CN105648046B - 一次性鉴别绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭肉的方法 - Google Patents
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Abstract
针对市场上用水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉冒充羊肉的现象，本发明利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计5种动物(绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和鸭)种属特异性引物，通过PCR反应得到长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物电泳检测，能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。
Description
技术领域
本项发明技术将分子生物学技术应用于食品检测领域，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过多重PCR反应和核酸电泳技术检测绵羊、山羊、水貂、海狸鼠和家鸭的肉样品。
背景技术
线粒体DNA(Mitochondrial DNA) 是动物体内唯一存在的核外遗传信息载体，为双链的闭合环状分子，为严格的母系遗传，在高等动物中结构基本一致，大小为16 kb左右，有37个基因（细胞色素C氧化酶的三个亚基 COⅠ、COⅡ、COⅢ的基因，细胞色素b的基因，两个编码 ATP 合成酶亚基 ATPase6 和 ATPase8 的基因，NADH脱氢酶的7个亚基的基因 以及2个rRNA 基因和22个tRNA基因），另外还有一段和复制转录有关的控制区D-loop。
线粒体DNA进化速度较快，具有很强的种属特异性，并且具有分子量小、结构简单稳定、不与组蛋白结合、存在广泛、拷贝数极多、易于操作和分析等优点。线粒体DNA最早用于动物检材的种属鉴定是在法医和考古领域，近年来也被试图用于动物源食品、饲料检测，特别是当检材为熟制品或成分复杂的混合物时，蛋白质分析技术和免疫方法显得无能为力，线粒体DNA的PCR检测则显示出优越性，即使经过高压、蒸煮等处理也会有少量线粒体DNA完整保存下来，经PCR反应扩增百万倍后可经电泳显带，或用更灵敏的实时荧光PCR检测出来。
目前用于种属鉴定的分子生物学方法主要有: 随机扩增多态性DNA分析 (RAPD)、限制性片段长度多态性分析 (RFLP)、扩增片段长度多态性分析 (AFLP)、种属特异 PCR技术等。
PCR-RFLP 技术结果准确, 操作简单, 同时对试验设备要求较低, 冯强等采用PCR-RFLP 技术对Cyt B基因在人及动物间差异进行了研究, 结果表明, 在15 种常见动物中,狗线粒体DNA 有微弱的非特异性扩增产物；对鸡、蛙、鸭、鱼、马线粒体DNA 无扩增产物。根据扩增产物的有或无,可初步区分人与狗、鸡、蛙、鸭、鱼、马。扩增产物经Alu I酶切后,除鳝鱼及人的扩增产物不被酶切外, 牛、猪、羊、猫、猴、兔、豚鼠和鼠均有不同变化。Zehner等采用相同的引物扩增不同动物线粒体DNA 后, 联合应用内切酶Alu I和Nco I酶切扩增产物, 人类cyt b基因的981bp 片段被Alu I酶切, 产生978bp和3bp 片段, 除鸡和火鸡外, 其他动物cyt b基因酶切片段与人类cyt b基因酶切片段明显不同。Nco I可以酶切鸡和火鸡cyt b基因而不酶切人类cyt b基因。
种属特异 PCR是根据扩增的目的基因设计高特异性引物，包括单一或多种属特异性引物，相应的扩增产物就有单一和多种种属目的片段。常规 PCR 技术一次只能扩增一个目的片段。在肉制品检测中, 混合肉的成分比较复杂, 必须对成分的不同动物源性同时进行检测。若是用单一PCR 分开检测这几个项目, 就存在操作繁琐, 耗时费事和试剂消耗大等缺点。Matsunaga等建立多重 PCR 技术, 通过 7 种按适当比例混合的引物, 用一次PCR 同时对食品中的 6 种肉——牛肉、猪肉、鸡肉、山羊、绵羊和马肉中限制性 DNA 片段进行检测, 其中 7 种引物包括一条用线粒体色素细胞 b 基因设计的正链引物和 6 条各物种的特异性的DNA引物，反应采用35个循环进行PCR 扩增, 从山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马肉的扩增产物中分离出长度分别为 157, 227, 274, 331, 398 和 439bp的 DNA 片段,从而根据 DNA 片段的长度来鉴别混合肉制品的动物源性。张娟等克隆出了鸭线粒体DNACOⅢ基因（Genbank accession:DQ655706），利用BLAST软件、Bioedit软件分析线粒体DNA序列，根据鸭线粒体DNA COⅢ基因的特异性，设计引物（5-CTCATCTATCCTGCTAGCCGC-3′）、（5′-TACCAACCCCCGAACTA GGC-3′），利用此引物PCR扩增鸭DNA的特异性片段为226bp。王丽媛等根据线粒体细胞色素b基因设计一条共用的上游引物，根据种属差异设计其下游引物，然后通过多种类引物的合理配比，可以同时对样品中的多种动物源成分进行鉴定。
针对市场上用鸭肉、海狸鼠肉和水貂肉经过加工冒充羊肉的现象，需要一个统一的检测方法，以鉴别绵羊肉、山羊肉、鸭肉、水貂肉和海狸鼠肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。曾经提出或使用过的方法，如红外线光谱检测、蛋白质指纹方法、免疫学方法、随机扩增多态性DNA分析 (RAPD) 、限制性片段长度多态性分析 (RFLP)和扩增片段长度多态性分析 (AFLP)等均存在某些缺点，如检测结果不稳定、难以区分混合肉样、难以鉴别熟肉制品等。本发明利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列设计种属特异性引物，通过PCR反应得到长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物电泳检测，能够一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、鸭肉、水貂肉和海狸鼠肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分。
