KR100653400B1

KR100653400B1 - 한우육 판별 방법 및 이를 위한 프로브와 프라이머

Info

Publication number: KR100653400B1
Application number: KR1020040046486A
Authority: KR
Inventors: 이재일; 김태중
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2004-06-22
Filing date: 2004-06-22
Publication date: 2006-12-04
Also published as: KR20050121375A

Abstract

본 발명은 한우육의 판별 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 소의 MC1R 유전자의 PCR-RFLP를 이용하여 아가로즈 겔 상에서 쉽게 한우육을 판별할 수 있는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 한우의 MC1R 유전자에서 구아닌(G)이 결여된 부분(594번째 염기)을 포함하되 비한우의 MC1R 유전자에는 3‘쪽의 2-mer 또는 3-mer가 상보적이지 않아 프라이머와 주형(template)이 결합하지 않는 테일(tail)을 형성하는 프라이머 및 이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물의 생성 여부를 통해 한우육을 판별하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 한우 또는 비 한우의 MC1R 염기 서열에 특이적으로 결합한 후 PCR 과정중에 활성화되어 나오면서 형광을 띄는 프로브를 이용하여 한우 또는 비한우의 MC1R 유전자의 실시간(real-time) PCR을 수행한 후, 각 시료에서 나타나는 형광의 분포를 통하여 한우육을 판별하는 방법에 관한 것이다.

한우육 판별 방법

Description

한우육 판별 방법 및 이를 위한 프로브와 프라이머{Method for Distinguishing Korean Beef from Non-Korean Beef, and Probe and Primer therefor}

도 1은 MC1R-5F와 MC1R-3R 2개의 프라이머를 이용하여 소의 MC1R 유전자의 일부를 PCR에 의해 증폭하여 얻은 538bp의 PCR 산물을 나타내는 전기영동 사진이다.

도 2는 Hpa II 또는 Hap II에 의해 한우와 비한우의 MC1R 유전자가 절단되거나 절단되지 않는 원리를 나타낸 모식도이다.

도 3은 Hpa Ⅱ 또는 Hap II를 이용하여 한우와 비한우의 MC1R 유전자의 538bp PCR 산물을 절단한 다음 전기영동한 겔의 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 3‘ 테일을 가진 프라이머를 이용하여 한우와 비한우의 MC1R 유전자의 PCR을 수행할 경우 유전자 증폭이 이루어지거나 이루어지지 않는 원리를 나타내는 모식도이다.

도 5는 본 발명에 따른 3‘ 테일을 가진 프라이머를 이용하여 한우와 비한우 의 MC1R 유전자의 PCR을 실시한 결과 얻어진 PCR 산물을 전기영동한 사진으로서, 상부의 사진은 PF2mer를 이용한 것이고, 하부의 사진은 PF3mer를 이용한 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 소 MC1R 유전자에 대해 Assay-by-Design 프라이머와 TaqMan^TM　 MGB 프로브를 이용한 실시간 PCR의 결과를 보여주는 것으로서, 한우와 비한우의 형광 분포의 차이를 보여준다.

소의 모색은 품종의 특징을 나타내고 개체 및 품종을 식별하는 수단으로 이용될 수 있는 대표적인 형질이다. 그러나 소의 품종 구별이 외형적 특징인 모색, 체형 등에 의존하는 것이 지금까지의 방법이어서 표현형으로 구별되는 소의 품종이라 할지라도 도축하여 쇠고기 형태로 전환되면 품종별 식별이 거의 불가능하다. 더구나 유통과정에서 젖소육이 한우육으로 판매되는 경우가 발생하여 소비자와 양축농가의 경제적 손실 및 피해가 발생하여 한우 산업의 경쟁력이 약화되어 왔다. 따라서 순수한 한우육을 명확히 구별할 수 있는 한우육 판별 기술 개발은 양축 농가 및 소비자를 보호하고 유통과정 중 발생하는 수입육의 한우육으로의 눈속임을 차단해 쇠고기 시장을 활성화시키기 위해 반드시 필요하다.

과거 품종별 판별 기술로서 면역 효소 측정법(ELISA) (Patterson, R. M., Whittaker, R. G. and Spencer, T. L. 1984. Improved species identification of raw meat by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. J. Sci. Food Agric., 35:1018; 및 Jones, S. J. and Patterson, R. L. S. 1985. Double-antibody ELISA for detection of trace amounts of pig meat in raw meat mixture. Meat Sci., 15:1)과 등전점 전기영동법 (Isoelectric focusing; IEF) (King, N. L. and Kurth, I. 1982. Analysis of raw beef samples for adulterant meat species by enzyme-staining of isoelectric focusing gels. J Food Sci., 47:1608)등이 사용되었으나, 이 방법들은 축종간의 단백질 조성 및 구조적 차이에 따른 특이적 단백질을 검출했기 때문에 축종별 식별은 가능하나 동종내 품종간의 판별은 불가능했다.

