CN109609613B

CN109609613B - 一种dna羟甲基化目标区域捕获测序方法

Info

Publication number: CN109609613B
Application number: CN201910073341.4A
Authority: CN
Inventors: 梁加龙; 韩京京; 余越美; 张坤; 蔡万世
Original assignee: Igenetech Biotech Beijing Co ltd
Current assignee: Igenetech Biotech Beijing Co ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109609613A

Abstract

本发明公开了一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；将所述第一样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；将所述处理后的样品变性、复性、去除单链，获得羟甲基化文库捕获促进剂；将所述第二样品与接头连接；将所述连接接头的第二样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；将上步骤中处理的第二样品与所述羟甲基化文库捕获促进剂混合；对所述混合样品进行探针捕获；对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。本发明的方法可以检测基因组目标区域内CpG的羟甲基化水平，有效提高目标区域内CpG的检测准确性、降低成本。

Description

一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法。

背景技术

在甲基转移酶的催化下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)5'碳位以共价键结合一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化中5-甲基胞嘧啶(5-mdC)在TET家族酶的催化下发生氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmdC)。5-羟甲基胞嘧啶被称为哺乳动物中的“第六碱基”。5-羟甲基胞嘧啶可以作为稳定的DNA表观遗传修饰参与干细胞和癌症相关基因表达与调控的重大生命活动。由于5-羟甲基胞嘧啶主要分布在增强子和转录起始位点附近，因而它对基因的转录有很大影响，而5hmC的含量又受到Tet蛋白的调节，因此基因的表达调控在很大程度上会受到Tet蛋白和5-羟甲基胞嘧啶的影响，作用机制为5-羟甲基胞嘧啶通过降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域与甲基化DNA的亲和性，来参与基因的表达调控，同时它还参与了DNA去甲基化过程。并且，在众多的疾病中均有发现5-羟甲基胞嘧啶的紊乱，如黑色素瘤、帕金森症等。一些基因组上重要区域的5-羟甲基胞嘧啶水平的变化，已经被作为疾病诊断和预后的分子标标志物，5-羟甲基胞嘧啶和另外一种起修饰作用的DNA碱基5-甲基胞嘧啶(5-mC)很相似，但它们之间的差异受到化学技术的限制一直无法分辨，因此开发对目标区域单碱基分辨率的5-羟甲基胞嘧啶检测技术显得尤为重要。

目前虽然已有一些方法可以实现对全基因组范围单碱基分辨率的5-羟甲基胞嘧啶的检测，如TAB-Seq、oxBS-Seq技术，但是尚缺乏对5-羟甲基胞嘧啶基因组目标区域的检测技术。

发明内容

为了实现准确、有针对性地对5-羟甲基胞嘧啶水平的检测，发明人提出了一种单碱基分辨率的目标区域5-羟甲基胞嘧啶检测技术。

因此，本发明提供了一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：

(1)将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；

(2)将所述第一样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；

(3)将所述处理后的样品变性、复性、去除单链，获得羟甲基化文库捕获促进剂；

(4)将所述第二样品与接头连接；

(5)将所述连接接头的第二样品依次经糖基化修饰、TET酶处理和亚硫酸盐处理；

(6)将步骤(5)中处理的第二样品与步骤(3)获得的羟甲基化文库捕获促进剂混合；

(7)对所述混合样品进行探针捕获；

(8)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

在一个实施方案中，在步骤(4)中在所述第二样品中加入双链序列后再进行接头连接，所述双链序列为：

oligoA：5’-3’

ATC*GGGATGCTACC&GATGCC*GATCAATGCAATGCATGCATGGACCGATCGACATTC*GGACCTATGACCTGCAATGCATGGCATGATCC*GCTGAC&GACTGAC*GTCGATTC*GGAGCTAGATC

oligoB：5’-3’

GATCTAGCTCC*GAATCGAC*GTCAGTC&GTCAGC*GGATCATGCCATGCATTGCAGGTCATAGGTCC*GAATGTCGATCGGTCCATGCATGCATTGCATTGATC*GGCATC&GGTAGCATCCC*GAT

