CN112359119A - 用于大型底栖动物群落结构研究的环境dna宏条形码方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于大型底栖动物群落结构研究的环境DNA宏条形码方法。本发明所要保护的一个技术方案是引物对在检测待测水域大型底栖动物群落结构中的应用。所述引物对名称为COI，是由引物1和引物2组成的引物对，所述引物1和引物2可为序列表中序列1和序列2。相比较于传统方法，使用本发明所提供的COI引物扩增待测水域的环境DNA样品，测序、注释分析到显著更多的物种，尤其是易逃逸，小型以及部分生活史在水中的底栖动物类群；并可补充传统调查方法中易忽视、难发现及个体小的底栖动物丰度数据，有效提高了大型底栖动物的鉴定水平、物种检测率及丰度评估准确度，是一项有效可靠的大型底栖动物群落结构调查新方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生态学领域，具体涉及用于大型底栖动物群落结构研究的环境DNA宏条形码方法。
背景技术
环境DNA(eDNA)宏条形码是指直接从水、土壤、沉积物等环境中提取生物DNA片段后，通过设计通用引物扩增eDNA，利用高通量测序分析获得大量DNA序列，并与具有可靠物种分类信息的DNA条形码参照序列进行比对,从而确定目标生物在该环境中的组成及丰度，是一种新型的水生生物群落结构与多样性检测技术。相比传统水生生物群落结构调查技术，该技术具有准确率高、对资源和环境友好、稀有种易检测、非入侵式调查等特点，可有效避免传统调查中的缺陷与不足。
大型底栖动物是生活史全部或大部分时间在水体底部的一类水生动物，是水生生态系统的重要组成部分，具有重要的生态功能，包括加速水底碎屑分解，调节泥水界面物质交换，维持水生生态系统动物完整性及水生生态系统健康评价等。大型底栖动物群落多样性是水生态系统健康监测的关键指标之一，准确高效地底栖动物群落结构分析与评估对于水生生物保护、水环境管理以及农业水产养殖等具有重要意义。传统大型底栖动物群落结构调查依赖于采泥器采集沉积物从沉积物中挑选大型底栖动物，该调查法费时、费力且普遍存在调查不全面、鉴定困难及估算丰度不精确等问题。而环境DNA方法在检测大型底栖动物群落结构研究中还未形成成熟系统的标准化实验流程，对于通用引物的选择，采样样品类型的筛选以及注释结果的有效、可靠性评估还未得到科学验证与评估。因此，eDNA宏条形码方法检测底栖动物的标准化实验流程构建、注释和检测结果的可靠性评估是提高底栖动物物种检测率和鉴定准确率的重要突破点，是准确评估底栖动物群落结构的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何准确检测水域大型底栖动物群落结构即多样性或如何更准确地对水生生态系统进行健康监测。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了引物对在检测待检测水域大型底栖动物群落结构(多样性)研究中的应用。所述引物对的名称为COI，是由下述引物1和引物2组成的引物对：
所述引物1为下述a1)或a2)：
a1)、核苷酸序列为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)、将序列表中序列1所示的序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a1)衍生的单链DNA分子。
所述引物2为下述b1)或b2)：
b1)、核苷酸序列为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)、将序列表中序列2所示的序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由b1)衍生的单链DNA分子。
上文所述的COI在制备检测待测水域大型底栖动物群落结构(多样性)的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测水域大型底栖动物群落结构(多样性)的环境DNA宏条形码(简称环境DNA)的方法，包括如下步骤：
A1)采集待测水域的表层沉积物样本；
A2)提取所述表层沉积物样本中的环境DNA；
A3)使用权利要求1中所述的COI对所述环境DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
A4)对所述PCR产物进行序列分析得到待测水域大型底栖动物群落结构结果。
上述方法中，A1)所述采集待测水域的表层沉积物样本为采集待测水域沉积物表层0-1cm的沉积物样品。
上述方法中，所述环境DNA为直接从待测水域的水、土壤、沉积物等环境中提取的生物DNA片段。
上述方法中所述大型底栖动物为生活史全部或大部分时间在所述待检测水域水体底部的一类水生动物。上述大型底栖动物群落结构具体通过物种种类组成和/或物种种类丰富度和/或物种相对丰度特征体现。
上述方法中，A4)所述序列分析包括测序、测序数据聚类和注释。
