CN105506084B - 快速高效检测基因组dna羟甲基化的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速高效地检测基因组DNA羟甲基化的方法及试剂盒。该方法包括：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段；对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段；将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到测序用DNA文库；以及，对所述测序用DNA文库进行二代测序。与传统的RRHP方法相比，该方法无需使用包含双脱氧核糖核苷酸的接头。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种快速高效检测基因组DNA羟甲基化的方法。
背景技术
上世纪70年代，Penn等[1]在哺乳动物DNA中首次发现5-羟基胞嘧啶(5hmC)的存在，由于当时技术的限制，对5hmC的进一步验证和研究没有受到重视。2009年，5hmC再一次出现在科学家的视野，Kriaucionis[2]和Tahiliani[3]在小鼠Purkinje细胞、神经元颗粒和胚胎干细胞中证实5hmC的存在。此后，科学家们陆续在哺乳动物中枢神经、脊髓、肾脏、心脏、骨骼肌、肝脏等组织证实5hmC的普遍存在[4]。
随着高通量测序的出现，对DNA甲基化的检测也随之展开，BS-Seq中亚硫酸盐将胞嘧啶(C)经过磺化、脱氨、脱磺基转变成尿嘧啶(U)，尿嘧啶(U)经过PCR扩增被胸腺嘧啶(T)替代，整个过程5mC和5hmC不能被转变，通过高通量测序未修饰的胞嘧啶(C)与被修饰的胞嘧啶(5mC和5hmC)被区分，但并不能将5mC和5hmC区分开[5]。
随着对5hmC研究的深入，逐渐出现多种基于高通量测序的5hmC检测方法。2011年，Hume等[6]采用羟甲基化抗体特异的识别甲基化DNA片段，发生免疫共沉淀反应，以此富集羟甲基化区域，结合高通量测序对基因组羟甲基化进行检测，这种方法被称为hMeDIP。2012年，Yu等[7]利用UDPG保护5hmC，将5hmC转化为5gmC。mTet1蛋白将5mC氧化成5caC，再经亚硫酸盐进行处理，5gmC不被转化，而5caC被转化为U，通过高通量测序可将5hmC和5mC区分，这种方法被称为TAB-Seq。2012年，Michael等[8]，通过KRuO4氧化5hmC为5fC，再经亚硫酸盐进行处理，5fC转化U，通过高通量测序5hmC被测为T，整个过程5mC不被氧化和转化被测为C，这种方法被称为oxBS-Seq。
目前，以上三种最为常用的DNA羟甲基化检测方法逐渐被应用于科学研究，在应用过程中它们的优缺点也逐渐显露出来。，
基于免疫共沉淀来富集5hmC区域的hMeDIP方法，由于羟甲基化抗体对羟甲基化DNA片段的识别需要一定数量的5hmC，当某一DNA片段中5hmC数量少于抗体识别最小数量时，不能发生免疫共沉淀来富集该DNA片段，后续的高通量测序结果便不能检测出该DNA片段，hMeDIP仅能检测到DNA中富含羟甲基化的区域，不能做到DNA单碱基水平羟甲基化的检测。
基于保护5hmC氧化5mC的TAB-Seq方法，建库起始量高(3～5μg)，mTet1蛋白价格昂贵，亚硫酸盐对DNA存在损伤，需要先对5hmC保护效率和5mC氧化效率进行评估再进行高通量测序，导致建库周期长，并且需要构建BS-Seq文库作为对照，这些因素限制了TAB-Seq的广泛应用。
基于氧化5hmC的oxBS-Seq方法，建库周期长，商业化氧化试剂价格昂贵，并且存在氧化试剂和亚硫酸盐对DNA的双重损伤，同时也需要通过Sanger测序评估转化效率，构建BS-Seq作为对照等，并且测序要求数据量较大。
最近，RRHP方法[10]作为一种建库周期短、成本低、数据利用率高的羟甲基化检测方法，解决了hMeDIP不能单碱基水平检测、TAB-Seq成本高周期长、oxBS-Seq对DNA损伤大等问题。该方法的基本原理是使用MspI酶切gDNA，所有含CCGG的序列被酶切；酶切位点两端加上特殊的P5和P7接头，其中P5接头连接后仍存在MspI酶切位点，P7接头连接后消除掉MspI酶切位点；使用T4-βGT糖基化5hmC为5gmC，C和5mC不会被糖基化修饰；再次使用MspI酶切时，5gmC不会被MspI酶切，而C和5mC会被酶切；最后通过琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，PCR扩增后，对文库进行高通量测序，每测一条reads，即测到一个羟甲基化位点。该RRHP方法具有检测精度高、对DNA损伤小等诸多优点，但是该方法的加接头步骤中需要使用包含双脱氧核糖核苷酸的接头，这造成了检测成本的增加；而且，包含双脱氧核糖核苷酸的接头的合成往往耗费时间，这造成了检测时间的增加。
因而，迫切希望有RRHP方法的快速、低成本的替代方法。
参考文献
非专利文献
[1]Penn N W et al.The presence of 5-hydroxymethylcytosine in animaldeoxyribonucleic acid.Biochem J,1972.126(4):p.781-90.
