CN109943645A - 一种淡水鱼类线粒体12s通用宏条形码扩增引物及其应用方法 - Google Patents

一种淡水鱼类线粒体12s通用宏条形码扩增引物及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法，属于生物技术领域。本发明依据常见淡水鱼类线粒体12S基因序列设计了16条宏条形码扩增引物，包括6条上游引物和10条下游引物，该引物对对鱼类群落覆盖度广、扩增效率高，引物组合可以扩增出长度为70bp至350bp的产物，兼容不同高通量测序平台，这种多引物组合的方法可以降低非特异性扩增，提高PCR成功率，可广泛用作特征条码序列进行鱼类物种鉴定、鱼类多样性分析等研究。

Description

一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法。
背景技术
宏条形码(Metabarcoding)是目前最有力的物种多样性分析技术之一，尤其在濒危、珍稀物种的监测中起着重要的作用。随着高通量测序通量的提高和测序成本的降低，宏条形码技术开始越来越多的应用于环境、生物多样性的调查中。其中，环境源DNA包括水样DNA、沉积物DNA、生物膜DNA；生物源DNA是指有生物组织提取出的DNA，例如皮肤、毛发等。DNA的两条链是反向平行结构，人们通常把DNA的羟基(-0H)末端称为3'端，而磷酸基团的末端称为V端。DNA聚合酶不能够从头合成DNA，只能从3'端延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。在PCR反应中，引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。但是，对于不同对象，采用不同的方法，设计引物的思路也不尽相同。
目前用于鉴定动物的DNA条形码主要是线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因片段，经检索，中国专利申请号为201210332088.8，申请公开日为2012年12月19日的专利申请文件公开了一种鸟蛤贝类线粒体COI基因扩增引物。该发明利用通用引物扩增得到的66条鸟蛤科mtCOI序列，通过CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件PrimerPremier 5设计5对引物，用216个鸟蛤科个体在10μL体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，即为NGF5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3’和NGR5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’，该发明的鸟蛤科贝类线粒体COI引物可有效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段，能够满足鸟蛤遗传多样性研究的需要。
再如，中国专利申请号为201010254709.6，申请公开日为2011年1月12日的专利申请文件公开了一种骨螺科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法。该发明的步骤为：a、用COI通用扩增引物扩增出部分骨螺科物种的COI序列，b、将所述的COI通用扩增引物序列与已获得的部分骨螺科物种的COI序列进行比对，找出骨螺科线粒体COI序列在COI通用扩增引物序列段的所有突变碱基，重新合成不同的骨螺科COI扩增引物，c、从新合成的不同COI扩增引物中筛选出扩增骨螺科物种效果最好的一对引物，采用该发明的骨螺科线粒体COI基因扩增引物，可以有效的扩增出骨螺科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究骨螺科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护骨螺科种质资源具有重要意义。
虽然COI基因能够很好区别不同的动物，但由于环境样品中游离的鱼类DNA含量极低，通用COI引物对于鱼类扩增能力很差，使得难以通过环境DNA准确检测鱼类多样性，尤其是对稀有鱼类，传统COI引物几乎无法成功从环境DNA中有效扩增。
尽管有报道称18S引物能够进行大多数动物的物种多样性分析，但是18S引物的PCR产物长度在500-700bp，超出了大多数二代测序平台的读长，而难以在高通量测序平台上进行测序，这也限制了其在环境物种多样性分析中的应用。
中国专利申请号为201210314978.6，申请公开日为2013年2月6日的专利申请文件公开了海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物及其设计和扩增方法。该发明海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成。本发明还提供了所述扩增引物的设计方法和利用该扩增引物对海洋鱼类DNA溶液进行扩增的方法。该发明可以高效特异性地扩增多种海洋鱼类线粒体12SrRNA基因，能应用于鱼类不同分类阶元系统进化的分析研究，但是，总所周知，海洋鱼类终生生活在汪洋大海里，海洋鱼类鱼体组织的含盐浓度比外界海水的含盐浓度要低得多，由于海水中有大量盐分，故比重高、密度大；而淡水鱼则终生生活在江、河、湖泊和溪涧的淡水中，淡水鱼与海洋鱼类大不一样，淡水鱼鱼体组织的含盐浓度比外界淡水的含盐浓度要高，也就是说，淡水的含盐浓度低、比重低、密度小；因此，海洋鱼类与淡水鱼类在进化中存在明显差异，海洋鱼类的引物很难用于淡水鱼类的扩增，而且，该引物扩增出的产物序列长达1200bp，不适用对其进行高通量测序，故需要针对淡水鱼类区系设计更具针对性的引物或者组合，且产物可适用于多种高通量测序平台。