上述方法中，A3)步骤中所述PCR扩增的退火温度为46℃。
上述方法中所述PCR产物使用磁珠纯化，并用多功能酶标仪INFINITE F NANO+对回收产物进行检测定量，构建文库。
上述方法中，所述测序采用Illumina Miseq测序平台。在测序后，还需要将原始测序结果进行优化，得到高质量序列；
所述原始测序结果优化标准如下：
(1)将两条序列进行比对，根据比对的末端重叠区进行拼接，拼接时保证至少有20bp的重叠区，去除拼接结果中含有N的序列；
(2)去除引物和接头序列，去除两端质量值低于20的碱基，去除长度小于200bp的序列；
(3)将上面拼接过滤后的序列与数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列(chimera sequence)，得到最终的有效数据；
上述方法中，所述聚类为采用软件Vsearch(1.9.6)对高质量序列在97％的相似性水平上进行聚类，产生可操作性分类单元(operational taxonomic units，OTUs)；
上述方法中，所述注释为利用RDP classifier(http//rdp.cme.msu.edu/)，比对NT数据库，对每条OTU代表序列进行物种分类注释。
上述方法的下述任意一种应用也属于本发明的保护范围：
P1)上述方法在检测待测水域大型底栖动物群落结构(多样性)中的应用；
P2)上述方法在制备检测待测水域大型底栖动物群落结构(多样性)的产品中的应用；
P3)上述方法在对待测水域水生生态系统进行健康监测和/或评价中的应用；
P4)上述方法在制备待测水域水生生态系统进行健康监测和/或评价产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测水域大型底栖动物群落结构(多样性)的产品。所述产品包括试剂、和/或试剂盒。所述试剂和/或试剂盒含有上文所述的COI。
上述产品还包括系统。所述系统含有仪器或设备。
上述产品的下述任一应用也属于本发明的保护范围：
D1)上述产品在检测待测水域大型底栖动物群落结构(多样性)中的应用；
D2)上述产品在对待测水域水生生态系统进行健康监测和/或评价中的应用。
通过实施上述技术方案，本发明方法具有如下的优点：
1、取样简单，快速；
2、检测高效、灵敏度高，检测结果准确；
3、无需采集大型底栖动物，保护了大型底栖动物种群，尤其是对于珍稀濒危物种的保护。
附图说明
图1为eDNA检测方法流程图。
图2为用COI、ArF、BF和18S引物扩增沉积物DNA样品的胶图结果。条带1-3代表水样样品；条带4-6代表沉积物样品。
图3为各引物OUT注释结果中各类群比例分布图。
图4为COI引物扩增沉积物DNA样品胶图结果。
图5为潮白河流域大型底栖动物群落结构调查样点分布图。
图6为eDNA方法与传统方法各采样点检测物种数。
图7为eDNA方法与传统方法检测的各门底栖动物组成分布图。
图8为eDNA方法与传统方法鉴定物种种水平相对丰度图。总体水平上相对丰度小于1％归于others。
图9为eDNA方法与传统方法鉴定的大型底栖动物门水平各类群相对丰度图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、环境DNA方法应用于检测大型底栖动物群落结构
一、采集样品类型及通用引物的筛选
1、样本采集
分别于2019年6月在京津冀区域的潮白河流域设置3个采样点，采集表层水样(距离水表面5-20厘米)及表层沉积物样品(沉积物表层0-1cm)，采样点间隔约5Km。
2、通用引物设计
选取线粒体基因COI设计NextF-mlCOIintF_NextR-jgHCO2198引物对(简称COI)，该引物对由序列表中序列1所示的上游引物和序列表中序列2所示的下游引物组成(表1所示)；序列1中，w为a或t，y为t或c；序列2中，r为a或g，y为t或c,n为肌苷。
选取线粒体基因COI设计BF2F_BR2R引物对(简称BF)，该引物对由序列表中序列3所示的上游引物和序列表中序列4所示的下游引物组成(表1所示)；序列3中，h为a或c或t，r为a或g，y为t或c；序列4中，r为a或g，y为t或c,d为a或g或t，n为a或g或c或t。
选取线粒体基因COI设计ArF2_LoboR1引物对(简称ArF)，该引物对由序列表中序列5所示的上游引物和序列表中序列6所示的下游引物组成(表1所示)；序列5中，n为肌苷，r为a或g，y为t或c；序列6中，r为a或g，y为t或c,w为a或t。
选取核糖体RNA(rRNA)基因18S设计TAReuk454FWD1_TAReukREV3引物对(简称18S)，该引物由序列表中序列7所示的上游引物和序列表中序列8所示的下游引物组成(表1所示)；序列7中，s为g或c，y为t或c；序列8中，r为a或g，y为t或c。
表1 4对通用引物序列
注：上表中，第3列的引物序列从上到下依次为序列表中序列1至序列8；第4列扩增片段长度中括号中的值为平均值。
3、通用引物的选取
1)提取
分别提取表层水样及沉积物样品中的环境DNA(eDNA)。
