결합이 이루어지지 않을 때는 PCR 반응이 진행되지 않는 것을 이용하는 방법으로서 제한효소를 필요로 하지 않으면서도, 단 하나의 염기서열의 삽입, 치환 형태의 돌연변이까지 검출할 수 있는 방법이다.
한편, 본 발명자들은 이미 SS-PCR을 사용하여 육우의 품종을 판별하는 방법(한국등록특허 제813996호)을 이용해 한우를 다른 육우와 구분하는 기술을 보유하고 있는데, 상기 방법을 이용하게 되면, 한우와 비한우 및 이들의 교잡우를 판별하기 위해 2번의 AS-PCR을 수행해야만 하며, 성별 감별을 위해서도 다시 추가적으로 PCR을 수행해야만 하지만, 본 발명에서는 단 1회의 SS-PCR을 수행해서 육우의 품종 및 성별을 용이하게 감별할 수 있기에, 본 발명은 상기 한국등록특허 제813996호와는 다른 기술구성을 갖는 발명이라고 할 수 있다.
본 발명의 선행기술들로서, 한국등록특허 제898721호에는 SRY(sex- determining region Y) 유전자의 다형성을 확인하여 육우의 품종을 감별하는 방법이 개시되어 있다는 점에서 본 발명과는 다르고, 한국등록특허 제1099628호에도 MC1R 유전자를 분석하여 육우의 품종을 감별하는 방법이 개시되어 있지만 이는 제한효소를 이용하는 분석방법이기에 역시 본 발명과는 기술구성이 다른 발명이라고 할 수 있다. 또한, 한국등록특허 제1008941호에는 멀티플렉싱 PCR을 이용하여 초위성체 좌위(microsatellite loci)의 대립유전자 형질을 측정하여 육우의 품종을 감별하는 방법이 개시되어 있기에 역시 본 발명과는 다른 기술로 확인된다.
한국등록특허 제813996호 (염기특이-중합효소연쇄반응을 이용한 한우육 판별방법, 2008.03.10. 등록) 한국등록특허 제898721호 (한우육과 외래도입우육의 판별 방법, 2009.05.14. 등록) 한국등록특허 제1099628호 (소의 품종을 판별하기 위한 신규 프라이머, 2011.12.21. 등록) 한국등록특허 제1008941호 (멀티플렉싱 피씨알에 의한 한우와 수입우의 판별방법 및 이에 사용되는 프라이머, 2011.01.11. 등록)
본 발명의 목적은 염기특이-중합효소연쇄반응(sequence specific polymerase chain reaction, ss-PCR)을 이용한 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별방법을 제공하는 데에 있다. 보다 상세하게는 육우의 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1; MC1R) 유전자의 변이 부위에 관한 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 황우, 비황우 및 이들의 교잡우를 판별하는 방법을 제공하는 데에 있다.
황우의 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1) 유전자(GenBank accession number JQ004020) 또는 비황우의 MC1R 유전자(GenBank accession number AF445642)를 인식하는 서열번호 4~7의 프라이머 세트를 이용하여 염기특이-중합효소연쇄반응(ss-PCR)을 수행하는 단계; 및,
상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계;를 포함하는 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별방법을 제공한다.
상기 서열번호 4~7의 프라이머 세트에는,
황우 또는 비황우의 MC1R 유전자를 인식하는 서열번호 4의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
황우 또는 비황우의 MC1R 유전자를 인식하는 서열번호 5의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머;
황우 MC1R 유전자의 99번째 코돈을 인식하는 서열번호 6의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머; 및,
비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하는 서열번호 7의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;가 포함될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 4~7의 프라이머 세트 이외에,
황우 또는 비황우의 SRY(sex-determining region Y, GenBank accession number DQ336526) 유전자를 인식하는 서열번호 8의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머; 및,
황우 또는 비황우의 SRY 유전자를 인식하는 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머;를 추가적으로 포함시켜 사용할 수 있다.
한편, 상기 PCR 산물을 전기 영동한 후, 황우는 200 및 400bp(base pairs)의 DNA 밴드(band); 비황우는 300 및 400bp의 DNA 밴드; 이들의 교잡우는 200, 300 및 400bp의 DNA 밴드;가 생성되는 것을 통해 확인할 수 있다.
