CN113355403A

CN113355403A - 一种利用环境dna技术检测鱼类物种多样性的方法

Info

Publication number: CN113355403A
Application number: CN202110518941.4A
Authority: CN
Inventors: 邢迎春; 赵亚辉; 高婉茹
Original assignee: Chinese Academy Of Fishery Sciences
Current assignee: Chinese Academy Of Fishery Sciences
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明提出了一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，涉及分子生态学技术领域。该利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行高通量测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。本发明的优点在于，该方法可用于检测鱼类物种多样性，尤其是湖泊水生生物多样性，并且检测结果精准，可检出的种类多。

Description

一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法

技术领域

本发明涉及分子生态学技术领域，具体而言，涉及一种利用环境DNA 技术检测鱼类物种多样性。

背景技术

环境DNA(environmentalDNA，eDNA)于20世纪70年代末被首次提出，是指从有机体脱落释放出来的游离的DNA分子，存在于土壤、沉积物、空气和水体等环境中。环境DNA提取技术最早被用于分离和纯化沉积物中微生物的DNA。近年来，环境DNA技术被应用于生物多样性分析、生物量估测、珍稀物种发现、生物入侵物种的监控以及群落系统发育重建等生态学研究领域。通过环境DNA技术，可以在提取DNA片段后利用测序技术进行定性或定量分析环境中的物种种类和物种生物量。

传统的湖泊生物多样性的研究主要有捕捞法和声学探测法。捕捞法是通过对水体中的鱼类进行捕捞，捕捞存在作业强度高、成本高、准确性低以及破坏鱼类资源等问题。声学探测法受限于水域理化指标和天气状况，而且无法实现大面积调查。为了解决传统方法中存在的技术问题，人们开始考虑使用环境DNA技术监测水体中鱼类的物种多样性。如“用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法”(CN201510005835.0)，其包括如下步骤，步骤(1)：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；步骤(2)：将所述的水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；步骤(3)：将所述的总环境 DNA采用核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的16S rDNA序列作为通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤(4)：将所述的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；步骤(5)：将所述的带有DNA的凝胶进行切胶克隆测序后通过GENBANK进行blast比对，以确定所述的DNA 是否为鱼类序列；步骤(6)：确定所述的DNA为鱼类序列后，采用二代测序技术对所述的PCR产物的组成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA 的鱼类群落组成及分布，可以在一个PCR样品中获得几千乃至上万条16S rDNA条带，有利于统计和增加研究的精确性，同时降低了固定样品数下样品采集的成本。然而这种鉴定方法还存在一些缺陷，比如检测精度不够，结果准确率有待提高。针对这一技术问题，“一种基于环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法”(CN201910216942.6)，其包括如下步骤：(1) 取待测水域的表层水样；(2)将所取的水样进行处理，提取eDNA；(3) 以提取的eDNA为模板，CytbF(序列如SEQIDNO:1)和CytbR(序列如SEQIDNO:2)、16SF(序列如SEQIDNO:3)和16SR(序列如SEQIDNO:4) 为引物，PCR扩增，得到PCR产物；(4)回收、纯化目的片段，构建目的片段文库，进行高通量测序后的原始数据优化后获得高质量序列；(5) OTU聚类：应用软件Vsearch2.3.4对高质量序列在97％的相似性水平上进行聚类，产生可操作性分类单元(operationaltaxonomicunits，OTUs)；(6) 建立鱼类本地比对数据库；(7)OTUs代表性序列与建立的鱼类数据库的数据信息进行比对分析，确定待测水域中鱼类的物种多样性组成。该专利可以在保证检测精度的基础上，检测到21～38种鱼类。然而，该方法的检测量还存在一定的问题，无法在相同检测时间内监测到更多的物种。

因此，需要研发一种检测精度高，检测量大的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，此方法通过采用如SEQID.NO 1和SEQID.NO 2所示的引物组检测水体鱼类多样性，检出率高，检出量大。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本申请实施例提供一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样 eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行高通量测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。