因此需要研究适用于鱼类多样性检测的引物，能在高通量测序平台上进行测序，适用于鱼类物种鉴定、生物多样性分析等研究。
发明内容
1.要解决的问题
针对环境样品中游离鱼类DNA浓度低，现有COI引物对环境样本中鱼类群落的扩增能力差问题，本发明提供一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物，线粒体12S是动物线粒体基因组中相对比较保守的基因，是潜在的进行物种鉴定的条形码区域之一。
本发明还提供了一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，进一步解决了现有引物扩增的产物难以在高通量测序平台上进行测序的问题，依据常见鱼类群落12S基因序列设计了6条上游引物和10条下游引物，上、下游引物的组合可以扩增出长度70bp到350bp不等的PCR产物，引物的简并度低，PCR成功率高，而且PCR产物的长度可以兼容二代高通量测序平台，可用于鱼类物种鉴定、鱼类多样性分析等研究。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物，包括至少一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，
所述的上游引物为Fish-F1：TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA、Fish-F2：AACGTCAGGTCGAGGTGTAGCG、Fish-F3：AGCATCTCNCTTACACNGAGAA、Fish-F4：GTACCTTTTGCATCATGATTTAG、Fish-F5：AGAAAGCGTTAAAGCTC、Fish-F6：GAAGACCCTNTGGAGCTT；
所述的下游引物为Fish-R1.1：ATAGTGGGGTATCTAATCCCAG、Fish-R1.2：TTNTAGAACAGGCTCCTCTAGG、Fish-R2.1：AGAGTGACGGGCGGTGTGTNCG、Fish-R2.2：TTCTCNGTGTAAGNGAGATGCT、Fish-R3.1：TTCCCTTGCGGTACTTTNTCTAT、Fish-R3.2：CTAAATCATGATGCAAAAGGTAC、Fish-R4：CCACTCTTTTGCCACAGAGACG、Fish-R5：TCTTNTTACTCATNTTAGC、Fish-R6.1：CCGNGGTCGCCCCAACC、Fish-R6.2：AACTNGGTNCGTTGATCGG。
进一步地，所述上游引物和下游引物优选地引物对组合为：Fish-F1与Fish-R1.1组合，Fish-F1与Fish-R1.2组合，Fish-F2与Fish-R2.1组合，Fish-F2与Fish-R2.2组合，Fish-F3与Fish-R3.1组合，Fish-F3与Fish-R3.2组合，Fish-F4与Fish-R4组合，Fish-F5与Fish-R5组合，Fish-F6与Fish-R6.1组合，Fish-F6与Fish-R6.2组合。
上述淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其步骤为：
(1)环境DNA样本的提取；
(2)目的片段的扩增：对步骤(1)中的环境DNA样本进行PCR扩增，其中，引物为上述引物组合中的至少一对引物对；
(3)步骤(2)中扩增产物的片段大小分析及鱼类鉴定分析。
进一步地，所述步骤(2)中，上游引物与下游引物组合的摩尔比为1：(1～3)，其中，优选上游引物与下游引物组合中两者的摩尔比为1:1。
进一步地，所述步骤(2)中，Fish-F1与Fish-R1.1组合或Fish-F2与Fish-R2.1组合的引物对进行PCR反应的退火温度为53-58℃；Fish-F1与Fish-R1.2组合、Fish-F3与Fish-R3.1组合、Fish-F4与Fish-R4组合或Fish-F6与Fish-R6.1组合的引物对进行PCR反应的退火温度为50-55℃；Fish-F2与Fish-R2.2组合的引物对进行PCR反应的退火温度为50-58℃，Fish-F3与Fish-R3.2组合的引物对进行PCR反应的退火温度为55-60℃，Fish-F5与Fish-R5组合的引物对进行PCR反应的退火温度为52-59℃；Fish-F6与Fish-R6.2组合的引物对进行PCR反应的退火温度为58-62℃。
进一步地，还包括步骤(4)，其对步骤(2)中的扩增产物进行高通量测序；步骤(3)和步骤(4)的顺序可更换。