상기 황우로는 한우가 포함될 수 있다.
상기 비황우로는 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 품종의 육우가 이용될 수 있다.
상기 교잡우는 황우와 비황우의 교잡종 육우가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 4~7의 프라이머 세트를 포함하는 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별용 진단세트를 제공한다. 상기 진단세트에는 서열번호 8의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머, 및, 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명을 자세하게 설명한다.
상기 MC1R 유전자는 육우의 모색유전에 관여하는 유전자로서, 본 발명에서 이용하는 MC1R 유전자의 염기서열은 하기 표 1에 개시된 것과 같다.
서열
번호 1		 황우
MC1R
(GenBank accession number JQ004020)		 atgcctgcacttggctcccagaggcggctgctgggttcccttaactgcacgcccccagccaccctccccttcaccctggcccccaaccggacggggccccagtgcctggaggtgtccatccctgacgggctctttctcagcctggggctggtgagtctcgtggagaacgtgctggtagtggctgccattgccaagaaccgcaacctgcactcccccatgtactactttatctgctgcctggctgtgtctgacttgctggtgagcgtcagcaacgtgctggagacggcagtcatgc t gctgctggaggcc gt gtcctggccacccaggcggccgtggtgcagcagctggacaatgtcatcgacgtgctcatctgcggatccatggtgtccagcctctgcttcctgggtgccattgctgtggaccgctacatctccatcttctacgccctgcggtaccacagtgttgtgacactgccccgagcgtggaggatcattgcggccatctgggtggccagcatcctcaccagcctgctcttcatcacctactacaaccacaaggtcatcctgctgtgcctcgttggcctcttcatagctatgctggccctgatggccgtcctctacgtccactgctggcccgggcctgccagcatgcccggggcattgcccggctccagaagaggcagcgccccattcatcagggctttggcctcaagggcgctgccaacctcaccatcctgctgggcgtcttcttcctctgctggggccccttcttcctgcacctctcgctcatcgtcctctgcccccagcaccccacctgtggctgcatcttcaagaacttcaacctcttcctggccctcatcatttgcaacgccattgtggaccccctcatctatgccttccgcagccaggagctccggaagacgctccaagaggtgctgcagtgctcctggtga

*굵은 글씨의 base가 비황우와 다름/ 밑줄친 base들은 프라이머와 결합하는 위치임
서열
번호 2		 비황우
MC1R
(GenBank accession number AF445642)		 atgcctgcacttggctcccagaggcggctgctgggttcccttaactgcacgcccccagccaccctccccttcaccctggcccccaaccggacggggccccagtgcctggaggtgtccatccctgacgggctctttctcagcctggggctggtgagtctcgtggagaacgtgctggtagtggctgccattgccaagaaccgcaacctgcactcccccatgtactactttatctgctgcctggctgtgtctgacttgctggtgagcgtcagcaacgtgctggagacggcagtcatgcc gctgctggaggcc gg tgtcctggccacccaggcggccgtggtgcagcagctggacaatgtcatcgacgtgctcatctgcggatccatggtgtccagcctctgcttcctgggtgccattgctgtggaccgctacatctccatcttctacgccctgcggtaccacagtgttgtgacactgccccgagcgtggaggatcattgcggccatctgggtggccagcatcctcaccagcctgctcttcatcacctactacaaccacaaggtcatcctgctgtgcctcgttggcctcttcatagctatgctggccctgatggccgtcctctacgtccactgctggcccgggcctgccagcatgcccggggcattgcccggctccagaagaggcagcgccccattcatcagggctttggcctcaagggcgctgccaacctcaccatcctgctgggcgtcttcttcctctgctggggccccttcttcctgcacctctcgctcatcgtcctctgcccccagcaccccacctgtggctgcatcttcaagaacttcaacctcttcctggccctcatcatttgcaacgccattgtggaccccctcatctatgccttccgcagccaggagctccggaagacgctccaagaggtgctgcagtgctcctggtga

