CN111549146B - 一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，公开了一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物及其应用方法。所述的扩增引物包括至少一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，将Am312‑F1与Am312‑R1组合，Am246‑F2与Am246‑R2组合，Am250‑F3与Am250‑R3.1组合，Am250‑F3与Am305‑R3.2组合，Am250‑F3与Am387‑R3.3组合进行PCR扩增的产物，满足二代测序要求，可用来进行两栖动物物种鉴定和多样性分析；还可通过以上几对引物的灵活组合，以达到两栖动物物种分类、系统进化关系、系统地理学等研究目的。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体的涉及一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物及其应用方法。
背景技术
两栖纲是一类原始的、初登陆的、具五趾型的变温四足动物，皮肤裸露，分泌腺众多，混合型血液循环。其个体发育周期有一个变态过程，即以鳃(新生器官)呼吸生活于水中的幼体，在短期内完成变态，成为以肺呼吸能营陆地生活的成体。现生的有3目约40科400属4000种。除南极洲和海洋性岛屿外，遍布全球。据中国两栖类http://www.amphibiachina.org/记载，中国现有13科61属520余种，主要分布于秦岭以南、华西和西南山区等地带。
两栖动物既有从鱼类继承下来适于水生的性状，如卵和幼体的形态及产卵方式等；又有新生的适应于陆栖的性状，如感觉器、运动装置及呼吸循环系统等。变态既是一种新生适应，又反映了由水到陆主要器官系统的改变过程。
采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技术。快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。近年来，我国两栖动物种类与数量急剧下降，群落密度持续降低，导致游离在环境中的DNA浓度很低。
经检索，中国专利申请号为201810472889.1，公开日期为2018.08.28的申请案公开了一种用于鉴定合征姬蛙物种特异性的PCR引物，该申请案的方法通过从合征姬蛙肌肉组织中提取其DNA，在对提取后的DNA进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用该申请的PCR引物对，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测结果中是否出现条带来鉴定其是否为合征姬蛙。这种鉴定方式，相较于传统DNA测序及序列比对既简单又准确，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为合征姬蛙，缩短了检测时间，提高了检测效率。
然而，该申请案的引物是一种特异性引物，仅能准确鉴定合征姬蛙物种，无法适用于两栖类多个物种的检测鉴定，而关于两栖动物群落监测的通用引物研究甚少，极大地限制了宏条形码对两栖动物群落多样性的研究与保护工作。
基于现有技术的缺陷，亟需发明一种新的针对两栖动物群落监测的方法。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有引物难以同时满足特异性和通用性均较强的特点，且扩增的产物难以在高通量测序平台上进行测序的问题，极大地限制了宏条形码对两栖动物群落多样性的研究与保护的问题，本发明提供了一种两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物，可以同时具备高特异性和通用性的优势，可扩增出长度为240bp至400bp不等的PCR产物，满足不同的高通量测序平台的要求，适用于两栖类多个物种的检测鉴定。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物，包括至少一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，
所述的上游引物序列为Am312-F1：TAGAGGAGCCTGTNCTATAATCGAT；
Am246-F2：CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；
Am250-F3：ACGAGAAGACCCNATGGAGCTT；
所述的下游引物序列为Am312-R1：GAAGAGGGNGACGGGCGGTGTGT；
Am246-R2：AAGCTCCATNGGGTCTTCTCGT；
Am250-R3.1：CGCTGTTATCCCNAGGGTAACTTG；
Am305-R3.2：ATCCAACATCGAGGTCGTAAACC；
Am387-R3.3：CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG；