进一步地，所述步骤(3)中，Fish-F1与Fish-R1.1组合引物对的PCR产物长度为160-190bp；Fish-F1与Fish-R1.2组合引物对的PCR产物长度为280-310bp；Fish-F2与Fish-R2.1组合引物对的PCR产物长度为120-150bp；Fish-F2与Fish-R2.2组合引物对的PCR产物长度为275-300bp；Fish-F3与Fish-R3.1组合引物对的PCR产物长度为150-180bp；Fish-F3与Fish-R3.2组合引物对的PCR产物长度为220-350bp；Fish-F4与Fish-R4组合引物对的PCR产物长度为80-100bp；Fish-F5与Fish-R5组合引物对的PCR产物长度为80-100bp；Fish-F6与Fish-R6.1组合引物对的PCR产物长度为70-90bp；Fish-F6与Fish-R6.2组合引物对的PCR产物长度为180-210bp。
上述淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物在环境源DNA(包括水样DNA、沉积物DNA和生物膜DNA)和生物源DNA(指有生物组织提取出的DNA，例如皮肤、毛发等)的PCR扩增中的应用。
上述淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物在鱼类物种鉴定、鱼类多样性、鱼类的进化、系统发育、系统地理学或遗传多样性分析中的应用。
上述淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物在鱼类濒危物种和鱼类入侵物种监测中的应用。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明中没有使用传统的COI条形码基因区域，选择鱼类群落较保守的线粒体12S基因作为宏条形码引物区域，提高宏条形码多样性研究中引物对环境DNA中鱼类群落的扩增能力，提高环境低丰度鱼类DNA的扩增与识别；
(2)本发明中设计的引物长度适合高通量测序，传统的引物扩增的片段过长(大于500bp)，不能在二代测序平台上测序，而本发明中设计得到的引物扩增长度在80bp至350bp之间，长度合适，可以在高通量测序平台上测序；
(3)本发明将序列Fish-F1与Fish-R1.1(或Fish-R1.2)组合、Fish-F2与Fish-R2.1(或Fish-R2.2)组合、Fish-F3与Fish-R3.1(或Fish-R3.2)组合、Fish-F4与Fish-R4组合、Fish-F5与Fish-R5组合、Fish-F6与Fish-R6.1(或Fish-R6.2)组合进行PCR扩增得到的产物可用于鱼类物种鉴定和生物多样性分析，特别是能够满足鱼类群落物种鉴定和生物多样性分析研究的需要，对于研究鱼类群落的物种分类、系统发育、系统地理学和保护浮游动物种质资源具有重要意义；
(4)本发明中筛选得到的12S引物简并度低，对淡水鱼类群落具有较强的扩增偏好性，灵敏度高，在模板量为10ng时，所有引物的扩增成功率都超过现有COI、18S的引物扩增成功率，适用于环境样品中低丰度DNA的扩增，进行PCR扩增时条件温和，PCR成功率高，对DNA聚合酶的要求没有COI引物那么苛刻，扩增得到的片段长度小于500bp(70bp至350bp之间)，可以用高通量测序平台测序，一次性可以获得很多序列，成本低，具有很好的应用前景；
(5)本发明的引物是基于我国常见淡水鱼类全线粒体组设计的，具有通用性高的特点，且设计了6条上游引物和10条下游引物，可以很好兼容不同测序平台。
附图说明
图1线粒体12S引物对太湖常见鱼类的PCR扩增电泳图；
图2线粒体12S引物对环境DNA样本的PCR扩增电泳图；
图3线粒体12S引物PCR产物建库片段大小分析图；
图4为实施例4中12S、18S和COI引物分别对环境样本DNA的模板量为10ng时的PCR的成功率；
图5为实施例4中12S、18S和COI引物分别对环境样本DNA的模板量为100ng时的PCR的成功率；
图6为对实施例5中12S、18S和COI扩增产物进行高通量测序的物种信息。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例中所说的引物都由上海捷瑞生物工程有限公司合成，使用前溶解于去离子水中，实施例2中的浮游动物为2014年6月份采集于江苏太湖竺山湾和庙港等位点，进行物种鉴定后提取其DNA，PCR试剂为Platinum Taq试剂盒(Invitrogen)，PCR仪器为Bio-Rad热循环仪。
值得说明的是，本发明的一条上游引物和一条下游引物的组合引物对，可将6条上游引物和10条下游引物随机组合成60对引物对，均可以很好完成对鱼类样本的PCR扩增，但是以下十对引物：Fish-F1与Fish-R1.1组合，Fish-F1与Fish-R1.2组合，Fish-F2与Fish-R2.1组合，Fish-F2与Fish-R2.2组合，Fish-F3与Fish-R3.1组合，Fish-F3与Fish-R3.2组合，Fish-F4与Fish-R4组合，Fish-F5与Fish-R5组合，Fish-F6与Fish-R6.1组合，Fish-F6与Fish-R6.2组合，使用其中任意一对引物对PCR扩增出的产物序列长度比较短，适合高通量测序，而其他组合的引物对PCR扩增出的产物序列长度过长，不适宜进行高通量测序。故，为了表现出本发明引物对的最优效果，以下实施例均采用最适合高通量测序的上述十对引物对进行实验。
