CN113430279A - 用于肉制品中动物种源成分筛查的dna宏条形码检测靶标序列、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列、检测试剂盒及检测方法。DNA宏条形码检测靶标序列是线粒体16SrRNA基因上的一个片段，在23个目标物种中该片段长度为368bp～384bp，试剂盒包括一对通用引物、反应试剂。利用检测试剂盒对肉制品中动物种源成分进行筛查时，包括以下步骤：采用通用引物对被检样品的基因组DNA进行PCR扩增，并将扩增产物回收、纯化；将纯化好的扩增产物进行二代测序；进行比对或生物信息学分析，确定被检样品的种源成分。本发明为肉制品中23个物种(包括14种食用动物和9种非食用动物)的非定向筛查提供了可靠的手段，具有非定向、高通量、灵敏度高等特点。

Description

用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序 列、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于技术领域，具体涉及用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

随着人们生活品质的提高，全球对于肉制品的需求也越来越大，肉制品中动物种源成分的检测成为了食品监管和市场管理部门的一项重要工作。自2015年10月1日起施行的《中华人民共和国食品安全法》明确禁止生产、经营用非食品原料生产的食品，而且强调预包装食品的标签应当标明其正确成分，违反者将由各地卫生行政部门、食品安全监督管理等部门处以严厉惩罚。随后，在2017年食品药品监管总局发布了《食品安全欺诈行为查处办法》(征求意见稿)，将多项常见食品安全掺假欺诈行为划分为产品欺诈、标签说明书欺诈、信息欺诈等多个类别，并提出相应的惩处措施。为了获得更高的经济效益，肉制品掺假形式和掺假成分也越来越多样，含有未知种源成分的掺假肉制品经加工后流入市场，严重损害消费者利益，并带来食品安全隐患，因而需要对肉制品中的种源成分进行筛查。

目前国内外已报道了多种肉制品中动物种源成分检测技术，包括多重PCR检测、酶联免疫吸附法等，但这些检测方法通常只能针对一种或几种动物种源成分进行检测，对于多物种成分的复合样品往往要进行多次实验、对未知样品的盲检筛查难度更大。而在实际应用中，掺假成分往往更为复杂，且检测人员很难获知样品所含种源成分的具体信息。因此，有必要建立一种高通量的非定向检测技术来保障肉类食品安全，满足监管部门的筛查要求。DNA序列具有丰富的变异和较好的热稳定性，被认为是最佳的种源检测靶标。2003年加拿大科学家Hebert首先提出了DNA条形码技术，该技术是利用生物体内能够代表该物种的、标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的保守性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种的快速、准确和标准化鉴定。而DNA宏条形码技术是将DNA条形码技术与二代测序技术结合，借助二代测序所具有的高通量优势，可以得到混合样品中所含多个物种的序列信息。但是由于要检测种类越多，且检测深加工肉制品对序列长度有一定的要求，这都导致合适长度及扩增效率高的标记难以确定，通用引物的设计难度越大，容易引起特异性差，灵敏度不高等问题。针对目前肉制品掺假成分复杂多样的问题，普通的DNA条形码要经过多个实验才能确定样品种源成分信息，所以急需建立一种DNA宏条形码技术对肉制品中多种动物种源成分进行非定向筛查，为监管部门提供技术支撑，杜绝掺假、掺杂肉类流入市场。

发明内容

本发明的一个目的在于提供用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列及其试剂盒。

本发明的第二个目的在于提供用于肉制品中动物种源成分筛查的检测试剂盒。

本发明的目的还在于提供用于肉制品中动物种源成分筛查的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列，DNA宏条形码靶标序列为线粒体16S rRNA基因上的一个片段，在23个目标物种中该片段长度为368bp～384bp，根据不同物种在该片段序列中的差异即可实现区分物种的目的。

进一步地，DNA宏条形码靶标序列通过通用引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示对23种动物的基因组DNA扩增获得，其中，序列SEQ ID No.1中碱基M代表为简并碱基A/C，碱基Y代表为简并碱基C/T，碱基R按照简并碱基A/G。