相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：

本发明实施例的提供的利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，通过前期摸索出最为适宜的采样方法，过滤方法，eDNA提取方法，PCR条件和体系，排除了采样误差、eDNA体系内杂质对于检测结果的影响，同时摸索出的PCR条件和体系，有利于排除引物组对于检测结果的影响，最终形成的整体方法可用于检测鱼类物种多样性，尤其是湖泊水生生物多样性，并且检测结果精准，可检出的种类多。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例2的采样点信息图；

图2为本发明实施例2中检测出的eDNA种类分布图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

本申请实施例提供一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样 eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。通过采用如SEQID.NO 1和SEQID.NO 2所示的引物组检测水体鱼类多样性，检出率高，检出量大。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述过滤包括如下步骤，将所述水样在采集后24h内使用混合纤维素脂膜进行真空处理，抽滤完后将所述混合纤维素脂膜立即保存于-20℃或进行后续步骤。工业废水、生活污水和其他废弃物进入江河湖海等水体，超过水体自净能力会导致水体的物理、化学、生物等方面特征的改变，从而影响到水的利用价值，危害人体健康并破坏生态环境，造成水质恶化的现象，而水体污染又为江河湖泊鱼类多样性的研究带来极大的阻碍。本实施例通过在限期内对水样进行真空过滤处理，有利于去除水体中的各种杂质，如各种病原体、植物营养物质、需氧化质、石油、放射性物质、有毒化学品和酸碱盐类等，避免这些物质对于eDNA的提取造成干扰，同时还选用混合纤维素脂膜作为过滤膜，相较于玻璃纤维素滤膜(GF)、硝酸纤维素滤膜(NC)、尼龙滤膜(NL)、聚碳酸酯滤膜(CF)和聚醚砜滤膜(PES)，混合纤维素脂膜能更好的去除水体中的杂质，有利于物种的检出。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述混合纤维素脂膜的孔径为0.45μm。孔径在0.22-10.0μm范围内的滤膜都适用于eDNA提取用水样的前处理，可以有效除去大部分物质，经过前期试验的摸索，发明人发现当孔径为0.45μm时，稳定性更好，有利于减少检测的误差。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述正向引物和反向引物的5’端均添加有核苷酸序列如SEQID.NO 3 所示的标签。通过在5’端添加标签，有利于提升引物的特异性，避免形成引物二聚体等，提高该方法的精度。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；55个循环包括 94℃变性30s，54℃退火30s，延伸72℃延伸1min；72℃最后延伸5min。变性温度低，原DNA解链不完全会影响PCR反应扩增出特异性条带，而变性温度过高，又会因为高温抑制酶的活性进而影响扩增效率，因此适宜的变性温度和变性时间是保证DNA解链完全的基本条件。变性后温度快速冷却至复性温度，可使引物和模板发生结合，由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度，因此需要针对引物的长度和目的片段的大小设置合适的复性温度。循环数的多少影响着目的片段量的大小，过少的循环数无法达到足够的目的片段数导致无法检出，过多的循环数虽然可以在一定程度上保证获得足够量的目的片段数以便检出，但同时也会导致非特异性扩增的增加，导致出现很多非特异性片段，进而影响整个体系的检测精确度。此外，延伸时间的长度也是导致非特异性扩增带出现的重要因素。由此可见，探索适宜的PCR反应条件，是保证eDNA中各类DNA被有效扩增的关键因素之一，同时也是保证各物种能被顺利检出的关键。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，PCR扩增的反应体系为每25μL体系中包括：2*PCR Mastermix 12.5 μL，DMSO 1μL，Dnase I 0.5μL，BSA 0.25μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，eDNA 2～5μL，余量为ddH₂O。适宜的反应体系，避免了引物的错配。如，PCR Mastermix中的酶和Dnase I浓度过高可引起非特异性扩增影响检出的灵敏度，浓度过低则目的产物DNA片段数过少导致无法检出，又如，当引物在整个反应体系中的浓度太低时，会导致扩增的目的产物DNA片段数太少无法检出，引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应，出现很多假阳性带，导致整个检测方法的灵敏度降低。同时添加一定量的BSA，有助于稳定整个体系，通过抑制其他化学类物质与酶的结合，大幅度提升PCR Mastermix中的酶和Dnase I的活性，便于目的DNA片段的聚合和延伸等，是保证整个方法灵敏度的关键因素之一。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述PCR Mastermix中包括Pfu polymerase/μL 0.09～0.11U、dNTP 490～510μM、Tris-HCl 20～50mM、KCl 20～100mM、MgCl₂ 3～4mM。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述PCR Mastermix中包括Pfu polymerase/μL 0.1U、dNTP 500μM、 Tris-HCl 20mM、KCl100mM、MgCl₂ 3mM。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述PCR Mastermix中包括Pfu polymerase/μL 0.1U、dNTP 500μM、 Tris-HCl 50mM、KCl 20mM、MgCl₂ 4mM。