发明内容
本发明既提供一种由10种引物（S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R的浓度为1.47、1.47、0.88、0.88、0.88、0.88、1.18、1.18、0.59、0.59μmol/Lμmol/L）、PCR反应液、DNA Marker、五种目的片段组成的试剂盒，也提供一种用这种试剂盒对待测样品DNA进行扩增并电泳检测的方法。
为了鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，利用动物种属间特异性较强的线粒体DNA序列针对每种动物分别设计各自的种属特异性引物，分别以绵羊、山羊、鸭、水貂和海狸鼠5种动物的全基因组DNA为模板，通过PCR反应得到5种长度各不相同的特异性扩增片段，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，5种长度不同的条带可以在电泳图中分辨出来（见附图1）。
用于鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉所用的5种动物引物序列为：
绵羊：
S-F: 5'-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3'
S-R: 5'-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3' 扩增片段大小为265bp
山羊：
G-F: 5'-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3'
G-R: 5'-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3' 扩增片段大小为578bp
水貂：
M-F: 5'- CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3'
M-R: 5'- TGCAGTAGGGGAATGATAG-3' 扩增片段大小为230bp
海狸鼠：
N-F: 5'- CGGCTCTTACACCTTCATA-3'
N-R: 5'- TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3' 扩增片段大小为812bp
鸭：
D-F: 5'- GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3'
D-R: 5'- GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3' 扩增片段大小为348bp
本发明所针对的绵羊属于哺乳纲-偶蹄目-反刍动物亚目-牛科-羊属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_001941.1；山羊属于哺乳纲-偶蹄目-反刍动物亚目-牛科-羊属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_005044.2；水貂属于哺乳纲-食肉目-鼬科-鼬属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_020641.1；海狸鼠属于哺乳纲-啮齿目-豪猪型亚目-海狸鼠科-海狸鼠属，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为AF422919.1；家鸭属于鸟纲-雁形目-鸭科-河鸭属-绿头鸭，线粒体DNA序列来自于Genbank，序列号为NC_009684.1。所有引物均为自行设计。
5种动物肉样单PCR反应共同的反应条件为：
预变性 94℃ 10min
循环 94℃ 30s
59℃ 30s
72℃ 1min 共30个循环
延伸 72℃ 10min 冷却，电泳检测。
将5种动物的肉样的DNA与5对引物进行5×5交叉试验，没有非特异性扩增。将5对引物中的任何2对混合后进行PCR扩增，引物间没有明显的竞争或干扰。将5种肉样的DNA中的任何2种混合后PCR扩增，模板间没有明显的相互干扰。将5种肉样经100℃加热10min或120℃高压加热20min后，PCR产物有所减少，但电泳条带仍清晰可见。
为达到五重PCR反应的最佳扩增效果，将S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R共10种引物的原液（浓度各为10μmol/L）按照5:5:3:3:3:3:4:4:2:2的比例混合得到混合引物，即得到的混合引物中S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R的浓度分别为1.47、1.47、0.88、0.88、0.88、0.88、1.18、1.18、0.59、0.59μmol/L。
五重PCR反应体系为：总体积20μl，Multiplex PCR MasterMix PCR反应液10μl(购自北京康为生物技术有限公司)，混合引物3.4μl，模板DNA 1.0μl，去离子水补至20μl。
为使电泳检测更加方便，试剂盒中除了提供混合引物、PCR反应液外，还可以包括DNA Marker，可以直接由市售的现有产品充当，也可以用经过PCR扩增、电泳分离、胶回收纯化得到的5种纯化的目的片段的混合液作为一种Marker。
此方法通过实验证实了正确可靠，是一种可以一次性、准确、稳定、简单快捷的鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉，以及混合或加工过的肉制品中的这五种肉的成分的种属特异性的多重PCR方法。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