进一步的，所述23个目标物种包括牦牛(Bos grunniens)，普通牛(Bos taurus)，水牛(Bubalus bubalis)，山羊(Capra hircus)，绵羊(Ovis aries)，马鹿(Cervuselaphus)，梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)，猪(Sus scrofa)，驴(Equus asinus)，马(Equus caballus)，狗(Canis lupus familiaris)，貉子(Nyctereutes procyonoides)，狐狸(Vulpes vulpes)，水貂(Neovison vison)，猫(Felis catus)，兔(Oryctolaguscuniculus)，豚鼠(Cavia porcellus)，小鼠(Mus musculus)，大鼠(Rattus norvegicus)，仓鼠(Mesocricetus auratus)，鸡(Gallus gallus)，鸭(Anas platyrhynchos)和鹅(Ansercygnoides)。

用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码的通用引物，所述通用引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中，序列中碱基M代表简并碱基A/C，碱基Y代表简并碱基C/T，碱基R代表简并碱基A/G；

SEQ ID No.1：5’-MAYAAGACGAGAAGACCCTRTG-3’

SEQ ID No.2：5’-CGGTCTGAACTCAGATCACGTA-3’。

进一步地，所述动物种源成分筛查包括牦牛(Bos grunniens)，普通牛(Bostaurus)，水牛(Bubalus bubalis)，山羊(Capra hircus)，绵羊(Ovis aries)，马鹿(Cervuselaphus)，梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)，猪(Sus scrofa)，驴(Equus asinus)，马(Equus caballus)，狗(Canis lupus familiaris)，貉子(Nyctereutes procyonoides)，狐狸(Vulpes vulpes)，水貂(Neovison vison)，猫(Felis catus)，兔(Oryctolaguscuniculus)，豚鼠(Cavia porcellus)，小鼠(Mus musculus)，大鼠(Rattus norvegicus)，仓鼠(Mesocricetus auratus)，鸡(Gallus gallus)，鸭(Anas platyrhynchos)，鹅(Ansercygnoides)。

用于肉制品中动物种源成分筛查的检测试剂盒，其包括如上所述的通用引物。

如上所述的试剂盒，其还包括：Prime STAR GXL DNA酶、dNTPs、5×Prime STARGXL缓冲液、双蒸水。

一种用于肉制品中动物种源成分筛查的检测方法，其包括如下步骤：

S1、提取样品的DNA；

S2、采用上述检测试剂盒对提取的DNA进行PCR扩增；并将扩增产物回收、纯化；

S3、将纯化好的扩增产物构建测序文库，进行二代测序；

S4、将测序结果进行比对或生物信息学分析，确定被检样品的种源成分，其中，动物种源的成分用于包括对牦牛，普通牛，水牛，山羊，绵羊，马鹿，梅花鹿，猪，驴，马，狗，貉子，狐狸，水貂，猫，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，仓鼠，鸡，鸭，鹅的筛查。

如上所述的检测方法，优选地，步骤S2中，所述PCR扩增的反应体系包括双蒸水11.2μL，0.4μL如SEQ ID No.1所示的正向引物，0.4μL如SEQ ID No.2所示的反向引物，2μLDNA模板；0.4μL的Prime STAR GXL DNA Polymerase；1.6μL的dNTPs；4μL的5×Prime STARGXL Buffer，其中，正向引物与反向引物的浓度为10μL mol/L。

如上所述的检测方法，优选地，步骤S2中，PCR扩增的反应条件为98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸30s，共30个循环，置4℃保存。

如上所述的检测方法，优选地，步骤S4中所述生物信息学分析步骤为：

①采用FastQC(v0.11.7)对测序结果的质量进行分析，包括碱基质量、碱基含量分布、GC含量分布、测序数据平均质量；

②采用AdapterRemoval(v2.2.2)去除3'端的接头序列，对数据长度及质量进行过滤；

③根据重叠片段信息，利用FLASH(v1.2.11)软件进行短片段拼接；

④使用Cutadapt(v3.2)切除两端的引物序列，过滤其余无关序列；

⑤利用Vsearch(v2.14.1)去除扩增过程中产生的嵌合序列和冗余序列并过滤长度小于300bp或大于450bp的数据；

⑥经过质控、去冗余、去嵌合体之后，通过NCBI BLAST对结果文件中的代表性DNA序列进行物种注释，相似度最高且在99％以上的物种即为样品内所含种源成分。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了用于检测肉制品种源成分的DNA宏条形码靶标序列、通用引物、检测试剂盒和检测方法，通过一对引物在一个反应内实现未知样品中多个种源成分的非定向检测鉴定，为肉制品种源成分检测提供鉴别、评估以及为掺假肉制品提供举证方法和依据。