한편, PCR을 이용한 RAPD (random amplified polymorphic DNA)기법이 국내에서 쇠고기 품종 구별 및 각종 육류의 축종 판별 (민병록, 한재용, 이무하. 1995. RAPD 기법을 이용한 쇠고기의 품종(한우육, 젖소육(홀스타인육), 수입우육) 구분. Korean J. Anim. Sci. 37:651-660), 및 한우와 구별되는 홀스타인 젖소 품종의 특이적인 RAPD 마커 검출 (정의룡, 김우태, 김연수, 한상기. 1995. RAPD-PCR 기법을 이용한 젖소의 DNA 다형분석과 유전적 특성에 관한 연구. 한국동물자원과학회지. 37:455)등에 사용되었고, 국외에서는 동물의 유전 분석 및 품종 식별에 폭 넓게 응용되어 왔다 (Kemp, S. J. and Medrano, J. F. 1994. Randomly primed PCR amplification of pooled DNA reveals polymorphism in a ruminant repetitive DNA sequence which differentiates Bos indicus and B. taurus. Anim. Genet., 25:83; Bailey, E. and Lear, T. L. 1994. Comparison of Thoroughbred and Arabian horses using RAPD markers. Anim. Genet. 25:105-108; 및 Appa Rao, K. B., Bhat, K. V. and Totey, S. M. 1996. Detection of species-specific genetic markers in farm animals through random amplified polymorphic DNA(RAPD). Genet. Anal. 13:135-138).

PCR-RAPD는 10bp 정도의 짧은 프라이머를 이용하여 PCR을 할 경우, 프라이머가 게놈상에 여러 군데 결합하여 여러 단편들을 생성시키는 것을 이용한다. 이렇게 만들어진 여러 단편들을 전기 영동을 사용해서 확인하면 동물 품종마다 각각 독특한 밴드를 형성하게 되며 이것을 품종 특이적 RAPD 마커로 이용하여 품종을 구별할 수 있다.

그러나 RAPD 기법은 PCR 증폭 조건에 대한 민감성이 매우 높고 결과의 재현성과 정확성이 낮기 때문에 한우 품종 구별을 위한 실용화에는 문제가 있다 (Yu, K. and Pauls, K. P. 1992. Optimization of the PCR program for RAPD analysis. Nucleic Acids Res., 20:2606; Ellsworth, D. L., Rittenhouse, K. D. and Honeycutt, R. L. 1993. Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. Biotech., 14:214; MacPherson, J. M., Eckstein, P. E., Scoles, G. J. and Gajadbar, A. A. 1993. Variability of the random amplified polymorphic DNA assay among thermal cyclers, and effects of primer and DNA concentration. Mol. Cell Probes 7:293).

한편, 소를 비롯한 포유동물에서 모색 발현에 관여하는 것으로 밝혀진 MSH 수용체 (Melanocyte-stimulating Hormone receptor 1; MC1R)유전자는 멜라닌의 합성 및 확산을 자극하는 호르몬 수용체이다. 포유동물의 모색을 결정하는 티로신-유도된 멜라닌에는 두 가지 색소 즉, 적색/노란색을 나타내는 페오멜라닌(phaeomelanin)과 갈색/검정색을 나타내는 유멜라닌(eumelanin)이 있는데, 이들의 합성, 색소 세포 내의 상대적 양을 조절하는 데에 확장(Extention) (E) 및 아구티(Agouti) (A) 좌위가 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며(Vage, D. I., Klungland, H., Lu, D. and Cone, R. D. 1999. Molecular and pharmacological characterization of dominant black coat color in sheep. Mamm. Genome 10:39-43), 확장 좌위에 의해 암호되는 MC1R에 의해 타이로시나제 활성이 조절되고 타이로시나제 효소 농도에 따라 페오멜라닌과 유멜라닌 생성이 조절됨이 밝혀졌다.

또한, 포유동물에서 MC1R 돌연변이가 모색변이를 일으킨다는 사실이 발견되어, 색소 합성에 관여하는 MC1R 유전자의 돌연변이를 검출하기 위해 PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism)분석 방법을 이용하여 말에서 MSH 수용체의 염기 서열 분석 결과 이 유전자의 단일 미스센스(missense) 돌연변이가 체스터넛(chestnut) 빛깔의 모색과 관련이 있음이 밝혀졌으며 (Marklund, L., Johansson, M., Sandberg, K. and Andersson, L. 1996. A missense mutation in the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor(MC1R) is associated with the chesnut coat color in horses. Mamm. genome 7:895-899), 돼지에서 돼지 품종 및 모색별로 특징있는 MSH 수용체 유전자형이 제시되었으며 (Kijas, J. M., Wales, R., Tomsten, A., Chardon, P., Moller, M. and Andersson, L. 1998. Melanocortin Receptor 1(MC1R) mutaions and coat color in pigs. Genetics 150:1177-1185), 소 (Klungland, H., Vage, D. I., Gomez-Raya, L., Adalsteinsson, S. and Lien, S. 1995. The role of melanocyte-stimulating hormone(MSH) receptor in bovine coat color determination. Mamm. Genome 6:636-639), 면양 (Vage, D. I., Klungland, H., Lu, D. and Cone, R. D. 1999. Molecular and pharmacological characterization of dominant black coat color in sheep. Mamm. Genome 10:39-43) 등의 여러 축종을 대상으로 모색변이에 관한 연구가 이루어 졌다.

