CN105154564A - 基于环境dna技术对鱼类dna丰度估算的联合分析法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，所述的联合分析法包括：定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度；454？GS-FLX？Titanium测序分析鱼类物种组成比例；测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种；使用sufer？8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。本发明基于环境DNA鉴定技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可以最大限度的保护鱼类资源；同时，对于一些分布较少难以捕获的物种，该方法也较传统捕捞调查更为有效，本方法能够有效的解决样品中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，且只需要上述两种技术各进行一次实验，即了解所有物种的DNA丰度信息。

Description

基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法
技术领域
本发明涉及分子生态学的鱼类数量评估技术领域，尤其涉及水体环境DNA的样品对近缘种鱼类的鉴定区分以及定量的分析，具体是指一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法。
背景技术
国内目前用于鱼类数量的方法主要有标记重捕法和声学探测法。标记重捕法是通过对水体中的鱼类进行标记后捕捞，进行鱼类物种数量的统计。该方法的实现主要是通过各种标记和捕捞工具(如各种网具、钓具、电捕等)对于鱼类进行捕获而完成。该方法存在以下几方面的问题：1、标记的选取及放置工作需要大量的工作，损耗人力、物力。2、重捕强度要求高。需要通过大量的捕捞工作，并且需要足够大的重捕数量，成本投入较大且难以保证准确性。3、该方法需要捕获活体，难以保证被捕获鱼类的存活，对于鱼类资源有一定的破坏。4、对于稀有物种、外来物种的监测调查由于其数量稀少，无法有效进行标记和重捕，难以取得良好的效果，调查结果更加容易产生偏差。
声学探测法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行了评估。研究通过回声成像，并充分结合分层拖网的鱼类取样，进行积分分配，从而得到目标强度与鱼体长度的换算关系式，最后估算水域鱼类资源量及分布，其结果相对捕捞法更为准确。然而该技术还是要建立在捕捞的基础上，不仅存在上述的问题，该技术还受到水域理化指标和天气状况的限制，而且对于大面积水域的调查仍有很大的局限性。在物种鉴定方面，该方法也无法实现准确有效的物种鉴定和群落结构的分析。对鱼群数量的估计也并不具有可靠性。
环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中(如空气、水、土壤等)的DNA，包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。环境DNA技术就是直接从水、土壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段，后通过DNA二代测序和实时定量PCR等分子生物学检测技术来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研究方法。环境DNA的应用最早是从土壤、沉积物中直接提取出来DNA基因组，用来研究微生物多样性以及物种鉴定，后来在生态学的研究中关于环境DNA的应用得到进一步的发展，逐渐从微生物学拓展到了动植物学研究领域中。由于水环境的特殊性，加上水生动物在水中的流动性、易躲藏、不易捕捞等特点，在大面积的水域中有关水生动物方面的调查研究往往费时费力不易进行。但是环境DNA的应用为我们在水生动物资源调查方面提供了一条良好的思路。
而在环境DNA的研究分析当中，国外多用于对于外来物种和稀有物种的监测，比如，在北美淡水生态系统中对于入侵亚洲鲤鱼的监测，以及日本对于蓝鳃太阳鱼入侵的监测。研究采用qPCR方法，设计一套针对目标物种线粒体基因序列的特异的引物和探针，即可完成对于目标物种的DNA丰度的测算，并且通过DNA的丰度进而来评估目标物种的生物量丰度。但是，这些物种由于在研究地属于归化物种，生态系统中其他物种与其亲缘关系很远，因此在对这些物种进行研究时，获得扩增这些物种的特异的引物序列是容易的。而当我们在研究一些重要的本土物种时，如鲤科鱼类的某些物种，由于大量近缘物种的存在，在对包含有多种物种的DNA的混合的环境DNA样品进行线粒体基因的扩增时，往往很难获取有效的物种特异引物，这一问题使得我们通过直接定量PCR的方法，难以获取目标物种的DNA丰度信息，这一问题尚未得到有效解决。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种不依赖物种特异引物，而采用鱼类线粒体通用引物进行二代测序技术(如454测序)和实时定量PCR(qPCR)联合分析获取目标物种DNA丰度评价鱼类分布的方法。
为了实现上述目的，本发明具有如下构成：
该基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其主要特点是，所述的联合分析法包括：