与传统的种源检测方法相比，本发明具有极其显著的有益效果，包括：

(1)本发明自主筛选了一段用于检测肉制品中动物种源成分的DNA宏条形码靶标序列，该序列在23个目标物种中普遍存在且具有足够变异，任意两个物种间存在至少7个碱基的差异，可根据序列差异对目标物种进行准确鉴别。

(2)本发明利用一对通用引物实现23个物种DNA的一致性扩增，具有适用性好、易扩增等特点。其中反向引物区域在23个物种中完全一致，正向引物采用简并碱基消除引物序列差异对扩增效率的影响，避免了假阴性结果，提高了扩增检测的可靠性。

(3)本发明将PCR技术与二代测序相结合，建立了肉制品中23种动物种源成分高通量筛查的DNA宏条形码检测方法，从根本上解决了现有检测技术盲检难度大、低通量、操作复杂等问题。

(4)本发明提供了一种利用一对引物的一次反应鉴别多个目标物种的DNA宏条形码方法，为肉制品中23种物种(包括14种食用动物和9种非食用动物)的非定向筛查提供了高效、可靠的手段，具有非定向、高通量、灵敏度高等的特点。

附图说明

图1为本发明中目标物种参考基因组的DNA宏条形码靶标序列比对结果。

图2为通用引物对23个目标物种的PCR扩增结果，其中，各泳道中编号说明如下：M：DL2000 DNA Marker，B：空白对照，1：牦牛，2：普通牛，3：水牛，4：山羊，5：绵羊，6：马鹿，7：梅花鹿，8：猪，9：驴，10：马，11：狗，12：貉，13：狐，14：貂，15：猫，16：兔，17：豚鼠，18：小鼠，19：大鼠，20：仓鼠，21：鸡，22：鸭，23：鹅。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1

1.1.DNA宏条形码检测靶标序列筛选和通用引物设计

从NCBI的Nucleotide数据库下载23个目标物种(牦牛、普通牛、水牛、山羊、绵羊、马鹿、梅花鹿、猪、驴、马、狗、貉、狐狸、水貂、猫、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、鸭、鹅)的靶标序列，并使用MEGA软件进行序列比对分析，在保守区域设计一对通用引物。正向引物区域在23个物种参考基因组内含有三个变异位点，在变异位点合成时设计采用了简并碱基，碱基M按照简并碱基A/C进行合成，碱基Y按照简并碱基C/T进行合成，碱基R按照简并碱基A/G进行合成，并反向引物区域则是完全保守的，并且扩增区域具有高度的种间多样性，不同物种存在不同的变异位点，可以根据序列对各个物种进行区分。引物结合区域的差异碱基使用简并碱基。正、反向通用引物序列如序列表SEQ ID NO：1和2所示。

16S-F(SEQ ID No.1)：MAYAAGACGAGAAGACCCTRTG

16S-R(SEQ ID No.2)：CGGTCTGAACTCAGATCACGTA

mtDNA中的COI基因在之前的研究中被称为是用于动物物种识别的最有效的DNA条形码靶基因，现有技术常通过扩增COI基因的全序列达到种源鉴定的目的，但是COI基因全长为658bp，不适用于检测深加工肉制品。本发明通过比对目标物种的mtDNA序列，在条形码序列筛选过程中发现，16S rRNA基因在目标物种中保守区域多，物种之间变异程度大，之前的研究也证明了其是用于物种鉴定的遗传标记之一，囊括的核酸序列信息可以识别区分现有的生物物种。本发明筛选的DNA宏条形码检测靶标序列位于16SrRNA基因上，在牦牛，普通牛，水牛，山羊，绵羊，马鹿，梅花鹿，猪，驴，马，狗，貉子，狐狸，水貂，猫，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，仓鼠，鸡，鸭，鹅的这23个目标物种中该片段长度为368bp～384bp，既满足检测深加工肉制品中种源成分的要求，又涵盖足够的物种信息，可以对所有目标物种进行区分。

1.2.样品采集及DNA提取

采用牦牛、普通牛、水牛、山羊、绵羊、马鹿、梅花鹿、猪、驴、马、狗、貉、狐狸、水貂、猫、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、鸭、鹅这23种动物的肌肉样作为实验材料进行DNA模板的提取。

DNA模板的提取采用苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京:科学出版社，1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其它提取方法。DNA模板制备后，将各个物种的基因组DNA稀释至20ng/μL，并于-20℃下保存备用。