소의 품종 판별을 위해 지금까지 수행된 MC1R 유전자의 PCR-RFLP 방법을 사용한 실험에서, 김 태헌 등(김태헌, 윤두학, 박응우, 이혜영, 오성종, 정일정, 탁태영, 김경남, 한재용. 2000. 소 품종별 Melanocortin Receptor 1(MC1R) 유전자의 유전자형 빈도에 관한 연구. 한국동물자원과학회지 42:735-744)은 한우와 젖소 유전자를 판별하는데 있어 제한 효소처리 후 4% 메타포어(Metaphore) 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동을 하였고, 이 등(이성수, 양영훈, 강승률, 오운용, 양보석, 고서봉, 오성종, 김규일. 2000. 한우, 제주재래흑우, 흑모화우와 갈모화우에서의 MSH Receptor(MC1R) 유전자의 유전자형 및 빈도 비교. 한국동물자원과학회지 42:253-260)과 정 등(정의룡, 김우태, 김연수, 한상기. 2000. 소 모색관련 유전자 MC1R의 PCR-RFLP Marker를 이용한 한우육 판별. 한국동물자원과학회지 42:379-390)은 각각 8%, 13% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 한 후 실버 염색(silver stain)을 사용했다. 이는 제한 효소 처리 후 생성된 저분자량의 DNA 밴드 검출을 목적으로 한 것이다. 이러한 방법들은 저분자량의 DNA 밴드 검출에 유리하지만 일반적으로 실험실에서 간편하게 사용되는 아가로즈 겔을 사용한 전기영동 방법에 비하면 실험과정이 복잡하며 비용과 시간이 많이 드는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 한우육 판별을 위한 기존의 RAPD 또는 RFLP 방법 등의 상기와 같은 문제점을 해결하고, 적은 비용과 시간으로 효과적으로 정확하게 한우육을 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 축우의 모색 발현에 관여하는 MC1R 유전자의 PCR-RFLP 기술을 이용함에 있어, 제한 효소 처리 후, 일반적인 아가로즈 겔에서도 식별이 가능한 크기의 단편들이 만들어질 수 있는 프라이머쌍과 제한 효소를 이용하여 한우육과 비한우육을 보다 간편하고 정확하게 구별할 수 있는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 한우육 판별 방법은 한우와 비한우(예, 홀스타인 종 또는 앵거스 종) MC1R 유전자를 위한 적합한 프라이머쌍을 이용하여 한우와 비한우 MC1R 유전자를 PCR에 의해 증폭시키는 단계; PCR 산물을 적합한 제한 효소로 처리하는 단계; 및 제한 효소 처리된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함하는 한우육 판별 방법에 있어서, 상기 제한 효소가 Hpa II 또는 Hap II인 것을 특징으로 한다.

한우육 판별을 위해 사용된 기존의 PCR-RFLP 방법에서 얻어진 단편들은 대부분 그 크기가 200 bp 미만이었다. 따라서, 이들 단편들을 겔 상에서 분리하여 확인하기 위해서는 일반적인 아가로즈 겔이 아닌 메타포어 아가로즈 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 필요로 하였다.

이에 본 발명자들은 편리하게 일반적인 아가로즈 겔상에서도 식별이 가능한 크기의 단편을 얻을 수 있는 PCR-RFLP 방법을 연구하던 중, 한우의 MC1R 유전자 상에는 제한 효소 Hpa II 또는 Hap II의 절단 부위가 없는 반면, 비한우의 MC1R 유전자 상에는 이들 제한 효소의 절단 부위가 있음을 발견하게 되었다(도 2 ).

이러한 제한 효소 절단 부위의 존재 여부의 차이로 인해, 한우와 비한우의 MC1R 유전자의 일부를 PCR에 의해 증폭한 뒤, 제한 효소 Hpa II 또는 Hap II를 이용하여 PCR 산물을 처리하게 되면, 한우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되지 않은 크기의 밴드를 형성하게 되는 한편, 비한우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되어 단편들을 생성하여 둘 이상의 밴드를 형성하게 되므로 한우와 다른 품종의 구별이 가능해 진다.

하지만, 이때 생성되는 단편들의 크기가 작으면 아가로즈 겔 상에서는 식별이 어려우므로, 본 발명자들은 제한 효소 처리 후 아가로즈 겔 상에서 용이하게 식별이 가능한 크기의 단편들이 생성될 수 있는 PCR 산물을 얻을 수 있는 프라이머 쌍을 고안하였다.

본 발명에 이용하기에 바람직한 프라이머 쌍은, 한우외의 다른 품종의 MC1R 유전자상의 제한 효소 Hpa II 또는 Hap II의 절단 부위(593번 염기부터 595번 염기를 포함)의 위치를 고려하여 제한 효소 절단 후 200 bp 이상의 크기의 단편이 생성될 수 있도록 하는 프라이머쌍이다.

본 발명에 이용하기에 바람직한 프라이머쌍은 전방 프라이머로서 5‘-CAGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3'(서열 번호 1)의 일부 또는 전부를 포함하는 프라이머와 역 프라이머로서 5’-GGCCAGCATGTGGACGTAGA-3‘(서열 번호 2)의 일부 또는 전부를 포함하는 프라이머이다.