为了表述方便，实施例和图中引物组合表示为：Fish-F1+Fish-R1.1，Fish-F1+Fish-R1.2，Fish-F2+Fish-R2.1，Fish-F2+Fish-R2.2，Fish-F3+Fish-R3.1，Fish-F3+Fish-R3.2，Fish-F4+Fish-R4，Fish-F5+Fish-R5，Fish-F6+Fish-R6.1，Fish-F6+Fish-R6.2。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
(1)鱼类线粒体12S基因宏条形码通用引物对组合列表
表1上、下游引物组合扩增片段大小
实施例2
鱼类样本采集于江苏太湖的竺山湾(东经120.036°，北纬31.373°)、庙港(东经120.461°，北纬31.002°)。现场用地笼和刺网进行鱼类捕获，采集到的鱼类样本拿到实验室进行物种鉴定和分离，共采集到10种鱼类(红鳍原鮊、鳊、团头鲂、翘嘴鮊、鳙、鲢、鲤、鲫、大鳞副泥鳅、刀鲚)，分别提取每个鱼类样本的DNA。分别用Fish-F1与Fish-R1.1(Fish-R1.2)引物组合、Fish-F2与Fish-R2.1(Fish-R2.2)引物组合、Fish-F3与Fish-R3.1(Fish-R3.2)引物组合、Fish-F4与Fish-R4引物组合、Fish-F5与Fish-R5引物组合、Fish-F6与Fish-R6.1(Fish-R6.2)引物对提取得到的鱼类DNA进行PCR扩增，上游引物与下游引物组合的摩尔比控制在1：(1～3)范围内即可，本实施例取优选方案，即上游引物与下游引物组合的摩尔比为1:1。其中，Fish-F1与Fish-R1.1组合、Fish-F2与Fish-R2.1组合进行PCR反应的退火温度为53-58℃；Fish-F1与Fish-R1.2组合、Fish-F3与Fish-R3.1组合、Fish-F4与Fish-R4组合、Fish-F6与Fish-R6.1组合进行PCR反应的退火温度为50-55℃；Fish-F2与Fish-R2.2组合进行PCR反应的退火温度为50-58℃；Fish-F3与Fish-R3.2组合进行PCR反应的退火温度为55-60℃；Fish-F5与Fish-R5组合进行PCR反应的退火温度为52-59℃；Fish-F6与Fish-R6.2组合进行PCR反应的退火温度为58-62℃。
采用Invitrogen公司的Platinum Taq酶进行PCR扩增，扩增反应体系的体积为50μL，反应体系中包含以下物质：1μL的10μM的上述12S引物；37.8μL的去离子水；5μL的10×PCRHifi buffer；2μL的MgSO4(50mM)；1μL的dNTP Mix(10mM)；0.2μL的Taq DNApolymerase；2μL的DNA template(待扩增的物种样本或环境样本DNA)。得到的PCR产物用浓度为1.5％的琼脂糖胶检测。
结果如图1表明：引物组合Fish-F1+Fish-R1.1、Fish-F1+Fish-R1.2、Fish-F2+Fish-R2.1、Fish-F2+Fish-R2.2、Fish-F3+Fish-R3.1、Fish-F3+Fish-R3.2、Fish-F4+Fish-R4、Fish-F5+Fish-R5、Fish-F6+Fish-R6.1、Fish-F6+Fish-R6.2能够成功扩增出所有太湖常见鱼类，PCR扩增的条带单一，明亮，没有明显拖尾和弥散，说明线粒体12S引物对鱼类有很好的扩增能力。
实施例3
在竺山湾(东经120.036°，北纬31.373°)、庙港(东经120.461°，北纬31.002°)，用1L采样瓶采集0.5-1L的表层水，在实验室用孔径为0.22μm的玻璃纤维滤膜过滤，除去水分，按照TheWater DNA Kit(OMEGA,CHINA)试剂盒标准操作提取滤膜中截留的环境DNA，用实施例2中的线粒体12S引物和试剂对滤膜DNA进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2％琼脂糖电泳检测(图2所示)。PCR产物通过胶回收试剂盒(MinElute Gel Extraction Kit)进行割胶回收，用QubitTM dsDNA HS Assay Kits进行准确定量，纯化后的PCR产物用Bioanalyser 2100(Agilent Technologies,USA)进行片段大小分析，分析结果如图3所示。图3中有六个图表，横坐标均表示的是产物的序列长度(即碱基对数目)，各曲线上两边的峰表示的是基因marker产生的峰，中间的峰均为各产物产生的峰，其中，具体分析如下：
a.左边第一个图中，Fish-F1+Fish-R1.1引物组合PCR扩增产物和Fish-F1+Fish-R1.2引物组合PCR扩增产物的混合产物长度集中在180-270bp之间，基本与Fish-F1+Fish-R1.1引物组合PCR扩增产物的长度为160-190bp、Fish-F1+Fish-R1.2引物组合PCR扩增产物的长度为280-310bp吻合；