定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，在设计好的通用引物下构建DNA标准品，扩增后提取DNA以制作标准曲线；
将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线以获得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数；
454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例；
测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种，计算公式为：目标物种线粒体基因拷贝数＝实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数×二代454测序获得的目标物种线粒体序列的百分比；
使用sufer8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。
优选地，所述的各环境DNA样本为提前根据水域大小，设置样点并采集柱状水层混合后的水样冷藏，在实验室中抽滤，后提取DNA冷藏备用。
更优选地，所述的水样在24h内进行抽滤处理，滤膜孔径为1.2μm，抽滤后使用DNA提取试剂盒提取滤膜中的所有环境DNA，提取好的DNA在-20℃条件下保存备用。
进一步优选地，所述的通用引物选择在16srRNA基因区域进行通用引物和探针设计，所设置的16srRNA基因正向引物序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；16srRNA基因反向引物序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；16srRNA基因探针序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
更进一步优选地，所述的标准曲线制备过程具体如下：
扩增包含检测目的的鱼类线粒体16srDNA基因部分序列，进行PCR反应，反应产物经电泳检测后，采用TIANgelMidiPurificationKit，对PCR产物进行回收纯化；
将所述的PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化入感受态细胞中，挑选菌斑进行培养，提取质粒后进行限制性内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳；
DNA胶回收后进行浓度测定，在A260/A280大于1.8的情形下，按下述公式计算质粒拷贝数：拷贝数＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)/(648×质粒总长度)(g/mol)；
质粒总长度＝2692bp+PCR产物长度；
其中，6.02×1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量；
使用EASYDilution将构建的DNA标准品分别按照1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL梯度稀释作为模板进行RealTimePCR反应，制作DNA标准曲线，每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；
对构建的DNA标准品进行扩增反应，反应采用两步法：95℃30s预变性；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸21s，45个循环，反应结束后得到各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。
再进一步优选地，所述的各环境样点的DNA相对丰度拷贝数的测定过程具体如下：
反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加，每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标准曲线表达式可以算出它的初始拷贝数；由拷贝数可知所测物种在各样点的DNA相对丰度情况。
最优选地，所述的454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例具体为：
选取16srRNA基因为引物，其中所设置的16srRNA基因F引物序列为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；16srRNA基因R引物序列为SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；
对环境样品DNA进行扩增，切胶回收后干冰保存；
测定样品浓度，将不同样品等摩尔混合，将3′端和5′端有特异性的接头连接到DNA片段上，变性后处理回收单链的DNA，接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，经过乳化扩增，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的平行扩增，产生数百万个形同的拷贝，最后将经过富集携带DNA片段的磁珠与其他反应物混合，放入到PicoTiterPlate板中开始测序；