本实施例中的试剂盒由10种引物（S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R的浓度分别为1.47、1.47、0.88、0.88、0.88、0.88、1.18、1.18、0.59、0.59μmol/L）、PCR反应液、DNA Marker GM345（购自生工生物工程（上海）有限公司）、5种纯化的目的片段混合成的Marker组成。用量由待测样品的量决定。待测样品为经过冷冻的生肉，由绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉中的某几种粉碎混合成。
实验步骤：
1、DNA提取：按照常规的DNA提取方法或试剂盒进行DNA提取均可。为缩短检测所耗时间，采用动物组织全基因组提取试剂盒提取（购自生工生物工程（上海）有限公司）。肉样的选取要有代表性，先肉眼大致区分肌肉组织、脂肪组织以及不同色泽、纹理的肉样，然后用干净的镊子或剪刀取6份肉样，每份25mg左右，置于6个2ml离心管中。按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。组织消化时间为1-3小时，消化时间越长，DNA提取效果越好，因此选择消化3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间,浓度为20-50ng/μl，将6管DNA相互充分混合均匀。
2、PCR扩增：6管待测DNA每管做2个平行实验，共12个管进行扩增，反应体系为：总体积20μl，Multiplex PCR MasterMix（含Taq DNA聚合酶、4种dNTP等，购自北京康为生物技术有限公司）10μl，混合引物（S-F、S-R、G-F、G-R、D-F、D-R、M-F、M-R、N-F、N-R的浓度分别为1.47、1.47、0.88、0.88、0.88、0.88、1.18、1.18、0.59、0.59μmol/L）3.4μl，待测模板DNA 1.0μl，去离子水补至20μl。设空白对照一管，不加待测模板DNA，用水补齐体积。
反应条件为：
预变性 94℃ 10min
循环 94℃ 30s
59℃ 30s
72℃ 1min 共30个循环
延伸 72℃ 10min 冷却
3、电泳检测：产物用TBE做缓冲液的3%的琼脂糖凝胶电泳检测，取2-5μl上样。与DNA Marker GM345及5种纯化的目的片段的混合Marker对比，待测肉样含有绵羊肉、鸭肉和海狸鼠肉，与事实相符，12个PCR结果完全一致，说明此方法正确可靠。
本方法用5对引物同时进行多重PCR反应，反应体系和条件一致，5对引物间以及和5种动物的模板DNA间没有相互干扰，不影响结果，5种目的片段大小不同，在电泳图上可以清晰分辨开，因此可一次性的鉴别出5种动物的肉样，节省了时间、人力和试剂、耗材。
附图说明：
附图1 五种肉类（绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉）PCR电泳图。
5种动物引物核苷酸序列：
绵羊：
S-F: 5'-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3'
S-R: 5'-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3'
山羊：
G-F: 5'-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3'
G-R: 5'-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3'
水貂：
M-F: 5'- CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3'
M-R: 5'- TGCAGTAGGGGAATGATAG-3'
海狸鼠：
N-F: 5'- CGGCTCTTACACCTTCATA-3'
N-R: 5'- TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3'
鸭：
D-F: 5'- GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3'
D-R: 5'- GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3'
Claims (3)
1.一种用于一次性鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉所用的5 种动物引物，其特征在于具有如下核苷酸序列：
绵羊：
S-F: 5'-TAAAGACATCCTAGGTGCTATC-3'
S-R: 5'-GCTCCGTTGCTTTGATGTA-3' 扩增片段大小为265bp
山羊：
G-F: 5'-CCTCCTGCTCGCGACAATG-3'
G-R: 5'-AGATGTGTGGAGGAAGGGTACA-3' 扩增片段大小为578bp
水貂：
M-F: 5'- CGCCCTATTCCTCATTTTAACA-3'
M-R: 5'- TGCAGTAGGGGAATGATAG-3' 扩增片段大小为230bp
海狸鼠：
N-F: 5'- CGGCTCTTACACCTTCATA-3'
N-R: 5'- TGTTTTCTGTGAGGCTTGTTACA-3' 扩增片段大小为812bp
鸭：
D-F: 5'- GTGATTCCACTACAACTCATCTATCCT-3'
D-R: 5'- GTGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3' 扩增片段大小为348bp。
2.一种一次性鉴别绵羊肉、山羊肉、水貂肉、海狸鼠肉和鸭肉的方法，其特征在于包括如下步骤：
（a）选取肉样并提取DNA；
（b）利用如权利要求1所述的5种动物引物对步骤（a）提取的DNA进行PCR扩增，反应条件为：
预变性 94℃ 10min
循环 94℃ 30s
59℃ 30s
72℃ 1min 共30 个循环
延伸 72℃ 10min 冷却；
（c）电泳检测。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：总体积20μl，Multiplex PCR MasterMix PCR 反应液10μl，混合引物3.4μl，模板DNA 1.0μl，去离子水补至20μl。
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