[2]Kriaucionis S and N Heintz.The nuclear DNA base5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.Science,2009.324(5929):p.929-30.
[3]Tahiliani M et al.Conversion of 5-methylcytosine to5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.Science,2009.324(5929):p.930-5.
[4]Globisch D et al.Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosineand search for active demethylation intermediates.PLoS One,2010.5(12):p.e15367.
[5]Li N et al.Whole genome DNA methylation analysis based on highthroughput sequencing technology.Methods,2010.52(3):p.203-12.
[6]Stroud H et al.5-Hydroxymethylcytosine is associated withenhancers and gene bodies in human embryonic stem cells.Genome Biol,2011.12(6):p.R54.
[7]Yu M et al.Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine inthe mammalian genome.Cell,2012.149(6):p.1368-80.
[8]Booth M J et al.Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution.Science,2012.336(6083):p.934-7.
[9]Yu M et al.Tet-assisted bisulfite sequencing of 5-hydroxymethylcytosine.Nat Protoc,2012.7(12):p.2159-70.
[10]Petterson A et al.RRHP:a tag-based approach for5-hydroxymethylcytosine mapping at single-site resolution.Genome Biol,2014.15(9):p.456.
[11]Wang L et al.Systematic assessment of reduced representationbisulfite sequencing to human blood samples:Apromising method for large-sample-scale epigenomic studies.J Biotechnol,2012.157(1):p.1-6.
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种RRHP方法的快速、低成本的替代方法及用于该方法的试剂盒。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：如果在传统RRHP方法的加接头步骤中使用本发明人设计的特定的P5接头和P7接头(不含双脱氧核糖核苷酸)，则能够快速地、低成本地实现与传统RRHP方法一致的数据品质，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种检测基因组DNA羟甲基化的方法，该方法包括：
步骤A：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；
步骤B：在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段，所述P5接头是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的退火产物，所述P7接头是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的退火产物；
步骤C：对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段；
步骤D：将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；
步骤E：对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到测序用DNA文库；以及
步骤F：对所述测序用DNA文库进行二代测序，基于测序结果，对所述基因组DNA的羟甲基化情况进行分析。
2.一种构建用于检测基因组DNA羟甲基化的二代测序文库的方法，该方法包括：
步骤A：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；
步骤B：在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段，所述P5接头是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的退火产物，所述P7接头是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的退火产物；
步骤C：对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段；
步骤D：将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；以及
步骤E：对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到二代测序用DNA文库。
3.根据项2所述的方法，其中，所述步骤C中的羟甲基化碱基是5-羟甲基胞嘧啶。
4.根据项2或3所述的方法，其中，所述步骤C中的糖基化处理使用β葡萄糖基转移酶进行。
5.根据项2～4中任一项所述的方法，其中，在所述步骤D和步骤E之间还包括
步骤G：对二次酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收指定大小的片段。
6.根据项2～5中任一项所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、和/或步骤E之后还包括纯化步骤。
7.根据项2～6中任一项所述的方法，其中，所述二代测序采用Illumina测序平台进行。