*굵은 글씨의 base가 황우와 다름/ 밑줄친 base들은 프라이머와 결합하는 위치임
서열
번호 3		 SRY
유전자
(GenBank accession number DQ336526)		 aggagaagtctcctcctattttattacatgaaaatactctatgtcaactttcaagtttgccttatggatttatttggaagaaggcttcacttatttcattttgtaaagccttacttttcaattttctccacagtttgaactacaatataaaacaattgatggttacaatttagaaatttagatttataaagctttttttttgttttgttttatttagtttgatcatctgttaggtaaaagtgcagaagagagtgatggatattacttctgcacagcctacgcatctaagacaccacacaccaacccccacccccaccctcccacttttcctactccccaaccgtcagaacaaaaaaataaaaatccagtccctttgaagtgttatattaacaccagggaactgcttgggtaccaaggttatgtgttttttcttttaatggaacaggtttttaatctaattttagttgtatctgagattgcctgttaaatatgtgttagtatatattagcattctgaaagtcgttagcacagataatagaattaccagttattagctactggaatacgtacatagatttttcagctgcactttgagcctaagtggagaagcagggttagtgattagcatggattgggtatcctgtgtattcaaatatataacaggattgggctgtttttcatctttttttgtttaagataacattctcttacattcataaccgtagacaatttgctagtatgtctgctgcaccttcattttcaatattga

*밑줄친 base들은 프라이머와 결합하는 위치임
상기 표 1의 서열번호 1은 황우의 MC1R 유전자, 서열번호 2는 비황우의 MC1R 유전자를 나타낸다. 황우와 비황우의 교잡우는 상기 서열번호 1 및 2의 유전자를 모두 포함하고 있다(황우/비황우 MC1R 헤테로 유전자를 가짐).
상기 표 1의 서열번호 3은 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 모든 육우에 공통되는 SRY 유전자를 나타낸다.
본 발명의 ss-PCR 분석을 위한 MC1R 유전자의 변이부분은 상기 서열번호 1 또는 2의 MC1R 유전자의 99 또는 104번째 코돈부위를 포함한다.
상기 MC1R 유전자의 99 또는 104번째 코돈부위는 서열번호 1 또는 2의 MC1R 유전자 중 황우와 비황우가 다른 염기서열을 갖는 부위로서, 보다 구체적으로 상기 MC1R 유전자의 99번째 코돈부위가 황우는 CTG이나 비황우의 경우 CCG이며, MC1R 유전자의 104번째 코돈부위가 황우는 GTG이나 비황우는 GGT이다(표 1 및 도 1 참조).
이 때, 황우의 MC1R 유전자의 104번째 코돈은, 비황우의 MC1R 유전자의 104번 코돈인 GGT에서 1개의 G가 결실되어 있는 구조로서, 이후의 코돈 서열이 전부 바뀌기 때문에, 육우의 모색이 달라지는 것이다.
한편, 본 발명의 서열번호 4~9 프라이머들의 염기서열은 하기 표 2와 같다.
서열
번호
이름
염기서열
비고

4
MC1R-F
5′-atccctgacgggctctttct-3′		 ‘황우 또는 비황우의 MC1R 전체 유전자’ 및 ‘황우 MC1R 유전자의 99번째 코돈’을 인식하는 전방 프라이머로 사용

5
MC1R-R
5′-catagctatgaagaggccaacg-3′		 ‘황우 또는 비황우의 MC1R 전체 유전자’ 및 ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈’을 인식하는 역 프라이머

6
HW-R
5′-cacggcctccagcagca-3′		 ‘황우 MC1R 유전자의 99번째 코돈’을 인식하는 역 프라이머

7
Hol-F
5′-gctgctggaggccgg-3′		 ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈’을 인식하는 전방 프라이머

8
SRY-F
5′-taacaggattgggctgtttttc-3′		 ‘황우 또는 비황우의 SRY’를 인식하는 전방 프라이머

9
SRY-R
5′-tgaaggtgcagcagacatac-3′		 ‘황우 또는 비황우의 SRY’를 인식하는 역 프라이머
상기 ‘황우 또는 비황우의 MC1R 전체 유전자’를 인식하는 ‘서열번호 4의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 5의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’를 통해서는, ss-PCR 반응이 제대로 수행되고 있는지 확인할 수 있으며, 황우, 비황우 및 이들 교잡우(황우/비황우 MC1R 헤테로 유전자를 가짐)의 MC1R 전체 유전자를 모두 인식하여 480bp의 DNA 밴드가 생성될 수 있다(도 2 및 3 참조).