본 발명에 이용하기에 보다 바람직한 프라이머쌍은 전방 프라이머로서 5‘-CAGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3'와 역 프라이머로서 5’-GGCCAGCATGTGGACGTAGA-3‘이다.

이러한 프라이머 쌍을 이용하여 한우와 비한우의 MC1R 유전자를 PCR 증폭하고 그 PCR 산물을 제한효소 Hpa II 또는 Hap II를 이용하여 처리한 뒤, 아가로즈 겔에서 전기 영동하면 한우 MC1R 유전자의 PCR 산물은 단일 밴드로 나타나고 비한우의 PCR 산물은 둘 이상의 밴드로 나타나게 되어 한우와 비한우를 아가로즈 겔 상에서 용이하게 식별할 수 있다.

이러한 본 발명의 방법에 따라 한우와 비한우의 MC1R 유전자를 PCR 증폭시킨 후, 제한효소 Hpa II 또는 Hap II를 이용하여 처리하여 아가로즈 겔에서 전기 영동한 결과가 도 3에 나타나 있다.

도 3에서, lane 1 내지 4는 홀스타인 종의 MC1R 유전자의 PCR 산물의 제한 단편이며, lane 5 내지 8은 앵거스 종의 MC1R 유전자의 PCR 산물의 제한 단편이고, lane 9 내지 12는 한우의 MC1R 유전자의 PCR 산물의 제한 단편이다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비한우의 MC1R 유전자의 경우, PCR 산물이 두 개의 단편으로 절단되는 반면, 한우의 MC1R 유전자의 PCR 산물은 절단되지 않고 하나의 밴드로 나타나, 한우와 비한우의 구별이 용이하다.

또한, 본 발명은, 한우의 MC1R 유전자에서 구아닌(G)이 결여된 부분(594번째 염기)을 포함하되 비한우의 MC1R 유전자에는 3‘쪽의 2-mer 또는 3-mer가 상보적이지 않아 프라이머와 주형(template)이 결합하지 않는 테일(tail)을 형성하는 프라이머, 및 이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물의 생성 여부를 통해 한우육을 판별하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 한우 또는 비한우의 MC1R 유전자를 PCR에 의해 증폭하는 단계, 및 PCR 산물을 전기 영동하여 PCR 산물의 생성 여부를 판단하는 단계를 포함하는 한우육 판별 방법으로서, PCR 반응을 위한 5' 프라이머로서 한우의 MC1R 유전자에서 구아닌(G)이 결여된 부분(594번째 염기)을 포함하되 비한우의 MC1R 유전자에는 3‘쪽의 2-mer 또는 3-mer가 상보적이지 않아 프라이머와 주형(template)이 결합하지 않는 테일(tail)을 형성하는 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 3' 테일을 가진(3'-tailed) 프라이머는, 한우의 MC1R 유전자 서열 중 구아닌이 결여된 부분을 포함하지만, 비한우의 MC1R 유전자에는 3‘쪽의 2-mer 또는 3-mer가 상보적이지 않아 프라이머와 주형이 결합하지 않는 테일을 형성하는 것을 특징으로 한다.

도 4를 보면, 한우의 MC1R 유전자의 경우는 3'-테일을 가진 프라이머가 DNA 주형에 정확하게 결합하여 Taq 폴리머라제가 증폭해 나갈 수 있지만, 비한우의 MC1R 유전자의 경우에는 프라이머가 DNA 주형에 상보적이지 않아 결합되지 않은 3'-테일이 생기는 것을 확인할 수 있다.

이러한 3' 테일이 존재할 경우, Taq 폴리머라제의 경우에는 3‘ → 5’ 엑소뉴클레아제의 작용이 없어 3‘ 쪽의 테일을 제거하지 못하므로 Taq 폴리머라제의 중합 작용이 더 이상 나가지 못하고 멈추게 되어 PCR 산물이 만들어 지지 않게 된다. 하지만, pfu 폴리머라제의 경우에는 3‘ → 5’ 엑소뉴클레아제 작용이 있어 3' 테일을 제거하고 다시 5‘ → 3’ 으로 DNA 중합할 수 있으므로 본 발명의 방법에 사용하지 못한다.

또한, 너무 적은 수의 염기서열을 가지고 프라이머를 만들 경우 우리가 원하는 부위 이외에, 프라이머와 상보적인 염기서열을 갖는 다른 부위에도 결합하여 불필요한 밴드가 생길 수 있으므로 정확한 프라이머-주형 결합을 위해 15머 이상의 길이가 바람직하다. 보다 바람직하게는 19-mer 또는 20-mer의 길이가 적합하다.

바람직하게는, 본 발명의 3' 테일을 가진 프라이머는 5‘-GCC GCT GCT GGA GGC CGT G-3' (PF2mer)(서열 번호 3)와 5‘-GCC GCT GCT GGA GGC CGT GT-3' (PF3mer)(서열 번호 4)이다.