8.一种用于检测基因组DNA羟甲基化的试剂盒，其包括：
SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列、或它们的退火产物；
SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、或它们的退火产物；以及
用于RRHP方法的试剂；
但，该试剂盒不包括包含双脱氧核糖核苷酸的接头。
9.根据项8所述的试剂盒，其中，所述用于RRHP方法的试剂选自MspI酶、MspI酶切反应缓冲液、β葡萄糖基转移酶、β葡萄糖基转移酶反应缓冲液、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及用于Illumina平台测序的试剂。
发明效果
根据本发明，能够提供一种RRHP方法的快速、低成本的替代方法及用于该方法的试剂盒。
发明的具体实施方式
本说明书中使用的缩略语如下：
RRHP方法的基本原理是：使用MspI酶切gDNA，所有含CCGG的序列被酶切；酶切位点两端加上特殊的P5和P7接头，其中P5接头连接后仍存在MspI，酶切位点，P7接头连接后消除掉MspI酶切位点；使用β-GT糖基化5hmC为5gmC，C和5mC不会被糖基化修饰；再次使用MspI酶切时，5gmC不会被MspI酶切，而C和5mC会被酶切；最后进行琼脂糖片段筛选，PCR扩增后，对文库进行高通量测序，每测一条reads，即测到一个羟甲基化位点。无论是传统方法还是本发明的方法均是基于该基本原理。
首先，在一个方面中，本发明提供一种构建用于检测基因组DNA羟甲基化的二代测序文库的方法(本发明的建库方法)，该方法包括：
步骤A：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；
步骤B：在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段，所述P5接头是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的退火产物，所述P7接头是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的退火产物；
步骤C：对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段；
步骤D：将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；以及
步骤E：对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到二代测序用DNA文库。
在本发明的建库方法中，对所述步骤A中的基因组DNA的量没有特殊限制，例如可以为10～10000ng，优选100～1000ng。
在所述步骤A中，用限制性内切酶MspI对所述基因组DNA进行处理以酶切基因组DNA。该处理可以在适于MspI酶的酶切反应缓冲液中进行，通常例如可以于20～50℃(优选35～40℃)、1～20小时(优选5～10小时)。
优选地，在所述步骤A与步骤B之间，可以对所得酶切片段进行纯化，例如可以使用QIA-quick PCR Purification Kit来进行过膜纯化。
所述步骤B是本发明的建库方法不同于传统RRHP方法(非专利文献10的方法)的步骤，这种不同主要体现在：传统RRHP方法使用包含双脱氧核糖核苷酸的P5和P7接头，而本发明的建库方法中使用不包含双脱氧核糖核苷酸的P5和P7接头。本发明人经过研究发现，通过使用本发明的P5接头和P7接头来代替传统RRHP方法中使用的包含双脱氧核糖核苷酸的P5和P7接头，所获得测序数据能够达到与传统RRHP方法一致的品质，其中，所述P5接头是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的退火产物，所述P7接头是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的退火产物。这使得与传统RRHP方法相比，本发明的建库方法显著地快速且低成本。所述加接头可以使用DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)来进行。
优选地，在所述步骤B与步骤C之间可以对所得的加接头的酶切片段进行纯化，例如可以使用QIA-quick PCR Purification Kit来进行过膜纯化。
优选地，所述步骤C中的羟甲基化碱基是5-羟甲基胞嘧啶。优选地，所述步骤C中的糖基化处理可以使用T4噬菌体β葡萄糖基转移酶在适于该酶的反应缓冲液中进行。优选地，在所述步骤C与步骤D之间可以对所得的加接头的酶切片段进行纯化，例如可以使用QIA-quick PCR Purification Kit来进行过膜纯化。
优选地，在所述步骤D和步骤E之间可以对二次酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收指定大小(例如110～500bp)的片段。
优选地，在步骤E之后还可以对所得的二代测序用DNA文库进行纯化，该纯化例如可以使用磁珠来进行。
通过对所得测序用DNA文库进行二代测序，并基于测序结果进行分析，可以获得所述基因组DNA的羟甲基化的信息。因此，本发明还提供一种检测基因组DNA羟甲基化的方法，其在包括上述本发明的建库方法的各步骤的基础上，还包括步骤F：对所述测序用DNA文库进行二代测序，基于测序结果，对所述基因组DNA的羟甲基化情况进行分析。优选地，所述二代测序采用Illumina测序平台进行。
此外，在另一个方面中，本发明还提供一种用于检测基因组DNA羟甲基化的试剂盒，其包括：SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列、或它们的退火产物(P5接头)；
SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、或它们的退火产物(P7接头)；以及用于RRHP方法的试剂；但，该试剂盒不包括包含双脱氧核糖核苷酸的标签。
所述用于RRHP方法的试剂是本领域技术人员已知的，例如可以是选自MspI酶、MspI酶切反应缓冲液、β葡萄糖基转移酶、β葡萄糖基转移酶反应缓冲液、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及用于Illumina平台测序的试剂中的一种或多种或全部。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
实施例1采用本发明的方法进行建库、测序及数据分析
(1)MspI(NEB公司)酶切：500ng起始建库，按照下表反应体系进行酶切，37℃酶切8小时；
酶切产物用QIA-quick PCR Purification Kit(Qiagen公司)过膜纯化。