2)扩增
分别用COI、BF、ArF和18S引物对(苏州金唯智生物科技有限公司)对步骤1)中提取的水样样品和沉积物样品的eDNA进行PCR扩增，每个样品设置三个重复，扩增产物回收纯化获得纯化后PCR产物。
PCR扩增的体系为：TransStart FastPfu缓冲液2.5μL，dNTPs 2μL，上游引物(10uM)0.5μL，下游引物(10uM)0.5μL，TransStart Taq DNA聚合酶0.5μL，模板eDNA 1uL，无核酸酶水补足至25μL。
上述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，46℃退火15s，72℃延伸10s，25个循环；72℃稳定延伸3min。上述PCR产物使用磁珠纯化，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Tecan公司的多功能酶标仪INFINITE F NANO+对回收产物进行检测定量，构建文库。
PCR扩增胶图结果如图2所示，条带1-3为水样样品；条带4-6为沉积物样品；CK为无核酸酶水样品(阴性对照)。胶图结果可以看出，BF和ArF引物对无论是水样还是沉积物样品扩增产物均无条带，质控不合格，无法满足建库测序需求。而COI及18S引物对均能对水样和沉积物eDNA进行良好的扩增，条带单一、明亮清晰，质控合格。
3)测序
采用Illumina Miseq PE250测序平台进行高通量测序，得到原始数据，再进行质控优化(使用Trimmomatic软件原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接)，获得高质量序列；
上述优化标准：
(1)将两条序列进行比对，根据比对的末端重叠区进行拼接，拼接时保证至少有20bp的重叠区，去除拼接结果中含有N的序列；
(2)过滤去除引物和接头序列，去除两端质量值低于20的碱基，去除长度小于200bp的序列；
(3)将上面拼接过滤后的序列与NT数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列(chimera sequence)，得到最终的有效数据；
4)OTU聚类和注释
应用软件Vsearch(1.9.6)对上述3)得到的高质量序列在97％的相似性水平上进行聚类，产生可操作性分类单元(operational taxonomic units，OTUs)；
利用RDP classifier(http//rdp.cme.msu.edu/)，比对NT数据库(https://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/)，对每条OTU代表序列进行物种分类注释，确定待测水域大型底栖动物组成与占比。下面的占比(％)为大型水生底栖动物种类数占所有检测到的类群(包括真菌、细菌、浮游生物和鱼类等)的比例。
结果如图3所示，可以看出，COI引物对通过沉积物样品注释到的大型底栖动物占比均明显高于水样样品，其中COI引物对扩增的沉积物样品中大型底栖动物占检测到的所有类群的65.38％，COI引物对扩增的水样样品中大型底栖动物占检测到的所有类群的32.43％。在18S引物对得到的注释结果中，相比水样样品，大型底栖动物在沉积物样品中占比更大，但不高于总类群的15％；两种类型样品注释结果中均以浮游生物(占比高于60％)为主要类群。
因此，相比较而言，沉积物样品更适合通过eDNA宏条形码方法即环境DNA方法检测大型底栖动物群落结构。
综合PCR扩增效果及OUT注释结果，COI引物对扩增表层沉积物是环境DNA方法调查大型底栖动物群落结构的最佳通用引物和样品材料。
二、COI引物检测大型底栖动物群落结构即多样性的标准化实验流程构建
按照实验流程图1，对潮白河流域采集的表层沉积物样品进行检测和分析，具体取样、检测及分析步骤如下：
1、样品采集
于2019年6月在潮白河流域采集3个采样点表层0-1cm的沉积物样品，放入灭菌的5ml EP管，置于液氮中保存运至实验室，-80℃保存至eDNA提取。
2、eDNA提取
使用MAGEN公司生产的试剂盒HiPure Soil DNA Kit提取沉积物中的环境DNA，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用
dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度和纯度，各样品核酸浓度及核酸质量如下表(表2)所示：
表2样品核酸浓度及核酸质量表
| 样品编号 | 核酸浓度(ng/μL) | 核酸质量(ng) |
| 1 | 5.47 | 218.80 |
| 2 | 12.18 | 487.20 |
| 3 | 11.76 | 470.40 |
各样品提取的DNA质检结果表明，各样品均满足扩增需求，可开展扩增实验。
3、PCR扩增,产物回收纯化,建库
采用上述步骤一中的COI引物对对表层沉积物中eDNA样品进行扩增，引物序列见表1。