적합한 크기의 PCR 산물을 생성하기에 알맞은 3'-프라이머와 함께 본 발명의 3' 테일을 가진 프라이머(3'-tailed 프라이머)를 5‘-프라이머로 이용하여 한우 또는 비한우의 소의 MC1R 유전자를 PCR 증폭시키고 그 PCR 산물을 전기영동에 의해 확인함으로써, 밴드 존재 여부에 의해 한우와 비한우를 용이하게 구별할 수 있다.

도 5는 이러한 본 발명 방법에 따라 3' 테일을 가진 프라이머를 이용하여 한우와 비한우의 MC1R 유전자의 PCR을 실시한 결과를 보여준다. 도 5에서, lane 1-8은 비한우의 MC1R 유전자의 PCR 결과이고 lane 9-12는 한우의 MC1R 유전자의 PCR 결과이다. 비한우의 MC1R 유전자에서는 PCR 증폭이 전혀 일어나지 않은 반면, 한우의 MC1R 유전자에서는 PCR 증폭이 일어났음을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 한우 또는 비 한우의 MC1R 염기서열에 특이적으로 결합한 후 PCR 과정중에 활성화되어 나오면서 형광을 띄는 프로브를 이용하여 한우 또는 비한우의 MC1R 유전자의 실시간(real-time) PCR을 수행한 후 각 시료에서 나타나는 형광의 분포를 통하여 한우육을 판별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 한우 또는 비 한우의 MC1R 유전자의 증폭을 위한 프라이머와, 한우의 MC1R 유전자와 비 한우의 MC1R 유전자를 구별하여 각각 특이적으로 인식하는 프로브들을 이용하여 MC1R 유전자의 실시간 PCR을 실시하는 단계, 및 PCR 실시 후 형광 분석에 의해 한우육을 판별하는 단계를 포함한다.

실시간 PCR은 표지된 프라이머나 형광 물질이 있는 프로브 또는 앰플리콘(amplicon)을 이용하여 실시간으로 증폭된 산물의 축적량을 모니터링할 수 있어 PCR 산물의 확인을 위해 겔을 이용할 필요가 없다. 이러한 실시간 PCR은 DNA-결합 형광발색단(fluorophore), 선형 올리고프로브, 5' 뉴클레아제 올리고프로브, 헤어핀 올리고프로브 등을 이용하여 PCR 산물의 생성을 실시간으로 측정한다. 따라서, PCR 산물의 분석을 위해 별도로 아가로즈 겔에서의 전기 영동 등을 실시할 필요가 없다.

상기 프로브들중 5' 뉴클레아제 올리고프로브를 이용하는 5' 뉴클레아제 분석은 프로브의 한쪽 끝에 리포터 형광 염료를 붙이고 다른 한끝에는 켄쳐(quencher) 염료를 붙여, PCR이 진행될 때 5' 말단의 리포터 형광 염료가 떨어지면서 내는 고유의 형광을 정량하는 방식이다. 이 프로브는 표적 부위의 고유 염기 서열을 가지므로 표적 부위에만 특이적으로 붙으며, PCR 반응이 없으면 3' 말단의 켄쳐 염료에 의해 형광이 억제되도록 고안된다.

한우육 판별을 위한 본 발명 방법에서는 소의 MC1R 유전자를 PCR 증폭시키기 위한 5‘, 3’의 각각 1개의 프라이머와, 증폭되는 부분내에 상보적으로 결합할 수 있는 2개의 다른 형광 리포터로 표지된 프로브가 사용된다. 이때 프로브 중 하나는 한우의 염기 서열만을 특이적으로 인식하고 또 다른 프로브는 한우가 아닌 염기 서열만을 인식한다.

소의 MC1R 유전자 부위를 주형으로 하여 PCR을 수행하면 PCR 증폭 부분내에 이 프로브들이 결합하게 되는데 각각의 프로브는 자신이 인식하는 상보적인 서열의 주형에만 결합한다. 그러다가 5‘쪽에서 폴리머라제에 의해 DNA가 중합되어 오던 중 DNA 폴리머라제에 의해서 프로브의 5’쪽에 표지된 형광물질 (예, FAM이나 VIC)이 프로브에서 떨어져 나오면서 형광을 띄게 된다.

예를 들어, FAM이 표지된 프로브가 소비되어 FAM의 형광이 나타난다는 것은 FAM으로 표지된 프로브가 인식하는 염기서열이 있다는 말이 되고 이것을 통해 유전자를 식별할 수 있다.

본 발명 방법에 사용하기 위한 프라이머는 MC1R 유전자 서열을 기초로 하여 적합한 PCR 산물을 얻기에 알맞은 크기와 서열로 설계될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명 방법에 사용하기 위한 프라이머는 소의 MC1R 유전자의 (AF445642) 559번째에서 576번까지의 서열 5‘-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3’(서열 번호 7)의 일부 또는 전부를 포함하는 전방 프라이머와, 617번째에서 633번까지의 서열 5'-TCCAGCTGCTGCACCAC-3'(서열 번호 8)의 일부 또는 전부를 포함하는 역 프라이머이다.

