CN115948500A - 用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法，涉及分子生态学技术领域。所述的通用引物是基于公共库和本土自建数据库中所有鱼类完整线粒体12Sr RNA基因序列设计、筛选与测试的结果。正向引物和反向引物的5’端分别添加不同的功能核苷酸序列得到建库引物，用于一步法PCR扩增建库和Ion Torrent二代测序仪测序。本发明不仅从设计上采用了大规模的鱼类完整线粒体12S基因数据，而且从信息分析层面，模拟了PCR扩增情况，并对引物的覆盖度、区分度进行了比较筛选，基于此结果再进行试验测试，最终筛选了一组通用性好、覆盖度广、区分度高的引物，能满足不同水域环境中鱼类多样性的监测要求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生态学技术领域，尤其涉及一种用于鱼类环境DNA 监测的12SrRNA通用引物及其应用方法。
背景技术
保护水生态系统生物多样性，是改善和提升水生态环境健康的重要举措。摸清水域生态系统生物多样性本底是开展保护工作的前提和基础。鱼类是水域生态系统食物链的重要环节，对鱼类群落多样性监测与研究，不仅能通过可能产生的环境影响响应机制反映水域生态系统的健康水平，而且对正确的开发、调控和管理渔业资源、固碳、对抗气候变化、应对全球粮食安全方面有着重要的意义。
目前针对鱼类生物多样性现场监测采用的是网、笼、电等捕捞后进行形态学鉴定的方法，该方法费时，费力，精度低，未知物种无法鉴定，且重复性差。而环境DNA（evironmental DNA, eDNA）技术具有采样环节相对方便、简单，对生态无损伤，无需捕获生物活体，无需依赖分类鉴定人员经验，操作通量高、重复性好、结果准确等优点，为水域生态系统鱼类多样性监测提供了强有力的技术支持。
目前基于eDNA技术的鱼类生物多样性监测，常采用的引物有线粒体Cytb基因、线粒体16S rRNA、线粒体COI基因和12S rRNA等。CN109825563A公开了一种基于环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，该方法中公开的CytbF/R和16SF/R引物对，检测精度好但物种的检测范围受到限制，部分物种无法监测到；CN104531879A公开了一种用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，该方法提及的鱼类COI通用引物对某些物种无法进行扩增，而且产物平均长度为608bp，不适合Ion Torrent二代测序仪的读长，这也直接限制了基于IonTorrent二代测序仪平台的COI通用引物在鱼类多样性中的应用；CN113355403A公开了一种利用环境DNA技术检测鱼类物种多样性的方法，该申请公开的12S rRNA，其扩增循环数为55，过高的循环数增加了非特异性扩增风险，不利于文库的筛选，也会导致后期假阳性的增加；CN109943645A公开了一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法，该方法共设计出10种引物对，可以满足不同测序平台的需求，而且能高效扩增多种淡水鱼，满足一定的淡水鱼监测需求，然而本申请人通过信息手段模拟PCR分析发现，Fish-F2、Fish-F4对应的引物组合覆盖度和区分度均较低，Fish-F3和Fish-F6对应的引物组合其区分度可达100%，但物种覆盖度却较低，Fish-F1对应的引物组合覆盖度和区分度尚需改进；而且在部分水域，其通用引物按照所公开的PCR扩增条件，核酸PCR扩增无条带，故其公开的引物组合并不能满足所有水域监测需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足, 本发明的目的是提供一种用于鱼类环境DNA 监测的12Sr RNA通用引物及其应用方法，针对不同水域系统，采用设计的鱼类12Sr RNA通用引物，具有通用性好，覆盖度广、区分度高的优点，能实现不同水环境DNA中鱼类多样性的精准监测。
一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物设计方法，
a. 采用了公共数据库中的鱼类数据库中的所有的鱼类完整线粒体12Sr RNA序列，所述的公共数据库包括NCBI、MitoFish，和浙江省本土自建鱼类数据库；
b. 通过ClustalW软件进行多序列比对分析，对保守区域采用Primer Premier 5设计软件设计出多组引物对；
c. 从信息分析层面，对上述多对引物对进行鱼类PCR扩增模拟，比较筛选出多组待测试的引物对，所述的比较筛选的考虑因素包括覆盖度、区分度、扩增片段长度；
d. 对上述比较筛选出多组待测试的引物对进行实验测试，最终筛选出优选的一组或者多组引物对。
一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物，采用所述的12Sr RNA通用引物设计方法设计，最终筛选出所述引物序列为：正向引物TK_12S-F：TCGTGCCAGCHRCCGCGGT，如SEQ ID NO 1所示；反向引物TK_12S-R：ARTRGGGTMTCTAATCCYAG，如SEQ ID NO 2所示。
所述的正向引物和反向引物的5’端分别添加不同的功能核苷酸序列得到建库引物，用于一步法PCR扩增建库和Ion Torrent二代测序仪测序；所述的建库引物的正向引物的各部分组成如下：用于识别Ion Torrent二代测序仪的正向固定核苷酸序列，如SEQ IDNO 3所示；核苷酸序列标签；接头核苷酸序列，GGTGAT；TK_12S-F，如SEQ ID NO 1所示；所述的建库引物的反向引物由用于识别Ion Torrent二代测序仪的反向固定核苷酸序列，如SEQID NO 4所示，TK_12S-R，如 SEQ ID NO 2所示组成；不同样本的建库引物采用不同的所述的建库引物的正向引物，采用相同的所述的建库引物的反向引物。
所述的建库引物的正向引物包括正向建库引物1至23，分别如SEQ ID NO 5至SEQID NO 27所示，所述的建库引物的反向引物如SEQ ID NO 28所示。
一种根据所述的通用引物用于鱼类环境DNA监测的应用方法，包括以下步骤：
步骤一，水样采集、富集和环境DNA的提取；