1.3.PCR扩增验证

PCR扩增片段为线粒体16S rRNA基因片段，正、反向通用引物序列如序列表SEQ IDNO：1和2所示。反应体系是20μL包括：双蒸水11.2μL，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，2μLDNA模板；0.4μL的Prime STAR GXL DNA Polymerase(Takara公司)；1.6μL的dNTPs；4μL的5×Prime STAR GXL Buffer(Takara公司)。其中，正向与反向引物的浓度为10μmol/L，DNA模板浓度为20ng/μL，并以双蒸水为模板设置空白对照。反应条件为98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸30s，共30个循环，置4℃保存。

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统下观察扩增结果。

1.4.结果分析与表述

1.4.1.参考序列比对结果

序列比对结果如图1所示，框内序列为通用引物区域。因不同物种在16SrRNA基因上有不同的插入缺失位点，通用引物扩增片段在368bp至384bp之间。序列两端的高度保守区是设计的引物结合区，序列内部的高度变异区可用于物种鉴别，该序列在23个目标物种间存在至少7个碱基差异，可作为DNA宏条形码靶标序列。结果表明，不同物种的靶标序列大小在368bp至384bp之间，正向引物区域在23个物种参考基因组内含有三个变异位点，在变异位点设计了简并碱基，反向引物区域则是完全保守的，并且扩增区域具有高度的种间多样性，不同物种存在不同的变异位点，可以根据序列对各个物种进行区分。

1.4.2.PCR验证结果

电泳结果如图2所示，通用引物在这23个物种中都扩增出了大小相似的目的片段，条带明亮程度相似，表明扩增效率相近，且无任何非特异性扩增，而空白对照中没有任何扩增片段。结果显示本发明的通用引物对和反应体系对目标物种靶标序列具有较好的扩增效果，适用性好。将产物进行一代测序判断通用引物的扩增准确性，结果如表1所示，23个物种的测序结果均与NCBI中已发表序列比对结果一致，序列相似度均在99.7％以上，各物种扩增序列结果见表1。

表1.一代测序结果

实施例2样品中目标物种源性成分检测

2.1.样品采集及DNA提取

样品采集及DNA提取同实施例1。

2.2.样品制备

将23个物种的DNA以相同比例进行混合，每个物种DNA含量所占比例各为4.35％，最终浓度约为0.87ng/μL，作为试验样品，并于-20℃下保存备用。

2.3.PCR扩增及产物回收纯化

PCR扩增同实施例1。

PCR产物纯化使用

Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒或者公认的、具有相同效力的其他扩增产物纯化方法。

2.4.二代测序

利用Illumina文库构建试剂盒对纯化好的扩增产物进行测序文库的构建，并使用Illumina NovaSeq PE250平台进行二代测序。

2.5.生物信息学分析

①采用FastQC(v0.11.7)对测序结果的质量进行分析，包括碱基质量、碱基含量分布、GC含量分布、测序数据平均质量；

②采用AdapterRemoval(v2.2.2)去除3'端的接头序列，采用滑动窗口法进行质量过滤，窗口大小设置为5bp，步长设置为1bp。每一次往前移动一个碱基，取5个碱基计算窗口的平均Q值，若窗口的平均Q值≤20，则仅保留该窗口倒数第二个碱基及之前的碱基。若双末端中任意一条reads的长度≤50bp，则去除该双末端reads。

③根据重叠片段信息，利用FLASH(v1.2.11)软件进行短片段拼接，拼接时保证有10bp的重叠区；

④使用Cutadapt(v3.2)切除两端的引物序列，过滤其余无关序列；

⑤利用Vsearch(v2.14.1)基于全长模式去除冗余序列，基于无参考数据库的denovo方法去除扩增过程中产生的嵌合序列，过滤长度小于300bp或大于450bp的数据；

⑥经过质控、去冗余、去嵌合体之后，通过NCBI BLAST对结果文件中的代表性DNA序列进行物种注释，相似度最高且在99％以上的物种即为样品内所含种源成分。

2.6.结果分析与表述

试验结果见表2。试验结果显示测序数据经生物信息学分析后，DNA混合样品中23个物种均被鉴定到。表明本发明可以在一次反应中对复杂的混合DNA样品进行准确的高通量鉴定，并且能够有效鉴别样品中所含的所有物种的源性成分。