보다 바람직하게는, 본 발명 방법에 사용하기 위한 프라이머는 MC1R 유전자 의 (AF445642) 559번째에서 596번까지의 전방 프라이머 (5‘-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3’)와, 617번째에서 633번까지의 역 프라이머 (5'-TCCAGCTGCTGCACCAC-3')이다.

또한 본 발명 방법에 사용하기 위한 프로브는, 한우의 MC1R 유전자에만 특이적으로 결합하는 프로브로서는 한우의 MC1R 유전자상의 594번째 염기에서의 구아닌의 결실을 인식하고 이 구아닌 결핍 부위에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 이용하고, 또 다른 프로브는 비한우의 MC1R 유전자 상의 594번째 염기에서 구아닌 존재를 인식하고 이 부위에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 이용한다.

바람직하게는, 본 발명 방법에 사용하기 위한 프로브는 한우의 MC1R 유전자에 있어 594번째 염기에서 구아닌의 결손을 인식하며 형광 표지된 프로브로서 5' CCAGGACACCGCCT 3' 서열(서열 번호 5)의 일부 또는 전부를 포함하는 프로브와, 비한우의 MC1R 유전자에 있어 594번째 염기에서 구아닌의 존재를 인식하며 형광 표지된 프로브로서 5' CCAGGACACCGGCCT 3'(서열 번호 6)의 일부 또는 전부를 포함하는 프로브이다.

보다 바람직하게는, 본 발명 방법에 사용하기 위한 프로브는 한우의 MC1R 유전자에 있어 594번째 염기에서 구아닌의 결손을 인식하는 VIC-표지된 리포터 1 TaqMan^TMMGB 프로브 (CCAGGACACCGCCT)와 비한우의 MC1R 유전자의 594번째 염기에서 구아닌의 존재를 인식하는 FAM-표지된 리포터 2 TaqMan^TM　 MGB 프로브 (CCAGGACACCGGCCT)이다.

도 6은 상기 프로브를 이용하여 한우와 비한우의 MC1R 유전자의 실시간 PCR 을 실시한 결과를 보여준다. 한우의 MC1R 유전자에서 실시한 PCR에서는 VIC 형광만이 나타나고, 비한우의 MC1R 유전자에서 실시한 PCR에서는 FAM 형광만이 나타남을 확인할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

실시예

실시예 1

가. 재료

DNA를 얻기 위한 근육 조직은 도축장에서 홀스타인 4 개체, 한우 4 개체 그리고 앵거스 4개체로부터 각각 혈액 또는 근육 시료를 채취하였다.

나. DNA 분리

근육 및 혈액으로 부터 DNA 분리 및 정제는 Miller 등 (Miller, S. A., Dykes, D. D. and Polesky, H. F. 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl. Acids Res., 16:12151988)의 페놀/클로로포름 추출 방법의 일부를 변형해 실시하였고, 분리된 DNA는 TE 완충액 (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4) 적당량을 넣어 재부유시킨 뒤 1% 아가로즈 겔에서 전기 영동하여 확인하였다.

다. 프라이머

MC1R 유전자의 GenBank (AF445642)에 등록된 Bos taurus melanocortin 1 수용체 (MC1R) mRNA를 지정하는 cDNA 영역의 E-좌위가 포함된 382에서 919 번째 염기서열부위의 583 bp 단편을 증폭하기 위해 전방 프라이머 (MC1R-5F)로서 5‘- CAGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3'와 역 프라이머 (MC1R-3R)로서 5’-GGCCAGCATGTGGACGTAGA-3‘를 사용하였는데, 이는 Gene Runner^TM 소프트웨어를 사용하여 염기 배열을 설계하여 합성 (Bionics, Korea)하였다.

라. PCR에 의한 MC1R의 증폭 및 전기영동

PCR 반응을 위해 반응액은 주형 DNA 1 ㎕, 각 20 pM 프라이머 1 ㎕, 무 MgCl₂ 10ㅧ PCR 완충액 5 ㎕, 25 mM MgCl₂ 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 5 ㎕, Taq DNA 폴리머라제 (5 U) 1 ㎕를 첨가하고, 멸균 증류수를 첨가하여, 총 50 ㎕로 조정하였다. PCR 수행은 94℃에서 5 분간 예비변성시킨 후 94℃, 1 분과 63℃, 1분, 72℃, 1 분씩 3 단계로 35 사이클을 수행한 후 마지막으로 72℃에서 5 분간 쇄 연장을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% 아가로즈 겔에서 확인하였다.

마. 제한효소 처리에 의한 DNA 절단 및 전기영동

전기영동으로 확인된 MC1R 유전자의 PCR 산물은 Geneclean Ⅱ 키트 (Qbiogene^TM, USA)를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 용출시킨 PCR 산물을 제한 효소 Hpa Ⅱ 또는 Hap II를 이용하여 절단하였다. 제한 효소 처리는 10X 용출 완충액 2 ㎕, DNA 10 ㎕, BSA (소 혈청 알부민) 0.5 ㎕, 제한 효소인 Hpa II 또는 Hap II 1 ㎕, 멸균 증류수 6.5 ㎕를 넣어 총 20 ㎕가 되게 하여 37℃에서 3 시간 동안 반응시킨 후 1.5% 아가로즈 겔을 사용하여 확인 하였다.