在本发明的一些实施例中，上述利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，所述提取eDNA所用试剂盒为Qiagen DNeasy Blood and Tissue DNA extraction kit的试剂盒，提取eDNA时每2mL EP管中所用的ATL buffer的用量为720μL，所述Proteinase-K的用量为80μL，其中裂解时间为3h，裂解温度为56℃，洗脱时所用的缓冲液为EB buffer。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例的目的在于提供一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法。

1、设计引物

按照引物设计使用脊椎动物12S rRNA通用引物的序列如表1所示，扩增的目标条带为106bp。为了标记45个采样点的样品序列以及阴性对照(采样时的阴性对照、eDNA提取过程的阴性对照、PCR过程的阴性对照)，在正反向引物的5’末端添加相同的特定标签。标签是使用OLIGOTAG软件设计，由六个核苷酸组成，并且在标签前面添加2或3个N碱基，tag标签如表2所示。将添加好tag后的48组12s rRNA通用引物送至生物合成公司合成，得到引物组，对前述引物组进行测序，测序表明前述引物组的核苷酸序列即为表1中所述，表明合成的引物组即为调整后的12s rRNA通用引物。表1扩增出的片段如下所示。

表1

表2

Tag标签	核苷酸组成	Tag标签	核苷酸组成	Tag标签	核苷酸组成
						1	AACAAC	17	AAGGTC	33	GGTAAG
2	CCGGAA	18	TCGACG	34	CGTCAC
						3	CCGCTG	19	AGAAGA	35	AAGCAG
4	GGCTAC	20	GGTTCT	36	CACGTA
						5	TCACTC	21	GTAACA	37	TGCGTG
6	CCGTCC	22	AGACCG	38	CACTCT
						7	CGTGCG	23	CTATAA	39	TCCAGC
8	ATAATT	24	CGAATC	40	GCGAGA
						9	TTGAGT	25	TTCGGA	41	GTACAC
10	TTGCAA	26	CTCATG	42	TCTTGG
						11	TAACAT	27	AACCGA	43	GGCGCA
12	GGTCGA	28	AGTGTT	44	CCTGTC
						13	CTTGGT	29	AACGCG	45	AATAGG
14	ACTTCA	30	TTCTCG	46	TAATGA
						15	TGGAAC	31	GAACTA	47	AATCCT
16	AAGTGT	32	AAGACA	48	TGGCGG

2、采样

选取要采集的地点，在需要采样的地点采集水样，每个采样点采集1000 mL表层水，重复三次采样，将所采集的表层水保存在密封的采样瓶中，并且避光保存，采样瓶在使用前需经过10％的漂白液消毒，无菌水冲洗并干燥。采集人员需佩戴一次性手套和口罩，每次取样后及时更换。

3、过滤

将所采集的水样品在24h内使用0.45μm的混合纤维素脂膜(MCE: Whatman公司)进行真空过滤。每个检测点增加1个以1L矿泉水为样本的阴性对照，用来检测在保存、运输、提取过程中样品是否受到污染。每份样品过滤后，滤膜放置于2mL离心管中立即冷冻保存直至DNA提取。不同采样点的样品隔离保存，防止样品间的交叉污染。