b.右边第一个图中，Fish-F2+Fish-R2.1引物组合PCR扩增产物和Fish-F2+Fish-R2.2引物组合PCR扩增产物的混合产物长度集中在170-290bp之间，基本与Fish-F2+Fish-R2.1引物组合PCR扩增产物的长度为120-150bp、Fish-F2+Fish-R2.2引物组合PCR扩增产物的长度为275-300bp吻合；
c.左边第二个图中，Fish-F3+Fish-R3.1引物组合PCR扩增产物和Fish-F3+Fish-R3.2引物组合PCR扩增产物的混合产物长度集中在170-300bp之间，基本与Fish-F3+Fish-R3.1引物组合PCR扩增产物的长度为150-180bp、Fish-F3+Fish-R3.2引物组合PCR扩增产物的长度为220-350bp吻合；
d.右边第二个图中，Fish-F4+Fish-R4引物组合PCR扩增产物长度集中在80-100bp之间，与Fish-F4+Fish-R4引物组合PCR扩增产物的长度为80-100bp吻合；
e.左边第三个图中，Fish-F5+Fish-R5引物组合PCR扩增产物长度集中在80-100bp之间，与Fish-F5+Fish-R5引物组合PCR扩增产物的长度为80-100bp吻合；
f.右边第三个图中，Fish-F6+Fish-R6.1引物组合PCR扩增产物和Fish-F6+Fish-R6.2引物组合PCR扩增产物的混合产物长度集中在80-190bp之间，基本与Fish-F6+Fish-R6.1引物组合PCR扩增产物的长度为70-90bp、Fish-F6+Fish-R6.2引物组合PCR扩增产物的长度为180-210bp吻合。
上述表明，不同引物组合均具有明显的扩增产物，显示引物对环境样品有很好的扩增能力，可以用于鱼类多样性研究。
值得说明的是，对比文件：中国专利申请号为201210314978.6，发明名称为海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物及其设计和扩增方法，提到了该海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物还可用于扩增的淡水鱼类，专利中对鲫鱼样本进行PCR扩增的产物大小约为1200bp，序列长过长，不适宜对其进行高通量测序；而本实施例中，引物对对滤膜DNA进行PCR扩增的产物序列长均较短，不超过350bp，明显小于对比文件中引物对鲫鱼样本DNA的扩增产物序列长，说明本发明引物对具有明显的优势，适合进行高通量测序。
实施例4
采用两种DNA模板量验证12S引物对环境样本的PCR扩增成功率。在实施例3中的竺山湾湖区按照实施例3的方法分别采集10个环境样本，提取环境DNA，用qubit测定DNA的浓度。利用实施例2中PCR反应体系和反应条件分别用12S、18S(上游引物：CCTTCYGCAGGTTCACCTAC；下游引物：TCCCTGCCHTTTGTACACAC)和COI(上游引物：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC；下游引物：TAAACYTCAGGRTGACCRAARAAYCA)引物进行PCR扩增，扩增产物利用2％琼脂糖电泳进行检测，能扩增出明亮条带的视作成功扩增，否则视为失败扩增。实验结果如下，如图5所示，在模板量是100ng时，所有引物的扩增成功率都超过90％，但是，根据图4所示，在模板量为10ng时，除了12S的引物Fish-F4+Fish-R4，其他12S引物的扩增成功率均高于18S引物和COI引物。这说明12S引物对模板量要求低，PCR的成功率高。
实施例5
采用Ion Torrent PGM测序仪对实施例4中12S、18S和COI扩增产物进行高通量测序，测序前用测序仪专用的试剂盒Ion XpressTM Plus Region Library Kit(LifeTechnologies,USA)构建测序文库，用Ion Proton HiQ Sequencing Kit测序试剂盒按照标准仪器操作选用PI v2芯片进行测序，测序结果以Fastq格式输出，在基于Linux系统的QIIME2软件平台上进行序列前处理(过程如下)，过滤测序质量值低、序列长度短于70bp的序列，依据相应的Barcode(测序建库时加上的，属于测序试剂盒自带试剂)将测序结果按照不同的样品分类，分类后的序列分别用UCHIME软件除去嵌合子序列，然后用Uclust软件根据序列间的相似性进行OTU分型，提取每个OTU的代表序列并进行BLAST注释，筛选BLAST序列相似性大于等于97％的序列，最终确定物种信息和进行多样性的分析，分析结果见图6。本实施例表明12S引物扩增序列大部分都来自鱼类(93％)，仅有少部分序列来自昆虫(3％)，另有4％的序列无法注释。而COI扩增序列中仅有5％来自鱼类，有超过一半的序列是来自昆虫和浮游动物，另有25％的序列无法被注释。18S引物扩增序列中鱼类仅占3％，原生动物占35％。这说明12S引物对鱼类群落具有更好的特异性，扩增出来的序列大部分都来自鱼类，更加适合鱼类多样性研究。
本领域普通技术人员根据前面的描述已经能再现，也都知晓了作用原理，为了更加的便于对本专利感兴趣的人员更快的掌握本发明的操作，将以上操作涉及的公知代码列明如下：
1)序列前处理：
fastx_reverse_complement-iXXX.fastq-o XXX.rc.fastq-Q33
2)依据barcode分类：