表2.样品中目标物种源性成分检测结果

实施例3灵敏度试验

将23个物种的DNA以不同比例进行混合，14个食用动物(牦牛、普通牛、水牛、山羊、绵羊、马鹿、梅花鹿、猪、驴、马、兔、鸡、鸭、鹅)作为主要成分，各物种DNA所占比例均为7.08％，最终浓度约为1.42ng/μL；9个非食用动物(狗、貉、狐狸、水貂、猫、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠)作为次要成分，各物种DNA所占比例均为0.10％，最终浓度约为0.02ng/μL。

PCR扩增同实施例1，PCR扩增产物回收纯化、二代测序、生物信息学分析同实施例2。试验结果见表3，试验结果显示，测序数据经生物信息学分析后，DNA混合样品中各物种成分均被鉴定到。表明本发明可以对DNA混合样品中含量0.10％以上的成分进行准确鉴别，灵敏度较好。

表3.灵敏度试验结果

实施例4试剂盒的组装

该试剂盒的组成包括：

本试剂盒储存12个月不影响使用效果。

试剂盒的应用方法：

1.依据需要，按照实施例1中1.3所述的PCR反应体系加样。

2.依据实施例1中1.3所述的PCR扩增条件上样。

3.反应结束后取5μL PCR扩增产物，2.5％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2V/cm～5V/cm，电泳30min～45min)，用GelRed染色，凝胶成像系统检测结果。每个反应需设置空白对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

4.回收并纯化PCR扩增产物，构建测序文库并进行二代测序。

5.依据实施例2中2.5所述的生物信息学分析过程，确定样品中的种源成分。

实施例5市售肉制品检测

从超市购买9份熟肉制品，将各类肉制品分成三类，分别为香肠类(QQ肠、香肠)、火腿类(火腿肠、猪肉火腿、牛肉火腿、西式火腿)和肉馅类(牛肉馅饼、牛肉饺子、火锅饺)肉制品，按等比例混合样品后提取DNA，基因组DNA提取同实施例1。香肠类混合样品商品标签中标有鸡肉、鸭肉、猪肉，火腿类混合样品商品标签中标有牛肉、鸡肉、猪肉，肉馅类混样品商品标签中标有牛肉、鸡肉、鸭肉、猪肉。

使用实施例4中的DNA宏条形码检测试剂盒进行PCR扩增，PCR扩增产物回收纯化、二代测序、生物信息学分析同实例2。试验结果如表4所示，测序数据经生物信息学分析后，三个市售肉制品混合样品均成功检出标签标明物种，而无其它动物成分检出，表明本发明可对市场中各种深加工肉制品中的动物种源成分进行准确、高通量鉴别。

表4.市售肉制品检测结果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应属于本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列、检测试剂盒及检测方法

<160> 25

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttattgatcc aaaaaaaaat tgatcaacgg aacaagttac cctagggata acagcgcaat 240

cctattcaag agtccatatc gacaataggg tttacgacct cgatgttgga tcaggacatc 300

ccgatggtgc aaccgctatc aaaggttcgt ttgttcaacg attaaagtcc tacgtgatct 360

gagttcagac cg 372

<210> 10

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaactatt ccaaaagtta aacaattcaa 60

ccacaaaggg ataaaacata acttaacatg gactagcaat ttcggttggg gtgacctcgg 120

agtacaaaaa accctccgag tgattttaat ctagacaaac cagtcaaaat aaccataaca 180

tcacttattg atccaaaatt ttgatcaacg gaacaagtta ccctagggat aacagcgcaa 240

tcctattcta gagttcctat cgacaatagg gtttacgacc tcgatgttgg atcaggacac 300

ccaaatggtg caaccgctat taaaggttcg tttgttcaac gattaaagtc ctacgtgatc 360

tgagttcaga ccg 373

<210> 11

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaactgat tcacaaaaaa caacatacaa 60

acctaaccct cagggacaac aaaacttttg attgaatcag caatttcggt tggggtgacc 120

tcggagaaca aaacaacctc cgagtgattt aaatctagac taaccagtca aaatacataa 180

tcacttattg atccaaacct ttgatcaacg gaacaagtta ccctagggat aacagcgcaa 240

tcctattcca gagtccatat cgacaattag ggtttacgac ctcgatgttg gatcaagaca 300

tcctaatggt gcaaccgcta ttaagggttc gtttgttcaa cgattaaagt cttacgtgat 360

ctgagttcag accg 374

<210> 12

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaactgat tcacaaaaaa caacacacaa 60