‘황우 MC1R 유전자의 99번째 코돈’을 인식하는 ‘서열번호 6의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’는 ‘서열번호 4의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’와 함께 사용되어, 황우 또는 교잡우(황우/비황우 MC1R 헤테로 유전자를 가짐)의 99번째 코돈에 상보적으로 결합하여 200bp의 DNA 밴드를 생성할 수 있다. 이 때, 순수한 비황우의 유전자에서는 99번째 코돈이 다르기 때문에, 상기 서열번호 6의 염기서열 3′ 말단인 ‘a’가 결합하지 못해서, 200bp의 DNA 밴드가 생성되지 않는다(도 2 참조).
‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈’을 인식하는 ‘서열번호 7의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’는 ‘서열번호 5의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’와 함께 사용되어, 비황우 또는 교잡우(황우/비황우 MC1R 헤테로 유전자를 가짐)의 104번째 코돈에 상보적으로 결합하고 300bp의 DNA 밴드를 생성시킬 수 있다. 이 때, 순수한 황우의 유전자에서는 104번째 코돈이 다르기 때문에, 상기 서열번호 7의 염기서열 3′ 말단인 ‘g’가 결합하지 못해서, 300bp의 DNA 밴드가 생성되지 않는다(도 3 참조).
‘황우 또는 비황우의 SRY를 인식’하는 ‘서열번호 8의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머’ 및 ‘서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머’는 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별을 위해 ss-PCR 수행시 상기 프라이머 세트를 추가로 첨가하게 되면, 수컷 육우에서만 100bp의 DNA 밴드가 생성되어, 육우의 성별까지 판별가능하다.
한편, 본 발명에서 제공되는 서열번호 4~7의 프라이머 세트를 포함하는 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별용 진단세트에는 PCR 반응버퍼, dNTP, Taq DNA 폴리머라제, 증류수, PCR용 튜브, 대조군용 황우, 비황우, 교잡우 등의 DNA 샘플 등이 포함될 수 있다.
본 발명은 육우의 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1) 유전자의 변이 부위에 관한 염기특이-중합효소연쇄반응을 이용하여 황우, 비황우 및 이들의 교잡우를 판별하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 통해 PCR 산물을 정제하거나 제한효소를 사용하지 않고도 1회의 PCR을 통해 육우의 털색깔에 따른 황우, 비황우 및 이들의 교잡우의 판별이 가능하기에, 노동력과 시간을 현저하게 절약하면서도 황우, 특히 한우의 감별이 기존보다 용이하다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면 육우의 성별도 동시에 확인할 수 있어, 육우의 성별에 따른 소고기의 품질을 보다 쉽게 구별할 수 있다.
도 1은 황우와 비황우의 MC1R 유전자의 99번째 코돈과 104번째 코돈의 차이점을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 4~6의 염기서열을 포함하는 프라이머가 황우의 MC1R 유전자에 결합하는 위치를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 서열번호 4, 5 및 7의 염기서열을 포함하는 프라이머가 비황우의 MC1R 유전자에 결합하는 위치를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 서열번호 4~9의 염기서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 황우 암소, 비황우 암소, 비황우 수소, 교잡우 암소 및 교잡우 수소에 대해 ss-PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1. DNA 준비>
황우로서는 한우 암소 1마리(①로 명명), 비황우로서는 홀스타인 암소 2마리 및 수소(②~④로 명명)를 선택하고, 이들의 품종의 교잡우 암소 1마리 및 수소 7마리(⑤~⑫로 명명)를 선택하여, 도축 후 각 육우 조직에서 DNA를 채취하였다. 조직에서 DNA의 추출은 스핀-컬럼 방식을 이용하여 실시하였다. 구체적으로 조직(50㎎)을 잘게 부순 후 용해 완충액(Tris-EDTA) 400㎕와 10% SDS 50㎕와 프로테이나제 K(20㎎/㎖) 10㎕를 넣고 충분히 섞은 후 50℃에서 조직이 완전히 용해될 때까지 반응시켰다. 이 후, 조직이 완전히 용해되면 결합 완충액(구아니딘-HCl, Triton X-100, Tris-HCl) 400㎕를 첨가하고 이소프로판올 200㎕를 첨가한 후 잘 섞어주었다.