4、eDNA提取

将前述步骤中冷冻保存的滤膜，在提取前使用10％的漂白剂清洁操作台面和离心机等，再用75％酒精擦拭一遍。使用DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen公司)按照试剂盒说明书提取滤膜上的eDNA。主要对以下步骤进行优化：将说明书上推荐的在2ml EP管中加入180μL ATL buffer和20μL Proteinase-K优化为加入720μL ATL buffer和80μLProteinase-K，放至水浴锅，于56℃振荡3hours。最后一步洗脱使用100μL的EB试剂。并在提取时设置阴性对照，避免实验过程中造成污染，提取的eDNA于-20℃冷冻保存，直至PCR扩增。

5、PCR

将表1中的引物用于PCR扩增以便检测步骤4中提取的eDNA，同时对于PCR条件，包括对变性温度、变性时间、退火温度、退火时间、延伸温度和延伸时间摸索，同时也包括对于反应体系的摸索，最终得到的最优反应条件为95℃预变性10min；55个循环包括94℃变性30s，54℃退火30s， 72℃延伸1min；72℃最后延伸5min。最优的反应体系为每25μL体系中包括：2*PCR Mastermix 12.5μL，DMSO 1μL，Dnase I 0.5μL，BSA 0.25μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，eDNA 2～5μL，余量为ddH₂O。PCR Mastermix中包括Pfu polymerase/μL0.1U、dNTP 500μM、Tris-HCl 20mM、 KCl 100mM、MgCl₂ 3mM，或包括Pfu polymerase/uL0.1U、dNTP 500μ M、Tris-HCl 50mM、KCl 20mM、MgCl₂ 4mM。获得的PCR产物经2％凝胶电泳后检测是否含有目的条带，含有目的条带的PCR产物则送往测序公司继续测序。

6、测序分析

利用高通量测序技术(High-througput sequencing)Illumina NovaSeq测序平台(2*150bp)正反双向测序，对测序数据进行初级质控，主要包括以下四个部分：(1)当单端测序reads中N的含量超过3时，去除此对paired reads；(2)碱基质量值低于5时，属于低质量碱基；(3)当单端测序read 中含有的低质量碱基数超过该条read长度比例的20％时，去除此对paired reads；(4)去除adapter序列时，adapter序列至少要匹配8bp。数据处理使用Linux Ubuntu虚拟机处理后的测序片段，使用Vsearch(fastq-mergepairs) 命令将正反序列比对后拼接，使用OTU聚类结合cat(grep)命令进行鱼类多样性分析。

实施例2

本实施例的目的在于利用实施例1中提供的方法检测水样。

1、采样

按照实施例1中的方法采用，总共在鄱阳湖设置了45个采样点共有135 个样品，采样点信息图如图1所示。水样品在24h内使用0.45μm的混合纤维素脂膜(MCE:Whatman公司)进行真空过滤。每个检测点增加1个以1L 矿泉水为样本的阴性对照，用来检测在保存、运输、提取过程中样品是否受到污染。每份样品过滤后，滤膜放置于2mL离心管中立即冷冻保存直至 DNA提取。不同采样点的样品隔离保存，防止样品间的交叉污染。

2、过滤

按实施例1中所示方法真空抽滤前述样品，抽滤完后将备用的样品于 -20℃保存，其余样品立即开始提取。

3、eDNA提取

按照eDNA试剂盒(Qiagen DNeasy Blood and Tissue DNA extraction kit) 的说明书进行提取，其中提取eDNA时每2mL EP管中所用的ATL buffer 的用量为720μL，所述Proteinase-K的用量为80μL，其中裂解时间为3h，裂解温度为56℃，洗脱时所用的缓冲液为EB buffer，并且洗脱时提取完后得到eDNA，将多余的eDNA于-20℃保存，其他eDNA用于进行下一步。

4、PCR及测序分析

将步骤3中的eDNA利用表格1中的引物进行PCR反应，反应条件为， 95℃预变性10min；55个循环包括94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min；72℃最后延伸5min。最优的反应体系为每25μL体系中包括：2*PCR Mastermix 12.5μL，DMSO 1μL，Dnase I 0.5μL，BSA 0.25μL，正向引物 0.5μL，反向引物0.5μL，eDNA 2～5μL，余量为ddH₂O。