바. 실험 결과

제한효소 Hpa II 또는 Hap II를 이용하여 절단된 PCR 산물의 단편들의 크기 는 하기 표 1 및 도 3과 같다.

품 종	절단된 단편의 크기(bp)
한 우	538
젖 소 (Holstein)	328, 210
흑 우 (Angus)	328, 210

실시예 2

재료 및 DNA 분리는 실시예 1에서와 같다.

가. 테일을 가진 프라이머

MC1R 유전자의 GenBank (AF445642)에 등록된 Bos taurus melanocortin 1 수용체 (MC1R) mRNA를 지정하는 cDNA 영역의 E-좌위가 포함된 594번째 염기서열의 구아닌 결실부위를 포함하는 577에서 919번째 염기서열 부위의 343 bp단편을 증폭시키기 위하여, 전방 프라이머는 5‘-GCC GCT GCT GGA GGC CGT G-3' (PF2mer)와 5‘-GCC GCT GCT GGA GGC CGT GT-3' (PF3mer), 역 프라이머는 5’-GGC CAG CAT GTG GAC GTA GA-3‘ (MC1R-3R)를 사용하였는데, 이들 프라이머는 Gene Runner^TM 소프트웨어를 사용하여 염기 배열을 설계하여 합성 (Bionics, korea)하였다.

나. PCR에 의한 MC1R의 증폭 및 전기영동

PCR 반응을 위한 반응액은 주형 DNA 3 ㎕, 각 20 pM 프라이머 1 ㎕, 무(free) MgCl₂ 10X PCR 완충액 5 ㎕, 25 mM MgCl₂ 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 5 ㎕, 5 U Taq DNA 폴리머라제 (Promega^TM, USA) 1 ㎕를 첨가하고 멸균 증류수를 첨가하여 총 50 ㎕로 조정하였다.

PCR 수행은 95℃에서 5 분간 예비 변성시킨 후 95℃, 30초, 56℃, 30초 그리고 72℃, 30초씩 3 단계로 PCR을 30 사이클 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 5 분간 연장시켰다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔에서 343 bp의 밴드 유무를 확인하였다.

다. 실험 결과

PF2mer 또는 PF3mer를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물을 전기 영동에 의해 분석한 결과, 하기 표 2 및 도 5에서 나타난 것처럼 한우에서는 343bp의 PCR 산물이 만들어지지만 다른 품종은 PCR 산물이 만들어지지 않았다.

품 종	생성되는 PCR 산물의 크기(bp)
한 우	343
젖 소 (Holstein)	생성물 없음
흑 우 (Angus)	생성물 없음

실시예 3

재료 및 DNA 분리는 실시예 1에서와 같다.

가. 실시간 PCR용 프라이머 및 TaqMan^TMMGB 프로브

MC1R 유전자의 (AF445642) 559번째에서 596번까지를 전방 프라이머로 (5‘-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3’), 그리고 617번째에서 633번까지를 역 프라이머 (5'-TCCAGCTGCTGCACCAC-3')로 사용하여 75bp의 PCR 산물을 생산하고자 하였다. 그리고 이 사이에 있는 한우에 있어 594번째 구아닌의 결손을 인식하는 VIC-표지된 리포터 1 TaqMan　 MGB 프로브 (CCAGGACACCGCCT)와 한우가 아닌 시료는 구아닌이 존재하는 것을 인식하는 FAM-표지된 리포터 2 TaqMan^TMMGB 프로브 (CCAGGACACCGGCCT)를 이용하였다 (Applied Biosystems, USA). 이 프라이머와 프로브는 Assays-by-Design 서비스 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 40X 분석 혼합물(총 187.5μL중 전방 프라이머 농도 : 36μM, 역 프라이머 농도 : 36μM, 프로브 농도 : 8μM (VIC- 및 FAM-표지된 프로브 각각))로 준비하였다.

나. PCR에 의한 MC1R의 증폭 및 전기영동

PCR 반응을 위한 반응액은 주형 DNA 11.875 ㎕, 40X 분석 혼합물 0.625 ㎕, TaqMan^TMUniversal PCR master mix (2X) 12.5 ㎕로 총 25 ㎕로 조정하였다. 실시간 PCR은 ABI Prism 7000 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행되었는데 PCR 수행은 95℃에서 10 분간 예비변성시킨 후 92℃, 15초, 60℃, 1분간의 2 단계로 PCR을 40 사이클 수행하였다. PCR 수행이 끝난 후 결과의 분석은 SDS 7000 소프트웨어 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였다.

다. 실험 결과

VIC-표지된 리포터 1 TaqMan^TM MGB 프로브 (CCAGGACACCGCCT)와 FAM-표지된 리포터 2 TaqMan^TM MGB 프로브 (CCAGGACACCGGCCT)를 이용하여 실시간 PCR을 수행하면 그 결과는 하기 표 3 및 도 6과 같이 나타난다.