使用Qiime1.5.0对初始序列质量进行控制和筛选。之后再使用PyNAST对序列进行去杂和修剪；序列优化后使用Uparse提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，再按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中Uchime被用来检测序列中的嵌合体序列并去除，得到OTU的代表序列；用全部序列与OTU的代表序列进行Blast比对，得到每条序列与最相近的OTU的代表序列对应表，利用得到的OTU在NCBI数据库中对于测得序列所属的物种种类进行鉴定，并统计OTU的出现率从而得到鱼类的线粒体基因的组成比例信息。
采用了该发明中的联合分析法，具有如下的技术效果：
1、本发明基于环境DNA鉴定技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可以最大限度的保护鱼类资源；同时，对于一些分布较少难以捕获的物种，该方法也较传统捕捞调查更为有效。
2、本方法利主要利用了两种分子生物学鉴定技术，这两种方法的灵敏性都很强：454测序法可以对样品进行深度测序，每个样品的测序数在10000条-20000条以上，也就是说，比例在万分之一的物种理论上都可以被检出；实时定量PCR的方法在理论上也可以检测出每毫升样品中最低10个拷贝的DNA序列；两者共同保证了该方法的灵敏性和准确性。
3、利用通用引物的454测序和实时定量PCR结果联合分析物种相对丰度，可以避免近缘种DNA存在与环境样品中时物种特异引物难以设计，检测误差大等问题，有效地对目标物种进行准确定量。
4、利用通用引物的454测序和实时定量PCR结果，可以轻易的计算出任何被检测到的物种在样品中的相对丰度信息，省去了每个物种逐一设计特异引物进行检测的麻烦。
5、采用等高图绘制反应水域中鱼类分布更加直观形象；本方法能够有效的解决样品中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，且只需要上述两种技术各进行一次实验，即了解所有物种的DNA丰度信息。
附图说明
图1为本发明的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法技术路线图。
图2为本发明的两种途径得到的蓝鳃太阳鱼的相对丰度数据的相关性分析图。
图3为本发明的两种测算方法得到的2013年12月千岛湖蓝鳃太阳鱼分布比较图。
图4为本发明的千岛湖鲢鱼丰度的时空动态图。
图5为本发明的千岛湖鳙鱼丰度的时空动态图。
图6为本发明的千岛湖鲴类丰度的时空动态图。
图7为本发明的千岛湖鲌类丰度的时空动态图。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
实施例1：如图1所示，本发明的联合分析法具体步骤如下：
1.样品DNA采集
根据水域的大小，设置需要调查的样点区域，在采集样点处采集柱状水层混合，冷藏带回实验室，24h内对水样进行抽滤处理，抽滤好的滤膜装入灭菌离心管后，立即放入-20℃冰箱中保存备用，滤膜孔径为1.2μm；所获得的样品使用QIAGEN公司生产的试剂盒QIAampDNAMicroKit(QiagenGmbH,Hilden,Germany)或者其他同类试剂盒(如1.试剂盒DNeasyBloodandTissueKit(QiagenGmbH,Hilden,Germany)；2.试剂盒PowerWaterSterivexDNAIsolationKit(MoBio,CA)等)提取滤膜中的所有环境DNA，提取好的DNA在-20℃条件下保存备用。
2.实时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度
2.1通用引物的设计
从Genbank下载38种常见鱼类的线粒体全序列进行序列比对，发现16srRNA基因部分片段保守性较好，因此在该区域进行通用引物和探针设计。
所得引物和探针序列如下表1：
表1鱼类通用实时定量PCR引物和探针序列(FAM为荧光基团，TAMARA为淬灭基团，连接于探针两端)
该引物扩增产物约为140bp左右，符合实时定量技术对于检测DNA片段的长度要求。
2.2构建DNA标准品
扩增鱼类线粒体16srDNA基因部分序列(该序列包含上述检测目的序列)，进行PCR反应，反应产物经电泳检测后，采用TIANgelMidiPurificationKit，对PCR产物进行回收纯化。
将纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上，配制5μL的连接体系(pMD19-TVector1μL+DNA模板4μL)；加入等量的SolutionI(5μL)，16℃连接过夜；取感受态细胞置于冰浴中，将连接溶液全部(10μL)加入到100μLDH5α感受态细胞中进行转化，轻弹混匀，冰浴30分钟；将离心管置于42℃冰浴中放置90秒，然后将其快速转移到冰浴中，冷却3分钟，该过程不能摇晃离心管；向离心管中加入900μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟(150rmp)，使菌体复苏；将100μL转化菌液加入到含有抗生素的LB固体培养基上，同时加入X-gal和TPTG显色剂，均匀涂开，37℃倒置培养过夜；在蓝斑附近挑取白斑，放入含有1mLLB液体培养基和1μL抗生素的离心管中，封口，在37℃摇床振荡培养16小时(150rmp)。