25uL反应体系包括：TransStart FastPfu缓冲液(北京全式金生物技术有限公司，AP221-01)2.5μL，dNTPs 2μL，上游引物(10uM)0.5μL，下游引物(10uM)0.5μL，TransStartTaq DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，AP221-01)0.5μL，模板DNA1uL，无核酸酶水补足至25μL。
上述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15s，46℃退火15s，72℃延伸10s，25个循环；72℃稳定延伸3min。
上述PCR产物使用磁珠纯化，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Tecan公司的多功能酶标仪INFINITE F NANO+对回收产物进行检测定量，构建文库。质控(条带和定量)结果显示，扩增条带清晰明亮(图4)，扩增纯化后产物定量检测合格(表3)，满足测序需求，可进入下一步骤。
表3样品扩增纯化后产物质检结果
4、测序
采用Illumina Miseq PE250测序平台进行高通量测序，得到原始数据。
使用Cutadapt(v1.9.1)软件对原始测序序列进行质控，使用Qiime(1.9.1)软件进行拼接。质控标准如下：
(1)将两条序列进行比对，根据比对的末端重叠区进行拼接，拼接时保证至少有20bp的重叠区，去除拼接结果中含有N的序列；
(2)去除引物和接头序列，去除两端质量值低于20的碱基，去除长度小于200bp的序列；
(3)将上面拼接过滤后的序列与NT数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列(chimera sequence)，得到最终的有效数据即高质量序列。
5、OUT聚类
使用Vsearch(1.9.6)对上述4得到的高质量序列根据97％的相似度对序列进行OTU聚类，使用Qiime(1.9.1)软件剔除嵌合体，具体流程如下：
(1)对以上优化后的有效序列提取unique序列，保留各序列的重复次数。
(2)去除重复次数为1的unique序列。
(3)按照97％相似性对unique序列(重复次数>1)进行OTU聚类，在聚类过程中进一步去除嵌合体序列，得到OTU的代表序列。
(4)将所有优化后的高质量序列与OTU代表序列进行比对，与OTU代表序列相似性在97％以上的序列为同一OTU，统计生成OTU丰度表。
6、OUT序列比对及分类学注释
利用RDP classifier(http：//rdp.cme.msu.edu/)对每条OTU序列进行物种分类注释，比对NT数据库(https://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/)。
结果：COI引物在样品中共注释到到生物25种，其中浮游生物1种，原生动物1种，菌类2种，陆生昆虫4种，大型底栖动物17种(隶属于12属9科7目；表4)，在各个样品中底栖动物均为主要生物类群(平均检测率66％，平均检测率为各沉积物样品中大型底栖动物的物种数占总物种数的占比平均值)。
注释到的大型底栖动物均为潮白河流域历史记录种(属)，证明本发明的方法正确，能够准确注释待测水域底栖动物。
表4引物COI扩增产物大型底栖动物注释结果名录
| 种 | 属 | 科 | 目 |
| Limnodrilus hoffmeisteri | 水丝蚓属 | 仙女虫科 | 单向蚓目 |
| Limnodrilus claparedianus | 水丝蚓属 | 仙女虫科 | 单向蚓目 |
| Bothrioneurum vejdovskyanum | 盘丝蚓属 | 仙女虫科 | 单向蚓目 |
| Limnodrilus sp. | 水丝蚓属 | 仙女虫科 | 单向蚓目 |
| Glyptotendipes barbipes | 雕翅摇蚊属 | 摇蚊科 | 双翅目 |
| Kiefferulus tainanus | 球附器摇蚊属 | 摇蚊科 | 双翅目 |
| Glyptotendipes tokunagai | 雕翅摇蚊属 | 摇蚊科 | 双翅目 |
| Glyptotendipes barbipes | 雕翅摇蚊属 | 摇蚊科 | 双翅目 |
| Chironomus yoshimatsui | 摇蚊属 | 摇蚊科 | 双翅目 |
| Chironomus kiiensis | 摇蚊属 | 摇蚊科 | 双翅目 |
| Ephemera orientalis | 蜉蝣属 | 蜉蝣科 | 蜉蝣目 |
| Isonychia japonica | 等蜉属 | 等蜉科 | 蜉蝣目 |
| Geotrupes ibericus | 金龟属 | 粪金龟科 | 鞘翅目 |
| Penaeus latisulcatus | 对虾属 | 对虾科 | 十足目 |
| Paracercion melanotum | 尾蟌属 | 蟌科 | 蜻蜓目 |