作为本发明更进一步的改进，所述上游引物和下游引物优选的引物对组合为：(1)Am312-F1与Am312-R1组合，(2)Am246-F2与Am246-R2组合，(3)Am250-F3与Am250-R3.1组合，(4)Am250-F3与Am250-R3.2组合，(5)Am250-F3与Am250-R3.3组合，其中组合(1)所在线粒体区域为12S，组合(2)、(3)、(4)、(5)所在线粒体区域为16S。
作为本发明更进一步的改进，上述两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物的应用方法，其步骤为：
(1)DNA样本的提取；
(2)目的片段的扩增：对步骤(1)中的DNA样本进行PCR扩增，其中，PCR扩增引物采用至少一条所述上游引物和至少一条所述下游引物组合成的引物对；
(3)针对步骤(2)中扩增产物的片段大小分析，或对步骤(2)中的扩增产物进行高通量测序。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(2)中，所述上游引物与下游引物组合的摩尔比为1：(1～3)。
作为本发明更进一步的改进，上游引物与下游引物组合中两者的摩尔比为1:1。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(2)中，所有组合引物对进行PCR反应的退火温度均为55℃左右。
作为本发明更进一步的改进，上述两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物在环境源DNA(包括水样DNA、土壤DNA)和生物源DNA(指由生物组织提取出的DNA，例如皮肤、肌肉、内脏等)的PCR扩增中的应用。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(2)中待扩增的DNA样本浓度为0.1ng/μL以上。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤(2)中，扩增反应体系的体积为30μL，反应体系中包含以下物质：2μL的10μM的上述引物，所述的上游引物和下游引物体积各1μL；12μL的去离子水；15μL的Taq Master Mix；1μL的DNA样本。
本发明提供一种两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物，线粒体12S～16S是脊椎动物线粒体基因组中相对比较保守的基因，是潜在的进行物种鉴定的通用条形码区域之一。上述两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物在两栖动物物种鉴定、两栖动物多样性、系统发育关系、系统地理学或遗传多样性分析中的应用。
作为本发明更进一步的改进，上述两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物在两栖动物濒危物种及入侵物种监测中的应用。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过比对我国常见的120种两栖动物全线粒体基因序列，在保守区域12S～16S上设计并合成多对扩增引物，设计出的扩增引物通用性强，且上下游引物之间包含足够多的信息位点，保证物种分辨率，提高宏条形码多样性研究，同时提高引物对两栖动物群落的扩增能力与低丰度物种的检测能力。
(2)本发明的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物，引物长度适合高通量测序，传统的引物扩增的片段过长(大于500bp)，不适合二代测序平台，而本发明中设计得到的引物扩增长度在240bp至400bp之间，长度合适，可以满足环境样本的高通量测序分析。
(3)本发明的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物，将Am312-F1与Am312-R1组合，Am246-F2与Am246-R2组合，Am250-F3与Am250-R3.1组合，Am250-F3与Am305-R3.2组合，Am250-F3与Am387-R3.3组合进行PCR扩增的产物，满足二代测序要求，可用来进行两栖动物物种鉴定和多样性分析；还可通过以上几对引物的灵活组合，以达到两栖动物物种分类、系统进化关系、系统地理学等研究目的。
(4)本发明中的两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物，简并度低，对两栖动物群落具有较强的扩增偏好性，灵敏度高。实施例2和实施例3的结果表明，大部分设计引物的物种覆盖率均超过现有文献中扩增两栖动物的Ac16s、扩增鱼类的Metafish引物，适用于环境样品中低丰度DNA的扩增。该引物可以覆盖两栖动物有尾目与无尾目，且具有扩增效率高、条带单一、分辨率高等优势，能够满足我国两栖动物的物种鉴定与多样性分析等研究需求。
附图说明
图1为实施例1中线粒体12S～16S引物与文献中Ac16s、Metafish引物设计相对位置；
图2为实施例2中线粒体12S～16S引物与文献中Ac16s、Metafish引物对30种常见两栖动物混合DNA的PCR扩增电泳图；