acctaacctt cagggacaac aaaacttttg attgaatcag caatttcggt tggggtgacc 120

tcggagaaca aaacaacctc cgagtgattt aaatccagac taaccagtca aaatatataa 180

tcacttattg atccaaacca ttgatcaacg gaacaagtta ccctagggat aacagcgcaa 240

tcctattcca gagtccatat cgacaattag ggtttacgac ctcgatgttg gatcaagaca 300

tcctaatggt gcaaccgcta ttaagggttc gtttgttcaa cgattaaagt cttacgtgat 360

ctgagttcag accg 374

<210> 13

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaactaac ccaaacttat ggatactaga 60

tacctacaag gcataacata acaccattat tatgagttag caatttaggt tggggtgacc 120

tcggaatata aaaaaactcc cgagtgatta aaatttagac ccacaagtca aaatacaaca 180

tcacttattg atccaataat ttttgatcaa cggaacaagt taccctaggg ataacagcgc 240

aatcctattc aagagtccat atcgacaata gggtttacga cctcgatgtt ggatcaggac 300

atcctaatgg tgcagcagct attaagggtt cgtttgttca acgattaaag tcctacgtga 360

tctgagttca gaccg 375

<210> 14

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aataagacga gaagacccta tggagcttta attacttaac ccaaatttat ggccaacacc 60

cacctaccag gcataaaata ctaccattat tatgggttaa caatttaggt tggggtgacc 120

tcggaacata aaaaaacttc cgagtggtta aaatttagac ctaccagtca aaatgtagta 180

tcacttattg atccaattat ttttgatcaa cggaacaagt taccctaggg ataacagcgc 240

aatcctatcc aagagtccat atcgacgata gggtttacga cctcgatgtt ggatcaggac 300

atcctaatgg tgcagcagct attaagggtt cgtttgttca acgattaaag tcctacgtga 360

tctgagttca gaccg 375

<210> 15

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaattagc ccaaacttat gaactttaaa 60

ccccactggg aataacatac taccattgtt atgggctaac aatttaggtt ggggtgacct 120

cggaatataa aaaaactccc gagtgattaa aatttagacc taccagtcaa aatgtaccat 180

cacttattga tccaataatc tttgatcaac ggaacaagtt accctaggga taacagcgca 240

atcctattta agagtccata tcgacaatag ggtttacgac ctcgatgttg gatcaggaca 300

tcctaatggt gcagcagcta ttaagggttc gtttgttcaa cgattaaagt cctacgtgat 360

ctgagttcag accg 374

<210> 16

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaactaac ccataataat ttataaactc 60

acctaccagg tctaacacaa cattattact gggttaacaa tttaggttgg ggtgacctcg 120

gagaataaaa caacctccga gtgattaaat cacagacaaa ccagtcgaag cattttatca 180

tttattgatc caatatcttg atcaacggaa caagttaccc tagggataac agcgcaatcc 240

tatttgagag tccatatcaa caatagggtt tacgacctcg atgttggatc aggacatcct 300

aatggtgcag cagctattaa gggttcgttt gttcaacgat taaagtccta cgtgatctga 360

gttcagaccg 370

<210> 17

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aataagacga gaagacccta tggagcttta attaaccgac ccaaagagac cctatatcaa 60

ttaaccgaca ggaacaacaa acctctatgt gggccggcaa tttaggttgg ggtgacctcg 120

gagaacaaaa caacctccga gtgatttaaa tctagactac ccagtcgaaa gtattacatc 180

acttgttgat ccaaaaacct tgatcaacgg aacaagttac cctagggata acagcgcaat 240

cctatttcag agtccatatc gacaataggg ttgacgacct cgatgttgga tcaggacatc 300

ccgatggtgc agcagctagc gaaggttcgt ttgttcgacg attaaagtcc tacgtgatct 360

gagttcagac c 371

<210> 18

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aataagacga gaagacccta tggagcttta attatttaac ccaacacttc ctttattcta 60