使用天根快速质粒小提试剂盒对克隆好的质粒进行提取；并使用HindIII限制性内切酶对提纯的Cytb质粒进行线性化处理，对处理过后的质粒标准品进行琼脂糖凝胶电泳。
2.3制作标准曲线
使用NanoDropND-1000核酸蛋白分析仪测定上述质粒的OD值以及标准品浓度，判断其纯度(A260/A280＞1.8，则为纯品)，然后按照以下公式计算质粒拷贝数：
拷贝数＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)/(648×质粒总长度)(g/mol)
质粒总长度＝2692bp+PCR产物长度
(其中，6.02×1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量)。
使用EASYDilution将构建的DNA标准品分别按照(1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL)梯度稀释作为模板进行RealTimePCR反应，制作DNA标准曲线；每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；使用Takara公司的PremixExTaqTM(ProbeqPCR)进行扩增反应，反应体系为：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)12.5μL，上下游引物各0.5μL，探针1μL，标准质粒2μL，加蒸馏水补齐25μL，混合均匀，放置在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应；反应采用两步法：95℃30s预变性；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸21s，45个循环；反应结束后得到各自的Ct值(Ct值是指每个反应体系中的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数成线性关系，因此起始拷贝数越少，Ct值越大，起始拷贝数越多，Ct值越小)；以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。
2.4.实施定量PCR检测环境DNA的总鱼类DNA丰度
反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加，每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标准曲线表达式可以算出它的初始拷贝数；由拷贝数可知所测物种在各样点的DNA相对丰度情况。
3.454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例
使用文献中选取的鱼类通用引物16srRNA引物：
表2454测序所用的鱼类线粒体16srRNA基因的通用引物
对环境样品DNA进行扩增；该引物产物长度为600bp左右，经比对，其长度可以满足对于物种鉴定区分的需要；PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察反应效果，对扩增效果好的条带切胶回收纯化，将制备好的样本干冰保存。
使用NanoDrop测定样品浓度，将不同样品等摩尔混合，将3′端和5′端有特异性的接头连接到DNA片段上，变性后处理回收单链的DNA；接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，经过乳化扩增，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的平行扩增，产生数百万个形同的拷贝；最后将经过富集携带DNA片段的磁珠与其他反应物混合，放入到PicoTiterPlate板中开始测序。
使用Qiime1.5.0对初始序列质量进行控制和筛选；之后再使用PyNAST对序列进行去杂和修剪；序列优化后使用Uparse提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，再按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中Uchime被用来检测序列中的嵌合体序列并去除，得到OTU的代表序列；用全部序列与OTU的代表序列进行Blast比对，得到每条序列与最相近的OTU的代表序列对应表；利用得到的OTU在NCBI数据库中对于测得序列所属的物种种类进行鉴定，并统计OTU的出现率从而得到鱼类的线粒体基因的组成比例信息。
4.454测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种
计算目标鱼类DNA丰度的联合分析法的公式为：目标物种线粒体基因拷贝数＝实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数×二代测序(454测序)获得的目标物种线粒体序列的百分比。
5.环境中鱼类线粒体DNA相对分布的分布图绘制
使用sufer8.0软件完成环境中鱼类线粒体DNA相对分布的分布图绘制。
实施例2：
在浙江杭州千岛湖利用蓝鳃太阳鱼的qPCR直接检测结果与本发明提出的联合分析法的蓝鳃太阳鱼线粒体DNA的丰度结果进行比较验证：