*代表羟甲基化位点，&代表甲基化位点。

在一个实施方案中，在步骤(4)中在连接接头之前有加“A”的步骤。

在一个实施方案中，所述接头的两条链为，

Hydro-Adapter-1:

GATC*GGAAGAGC*AC*AC*GTC*TGAAC*TC*C*AGTC*AC*

Hydro-Adapter-2:

AC*AC*TC*TTTC*C*C*TAC*AC*GAC*GC*TC*TTC*C*GATC*T。

在一个实施方案中，在步骤(5)中亚硫酸盐处理后包括扩增步骤，扩增引物为：

TPE1.0：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

TPE2.0：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATindexGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。

在一个实施方案中，在步骤(7)中，设计探针时采用简并策略，由于CpG上的C存在以下3种状态：未发生甲基化，经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后转化为U对应探针上的碱基为T；发生甲基化，经经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后转化为U对应探针上的碱基为T；发生羟甲基化经，经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后，对应探针上的碱基仍为C，因此当遇到CpG碱基时，把C改为C/T这两种简并碱基，探针上CG不超过3个，优选不含CG的序列。CA、CT、CC上的C改为T,其他位置上的A、T和G都按照碱基互补配对原则进行设计。

在一个实施方案中，在步骤(7)中，所述探针与目标序列互补序列的TM值范围在65℃-85℃，优选75℃。

在一个实施方案中，在步骤(7)中，探针的长度为90-120nt，优选100nt。

在一个实施方案中，在步骤(7)中，针对所述双链片段的的探针序列分别为：

5’-3’ATCGGGATGTTATTGATGTCGATTAATGTAATGTATGTATGGATTGATTGATATTCGGATTTATGATTTGTAATGTATGGTATGATTCGTTGATGATTGA；

5’-3’GATTTAGTTTCGAATTGACGTTAGTTGTTAGCGGATTATGTTATGTATTGTAGGTTATAGGTTCGAATGTTGATTGGTTTATGTATGTATTGTATTGATC。

在一个实施方案中，在步骤(8)后包括分析测序结果的步骤，以如下方式确定羟甲基化位点：羟甲基化水平＝测序结果的到C碱基总数/(测序结果得到C碱基总数+测序结果得到的T碱基总数)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方案仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施方案对本发明的具体实施方式进行详细描述。

1.羟甲基化文库捕获促进剂制备

1.1将样品提取的DNA片段化：用Bioruptor Pico打断仪

表1：样品制备。

成分	体积
		基因组DNA	量为1μg
Nuclease-free water	补足至50μl

1.2Bioruptor Pico打断仪

1)将基因组DNA按照以上体系转移至0.6ml MaxyClear SnaplockMicrocentrifuge Tube内，充分混匀，短暂离心后置于冰上待用；

2)提前打开超声打断仪Bioruptor Pico，待冷循环仪温度降至4℃后，设置参数ON30s，OFF 30s为1个循环，每10循环为一轮，共进行3轮，每轮结束后将样品置于振荡器上充分混匀，短暂离心后进行下一轮打断(混匀越充分，打断样品片段大小越集中)；

3)取1μl样品使用Agilent2100(DNA 1000Assay)进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。

1.2β-GT(β-葡萄糖基转移酶)进行糖基化修饰

1)准备糖基化反应试剂

表-2：糖基化反应体系

成分	体积
		来自5.9反应结束的样品	20ul
10mM UDP-Glucose	0.4ul
		10×βGT protection buffer	3ul
T4-βGT(10U/μL)	2ul
		Milli-Q water	4.6ul
总体积	30ul

2)使用移液器吹打混匀，37℃孵育一小时。

3)用QIAquick PCR purification kit对上述产物进行纯化，洗脱体积为35ul。

1.3TET酶处理

1)准备氧化反应试剂如下：

表-3：氧化化反应体系

成分	体积
		来自6.3反应结束的样品	35ul
Tet oxidation reagent 2	15ul
		Tet oxidation reagent 1	3.5ul
mTet1protein(5mg/ml)	4ul
		Milli-Q water	3.5ul
总体积	60ul