ctctacaatg agcctaacca aggaaatccc tgggttaaaa attttggttg gggtgacctc 120

ggagtataaa tcaacctccg aatgatttta gcctagaccc aacaagtcaa agcaattata 180

atcataaatt gacccaaata atttgatcaa cggaacaagt taccctaggg ataacagcgc 240

aatcctattt tagagtccct atcgacaata gggtttacga cctcgatgtt ggatcaggac 300

atcccaatgg tgtagccgct attaaaggtt cgtttgttca acgattaaag tcctacgtga 360

tctgagttca gaccg 375

<210> 19

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aataagacga gaagacccta tggagcttta atttattagc ttacttaacc aatttttaac 60

ccataagggc ataacacata cacttaaacc taagctagta atttcggttg gggtgacctc 120

ggagtacaat aaaacctccg aatgatatta gcctagatcc aacaaatcga agtttaaatc 180

accaattgac ccaaattcct tttgatcaac ggaccaagtt accctaggga taacagcgca 240

atcctattct agagttcata tcgacaatgg ggtttacgac ctcgatgttg gatcaggaca 300

tcctaatggt gcagcagcta ttaagggttc gtttgttcaa cgattaatag tcctacgtga 360

tctgagttca gaccg 375

<210> 20

<211> 374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aataagacga gaagacccta tggagcttaa attatataac ttatctattt aatttattaa 60

acctaatggc ccaaaaacta tagtataagt ttgaaatttc ggttggggtg acctcggaga 120

ataaaaaatc ctccgaatga ttataaccta gacttacaag tcaaagtaaa atcaacatat 180

cttattgacc cagatatatt ttgatcaacg gaccaagtta ccctagggat aacagcgcaa 240

tcctatttaa gagttcatat cgacaattag ggtttacgac ctcgatgttg gatcaggaca 300

tcccaatggt gtagaagcta ttaatggttc gtttgttcaa cgattaaagt cctacgtgat 360

ctgagttcag accg 374

<210> 21

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aataagacga gaagacccta tggagcttca atttactagt tcaacttata taaaaacaac 60

ctaatgggct aaaacaaaat aaatatgaac taaaaaattt cggttggggt gacctcggag 120

aataaaaaat cctccgaatg attttaacct agactcacaa gtcaaagtaa tactaatatc 180

ttattgaccc aattattgat caacggacca agttacccta gggataacag cgcaatccta 240

tttaagagtt catatcgaca attagggttt acgacctcga tgttggatca ggacatccca 300

atggtgcaga agctattaat ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac gtgatctgag 360

ttcagaccg 369

<210> 22

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aataagacga gaagacccta tggagcttta atctcacaac ttaattttaa taacaaacag 60

tctactgact ttaaaaaact aaatataagt tgtagatttc ggttggggtg acctcggaga 120

ataaaaaaac ctccgaatga ttataaccta ggcttacaag ccaaagtaca aaatataatc 180

ttattgaccc aaactaattt gatcaacgga ccaagttacc ctagggataa cagcgcaatc 240

ctattcaaga gtccatatcg acaattaggg tttacgacct cgatgttgga tcaggacatc 300

ccaatggtgt agcagctatt aaaggttcgt ttgttcaacg attaaagtcc tacgtgatct 360

gagttcagac cg 372

<210> 23

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cataagacga gaagaccctg tggaacctta aaatcacgac caccttacaa ccttacacag 60

ccccactggg tccacccaca cataaacccc tggtcgacat ttttcggttg gggcgacctt 120

ggagaaaaaa aaatcctcca aacccacaga ccacaactct tcactaagac caactcctca 180

aagtaccaac agtaaccaga cccaatataa ttgagcaatg gaccaagcta ccccagggat 240

aacagcgcaa tctcctccaa gagcccatat cgacaaggag gtttacgacc tcgatgttgg 300

atcaggacaa cctaatggtg caaccgctat taagggttcg tttgttcaac gattaacagt 360

cctacgtgat ctgagttcag accg 384

<210> 24

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cataagacga gaagaccctg tggaacttaa aaatcaacgg ccaccgcgaa cctaagacta 60

aacccaccgg ggctacagac atcgcagagc atggccgata tttttcggtt ggggcgacct 120

tggagaacaa cagatcctcc aaaaacaaga ccacacctct ttacttagag ccacccctca 180

aagtgctaat agtgaccaga cccaatataa ttgattaatg gaccaagcta ccccagggat 240

aacagcgcaa tccccctcaa gagcccctat cgacaggggg gtttacgacc tcgatgttgg 300

atcaggacat cctaatggtg cagccgctat taagggttcg tttgttcaac gattaatagt 360

cctacgtgat ctgagttcag accg 384

<210> 25

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cataagacga gaagaccctg tggaacttaa aaatcaacga ccaccgcgaa tcctcaatca 60