상기 혼합용액을 스핀-컬럼에 옮기고 8,000rpm에서 1분간 원심분리한 후 스핀-컬럼을 새로운 튜브에 옮겼다. 그 뒤 80% 에탄올 500㎕를 첨가하여 8,000rpm에서 원심분리하고 상기 스핀-컬럼을 새로운 튜브로 옮겼다. 이 과정을 2회 반복한 후 400㎕에 용출 완충액(Tris-HCl, pH8.5) 200㎕를 첨가하고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 추출하였다. 그 뒤 추출된 DNA는 전기영동으로 확인하였다.
< 실시예 2. MC1R 유전자에 대한 염기특히 - 중합효소연쇄반응 수행>
상기 실시예 1에서 추출된 DNA를 증폭시키기 위하여 GenBank에 등록된 황우의 MC1R(Bos taurus melanocortin 1 receptor, JQ004020), 비황우의 MC1R (GenBank accession number AF445642), 및 SRY(GenBank accession number DQ336526) 유전자를 인식하는 서열번호 4~9의 전체 염기서열을 포함하는 프라이머를 합성(Bioneer. Korea)하였다.
서열번호 이름 염기서열
4 MC1R-F 5′-atccctgacgggctctttct-3′
5 MC1R-R 5′-catagctatgaagaggccaacg-3′
6 HW-R 5′-cacggcctccagcagca-3′
7 Hol-F 5′-gctgctggaggccgg-3′
8 SRY-F 5′-taacaggattgggctgtttttc-3′
9 SRY-R 5′-tgaaggtgcagcagacatac-3′
염기특이-중합효소연쇄반응단계를 위해 반응액은 주형 DNA 2㎕(100ng), 서열번호 4~9의 각각의 100pM 프라이머 0.2㎕, 10X 반응버퍼 2㎕(제넷바이오, G-7000), 10mM dNTP 2㎕, Taq DNA 폴리머라제(5U) 0.2㎕를 첨가하고 멸균 증류수를 첨가하여 총 20㎕로 부피를 조정하였다. PCR 반응은 하기 표 4의 조건으로 수행하였다.
단계(step) 온도 시간 사이클(cycle)
Pre-denaturation 95℃ 10분 1
Denaturation 95℃ 15초
10
Annealing 60℃ 30초
Extention 72℃ 1분
Denaturation 95℃ 15초
25
Annealing 45℃ 30초
Extention 72℃ 1분
Final extension 72℃ 5분 1
즉, 95℃에서 10분간 예비 변성을 시킨 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 10 사이클을 반응한 후, 다시 95℃에서 15초, 45℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 25 사이클을 반응하였다. 그 뒤 72℃에서 5분간 최종 신장반응을 수행하였다. 그 뒤 증폭된 PCR 산물을 1.8% 아가로즈 겔에서 확인하였으며, 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4는 상기 ss-PCR 분석결과로서, Lane 1의 샘플은 ‘MC1R 유전자를 인식하여 생성된 480bp의 밴드’와 ‘황우 MC1R 유전자의 99번째 코돈을 인식하여 생성된 200bp의 밴드’만이 확인되기에 ‘황우 암소 (①)’의 샘플임을 확인할 수 있다.
Lane 2 및 7의 샘플은 ‘MC1R 유전자를 인식하여 생성된 480bp의 밴드’와 ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하여 생성된 300bp의 밴드’만이 확인되기에 ‘비황우 암소(② 및 ③)’의 샘플임을 확인할 수 있다.
Lane 3, 4, 6, 8, 9, 10 및 12의 샘플은 ‘MC1R 유전자를 인식하여 생성된 480bp의 밴드’와 ‘황우 MC1R 유전자의 99번째 코돈을 인식하여 생성된 200bp의 밴드’, ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하여 생성된 300bp의 밴드’ 및 ‘SRY 유전자를 인식하여 생성된 밴드’가 모두 확인되기에 각각 ‘교잡우 수소 (⑥~⑫)’의 샘플임을 확인할 수 있다.