将以上PCR经过2％凝胶电泳检测，135个样品都有目标条带，阴性对照无条带选择检测出目的条带的PCR产物送至北京优吉科技有限公司进行高通量测序。

5、结果

将高通量测序结果按实施例1中所示步骤整理后，得到如下结果：

本次试验检测出来总计6个目12个科31个属36种鱼，包括鲤形目、鲈形目、鲇形目、鲱形目、鳉行目和鲑形目，其中9号采样点成功检测到江豚这种难以检测到的物种。45个点都检测出鱼类的目标片段，从序列丰度可以看出，鄱阳湖的优势物种主要包括黄颡鱼、鲇、鳜、鲫、鲤等，结果如表3和图2所示。

表3

综上所述，本发明实施例的提供的利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，通过前期摸索出最为适宜的采样方法，过滤方法，eDNA提取方法， PCR条件和体系，排除了采样误差、eDNA体系内杂质对于检测结果的影响，同时摸索出的PCR条件和体系，有利于排除引物组于检测结果的影响，最终形成的整体方法可用于检测鱼类物种多样性，尤其是湖泊水生生物多样性，并且检测结果精准，可检出的种类多。利用本发明提供的方法检测出6个目12个科31个属36种鱼，其中有1个点成功检测到江豚这种难以检测到的物种。检测结果表明，白边拟鲿(Pseudobagrus albomarginatus)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)、粗唇鮠(Leiocassis crassilabris)在鄱阳湖水样中检测到，鳡(Elopichthysbambusa)和鲢(Hypophthalmichthys molitrix)在中国除西北、西南外，由北至南平原地区的河流中均有分布，银鮈(Squalidus argentatus)和点纹银鮈(Squaliduswolterstorffi)分布比较广泛，珠江、闽江、富春江、长江、黄河等水系均有。

在本发明中，物种采样点序列分析表如下所示：

表4

表5

表6

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：采集待测地的水样，过滤后提取eDNA，得到待检测水样eDNA，利用引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行测序，得到序列片段，将所述序列片段拼接后进行OTU聚类分析物种多样性；所述引物组包括上游引物和下游引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID.NO 2所示。

2.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述过滤包括如下步骤，将所述水样在采集后避光保存并在24h内使用混合纤维素脂膜进行真空过滤处理，抽滤完后将所述混合纤维素脂膜放置2mL离心管中并立即保存于-20℃或进行后续步骤。

3.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述混合纤维素脂膜的孔径为0.45μm。

4.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的5’端均添加有核苷酸序列如SEQID.NO3所示的标签。

5.根据权利要求1所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；55个循环包括94℃变性30s，54℃退火30s，延伸72℃延伸1min；72℃最后延伸5min。

6.根据权利要求5所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为每25μL体系中包括：2*PCR Mastermix 12.5μL，DMSO 1μL，Dnase I 0.5μL，BSA0.25μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，eDNA 2～5μL，余量为ddH₂O。

7.根据权利要求6所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCRMastermix中包括Pfu polymerase/μL 0.09～0.11U、dNTP 490～510μM、Tris-HCl 20～50mM、KCl 20～100mM、MgCl₂ 3～4mM。

8.根据权利要求7所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCRMastermix中包括Pfu polymerase/uL 0.1U、dNTP 500μM、Tris-HCl 20mM、KCl 100mM、MgCl₂ 3mM。

9.根据权利要求7所述的环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述PCRMastermix中包括Pfu polymerase/uL 0.1U、dNTP 500μM、Tris-HCl 50mM、KCl 20mM、MgCl₂4mM。

10.根据权利要求1所述的利用环境DNA检测鱼类物种多样性的方法，其特征在于，所述提取eDNA所用试剂盒为Qiagen DNeasy Blood and Tissue DNA extraction kit的试剂盒，提取eDNA时每2mL EP管中所用的ATL buffer的用量为720μL，所述Proteinase-K的用量为80μL，其中裂解时间为3h，裂解温度为56℃，洗脱时所用的缓冲液为EB buffer。