TET酶(ten-eleven translocation)是生物体内存在的一种α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依赖的双加氧酶。

2)使用移液器吹打混匀，37℃孵育80min。

3)加入1ul Proteinase K(20mg/mL)至上述反应液中，使用移液器上下吹打混匀，50℃反应1小时。

4)通过Micro Bio-Spin 30Columns进行纯化，之后再通过QIAquick PCRpurification kit进行纯化，用4 0ul的Milli-Q water进行洗脱。

1.4亚硫酸盐处理

1)准备新鲜的亚硫酸盐：

溶解8.1g亚硫酸氢钠到水中，慢慢搅动避免氧化。用10M NaOH调整pH值到5.1。

加入0.66ml的20mM的对苯二酚，用水调整体积至20mL。至少需要用10min来溶解亚硫酸氢钠，在第二步沉淀干燥时，需要准备好亚硫酸氢钠溶液。

2)在PCR反应仪里，97℃加热上述打断后的DNA 1min，然后放入冰水中急速冷却1min。短暂离心2-3s。

3)加入1ul 6.3M新配置的NaOH，在39℃孵育30min。

4)保持PCR仪温度39℃时，加入280ul亚硫酸氢钠溶液至变性的DNA中，孵育在55℃，16h，每隔3小时，温度提高至95℃，5min。储存到4℃，备用。

5)用QIAGEN PCR纯化柱子对4)产物进行纯化。

6)加入6.3M NaOH至5)纯化产物中，至终浓度为0.3M进行混匀，在37℃孵育15min。

7)向6)反应产物中加入33μL 10M NH₄OAC pH7.0至终浓度为3M，再加入1-2μl的tRNA或者糖原和342μL的100％EtOH，13,000rpm离心15min，沉淀晾干至70％时，用100μl的QIAGEN EB或者TE。

1.5亚硫酸盐转化后DNA片段的变性

实验前的准备工作：

将水浴锅打开，调整水量，设置3个温度分别为100℃、65℃和37℃；每管所需SI核酸酶的酶量为10U/ug。

(1)用Nanodrop测定DNA溶液的浓度c。将DNA分为两管，每管43ul，备用。

(2)将DNA溶液分装到1.5离心管中，在100℃水浴中变性10min,同时将(500ul)3M的NaCl溶液放入65℃水浴备用。将3M的NaCl提前加热至65℃是为了在后续实验操作中加入时，对反应液的温度不造成影响。

1.6亚硫酸盐转化后DNA片段的复性：

(1)将1.3(2)中的离心管转入65℃水浴平衡5min。

(2)向每管中加入4.8ul预热的3M NaCl,上下颠倒混匀，放入65℃水浴并按照计算的DNA复性时间T进行复性。330g/mol DNA每对碱基的平均分子量(Sigma)，T＝330/c(ng/ul)*1000。比如说浓度为550ng/ul则需要复性时间为TS＝330/550*1000＝600s。

1.7去掉单链DNA片段：

(1)复性结束后，将DNA放入37℃金属浴中防止温度过低，向每管中加入12ul的10XS1buffer,上下颠倒混匀后，将反应管再放入水浴锅中。

(2)等待2-3min，向每管中加入所计算的0.2ul的S1酶量(参考10U/mg DNA)，上下颠倒混匀，简短离心。

(3)将离心管转入37℃水浴对上述反应物消化30min。消化完成后加入4ul的0.5MEDTA终止反应，充分混匀后立即进行下一步的抽提纯化。

1.6变复性后DNA的纯化

(1)加入等体积(75ul)的酚氯仿(酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，充分混匀后，放置5min，10000rpm离心5min。