split_libraries.py-m map-f*.fasta-q*.qual-s 20-w 50-z truncate_only-llow_length-H high length-b variable_length–H 8–M 3–e 2-o split_lib1
3)除去嵌合子：
identity_chimeric_seq.py-m usearch61-itotal_length_filter.fasta--suppress_usearch61_ref-o usearch61_chimer_checking/
3)OTU分型：
pick_otus.py-itotal.fasta-m uclust-o uclust_otus_0.97--word_length64--minsize 20-s 0.97
pick_rep_set.py-iuclust_otus/total_otus.txt-f total.fasta-o usearch_otus/rep_set.fasta
make_otu_table.py-iuclust_otus/total_otus.txt-o otu_table.biom
4)BLAST注释OTU：
blastn–query test.txt–db database–out ouput.txt
5)物种多样性分析：
alpha_rarefaction.py-iuclust_otus/otu_table.biom-m map.txt-o uclust_otus/alpha_deversity-p alpha_params.txt-t uclust_otus/rep_set.tre-n 20-aO 6-f
beta_diversity_through_plots.py-iuclust_otus/otu_table.biom-mmap.txt-o beta_deversity-f-t uclust_otus/rep_set.tre
序列表
<110> 南京易基诺环保科技有限公司
<120> 一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgtgccagc caccgcggtt a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacgtcaggt cgaggtgtag cg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agcatctcnc ttacacngag aa 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtaccttttg catcatgatt tag 23
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agaaagcgtt aaagctc 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaagaccctn tggagctt 18
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atagtggggt atctaatccc ag 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttntagaaca ggctcctcta gg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agagtgacgg gcggtgtgtn cg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttctcngtgt aagngagatg ct 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttcccttgcg gtactttntc tat 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctaaatcatg atgcaaaagg tac 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccactctttt gccacagaga cg 22
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcttnttact catnttagc 19
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccgnggtcgc cccaacc 17
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aactnggtnc gttgatcgg 19
<210> 17
<211> 1690
<212> DNA
<213> 淡水鱼类12s基因的保守序列
<400> 17
gctnnngtag cttaannnaa agcatancac tgaagatgnt aagangnnnc ntnnnaannn 60
ccgnnngcan aaangcntgg tccngacntt nnnntnanct ntnncnnnan ttacacatgc 120