步骤二，PCR扩增反应体系中模板为环境DNA，引物为所述的建库引物中的一组正、反向引物对；PCR扩增条件采用两步梯度法，为95℃预变性5 min；5个循环包括95℃变性30s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30s；72℃终延伸5 min；
步骤三，PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，对PCR产物目的条带进行割胶回收纯化，并Qubit检测文库浓度；
步骤四，将筛选的文库混合后，在Ion Torrent二代测序仪上进行高通量测序；
步骤五，对测序数据去除潜在的污染序列、接头和barcode序列后，使用QIIME对数据进行N较多或者低质量序列过滤，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据，采用DADA2算法对有效数据进行聚类，获得ASV，对比公共数据库和本土数据库进行物种鉴定与注释，得到鱼类物种组成结构信息。
所述的PCR扩增产物长度为194～221 bp。
所述的用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA扩增引物的应用方法，所述步骤三中，文库的PCR扩增产物长度为282～309 bp。
本发明的有益效果：
本发明基于对鱼类公共数据库结合本实验室鱼类本土自建鱼类数据库中大量的鱼类完整线粒体12S序列，进行引物设计，并模拟PCR扩增情况，从覆盖度、区分度、扩增片段长度等方面进行初步筛选后再通过大量实验测试与扩增条件优化，筛选出通用性好、覆盖度和区分度高的一组用于监测不同水域的鱼类多样性的引物；该发明在实际应用中，文库的构建采用的是一步PCR扩增法，该法相比常用的二步法，省去了文库的筛选环节，减少了目标扩增产物的损失，而且PCR扩增条件采用的是两步梯度法，第一梯度高温退火保证引物的特异性，减少非特异性扩增，第二梯度正常退火温度，保证引物的有效性。一步PCR扩增引物，两步梯度扩增的选择更有利于监测水域中低丰度鱼类和稀有物种。
附图说明
图1a是实施例1中不同水样的不同PCR扩增条件琼脂糖凝胶电泳图。
图1b是实施例1中另一个不同水样的不同PCR扩增条件琼脂糖凝胶电泳图。
图2是实施例1中不同鱼组织、养鱼水、水环境样本作为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图中，各泳道分别如下：1、100 bp Marker；2、兴凯刺鰟鮍；3、 大鳍鱊；4、金鲫；5、蒙古红鲌；6、翘嘴鲌；7、鲤鱼；8、 花䱻；9、䱗条；10、鲢鱼；11、鳙鱼；12、间下鱵；13、似鳊；14、华鳈；15、黄颡鱼；16、似鱎；17、黄尾密鲴；18、养鱼水；19～23、水样1～5；24、阴性对照。
图3是实施例2中养鱼水、水环境样本作为模板的建库PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图中，各泳道分别如下：1、100 bp Marker；2～22、21个水环境样本；23、养鱼水；24、 阴性对照。
图4是养鱼水的环境DNA监测鱼类结构组成图。
图5是不同水域水样的环境DNA监测鱼类占比情况。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1
一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物的设计方法，包括以下几个步骤：
步骤一：申请人收集整理了NCBI、MitoFish等公共数据库和浙江省本土自建鱼类数据库中所有的鱼类完整线粒体12S基因序列，其中浙江省本土自建鱼类数据库的12S基因序列是通过实地采集鱼类样本，对鱼类线粒体进行高通量测序后提取的12S基因序列和文献查阅收集的线粒体12S基因序列，包括20个科，53个属和74个种；结合公共数据库中完整的12S基因序列，去冗余后，可参考的所有物种数目为2369种。
步骤二：通过ClustalW软件进行多序列比对分析，对保守区域采用PrimerPremier 5设计软件设计出多组引物对，引物编号为1至15；对引物编号1至15引物对进行鱼类PCR扩增模拟，从覆盖度、区分度、扩增片段长度等方面进行比较筛选，如表1所示，同时对比了CN109943645 A引物情况，引物编号16至25。
表1 基因线粒体完整的12Sr RNA设计的引物及相关信息
对引物编号为13~15的3组引物进行实验测试，其中引物编号13覆盖度及区分度明显不及引物编号15。通过大量的实验和PCR扩增条件优化，确定PCR扩增反应体系50μL为：2X phanta Max Master Mix 25μL，10μM的正反向引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，Nuclease-free Water 21μL；PCR扩增条件采用两步梯度法，最优扩增条件为95℃预变性5 min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min，如图1a、图1b所示。
图1a各泳道分别如下：1、100 bp Marker；2、阴性对照，扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s 30个循环；72℃终延伸5 min；3、阴性对照，扩增条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s 35个循环；72℃终延伸5 min；4、养鱼水，扩增条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s 35个循环；72℃终延伸5 min；5、养鱼水，扩增条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s 30个循环；72℃终延伸5 min；6、养鱼水，扩增条件为95℃预变性5 min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min。