(2)将上清转移到新的离心管中，加入等体积(70ul)的氯仿，充分混匀后，放置5min，10000rpm离心5min。

(3)将上清转移到新的离心管中，加入1/10体积(7ul)的3M的醋酸钠，混合均匀，加入-20℃预冷的等体积的异丙醇，-20℃放置沉淀1小时以上。

(4)-20℃取出后室温放置10min,用吸水纸擦净离心管外壁上的水后，12000rpm离心10min。

(5)注意离心管底部的沉淀，小心的倒掉上清，加入等体积(80ul)75％的乙醇洗涤，12000rpm离心5min。

(6)弃掉上清，加入等体积(80ul)的无水乙醇洗涤，12000rpm离心5min。

(7)弃掉上清，将DNA放于室温干燥。约20min，保留较多乙醇，避免吸到沉淀。

(8)加入pH8.0的TE溶液10ul溶解干燥后的DNA，充分混匀进行定量检测，羟甲基化文库捕获促进剂制备完成。

2.C双链片段的化学合成：

2.1合成两条已知互补DNA序列，CG上的C部分发生甲基化和羟甲基化，用于羟甲基化转化率的计算。

oligoA：5’-3’

oligoB：5’-3’

*代表羟甲基化位点，&代表甲基化位点；

2.2C双链片段的形成：

(1)将合成好的oligoA和oligoB分别进行充分溶解，完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系

表4：oligo退火组分

成分	体积
		oligoA	20ul
oligoB	20ul
		退火buffer	20ul
NF H<sub>2</sub>O	40ul
		总体积	100ul

(2)使用移液器吹打混匀上述反应体系，95℃变性5min，关闭水浴锅，3小时后退火结束。

(3)oligoA和oligoB退火成功后，形成双链C片段。

3.末端修复，加A

3.1将C片段与打断后的DNA样品按照分子数比为1:10⁴进行混合，混合后样品标记为D，D样品的总量为30ng，完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行)：

表5：末端修复、3’端加“A”体系

成分	体积
		D样品	50ul
End Repair&A-Tailing Buffer	7ul
		End Repair&A-Tailing Enzyme Mix	3ul
总体积	60ul

3.2使用移液器吹打混匀(避免剧烈震荡混匀)，将PCR管放回冰盒上备用；

3.3将所述加“A”后的体系在PCR仪中进行如下操作：

Heat lid 85℃

20℃维持30min

65℃维持30min

4℃保持

3.4程序运行完成后立即进行下步连接反应。

4.连接羟甲基化接头

4.1羟甲基化接头的制备：

(1)将合成好的Hydro-Adapter-1和Hydro-Adapter-2分别进行充分溶解，浓度为100uM，完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系：

表-6：羟甲基化接头退火组分体系

成分	体积
		Hydro-Adapter-1	25ul
Hydro-Adapter-2	25ul
		退火缓冲液	20ul
NF H<sub>2</sub>O	30ul
		总体积	100ul

Hydro-Adapter-1：

GATC*GGAAGAGC*AC*AC*GTC*TGAAC*TC*C*AGTC*AC*

Hydro-Adapter-2：

AC*AC*TC*TTTC*C*C*TAC*AC*GAC*GC*TC*TTC*C*GATC*T

C*代表C碱基发生羟甲基化修饰；

(3)Hydro-Adapter-1和Hydro-Adapter-2退火成功后，形成HydroxymethylationAdapter。

4.2在上述步骤2反应的PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行)，进行接头连接：

表-7：连接体系

成分	体积
		来自步骤3反应结束的样品	60ul
Hydroxymethylation Adapter(25uM)	8.3ul
		Nuclease-free water	1.7ul
连接缓冲液	30ul
		DNA连接酶	10ul
总体积	100ul

4.3轻轻吸打混匀6次，避免产生气泡，然后短暂离心；

4.4在PCR仪中运行如下程序(要求无热盖)：

加盖关掉

20℃维持30min

4℃保持

4.5程序结束后，立即进行下步实验。

5.连接产物纯化

5.1将Agencourt AMPure XP磁珠拿至室温，震荡混匀备用；

5.2在步骤4中程序运行完的PCR管中，按照1.0×体积的纯化磁珠进行实验，按下面表格配置反应体系：

表-8：磁珠纯化体系

成分	体积
		来自步骤4反应结束的样品	110ul
Agencourt AMPure XP beads	110ul
		总体积	220ul

5.3轻轻吸打混匀6次，室温静置孵育5-15min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清；

5.4移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s；

5.5移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；

5.6室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；

5.7加入22μl的Nuclease-free water，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；