| Hippeutis umbilicalis | 圆扁螺属 | 扁蜷螺科 | 基眼目 |
| Radix plicatula | 萝卜螺属 | 椎实螺 | 基眼目 |
三、技术效果评估
为评估步骤一方法(环境DNA方法)在大型底栖动物群落结构调查中的可靠性及有效性，结合传统调查方法，基于物种组成、物种种类丰富度以及物种相对丰度等指标，比较了两种方法评估结果。
1、样品采集
于2019年6月在潮白河流域采集大型底栖动物环境样品，共布设样点12个，上中下游各4个采样点(图5，M1-M4；U1-U4；A1-A4)。
eDNA方法：样品采集同步骤二中的1样品采集。
传统方法：传统方法通过彼得森采泥器(武汉彼德森科技有限公司，PBS-411)(1/16m2)采集样品。具体而言，传统方法采集的底栖动物样品通过挑选，使用75％酒精对标本进行固定，之后存放于50ml标本瓶中。根据现场采集的底栖动物种类，将身体较硬的甲壳类和软体动物(如虾和螺类)与环节动物(如寡毛类)和水生昆虫分开，分别盛入标本瓶中保存。软体动物于解剖镜下进行形态学鉴定；水生昆虫除摇蚊类及其他少数科属外，皆在解剖镜下鉴定到种或属。摇蚊科幼虫的鉴定较为复杂，需加甘油制片镜检观察。寡毛类的仙女虫科可根据刚毛的形态差异进行种类鉴别，有些种类的鉴定需要有成熟的个体方能完成，虫体需制作成生物封片，然后对其内部结构特别是生殖系统的结构进行观察以判别物种。标本鉴定后，测量和记录各物种的数量，计算各物种丰度。
2、eDNA提取及传统样品数据分析
eDNA方法：样品采用步骤二中2的eDNA提取方法。eDNA方法获得的物种丰度均为相对丰度，即某物种的序列数占该样品所有大型底栖动物序列数的比例(％)。
传统方法：根据各样方中存在的物种，统计该水域大型底栖动物物种数。基于各样点各物种数量，计算物种的相对丰度。各物种或功能类群的相对丰度，为该物种或该功能类群的个体数占大型底栖动物总个体数的比例(％)。
3、PCR扩增,产物回收纯化，建库
将eDNA方法的eDNA样品用COI引物对扩增，扩增产物回收纯化建库，方法与步骤二中的3相同。
4、测序：方法与步骤的二的4相同。
5、OUT聚类：方法与步骤二的5相同。
6、OUT序列比对及注释：方法与步骤二的6相同。
物种组成比较：
eDNA方法测序数据注释后共鉴定大型底栖动物181种，隶属于112属75科27目，鉴定到种水平的比例为72％。
传统方法共鉴定27种大型底栖动物，隶属于24属16科8目，鉴定到种水平的比例为52％。两种方法累计共发现200种(属)大型底栖动物，隶属于128属84科29目。在科水平上，eDNA法鉴定出传统方法中总科数的75％；在目水平上，DNA法鉴定出传统方法中总目数87.5％。
相比较而言，eDNA方法检测出了显著更多的大型底栖动物物种数(曼-惠特尼U检W＝61.5,p＜0.01，图6)。从物种组成来看(图7)，eDNA方法和传统方法中节肢动物种类占比均高于60％，比较发现，eDNA方法鉴定出了显著更多的易逃逸、小型以及部分生活史在水中的大型底栖动物(曼-惠特尼U检验:W＝78.0,p＜0.01)，因此，eDNA方法有效提高了大型底栖动物的鉴定水平及物种检测率。
eDNA方法的某物种丰度(相对丰度)为该种大型底栖动物的序列数占总序列数的百分比；
传统方法的某物种丰度(相对丰度)为该物种个体数占大型大型底栖动物总个体数的百分比。
相对丰度比较结果如图8，图9所示，物种丰度是理解和评估生物群落结构的另一个关键指标；
eDNA方法调查结果中水丝蚓属一种(Limmodrilus sp.)相对丰度最高，占总物种丰度的16.33％；在丰度前4的物种中，水丝蚓属物种占3种，包括水丝蚓属一种(Limmodrilus sp.),霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)以及克拉泊水丝蚓(Limnodrilus claparedianus)，为主要的优势物种(占30.29％)(图8)。在门水平上，环节动物门和节肢动物门是主要的优势类群，各占总丰度的46.69％和45.22％(图9)。
传统调查方法结果显示，铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)为相对丰度最高的物种，占总物种丰度的41.38％(图8)；在门水平上，软体动物门和节肢动物门是主要的优势类群，各占总丰度的63.79％和35.56％(图9)
相比较而言，eDNA方法鉴定了明显高的环节动物门(占eDNA结果46.69％；占传统调查结果的0.65％)，而传统调查中软体动物丰度(63.79％)显著高于eDNA调查结果(2.72％)(图9)。该结果表明eDNA宏条形码方法可补充传统调查方法中易忽视、难发现的个体小的底栖动物丰富度数据，以及弥补了传统方法高估软体动物丰度的不足。
因此，相比较传统调查方法而言，eDNA宏条形码方法很好地提高了大型底栖动物的鉴定水平和检出率，同时提高了大型底栖动物丰度评估准确度，有效克服了传统调查方法中分析大型底栖动物群落结构的困难，是可靠并有前景的底栖动物群落结构调查方法。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院生态环境研究中心
