CN111690725A - 一种基于环境dna的过鱼通道效果监测和评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，包括如下步骤：S1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；S2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；S3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16S rDNA序列，获得PCR产物；S4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；S5、建立鱼类16S rDNA序列比对数据库；S6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；S7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估，与其他现有方法相比，无需进行大量的捕捞作业或仪器的操作，采样简单，而且不会对鱼类造成伤害，有利于鱼类的保护。
Description
技术领域
本发明涉及分子生态学技术领域，具体为一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法。
背景技术
过鱼通道是供鱼类通过拦河水闸或坝的人工设施，由于水利工程的修建破坏了河流的连通性，阻碍了河流中鱼类的洄游和物质的传输，严重威胁鱼类的生物多样性，为了缓解水利工程造成的负面影响，一般通过在水闸或坝上修建过鱼通道来保护鱼类的自然生活习性，实现上下游鱼类洄游和种群的交流；
过鱼通道效果监测和评估的研究起步较晚，对于效果的监测和评估没有统一的标准；虽然相关研究已有报道，但世界范围内数以万计的过鱼通道，绝大多数都未被监测和评估，过鱼通道效果监测和评估通常采用的方法有张网法、堵截法、视频监测、水声学和遥感法等，但这些方法也存在弊端，比如对鱼类造成损伤、消耗时间长、仪器设备使用成本高、不便于操作；
环境DNA(environmental DNA,eDNA)在20世纪80年代就被提出，初期仅应用于微生物研究，是指环境样品中，例如土壤、空气、水体、沉积物等，有机体脱落释放的DNA，随着分子生物学技术的发展，可以利用环境中包含的DNA进行物种的鉴定，近年来，eDNA技术被应用于水环境中来确定物种是否存在。
发明内容
本发明提供一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，可以有效解决上述背景技术中提出过鱼通道效果监测和评估的研究起步较晚，对于效果的监测和评估没有统一的标准；虽然相关研究已有报道，但世界范围内数以万计的过鱼通道，绝大多数都未被监测和评估，过鱼通道效果监测和评估通常采用的方法有张网法、堵截法、视频监测、水声学和遥感法等，但这些方法也存在弊端，比如对鱼类造成损伤、消耗时间长、仪器设备使用成本高、不便于操作的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，包括如下步骤：
S1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；
S2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；
S3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16S rDNA序列，获得PCR产物；
S4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；
S5、建立鱼类16S rDNA序列比对数据库；
S6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；
S7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估。
根据上述技术方案，所述S1中采集水样分别在表层、中层和下层各采集3次水样，每次采集2L水样，样品保存要置于4℃冷藏，并在24h内进行抽滤处理。
根据上述技术方案，所述S2中水样抽滤使用的滤膜规格为0.45μm孔径的硝酸纤维素无菌过滤膜，样品抽滤后直接提取DNA或者置于-20℃保存，总的环境DNA的提取采用氯仿萃取法提取或使用DNA提取试剂盒。
根据上述技术方案，所述S3中各采样点采集的表层、中层和下层水样抽滤后混合作为该采样点样本进行总环境DNA提取。
根据上述技术方案，所述S3中PCR扩增使用的引物为：
正向引物F：5-GCCTGTTTACCAAAAACATCAC-3；
反向引物R：5-CCGGTCTGAACTCAGAT CACGT-3；
目标片段长度为546bp。
根据上述技术方案，所述S3中PCR扩增使用25μL反应体系：
2.5μL 10×buffer，2μL dNTP，各1μL正反引物，0.15μL Taq酶，1μL DNA模板，17.35μL ddH2O；
反应条件设置为：94℃预变性2min；
94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；
72℃延伸10min。
根据上述技术方案，所述S5中根据过鱼通道所在水域的鱼类历史调查资料和文献资料，掌握水域鱼类种类信息；在NCBI数据库查询搜集鱼类16S rDNA序列，并用权利要求4所述引物PCR扩增，补充未查询到的序列，构建序列比对数据库。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明结构科学合理，使用安全方便，本发明将环境DNA的技术原理应用在过鱼通道效果监测和评估工作中，提供了一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法；
实施上述技术方案的益处为：