accccactgg ggccactacc atcgcagagc ctggtcgata tttttcggtt ggggcgacct 120

tggaggagaa caaatcctcc aaaaacaaga ccatacctct ttacctagag ctacccctca 180

aagtgctaac agtgaccaga cccaatataa ttgattaatg gaccaagcta ccccagggat 240

aacagcgcaa tccccctcaa gagcccatat cgacaggggg gtttacgacc tcgatgttgg 300

atcaggacat cctaatggtg cagccgctat taagggttcg tttgttcaac gattaacagt 360

cctacgtgat ctgagttcag accg 384

Claims (10)

1.用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列，其特征在于，DNA宏条形码靶标序列为线粒体16S rRNA基因上的一个片段，在23个目标物种中该片段长度为368bp～384bp，根据不同物种在该片段序列中的差异即可实现区分物种的目的。

2.根据权利要求1所述的DNA宏条形码检测靶标序列，其特征在于，DNA宏条形码靶标序列通过通用引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示对23种动物的基因组DNA扩增获得，其中，序列SEQ ID No.1中碱基M代表简并碱基A/C，碱基Y代表简并碱基C/T，碱基R代表简并碱基A/G；

SEQ ID No.1：5’-MAYAAGACGAGAAGACCCTRTG-3’

SEQ ID No.2：5’-CGGTCTGAACTCAGATCACGTA-3’。

3.用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码的通用引物，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中，序列中碱基M代表为简并碱基A/C，碱基Y代表为简并碱基C/T，碱基R按照简并碱基A/G；

SEQ ID No.1：5’-MAYAAGACGAGAAGACCCTRTG-3’

SEQ ID No.2：5’-CGGTCTGAACTCAGATCACGTA-3’。

4.根据权利要求3所述的通用引物，其特征在于，所述动物种源成分的筛查包括对牦牛，普通牛，水牛，山羊，绵羊，马鹿，梅花鹿，猪，驴，马，狗，貉子，狐狸，水貂，猫，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，仓鼠，鸡，鸭，鹅的筛查。

5.用于肉制品中动物种源成分筛查的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求3或4所述的通用引物。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括：Prime STAR GXL DNA酶、dNTPs、5×Prime STAR GXL缓冲液、双蒸水。

7.一种用于肉制品中动物种源成分筛查的检测方法，其包括如下步骤：

S1、提取样品的DNA；

S2、采用上述检测试剂盒对提取的DNA进行PCR扩增；并将扩增产物回收、纯化；

S3、将纯化好的扩增产物构建测序文库，进行二代测序；

S4、将测序结果进行比对或生物信息学分析，确定被检样品的种源成分；其中，动物种源的成分用于包括对牦牛，普通牛，水牛，山羊，绵羊，马鹿，梅花鹿，猪，驴，马，狗，貉子，狐狸，水貂，猫，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，仓鼠，鸡，鸭，鹅的筛查。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的反应体系包括双蒸水11.2μL，0.4μL如SEQ ID No.1所示的正向引物，0.4μL如SEQ ID No.2所示的反向引物，2μLDNA模板；0.4μL的Prime STAR GXL DNA Polymerase；1.6μL的dNTPs；4μL的5×Prime STAR GXL Buffer，其中，正向引物与反向引物的浓度为10μL mol/L。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，PCR扩增的反应条件为98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸30s，共30个循环，置4℃保存。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述生物信息学分析步骤为：

①采用FastQC版号为v0.11.7对测序结果的质量进行分析，包括碱基质量、碱基含量分布、GC含量分布、测序数据平均质量；

②采用AdapterRemoval版号为v2.2.2，去除3'端的接头序列，对数据长度及质量进行过滤；

③根据重叠片段信息，利用FLASH版号为v1.2.11的软件进行短片段拼接；

④使用Cutadapt版号为v3.2，切除两端的引物序列，过滤其余无关序列；

⑤利用Vsearch版号为v2.14.1，去除扩增过程中产生的嵌合序列和冗余序列并过滤长度小于300bp或大于450bp的数据；

⑥经过质控、去冗余、去嵌合体之后，通过NCBI BLAST对结果文件中的代表性DNA序列进行物种注释，相似度最高且在99％以上的物种即为样品内所含种源成分。

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