aagtntccgc annccngtga nnatgccctn nannncncnn ncngnnnann aggagcnggn 180
atcaggcnca nnnnnnnnnn agcccannac ncctngcnnn gccacacccn caagggannt 240
cagcagtgat ananattaag cnatnagtga aancttgact nagtnanngn naanagngcc 300
ngnannactc gtgccngccn ccncngttan acgagngncc cnagttgatn nnnnnncggc 360
gtaaagngtg gttannnnnn nnnnnnnnnn nnnntaaagn nnaannncnn nnnngcngtn 420
atacgcnncn nnnnnnnnga annncnnnnn nacgaaagtn nctttannnn nnnnnnnnng 480
annccnngaa anctnngnna canantnggn ttanatancn nnctatgcnn ancnntaaac 540
nnngannnnn nnnnacnnnn nnnnntncgc cngggnacta cgagcnnnag cttnaaaccc 600
aaaggacntg ncggtgnntn aganccncct nnnnnagcct gnnctnnaac cgataanccc 660
cgttnaacct caccnnnnct ngnnnnnncn gcctannnac cnnnntcgnc agcttaccct 720
gtgaaggnnn naanagtaag canaatnggn annnccnana annnnaggtn nnngtgtnnn 780
gnangnnnng gnaagnnann nnctacattn nctnnnnnna gnnnannacg nannnnnnnn 840
ntgaaannna nnnnnnnaag gnggatttag nagtaannnn naannagagn gtncnnntga 900
annnggcnct nanncgcgna cnnaccgcnn gtcannctcn ncnnnnnnnn nnnnnnnnnn 960
nntnnntnan nnnnnnnnnn nnnnnaaggg gaggcaagtc gtaacatgnn aanngtanng 1020
ganngtgnac nnggannana nncagnnnnt ngctnannna gnnaagnntc ncncttnnnc 1080
ngagaagnca ncnntgcaan tnngntnncc ctganncnna anagctagcn nnnnnnnnnn 1140
nnnnaannnn nnannntnna nannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnanaan naaancattn 1200
tnnnnccnna gtannggnga cngaaaaggn nnnnnnnnnn ngcnatagan annntacnnn 1260
aannggnnng ctgaannnga antgaaanaa nncannnaag nnnnannaan canagantnn 1320
nnctngtnnn ntttgcannn ngatnnngcn agnnnnnnnc aagcaaagng nnctttagtt 1380
tgnnnccccg aaacnnngtg agctacnccn agacagcctn nnnnnnnnna gggcnnaccc 1440
gnnnctgtnn naaaannnng ggnnnanctn ngngtagang tgananacct accgaacntn 1500
gtnatagctg gttgcntnng aantgnatan aagttcagcc nnnnnnnnnc nnnnnncnnn 1560
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnannnnnnn gagttantnn aagggggtac 1620
agcncctntn annnangana caacnttnnn agnagnntaa ngatnanann nnnnaannnn 1680
nnnnnnnnnn 1690

Claims (10)

1.一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物，其特征在于：包括至少一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，
所述的上游引物为Fish-F1：TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA、Fish-F2：AACGTCAGGTCGAGGTGTAGCG、Fish-F3：AGCATCTCNCTTACACNGAGAA、Fish-F4：GTACCTTTTGCATCATGATTTAG、Fish-F5：AGAAAGCGTTAAAGCTC、Fish-F6：GAAGACCCTNTGGAGCTT；