由于在蓝鳃太阳鱼产自北美地区，由于网箱养殖逃逸等原因，该种大量繁衍生存于浙江杭州千岛湖，为外来物种，水体中无近缘种，对该种的监测可以使用日本蓝鳃太阳鱼入侵状况调查研究中所使用的相关文献提供的实时定量PCR的引物和探针，该引物和探针组监测的是太阳鱼线粒体细胞色素b基因部分序列，由于线粒体所有基因是串联的单拷贝，因此对于线粒体上任何一个基因拷贝数的监测，都可以看成是对于线粒体全基因序列拷贝数的监测，因此，该结果与我们上述提出的鱼类16srRNA基因部分序列的结果有可比性，可以使用这一结果来验证联合分析法的可靠性。具体实验操作如下：
(1)样品和DNA提取
根据千岛湖不同的地形、水文条件，共设置了40个采样点进行水样采集。每个点采集表层水样2.5L，存于带冰的保温箱中带回，24h内对采集的水样进行抽滤处理(AP-01P真空泵；AUTOSCIENCE)，抽滤好的滤膜装入1.5ml灭菌离心管后，立即放入-20℃冰箱中保存备用，滤膜孔径为1.2μm。
将抽滤处理过的滤膜低温保存，使用QIAGEN公司生产的试剂盒QIAampDNAMicroKit提取滤膜中的环境DNA，提取方法参考QIAampDNAMicroKit操作手册。
(2)蓝鳃太阳鱼线粒体细胞色素b基因的qPCR直接检测
选择蓝鳃太阳鱼线粒体细胞色素b(cytb)基因片段作为扩增的目标序列，引物和探针如表3所示，其中所设置的Cytb基因F引物序列为SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；Cytb基因R引物序列为SEQIDNO:7所示的核苷酸序列；Cytb基因探针序列为SEQIDNO:8所示的核苷酸序列：
表3蓝鳃太阳鱼线粒体细胞色素b基因的实时定量PCR检测引物和探针序列
通过使用不同引物和酶的浓度进行PCR反应，确定最佳的反应体系。
(1)PCR反应体系总体积为50μL，包括：10×buffer5μL，2.5mMdNTP2μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.15μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，高压灭菌双蒸水39.85μL；
(2)PCR反应条件：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟；
(3)电泳检测目的条带：取PCR扩增的产物，点样于1％琼脂糖凝胶板上，电压100V，电泳30分钟；溴化乙锭染色8分钟，紫外凝胶成像系统下进行观察和拍照。
采用TIANgelMidiPurificationKit，对PCR产物进行回收纯化；将纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上，配制5μL的连接体系(pMD19-TVector1μL+DNA模板4μL)，加入等量的SolutionI(5μL)，16℃连接过夜；取感受态细胞置于冰浴中，将连接溶液全部(10μL)加入到100μLDH5α感受态细胞中进行转化，轻弹混匀，冰浴30分钟；之后将离心管置于42℃冰浴中放置90秒，然后将其快速转移到冰浴中，冷却3分钟，该过程不能摇晃离心管；向离心管中加入900μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟(150rmp)，使菌体复苏；将100μL转化菌液加入到含有抗生素的LB固体培养基上，同时加入X-gal和TPTG显色剂，均匀涂开，37℃倒置培养过夜；在蓝斑附近挑取白斑，放入含有1mLLB液体培养基和1μL抗生素的离心管中，封口，在37℃摇床振荡培养16小时(150rmp)；
使用天根公司快速质粒小提试剂盒对已克隆的质粒进行提取：
(1)取1mL培养过夜的菌液于离心管中，12000rmp离心1分钟，弃去上清液，沉淀菌体；
(2)加入150μL溶液P1涡旋振荡，使沉淀悬浮；
(3)加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次，裂解菌体；
(4)加入350μL溶液P5，立即快速上下翻转混匀12-20次，出现絮状沉淀，12000rpm离心2分钟；
(5)收集上一步离心产生的上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rmp离心30秒，弃收集管中废液，将吸附柱放入收集管中；
(6)向吸附柱中加入300μL漂洗液PWT，12000rpm离心30秒，弃废液；
(7)将吸附柱放入空的收集管中，12000rmp离心1分钟，去除残留漂洗液，打开离心管盖晾置2分钟；
(8)将吸附柱置于干净离心管中，向吸附膜中间滴加50μL洗脱缓冲液TB，12000rpm离心30秒，将收集到了质粒溶液-20℃保存备用。
使用HinIII限制性内切酶对提纯的Cytb质粒进行线性化处理，对处理过后的质粒标准品进行琼脂糖凝胶电泳；对标准品要使用NanoDropND-1000核酸蛋白分析仪测定OD值以及浓度，判断其纯度(A260/A280＞1.8，则为纯品)，然后按照以下公式计算质粒拷贝数：
拷贝数＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)/(648×质粒总长度)(g/mol)；
质粒总长度＝2692bp+PCR产物长度；
其中，6.02×1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量。