<120> 用于大型底栖动物群落结构研究的环境DNA宏条形码方法
<130> GNCSQ202575
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
ggwacwggwt gaacwgtwta yccycc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
tanacytcng grtgnccraa raayca 26
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
gchcchgaya trgchttycc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
tcdggrtgnc craaraayca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
ccngayatrg cnttyccncg 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
taaacytcwg grtgwccraa raayca 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
ccagcascyg cggtaattcc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
actttcgttc ttgatyra 18
Claims (10)
1.引物对在检测待测水域大型底栖动物群落结构中的应用；所述引物对的名称为COI，是由下述引物1和引物2组成的引物对；
所述引物1为下述a1)或a2)：
a1)、核苷酸序列为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)、将序列表中序列1所示的序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a1)衍生的单链DNA分子；
所述引物2为下述b1)或b2)：
b1)、核苷酸序列为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)、将序列表中序列2所示的序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由b1)衍生的单链DNA分子。
2.权利要求1中所述的COI在制备检测待测水域大型底栖动物群落结构产品中的应用。
3.一种检测待测水域大型底栖动物群落结构的环境DNA的方法，包括如下步骤：
A1)采集待测水域的表层沉积物样本；
A2)提取所述表层沉积物样本中的环境DNA；
A3)使用权利要求1中所述的COI对所述环境DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
A4)对所述PCR产物进行序列分析得到待测水域大型底栖动物群落结构结果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述待测水域的表层沉积物样本为待测水域沉积物表层0-1cm的沉积物样本。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述序列分析包括测序、测序数据聚类和注释。
6.根据权利要求3-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：A3)步骤中所述PCR扩增的退火温度为46℃。
7.权利要求3-6中任一权利要求所述的方法的下述任一种应用：
P1)权利要求3-6中任一权利要求所述的方法在检测待测水域大型底栖动物群落结构中的应用；
P2)权利要求3-6中任一权利要求所述的方法在制备检测待测水域大型底栖动物群落结构的产品中的应用；
P3)权利要求3-6中任一权利要求所述的方法在对待测水域水生生态系统进行健康监测和/或评价中的应用；
P4)权利要求3-6中任一权利要求所述的方法在制备待测水域水生生态系统进行健康监测和/或评价产品中的应用。
8.检测待测水域大型底栖动物群落结构的产品，其特征在于：所述产品包括试剂和/或试剂盒；所述试剂和/或试剂盒含有权利要求1中所述的COI。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述产品还包括系统；所述系统含有仪器或设备。
10.权利要求8或9所述的产品的下述任一应用：
D1)权利要求8或9所述的产品在检测待测水域大型底栖动物群落结构中的应用；
D2)权利要求8或9所述的产品在对待测水域水生生态系统进行健康监测和/或评价中的应用。
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