Lane 5의 샘플은 ‘MC1R 유전자를 인식하여 생성된 480bp의 밴드’와 ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하여 생성된 300bp의 밴드’ 및 ‘SRY 유전자를 인식하여 생성된 밴드’가 모두 확인되기에 ‘비황우 수소 (④)’의 샘플임을 확인할 수 있다.
Lane 7의 샘플은 ‘MC1R 유전자를 인식하여 생성된 480bp의 밴드’와 ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하여 생성된 300bp의 밴드’만이 확인되기에 ‘비황우 암소 (③)’의 샘플임을 확인할 수 있다.
Lane 11의 샘플은 ‘MC1R 유전자를 인식하여 생성된 480bp의 밴드’와 ‘황우MC1R 유전자의 99번째 코돈을 인식하여 생성된 200bp의 밴드’, ‘비황우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하여 생성된 300bp의 밴드’가 확인되기에 ‘교잡우 암소 (⑨)’의 샘플임을 확인할 수 있다.
따라서, 상기 결과를 통해 황우, 비황우 및 이들의 교잡우를 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 소의 성별까지도 1회의 ss-PCR을 통해 판별 가능함을 확인할 수 있다.
이러한 방법을 통해, 품질이 상대적으로 낮은 비황우나 교잡우 등의 젖소육 또는 수입육이 황우인 한우 수소육이나 암소육으로 불법 유통되는 것을 방지할 수 있기에, 한우의 품질관리가 용이해졌으며, 소비자들도 안심하고 고품질의 한우를 소비할 수 있게 되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 한우의 MC1R(Melanocyte-stimulating hormone receptor 1) 유전자(GenBank accession number JQ004020), 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 MC1R 유전자(GenBank accession number Y19103)를 인식하는 서열번호 4~7의 프라이머 세트를 이용하여 염기특이-중합효소연쇄반응(ss-PCR)을 수행하는 단계; 및,
    상기 염기특이-중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우의 판별방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 4~7의 프라이머 세트는,
    한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 MC1R 유전자를 인식하는 서열번호 4의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 MC1R 유전자를 인식하는 서열번호 5의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머;
    한우 MC1R 유전자의 99번째 코돈을 인식하는 서열번호 6의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머; 및,
    홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하는 서열번호 7의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우의 판별방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 서열번호 4~7의 프라이머 세트에, 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 SRY(sex-determining region Y, GenBank accession number DQ336526) 유전자를 인식하는 서열번호 8의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머; 및,
    한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 SRY 유전자를 인식하는 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머;
    가 추가되는 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우의 판별방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 PCR 산물을 전기 영동한 후,
    한우는 200 및 400bp의 DNA 밴드;
    홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우는 300 및 400bp의 DNA 밴드;
    이들의 교잡우는 200, 300 및 400bp의 DNA 밴드;가 생성되는 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우의 판별방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 교잡우는 한우와 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 교잡종 육우인 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우의 판별방법.
  8. 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 MC1R 유전자(GenBank accession number JQ004020 또는 GenBank accession number AF445642)를 인식하는 서열번호 4의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 MC1R 유전자를 인식하는 서열번호 5의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머;
    한우의 MC1R 유전자의 99번째 코돈을 인식하는 서열번호 6의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머; 및,
    홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 MC1R 유전자의 104번째 코돈을 인식하는 서열번호 7의 3′ 말단 부위가 포함된 염기서열의 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우 판별용 프라이머 세트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 서열번호 4~7의 프라이머 세트에, 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 SRY(sex-determining region Y, GenBank DQ336526) 유전자를 인식하는 서열번호 8의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머; 및,
    한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우의 SRY 유전자를 인식하는 서열번호 9의 염기서열 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머;가 추가되는 것을 특징으로 하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우 판별용 프라이머 세트.
  10. 제8항 또는 제9항의 프라이머 세트를 포함하는 한우, 홀스타인 또는 앵거스에서 선택되는 육우 및 이들의 교잡우 판별용 진단 키트.
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