使用EASYDilution将构建的DNA标准品分别按照(1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL)梯度稀释作为模板进行RealTimePCR反应，制作DNA标准曲线；每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；本实验采用Takara公司的PremixExTaqTM(ProbeqPCR)进行扩增反应，按照试剂盒操作手册进行操作；反应体系为：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)12.5μL，上下游引物各0.5μL，探针1μL，标准质粒2μL，加蒸馏水补齐25μL，混合均匀；放置在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应；反应采用两步法：95℃30s预变性；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸21s，45个循环；反应结束后得到各自的Ct值(Ct值是指每个反应体系中的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数成线性关系，起始拷贝数越少，Ct值越大，起始拷贝数越多，Ct值越小)；以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。
反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加，每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标准曲线表达式可以算出它的初始拷贝数。
提纯含蓝鳃太阳鱼Cytb序列的质粒作为标准品，通过琼脂糖凝胶电泳对其进行检测；含Cytb序列的质粒(2692bp+501bp)在3000bp和4000bp之间出现明亮清晰的条带；用核酸蛋白分析仪测定质粒标准品在260nm与280nm波长下的吸光度值以及标准品浓度，其A260和A280分别为2.206、1.173，因此A260/A280＝1.88，在1.8～2.0之间，表明该标准品纯度达到标准。
根据所测浓度计算出标准品拷贝数为2.9×1010copies/μL；以拷贝数浓度梯度分别1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL的质粒标准品为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到标准品的扩增曲线，扩增曲线显示有明显的S型曲线，而且指数增长期的曲线平行，说明qPCR的扩增效率相近，据此建立相应的标准曲线，不同浓度标准品之间的Ct值相差均匀，这说明标准品Ct值与标准品拷贝数间有着严格的线性关系；表明可采用标准曲线计算蓝鳃太阳鱼基因的绝对含量。
按照建立的反应体系和条件，将提取的环境DNA作为反应模板进行TaqMan探针荧光定量PCR检测；为保证实验结果的准确性，每个样品进行2次重复的检测；结果显示：每个样品都得到了扩增，扩增曲线呈明显的S型；两个平行组之间的Ct值变异系数均在合理范围内(＜5％)，组间离散度小，稳定性高；将各样本测得的Ct值代入标准曲线，得到各点样本起始拷贝数。
(3)联合分析法
通用引物的实时定量PCR检测总鱼类DNA丰度：使用表1提供的鱼类通用引物和探针，对环境DNA样品中的鱼类总DNA拷贝数进行实时定量PCR检测，获得鱼类总拷贝数，实时定量实验方法同上。
454二代测序技术分析鱼类物种比例：使用表1提供用于454测序的鱼类线粒体16srRNA基因通用引物对环境样品DNA进行扩增，扩增前在引物上加相应的接头，使用加上接头后的引物扩增80个环境样品DNA，反应体系50μL：10×buffer5μL，2.5mMdNTP2μL，Taq酶0.15μL(5U/μL)，上下游引物各1μL，DNA模板1μl，使用高压灭菌水补齐到50μL，反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；71℃延伸10min；PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察反应效果，对扩增效果好的条带切胶回收纯化，将制备好的样本干冰保存测序。
使用NanoDrop测定样品浓度，将不同样品等摩尔混合，借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的接头连接到DNA片段上，变性后处理回收单链的DNA；接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，经过乳化扩增，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的平行扩增，产生数百万个形同的拷贝；最后将经过富集携带DNA片段的磁珠与其他反应物混合，放入到PicoTiterPlate板中，开始测序。
虽然454测序它测序单一读长的准确性达到了99％，但是随着序列读长的增加，测序的误差概率也增加，准确性下降；在正式的分析之前，对其进行序列优化，使用Qiime1.5.0对初始序列质量进行控制和筛选；之后再使用PyNAST对序列进行去杂和修剪；序列优化后使用Uparse提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，再按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，利用得到的OTU再进行鱼类种类的鉴定区分，并对鱼类群落组成比例进行分析。