图3为实施例3中线粒体12S～16S引物与文献中Ac16s、Metafish引物在不同水平上的物种覆盖率比较；
图4为实施例3中线粒体12S～16S引物与文献中Ac16s、Metafish引物的物种检出信息。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1
本实施例提供了本发明提供了一种两栖动物线粒体12S～16S通用宏条形码扩增引物，包括至少一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，
所述的上游引物序列为Am312-F1：TAGAGGAGCCTGTNCTATAATCGAT；
Am246-F2：CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；
Am250-F3：ACGAGAAGACCCNATGGAGCTT；
所述的下游引物序列为Am312-R1：GAAGAGGGNGACGGGCGGTGTGT；
Am246-R2：AAGCTCCATNGGGTCTTCTCGT；
Am250-R3.1：CGCTGTTATCCCNAGGGTAACTTG；
Am305-R3.2：ATCCAACATCGAGGTCGTAAACC；
Am387-R3.3：CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG；
本发明的两栖动物线粒体12S～16S基因宏条形码通用引物对组合列表如表1所示。所述上游引物和下游引物优选的引物对组合为：(1)Am312-F1与Am312-R1组合，(2)Am246-F2与Am246-R2组合，(3)Am250-F3与Am250-R3.1组合，(4)Am250-F3与Am250-R3.2组合，(5)Am250-F3与Am250-R3.3组合，其中组合(1)所在线粒体区域为12S，组合(2)、(3)、(4)、(5)所在线粒体区域为16S。
表1两栖动物线粒体12S～16S基因宏条形码通用引物对组合列表
实施例2
本实施例的两栖动物样本来自生态环境部南京环境科学研究所，共收集到30种两栖动物的脚趾样本，隶属于2目10科25属30种，覆盖范围广，有较强的物种代表性，用于验证扩增引物的30种两栖动物信息如表2所示。
表2用于验证扩增引物的30种两栖动物信息
分别提取每个两栖动物样本的DNA，使用QubitTMdsDNA HS Assay Kits进行DNA浓度的测定，根据测定结果将每个物种的DNA稀释到同一浓度10ng/μL，每个物种取相同体积的DNA溶液混合在一起，形成含有30个两栖动物组织DNA的混合溶液。
用实施例1中表1所述的5种引物组合(分别为Am312、Am246、Am250、Am305、Am387)对DNA混合溶液进行PCR扩增，对比实验采用技术中所采用的引物Ac16s和Metafish进行对比。
其中Ac16s的序列来自于：Evans,N.T.,Olds,B.P.,Renshaw,M.A.,Turner,C.R.,Li,Y.,Jerde,C.L.,...Lodge,D.M.(2016).Quantification of mesocosm fish andamphibian species diversity via environmental DNA metabarcoding.Mol EcolResour,16(1),29-41.doi:10.1111/1755-0998.12433的文献记载。Ac16s的序列为(上游引物：CCTTTTGCATCATGATTTAGC，下游引物：CAGGTGGCTGCTTTTAGGC)；
Metafish的序列来自中国专利申请号为201910341512.7，发明名称为“一种淡水鱼类线粒体12S通用宏条形码扩增引物及其应用方法”的发明专利文献的记载。Metafish的序列为(上游引物：TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA，下游引物：ATAGTGGGGTATCTAATCCCAG)。
上游引物与下游引物组合的摩尔比控制在1：(1～3)范围内即可，本实施例取优选方案，即上游引物与下游引物组合的摩尔比为1：1，设计引物对的退火温度都设置为55℃，文献中的引物按照其相应退火温度要求进行扩增。
采用Vazyme公司的Taq酶进行PCR扩增，扩增反应体系的体积为30μL，反应体系中包含以下物质：2μL的10μM的上述引物(上下游各1μL)；12μL的去离子水；15μL的Taq MasterMix；1μL的DNA template(待扩增的物种样本或环境样本DNA)。得到的PCR产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶检测。
实施例2中线粒体12S～16S引物与文献中Ac16s、Metafish引物对30种常见两栖动物混合DNA的PCR扩增电泳图如图2所示，上述结果表明：按照本发明的引物组合方式和文献的Ac16s、Metafish引物进行PCR扩增，所有引物都能够成功扩增，而且PCR扩增的条带单一、明亮，没有明显拖尾和弥散，扩增出的长度满足最初设计，说明本发明的线粒体12S～16S引物对两栖动物有很好的扩增能力。