(2)加接头：按下表连接体系进行连接反应，反应条件：16℃，12小时。反应产物用QIA-quick PCR Purification Kit过膜纯化；
其中，IDT-P5接头由浓度为100μM的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和浓度为100μM SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列等量混合；IDT-P7接头由浓度为100μM的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和浓度为100μM SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列等量混合。
(3)按下表反应体系进行糖基化反应，反应条件37℃下4小时，反应产物用QIA-quick PCR Purification Kit过膜纯化；
(4)MspI二次酶切反应：按下表加入酶切体系，反应时间，37℃4小时，产物用QIA-quick PCR Purification Kit过膜纯化；
(5)2.5％琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选，对二次酶切产物切胶纯化，筛选110-500bp之间的片段。
(6)PCR扩增：按下表加入PCR反应体系
IDT-F的序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC
IDT-Index的序列为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGGATCGTGACTGGAGTTC
其中，下划线部分可以替换为任何Index序列，可用于区分不同的样本。
PCR反应条件如下：94℃预变性5分钟；(94℃热变性10秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒)15个循环；72℃终延伸分钟，4℃保存。
(7)PCR产物1.8倍Ampure磁珠纯化，对文库进行Qubit定量。
(8)文库2100和qPCR质控：使用安捷伦生物2100生物分析仪对文库峰图进行检测，qPCR定量摩尔浓度，为上机测序提供依据。
(9)高通量测序：对该文库进行SE50测序，每个文库数据量为20M Reads；
(10)信息分析：对测序结果进行信息质控和其他相关分析。
将获得的数据信息与非专利文献10中公开的数据信息对比总结于表1。
表1
由表1可知，本发明的方法实现了与非专利文献10公开的传统RRHP方法品质一致的数据信息。因此，本发明的方法在具有快速、低成本的特点的同时，仍然保持了传统RRHP方法的高效的特点。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，能够提供一种RRHP方法的快速、低成本的替代方法及用于该方法的试剂盒。
Claims (6)
1.一种检测基因组DNA羟甲基化的方法，其是RRHP方法的替代方法，该方法包括：
步骤A：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；
步骤B：在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段，所述P5接头是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的退火产物，所述P7接头是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的退火产物；
步骤C：对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段，其中，所述羟甲基化碱基是5-羟甲基胞嘧啶，所述糖基化处理使用β葡萄糖基转移酶进行；
步骤D：将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；
步骤E：对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到测序用DNA文库；以及
步骤F：对所述测序用DNA文库进行二代测序，基于测序结果，对所述基因组DNA的羟甲基化情况进行分析；
该方法不用于人类及动物疾病诊断。
2.一种构建用于检测基因组DNA羟甲基化的二代测序文库的方法，其是RRHP方法的替代方法，该方法包括：
步骤A：用限制性内切酶MspI酶切基因组DNA，得到酶切片段；
步骤B：在所述酶切片段的两端分别连接P5接头和P7接头，得到加接头的酶切片段，所述P5接头是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列的退火产物，所述P7接头是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的退火产物；
步骤C：对所述加接头的酶切片段进行糖基化处理，使其中的羟甲基化碱基转化为糖基羟甲基化碱基，得到包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段，其中，所述羟甲基化碱基是5-羟甲基胞嘧啶，所述糖基化处理使用β葡萄糖基转移酶进行；
步骤D：将所述包含糖基羟甲基化碱基的酶切片段再次用限制性内切酶MspI酶切，得到二次酶切产物；以及
步骤E：对所述二次酶切产物进行PCR扩增，得到二代测序用DNA文库。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤D和步骤E之间还包括：
步骤G：对二次酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收110bp-500bp大小的片段。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、和/或步骤E之后还包括纯化步骤。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述二代测序采用Illumina测序平台进行。
6.一种用于检测基因组DNA羟甲基化的试剂盒，其包括：
SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列、或它们的退火产物；
SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、或它们的退火产物；以及
用于RRHP方法的试剂，所述用于RRHP方法的试剂选自MspI酶、MspI酶切反应缓冲液、β葡萄糖基转移酶、β葡萄糖基转移酶反应缓冲液、Taq酶、PCR反应缓冲液、以及用于Illumina平台测序的试剂；
但，该试剂盒不包括包含双脱氧核糖核苷酸的接头。
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