实验对80个样本进行测序(2013.12月40个样品A与2014.7月40个样品B)，其中58个样品测得有效序列共913070条，序列的平均碱基数为422bp；由于测序过程中通常会出现一些点突变和高分子均聚物等测序错误，随着测序长度的增加序列末端的质量会下降，为了得到更高质量及精准的生物信息分析结果，我们对序列进行了优化；共得到优化序列805040条，平均碱基数422bp，每份样品平均14123条序列，最少的4064条，最多29355条；优化序列中401-500bp和501-600bp的序列最多，分别占总序列数的42.12％和42.50％。
利用Mothur软件包对获得的优化序列进行比对和聚类分析，将相似度超过97％的序列归并为同一种水平的OTU，再利用OTU的比对注释信息对其进行进一步归类，最后将不同归类组的OTU代表序列与Genbank以及我们自己测定的部分千岛湖鱼类16srDNA序列进行手工核对，并对物种进行分类及比例推算。
用鱼类通用引物16S定量的16srRNA拷贝数和454测序所得的群落结构信息计算出的结果(鱼类总的16srRNA的绝对模板拷贝数*蓝鳃太阳鱼序列在454测序结果中的百分比)得到蓝鳃太阳鱼在千岛湖的丰度分布。
(4)两种方法得到结果的比较验证
可看出，两图中蓝鳃太阳鱼基因拷贝数在中心湖区有较多分布，在东南、西北、西南湖区的小水面库区中分布较少。
将两种方法得到的结果与丰度等值图进行对照，结果显示，如图2所示，两组结果的呈现极显著相关(R＝0.942，P＝0)；使用软件Sufer8.0根据两种方法得到的各样本拷贝数绘制千岛湖环境DNA中蓝鳃太阳鱼基因拷贝数的分布等值图，湖区中颜色的深浅代表拷贝数的多少，颜色越深说明该区域采样点目的基因拷贝数浓度越高，反之则拷贝数浓度越低；如图3所示，上图为通用引物qPCR结合454测序的方法联合分析所测算的千岛湖蓝鳃太阳鱼DNA丰度分布图，下图为特异引物qPCR方法所测算的千岛湖蓝鳃太阳鱼DNA丰度分布图两个图比较发现两组结果获得的等值图相似度非常高，高值区域都集中在中心湖区和东南湖区，结果基本一致，都能有效反映蓝鳃太阳鱼的分布情况；因此，该结果也验证了两种技术联合分析鱼类线粒体DNA丰度的方案是可行的。
实施例3：
如图4～7所示，其中上图背景时间为2013年12月；下图背景时间为2014年7月；利用上述的联合分析法对千岛湖内鲢、鳙、鲴、鲌四种主要鱼类类群丰度进行分析，分别得到四种鱼类在2013年12月和2014年7月的丰度时空分布图。
采用了该发明中的联合分析法，具有如下的技术效果：
1、本发明基于环境DNA鉴定技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可以最大限度的保护鱼类资源；同时，对于一些分布较少难以捕获的物种，该方法也较传统捕捞调查更为有效。
2、本方法利主要利用了两种分子生物学鉴定技术，这两种方法的灵敏性都很强：454测序法可以对样品进行深度测序，每个样品的测序数在10000条～20000条以上，也就是说，比例在万分之一的物种理论上都可以被检出；实时定量PCR的方法在理论上也可以检测出每毫升样品中最低10个拷贝的DNA序列；两者共同保证了该方法的灵敏性和准确性。
3、利用通用引物的454测序和实时定量PCR结果联合分析物种相对丰度，可以避免近缘种DNA存在与环境样品中时物种特异引物难以设计，检测误差大等问题，有效地对目标物种进行准确定量。
4、利用通用引物的454测序和实时定量PCR结果，可以轻易的计算出任何被检测到的物种在样品中的相对丰度信息，省去了每个物种逐一设计特异引物进行检测的麻烦。
5、采用等高图绘制反应水域中鱼类分布更加直观形象；本方法能够有效的解决样品中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，且只需要上述两种技术各进行一次实验，即可了解所有物种的DNA丰度信息。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (7)

1.一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的联合分析法包括：
定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，在设计好的通用引物下构建DNA标准品，扩增后提取DNA以制作标准曲线；
将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线以获得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数；
454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例；
测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种，计算公式为：目标物种线粒体基因拷贝数＝实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数×二代454测序获得的目标物种线粒体序列的百分比；
使用sufer8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。
2.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的各环境DNA样本为提前根据水域大小，设置样点并采集柱状水层混合后的水样冷藏，在实验室中抽滤，后提取DNA冷藏备用。