实施例3
采用Ion Torrent PGM测序仪对实施例2中12S～16S设计引物和文献引物的扩增产物进行高通量测序，测序前用测序仪专用的试剂盒Ion XpressTMPlus Region LibraryKit(Life Technologies,USA)构建测序文库，用Ion Proton HiQ Sequencing Kit测序试剂盒按照标准仪器操作选用PI v2芯片进行测序，测序结果以Fastq格式输出，在基于Linux系统的QIIME2软件平台上进行序列前处理(过程如下)：过滤测序质量值低、序列长度短于150bp的序列，依据相应的Barcode(测序建库时加上的，属于测序试剂盒自带试剂)将测序结果按照不同的样品分类，分类后的序列分别用UCHIME软件除去嵌合子序列，然后用Uclust软件根据序列间的相似性进行OTU分型，提取每个OTU的代表序列，使用NCBI数据库进行BLAST注释，筛选BLAST序列相似性大于等于97％的序列，最终确定物种信息和进行多样性的分析，分析结果见图3、图4。
根据图3可知，本发明引物Am312、Am250、Am305、Am387在种水平上的识别率最高(53.33％)，Am246在属、科水平上的覆盖率最高，分别检出了76％的属和100％的科，精确度和覆盖率均优于文献中引物。在后续的两栖动物宏条形码监测中，可结合图4的物种检出结果，根据监测目标物种的不同使用合适的引物，以及多对引物组合的方式，提高物种检测与群落分析效率。
Claims (9)
1.一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物，其特征在于：包括一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，
所述的上游引物序列包括：
Am312-F1：TAGAGGAGCCTGTNCTATAATCGAT；
Am246-F2：CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；
Am250-F3：ACGAGAAGACCCNATGGAGCTT；
所述的下游引物序列包括：
Am312-R1：GAAGAGGGNGACGGGCGGTGTGT；
Am246-R2：AAGCTCCATNGGGTCTTCTCGT；
Am250-R3.1：CGCTGTTATCCCNAGGGTAACTTG；
Am305-R3.2：ATCCAACATCGAGGTCGTAAACC；
Am387-R3.3：CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG；
所述上游引物和下游引物对组合包括以下几种方式：(1)Am312-F1与Am312-R1组合；(2)Am246-F2与Am246-R2组合，(3)Am250-F3与Am250-R3.1组合，(4)Am250-F3与Am305-R3.2组合，(5)Am250-F3与Am387-R3.3组合。
2.权利要求1所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)DNA样本的提取；
(2)目的片段的扩增：对步骤(1)中的DNA样本进行PCR扩增，其中，PCR扩增引物采用一条所述上游引物和一条所述下游引物组合成的引物对；
(3)针对步骤(2)中扩增产物的片段大小分析，或对步骤(2)中的扩增产物进行高通量测序。
3.根据权利要求2所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述上游引物与所述下游引物组合的摩尔比为1：(1～3)。
4.根据权利要求3所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述引物对进行PCR反应的退火温度为55℃。
5.根据权利要求4所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述DNA样本包括环境源DNA样本及生物源DNA样本。
6.根据权利要求5所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中待扩增的DNA样本浓度为0.1ng/μL以上。
7.根据权利要求4或5所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，扩增反应体系的体积为30μL，反应体系中包含以下物质：2μL的10μM的上述引物，所述的上游引物和下游引物体积各1μL；12μL的去离子水；15μL的TaqMasterMix；1μL的DNA样本。
8.根据权利要求3所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述上游引物与所述下游引物组合的摩尔比为1：1。
9.权利要求1所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物在两栖动物物种鉴定、两栖动物多样性、系统发育关系、系统地理学或遗传多样性分析中的应用。
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