所述的下游引物为Fish-R1.1：ATAGTGGGGTATCTAATCCCAG、Fish-R1.2：TTNTAGAACAGGCTCCTCTAGG、Fish-R2.1：AGAGTGACGGGCGGTGTGTNCG、Fish-R2.2：TTCTCNGTGTAAGNGAGATGCT、Fish-R3.1：TTCCCTTGCGGTACTTTNTCTAT、Fish-R3.2：CTAAATCATGATGCAAAAGGTAC、Fish-R4：CCACTCTTTTGCCACAGAGACG、Fish-R5：TCTTNTTACTCATNTTAGC、Fish-R6.1：CCGNGGTCGCCCCAACC、Fish-R6.2：AACTNGGTNCGTTGATCGG。
2.根据权利要求1所述的一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物，其特征在于：所述上游引物和下游引物优选地引物对组合为：Fish-F1与Fish-R1.1组合，Fish-F1与Fish-R1.2组合，Fish-F2与Fish-R2.1组合，Fish-F2与Fish-R2.2组合，Fish-F3与Fish-R3.1组合，Fish-F3与Fish-R3.2组合，Fish-F4与Fish-R4组合，Fish-F5与Fish-R5组合，Fish-F6与Fish-R6.1组合，Fish-F6与Fish-R6.2组合。
3.权利要求1～2任意一项所述淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其步骤为：
(1)环境DNA样本的提取；
(2)目的片段的扩增：对步骤(1)中的环境DNA样本进行PCR扩增，其中，引物为权利要求1或2所述引物组合中的至少一对引物对；
(3)步骤(2)中扩增产物的片段大小分析及鱼类鉴定分析。
4.根据权利要求3所述的一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，上游引物与下游引物组合中两者的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求3～4任意一项所述的一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中扩增时采用的引物为权利要求2中所述引物组合中的至少一对引物对，其中，Fish-F1与Fish-R1.1组合或Fish-F2与Fish-R2.1组合的引物对进行PCR反应的退火温度为53-58℃；Fish-F1与Fish-R1.2组合、Fish-F3与Fish-R3.1组合、Fish-F4与Fish-R4组合或Fish-F6与Fish-R6.1组合的引物对进行PCR反应的退火温度为50-55℃；Fish-F2与Fish-R2.2组合的引物对进行PCR反应的退火温度为50-58℃，Fish-F3与Fish-R3.2组合的引物对进行PCR反应的退火温度为55-60℃，Fish-F5与Fish-R5组合的引物对进行PCR反应的退火温度为52-59℃；Fish-F6与Fish-R6.2组合的引物对进行PCR反应的退火温度为58-62℃。
6.根据权利要求5所述的一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：还包括步骤(4)，其对步骤(2)中的扩增产物进行高通量测序；步骤(3)和步骤(4)的顺序可更换。
7.根据权利要求6所述的一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(3)中，Fish-F1与Fish-R1.1组合引物对的PCR产物长度为160-190bp；Fish-F1与Fish-R1.2组合引物对的PCR产物长度为280-310bp；Fish-F2与Fish-R2.1组合引物对的PCR产物长度为120-150bp；Fish-F2与Fish-R2.2组合引物对的PCR产物长度为275-300bp；Fish-F3与Fish-R3.1组合引物对的PCR产物长度为150-180bp；Fish-F3与Fish-R3.2组合引物对的PCR产物长度为220-350bp；Fish-F4与Fish-R4组合引物对的PCR产物长度为80-100bp；Fish-F5与Fish-R5组合引物对的PCR产物长度为80-100bp；Fish-F6与Fish-R6.1组合引物对的PCR产物长度为70-90bp；Fish-F6与Fish-R6.2组合引物对的PCR产物长度为180-210bp。
8.权利要求1～2任意一项所述的淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物在环境源DNA和生物源DNA的PCR扩增中的应用。
9.权利要求1～2任意一项所述的淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物在鱼类物种鉴定、鱼类多样性、鱼类的进化、系统发育、系统地理学或遗传多样性分析中的应用。
10.权利要求1～2任意一项所述的淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物在鱼类濒危物种和鱼类入侵物种监测中的应用。
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