图1b各泳道分别如下：1、100 bp Marker；2、阴性对照，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；3、养鱼水，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；4、水样1，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；5、水样2，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；6、阴性对照，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；7、养鱼水，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；8、水样1，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；9、水样2，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；10、阴性对照，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；11、养鱼水，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；12、水样1，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；13、水样2，扩增条件为95℃预变性5min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min。
图1a表明，PCR扩增条件中，30个循环数不及35个循环数的目的条带亮，且同样35个循环数，一步梯度法样本扩增条带明显不及两步梯度法的目的条带，确定PCR扩增的循环数为35个循环；图1b对扩增二步梯度法的引物退火温度进行了优化，筛选出了第一梯度退火温度采用65℃，可以保证引物特异性，5个循环数有利于减少非特异性扩增，第二梯度最优退火温度为60℃，能够扩增出明显的目的条带。另一方面，部分引物如引物编号14，模拟水样中的大鳍鱊未扩增出，这可能是该引物扩增产物长度更长，导致模拟水样中大鳍鱊的鱼类核酸因降解而不能有效扩增而出现鉴定结果假阴性情况。最终筛选出最佳的一组引物对引物编号15，即SEQ ID NO 1：TCGTGCCAGCHRCCGCGGT和SEQ ID NO 2：ARTRGGGTMTCTAATCCYAG （表2），它们分别位于12S基因的234～252 bp和编码区427～446bp，该组引物对浙江省杭州市内水域常见的不同16个鱼组织样本、养鱼水（即采集鱼缸中的水作为模拟水样，鱼缸中鱼类见表3）1个和浙江省代表水域的5个水样环境DNA样本的扩增效果，如图2所示。结果表明，该组引物不仅能扩增出杭州市常见的鱼类，而且对杭州不同水域的水样样本也能扩增出明显目的条带，说明该组引物对鱼类和不同水域中的鱼类环境DNA有很好的扩增能力，覆盖范围广。
表2 12Sr RNA通用引物信息
表3 鱼缸中的鱼类信息
实施例2
通用引物在水域环境DNA鱼类多样性监测中的应用：
（1）按照上述筛选出的12Sr RNA通用引物，基于Ion Torrent二代测序平台，用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA基因建库引物是在所述的正向引物和反向引物的5’端添加不同的核苷酸序列。其中正向引物主要由用于识别Ion Torrent二代测序仪的正向固定核苷酸序列、不同的核苷酸序列标签、固定的接头核苷酸序列和TK_12S-F引物序列SEQ ID NO 1组成，反向引物由用于识别Ion Torrent二代测序仪的反向固定核苷酸序列和TK_12S-R引物序列SEQ ID NO 2组成，相关信息见表4所示。建库正向引物根据正向barcode标签的不同命名依次命名为SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6……SEQ ID NO 27，反向建库引物命名为SEQID NO 28，不同样本的建库引物采用不同的正向建库引物，反向建库引物均为一样，建库引物信息如表5所示。
表4 Ion Torrent二代测序平台的序列固定信息
| 名称 | 序列编号 | 核苷酸序列 |
| 用于识别Ion Torrent二代测序仪的正向固定核苷酸序列 | SEQ ID NO 3 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG |
| 正向固定的接头 | 0 | GGTGAT |
| 正向barcode标签 | 1 | TCTGGATGAC |
| 正向barcode标签 | 2 | TCTATTCGTC |
| 正向barcode标签 | 3 | AGGCAATTGC |
| 正向barcode标签 | 4 | TTAGTCGGAC |
| 正向barcode标签 | 5 | CAGATCCATC |
| 正向barcode标签 | 6 | TCGCAATTAC |
| 正向barcode标签 | 7 | TTCGAGACGC |
| 正向barcode标签 | 8 | TGCCACGAAC |
| 正向barcode标签 | 9 | AACCTCATTC |
| 正向barcode标签 | 10 | CCTGAGATAC |
| 正向barcode标签 | 11 | TTACAACCTC |
| 正向barcode标签 | 12 | AACCATCCGC |
| 正向barcode标签 | 13 | ATCCGGAATC |
| 正向barcode标签 | 14 | CGAGGTTATC |
| 正向barcode标签 | 15 | TCCAAGCTGC |
| 正向barcode标签 | 16 | CGGAAGAACCTC |
| 正向barcode标签 | 17 | CGAAGCGATTC |
| 正向barcode标签 | 18 | CAGCCAATTCTC |
| 正向barcode标签 | 19 | TCGAAGGCAGGC |
| 正向barcode标签 | 20 | CCTGCCATTCGC |
| 正向barcode标签 | 21 | CTAGGACATTC |
| 正向barcode标签 | 22 | CTTCCATAAC |
| 正向barcode标签 | 23 | CCAGCCTCAAC |
| 用于识别Ion Torrent二代测序仪的反向固定核苷酸序列 | SEQ ID NO 4 | CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT |
表5 基于Ion Torrent二代测序平台的12Sr RNA通用建库引物信息
| 引物名称 | 序列编号 | 核苷酸序列 |
| 正向建库引物1 | SEQ ID NO 5 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物2 | SEQ ID NO 6 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物3 | SEQ ID NO 7 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物4 | SEQ ID NO 8 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物5 | SEQ ID NO 9 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物6 | SEQ ID NO 10 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTAC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物7 | SEQ ID NO 11 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物8 | SEQ ID NO 12 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAAC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物9 | SEQ ID NO 13 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物10 | SEQ ID NO 14 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATAC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物11 | SEQ ID NO 15 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物12 | SEQ ID NO 16 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCATCCGC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物13 | SEQ ID NO 17 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCCGGAATC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物14 | SEQ ID NO 18 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGGTTATC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物15 | SEQ ID NO 19 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCAAGCTGC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物16 | SEQ ID NO 20 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGGAAGAACCTC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物17 | SEQ ID NO 21 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAAGCGATTCGGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物18 | SEQ ID NO 22 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGCCAATTCTC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物19 | SEQ ID NO 23 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGAAGGCAGGC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物20 | SEQ ID NO 24 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGCCATTCGCGGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物21 | SEQ ID NO 25 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAGGACATTC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物22 | SEQ ID NO 26 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTTCCATAAC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 正向建库引物23 | SEQ ID NO 27 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCAGCCTCAAC GGTGAT TCGTGCCAGCHRCCGCGGT |
| 反向建库引物 | SEQ ID NO 28 | CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT ARTRGGGTMTCTAATCCYAG |