1、与其他现有方法相比，无需进行大量的捕捞作业或仪器的操作，采样简单，而且不会对鱼类造成伤害，有利于鱼类的保护；
2、利用环境DNA技术使样本的采集和鱼类种类的鉴定更加简单、高效、快速，而且检测结果可靠、使用成本低；
3、由于本方法有以上优点，该方法可用于长期的监测工作，可对大量的过鱼通道建立监测网。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的实施流程示意图；
图2是本发明的采样点示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：如图1-2所示，本发明提供技术方案，一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，包括以下步骤：
S1、水样的采集和环境DNA的提取：
在连江西牛过鱼通道的入口、出口和休息池设置采样点进行水样的采集，分别在表层、中层和下层各采集3次，每次采集2L水样，每个点9个样品，总共27个样品；
将采集的样品放置于4℃冷藏箱保存，在24h内对水样进行抽滤处理，抽滤处理使用的滤膜规格为0.45μm孔径的硝酸纤维素无菌过滤膜；
将每个采样点的9个抽滤样品分别混合进行DNA的提取，使用DNA提取试剂盒提取各采样点滤膜中的DNA，提取后使用TE缓冲液溶解，放置-20℃保存备用。
S2、PCR扩增和高通量测序：
采用引物(正向引物F：5-GCCTGTTTACCAAAAACATCAC-3；反向引物R：5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3)PCR扩增16S rDNA序列，PCR扩增使用25μL反应体系：2.5μL 10×buffer，2μL dNTP，各1μL正反引物，0.15μL Taq酶，1μL DNA模板，17.35μL ddH2O；
反应条件设置为：94℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；
PCR扩增结果使用琼脂糖凝胶电泳进行检测并回收、纯化；
将纯化的PCR样品送至生物公司利用第二代高通量测序技术进行测序，获得PCR序列信息。
S3、建立鱼类16S rDNA序列比对数据库：
根据连江鱼类相关文献资料信息和调查数据，掌握连江鱼类种类名录，在NCBI数据库中查询搜集相关鱼类的16S rDNA序列，并利用第二步骤的方法测序，补充未查询到的鱼类16S rDNA序列信息，构建连江鱼类16S rDNA序列比对数据库。
S4、序列比对，确定鱼类物种信息：
将环境样品的PCR扩增测序结果在NCBI数据库和已构建的连江鱼类16S rDNA序列比对数据库进行比对，根据序列的同源性确定鱼类物种信息。
S5、过鱼通道效果的监测和评估：
根据步骤四中16S rDNA序列比对结果确定鱼类物种信息，共检测到鱼类物种36种，其中过鱼通道入口检测到26种，出口检测到29种，休息池检测到33种；
具体信息见下表，因此，可以确定连江西牛过鱼通道对这36种鱼类的过鱼效果是有效的。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、在过鱼通道的入口、出口和休息池设置3个采样点，采集水样并保存；
S2、将采集的水样进行抽滤，然后提取总的环境DNA；
S3、以提取的总的环境DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增16S rDNA序列，获得PCR产物；
S4、将PCR产物回收、纯化，进行高通量测序，获得PCR产物序列；
S5、建立鱼类16S rDNA序列比对数据库；
S6、通过BLAST在NCBI数据库和已构建的数据库查找同源序列，确定鱼类物种信息；
S7、统计所获得的鱼类物种信息，完成过鱼通道效果的监测和评估。
2.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S1中采集水样分别在表层、中层和下层各采集3次水样，每次采集2L水样，样品保存要置于4℃冷藏，并在24h内进行抽滤处理。
3.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S2中水样抽滤使用的滤膜规格为0.45μm孔径的硝酸纤维素无菌过滤膜，样品抽滤后直接提取DNA或者置于-20℃保存，总的环境DNA的提取采用氯仿萃取法提取或使用DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S3中各采样点采集的表层、中层和下层水样抽滤后混合作为该采样点样本进行总环境DNA提取。
5.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S3中PCR扩增使用的引物为：
正向引物F：5-GCCTGTTTACCAAAAACATCAC-3；
反向引物R：5-CCGGTCTGAACTCAGAT CACGT-3；
目标片段长度为546bp。
6.根据权利要求5所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S3中PCR扩增使用25μL反应体系：
2.5μL 10×buffer，2μL dNTP，各1μL正反引物，0.15μL Taq酶，1μL DNA模板，17.35μLddH2O；
反应条件设置为：94℃预变性2min；
94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；
72℃延伸10min。
7.根据权利要求1所述的一种基于环境DNA的过鱼通道效果监测和评估方法，其特征在于，所述S5中根据过鱼通道所在水域的鱼类历史调查资料和文献资料，掌握水域鱼类种类信息；在NCBI数据库查询搜集鱼类16S rDNA序列，并用权利要求4所述引物PCR扩增，补充未查询到的序列，构建序列比对数据库。
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