3.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的水样在24h内进行抽滤处理，滤膜孔径为1.2μm，抽滤后使用DNA提取试剂盒提取滤膜中的所有环境DNA，提取好的DNA在-20℃条件下保存备用。
4.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的通用引物选择在16srRNA基因区域进行通用引物和探针设计，所设置的16srRNA基因正向引物序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；16srRNA基因反向引物序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；16srRNA基因探针序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的标准曲线制备过程具体如下：
扩增包含检测目的的鱼类线粒体16srDNA基因部分序列，进行PCR反应，反应产物经电泳检测后，采用TIANgelMidiPurificationKit，对PCR产物进行回收纯化；
将所述的PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化入感受态细胞中，挑选菌斑进行培养，提取质粒后进行限制性内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳；
DNA胶回收后进行浓度测定，在A260/A280大于1.8的情形下，按下述公式计算质粒拷贝数：拷贝数＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)/(648×质粒总长度)(g/mol)；
质粒总长度＝2692bp+PCR产物长度；
其中，6.02×1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量；
使用EASYDilution将构建的DNA标准品分别按照1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL梯度稀释作为模板进行RealTimePCR反应，制作DNA标准曲线，每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；
对构建的DNA标准品进行扩增反应，反应采用两步法：95℃30s预变性；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸21s，45个循环，反应结束后得到各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线。
6.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的各环境样点的DNA相对丰度拷贝数的测定过程具体如下：
反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加，每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标准曲线表达式可以算出它的初始拷贝数；由拷贝数可知所测物种在各样点的DNA相对丰度情况。
7.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的454GS-FLXTitanium测序分析鱼类物种组成比例具体为：
选取16srRNA基因为引物，其中所设置的16srRNA基因F引物序列为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；16srRNA基因R引物序列为SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；
对环境样品DNA进行扩增，切胶回收后干冰保存；
测定样品浓度，将不同样品等摩尔混合，将3′端和5′端有特异性的接头连接到DNA片段上，变性后处理回收单链的DNA，接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，经过乳化扩增，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的平行扩增，产生数百万个形同的拷贝，最后将经过富集携带DNA片段的磁珠与其他反应物混合，放入到PicoTiterPlate板中开始测序；
使用Qiime1.5.0对初始序列质量进行控制和筛选；之后再使用PyNAST对序列进行去杂和修剪；序列优化后使用Uparse提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，再按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中Uchime被用来检测序列中的嵌合体序列并去除，得到OTU的代表序列；用全部序列与OTU的代表序列进行Blast比对，得到每条序列与最相近的OTU的代表序列对应表，利用得到的OTU在NCBI数据库中对于测得序列所属的物种种类进行鉴定，并统计OTU的出现率从而得到鱼类的线粒体基因的组成比例信息。
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