（2）监控地的水样采集于浙江省杭州市的不同水域，21个点位，共21个样本，每个样本表层、中层、底层共采集500 mL，采用涡轮泵抽滤，滤膜选用0.22 μm的混合纤维滤膜，样本之间注意消杀，避免交叉污染，设置阴性对照，抽滤结束后，滤膜保存在2 mL的离心管中。采用凯杰水样提取试剂盒提取DNA，不同的样本选用表5中的不同建库引物对（一条正向建库引物和固定的反向建库引物）进行PCR扩增，PCR产物采用2.0%的琼脂糖凝胶电泳（电泳图如图3所示），采用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，对大小为300 bp左右的条带进行割胶回收纯化，并QubitTMdsDNA HS Assay Kits对文库浓度准确定量；将筛选的文库混合后，在Ion Torrent二代测序仪上进行高通量测序；对测序数据去除潜在的污染序列、接头和barcode序列后，使用QIIME对数据进行N较多或者低质量序列过滤，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据，采用DADA2算法对有效数据进行聚类，获得ASV，对比公共数据库和本土数据库进行物种鉴定与注释，得到鱼类物种组成结构等信息。
养鱼水的环境DNA监测鱼类结构组成图如图4所示，结果与鱼缸中的鱼类别比较，模拟水样的环境DNA能检测到鱼缸中的所有物种，表明该通用引物在环境DNA监测中的应用准确率为100%。21个环境水样的环境DNA可监测到的鱼类占比情况如图5所示，采用环境DNA的监测技术可以监测不同水域中的鱼类，而且无需依赖鱼类个体进行鉴别，无需受限于禁渔期的法律规定，达到对水域的随时监测，而且水样采样量仅需500 mL，结合申请人设计的通用引物，为实现简单、快捷、高灵敏、高检出和低成本的鱼类多样性监测提供了可行性方案。
以上所述实施例的各技术特征可以进行进一步的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1. 一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物设计方法，其特征在于，
a. 采用了公共数据库中的鱼类数据库中的所有的鱼类完整线粒体12Sr RNA序列，所述的公共数据库包括NCBI、MitoFish，和浙江省本土自建鱼类数据库；
b. 通过ClustalW软件进行多序列比对分析，对保守区域采用Primer Premier 5设计软件设计出多组引物对；
c. 从信息分析层面，对上述多对引物对进行鱼类PCR扩增模拟，比较筛选出多组待测试的引物对，所述的比较筛选的考虑因素包括覆盖度、区分度、扩增片段长度；
d. 对上述比较筛选出多组待测试的引物对进行实验测试，最终筛选出优选的一组或者多组引物对。
2. 一种用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物，其特征在于，采用根据权利要求1所述的12Sr RNA通用引物设计方法设计，最终筛选出所述引物序列为：正向引物TK_12S-F：TCGTGCCAGCHRCCGCGGT，如SEQ ID NO 1所示；反向引物TK_12S-R：ARTRGGGTMTCTAATCCYAG，如SEQ ID NO 2所示。
3. 根据权利要求2所述的用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物，其特征在于，所述的正向引物和反向引物的5’端分别添加不同的功能核苷酸序列得到建库引物，用于一步法PCR扩增建库和Ion Torrent二代测序仪测序；所述的建库引物的正向引物的各部分组成如下：用于识别Ion Torrent二代测序仪的正向固定核苷酸序列，如SEQ ID NO 3所示；核苷酸序列标签；接头核苷酸序列，GGTGAT；TK_12S-F，如SEQ ID NO 1所示；所述的建库引物的反向引物由用于识别Ion Torrent二代测序仪的反向固定核苷酸序列，如SEQ ID NO 4所示，TK_12S-R，如 SEQ ID NO 2所示组成；不同样本的建库引物采用不同的所述的建库引物的正向引物，采用相同的所述的建库引物的反向引物。
4.根据权利要求3所述的用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA通用引物，其特征在于，所述的建库引物的正向引物包括正向建库引物1至23，分别如SEQ ID NO 5至SEQ ID NO 27所示，所述的建库引物的反向引物如SEQ ID NO 28所示。
5.一种根据权利要求4所述的通用引物用于鱼类环境DNA监测的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，水样采集、富集和环境DNA的提取；
步骤二，PCR扩增反应体系中模板为环境DNA，引物为所述的建库引物中的一组正、反向引物对；PCR扩增条件采用两步梯度法，为95℃预变性5 min；5个循环包括95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s；30个循环包括95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸5 min；
步骤三，PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，对PCR产物目的条带进行割胶回收纯化，并Qubit检测文库浓度；
步骤四，将筛选的文库混合后，在Ion Torrent二代测序仪上进行高通量测序；
步骤五，对测序数据去除潜在的污染序列、接头和barcode序列后，使用QIIME对数据进行N较多或者低质量序列过滤，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据，采用DADA2算法对有效数据进行聚类，获得ASV，对比公共数据库和本土数据库进行物种鉴定与注释，得到鱼类物种组成结构信息。
6. 根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述的PCR扩增产物长度为194～221bp。
7. 根据权利要求5所述的用于鱼类环境DNA监测的12Sr RNA扩增引物的应用方法，其特征在于，所述步骤三中，文库的PCR扩增产物长度为282～309 bp。
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