TaqMan　 MGB 프로브 종류	품 종
VIC-염료 양성	한 우
FAM-염료 양성	젖소, 흑우

본 발명의 한우육 판별 방법은 도축과정 이후에 한우와 비한우간에 판별의 어려움을 극복하여 비 한우의 불법유통을 차단하여 한우에 대한 신뢰도 증가 및 인지도 증가로 인해 양축농가의 소득증대 및 소고기 유통에 있어서의 질서확립에 커다란 기여를 할것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

한우와 비한우 MC1R 유전자에 대해, 전방 프라이머로서 5'-CAGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3'(서열 번호 1)와 역 프라이머로서 5'-GGCCAGCATGTGGACGTAGA-3'(서열 번호 2)을 이용하여 한우와 비한우 MC1R 유전자를 PCR에 의해 증폭시키는 단계;

PCR 산물을 적합한 제한 효소로 처리하는 단계; 및

제한 효소 처리된 PCR 산물을 전기 영동하는 단계를 포함하는 한우육 판별 방법에 있어서, 상기 제한 효소는 Hpa II 또는 Hap II인 것을 특징으로 하는 한우육 판별 방법.
삭제
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제1항의 방법에 이용하기 위한 프라이머쌍으로서,

5 '-CAGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3'(서열 번호 1)의 전방 프라이머 및 5'-GGCCAGCATGTGGACGTAGA-3'(서열 번호 2)의 역 프라이머로 구성되는 프라이머쌍.
삭제
한우 또는 비한우의 MC1R 유전자를 PCR에 의해 증폭하는 단계; 및

PCR 산물을 전기 영동하여 PCR 산물의 생성 여부를 판단하는 단계

를 포함하는 한우육 판별 방법으로서, PCR 반응을 위한 5' 프라이머로서 한우의 MC1R 유전자의 594번째 구아닌(G)이 결여된 부분을 포함하되 비한우의 MC1R 유전자에는 3'쪽의 2-mer 또는 3-mer가 상보적이지 않아 프라이머와 주형(template)이 결합하지 않는 테일(tail)을 형성하는 5'-GCC GCT GCT GGA GGC CGT G-3'(서열 번호 3) 또는 5'-GCC GCT GCT GGA GGC CGT GT-3'(서열 번호 4) 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 한우육 판별 방법.
한우의 MC1R 유전자의 594번째 구아닌(G)이 결여된 부분을 포함하되 비한우의 MC1R 유전자에는 3'쪽의 2-mer 또는 3-mer가 상보적이지 않아 프라이머와 주형(template)이 결합하지 않는 테일(tail)을 형성하는 5'-GCC GCT GCT GGA GGC CGT G-3'(서열 번호 3) 또는 5'-GCC GCT GCT GGA GGC CGT GT-3'(서열 번호 4)의 프라이머.
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한우 또는 비한우의 MC1R 유전자의 증폭을 위한 5'-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3'(서열 번호 7) 전방 프라이머와, 5'-TCCAGCTGCTGCACCAC-3'(서열 번호 8) 역 프라이머와, 한우의 MC1R 유전자에 있어 594번째 염기에서 구아닌의 결손을 인식하며 형광 표지된 프로브로서 5'-CCAGGACACCGCCT-3'(서열 번호 5) 서열을 갖는 프로브와, 비한우의 MC1R 유전자에 있어 594번째 염기에서 구아닌의 존재를 인식하며 형광 표지된 프로브로서 5'-CCAGGACACCGGCCT-3'(서열 번호 6) 서열을 갖는 프로브를 이용하여 한우 또는 비한우의 MC1R 유전자의 실시간 PCR을 실시하는 단계; 및

PCR 실시 후 형광 분석에 의해 한우육을 판별하는 단계

를 포함하는 한우육의 판별 방법.
삭제
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제 11항에 있어서,

한우의 MC1R 유전자에 있어 594번째 염기에서 구아닌의 결손을 인식하는 5'-CCAGGACACCGCCT-3'(서열 번호 5) 서열을 갖는 프로브가 VIC-표지되고 비한우의 MC1R 유전자의 594번째 염기에서 구아닌의 존재를 인식하는 5'-CCAGGACACCGGCCT-3'(서열 번호 6) 서열을 갖는 프로브가 FAM-표지된 방법.
삭제
제11항 또는 제14항의 한우육 판별 방법에 이용하기 위한 형광 표지된 5'- CCAGGACACCGCCT-3'(서열 번호 5) 서열을 갖는 프로브.
제11항 또는 제14항의 한우육 판별 방법에 이용하기 위한 형광 표지된 5'- CCAGGACACCGGCCT-3'(서열 번호 6) 서열을 갖는 프로브.
제16항에 있어서, VIC-표지된 5'-CCAGGACACCGCCT-3'(서열 번호 5) 서열을 갖는 프로브.
제17항에 있어서, FAM-표지된 5'-CCAGGACACCGGCCT-3'(서열 번호 6) 서열을 갖는 프로브.
제11항 또는 제14항의 한우육 판별 방법에 이용하기 위한 전방 프라이머로서 5'-GCTGGAGACGGCAGTCAT-3'(서열 번호 7) 프라이머.
제11항 또는 제14항의 한우육 판별 방법에 이용하기 위한 역 프라이머로서 5'-TCCAGCTGCTGCACCAC-3'(서열 번호 8) 프라이머.