5.8将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清；

5.9用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记样本编号，准备下一步反应。

6.β-GT(β-葡萄糖基转移酶)进行糖基化修饰

6.1准备糖基化反应试剂

表-9：糖基化反应体系

成分	体积
		来自步骤5反应结束的样品	20ul
10mM UDP-Glucose	0.4ul
		10×βGT protection buffer	3ul
T4-βGT(10U/μL)	2ul
		Milli-Q water	4.6ul
总体积	30ul

6.2使用移液器吹打混匀，37℃孵育一小时。

6.3用QIAquick PCR purification kit对上述产物进行纯化，洗脱体积为35ul。

7.TET酶处理

7.1准备氧化反应试剂如下：

表-10：氧化化反应体系

成分	体积
		来自步骤6反应结束的样品	35ul
Tet oxidation reagent 2	15ul
		Tet oxidation reagent 1	3.5ul
mTet1protein(5mg/ml)	4ul
		Milli-Q water	3.5ul
总体积	60ul

7.2使用移液器吹打混匀，37℃孵育80min。

7.3加入1ul Proteinase K(20mg/mL)至上述反应液中，使用移液器上下吹打混匀，50℃反应1小时。

7.4通过Micro Bio-Spin 30Columns进行纯化，之后再通过QIAquick PCRpurification kit进行纯化，用40ul的Milli-Q water进行洗脱。

8.亚硫酸盐处理

8.1根据下表配制反应体系进行亚硫酸盐处理：

表-11：亚硫酸盐体系

成分	体积
		来自步骤7结束的样品	40ul
Bisulfite solution	85ul
		DNA Protect Buffer	15ul
总体积	140ul

8.2将移液器调至100μl，轻轻吸打混匀6次，然后分成两管置于PCR仪上。

8.3在PCR仪中进行如下程序：

Heat lid 105℃

95℃维持5min

60℃维持10min

95℃维持5min

60℃维持10min

4℃保持。

8.4PCR结束后，简短离心将两管相同样本转移至同一个干净的1.5ml离心管中；

8.5每个样本中加入310μl Buffer BL涡旋混匀，简短离心；

8.6加入250μl Ethanol(96-100％)至每个样本，涡旋混匀15s，简短离心；

8.7将带有收集管的离心柱(

DNA Spin Columns with collectionTubes)放置在板子上，将步骤8.6的混合液体转移到对应的标记好的离心柱中；

8.8静置1min，离心1min，将收集管中的液体重新转移至离心柱中，离心1min，弃掉离心管中的液体；

8.9加入500μl buffer BW，离心1min，弃掉离下来的液体；

8.10加入500μl buffer BD，盖好管盖，室温放置15min，离心1min，弃掉离下来的液体；

8.11加入500μl buffer BW，离心1min，弃掉离下来的液体，再重复一次，共2次；

8.12加入250μl乙醇(96-100％)，离心1min，将离心柱放置到新的2ml收集管中，弃掉全部剩余液体；

8.13将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl Nuclease-free water到离心柱膜中心，轻轻盖上管盖，室温放置1min，离心1min；

8.14将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，离心1min。

9.PCR扩增

9.1亚硫酸盐处理后对DNA文库进行扩增，根据下表配制反应体系，

选择其中一种配置反应体系开展实验(此操作需在冰盒上进行)：

表-12：Pre-PCR体系

成分	体积
		来自步骤8反应结束的样品	20ul
PreMix	25ul
		TPE1.0(10μM)	2.5ul
TPE2.0(10μM)	2.5ul
		总体积	50μl

PreMix：KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X)

TPE1.0：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

TPE2.0：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATindexGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

9.2使用移液器轻轻吹打混匀，然后短暂离心；

9.3将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：

Heat lid 105℃

95℃维持1min

15个循环

95℃维持30s

60℃维持30s

72℃维持45s

72℃维持5min

4℃保持。

9.4程序运行完成后立即进行磁珠的纯化。

10.目标区域片段捕获

10.1按照以下体系配置反应体系开展实验，将样品文库与各

Hybdro-Block混匀，标记为B管，按照下面所对应的体系进行配制。

表-13：Block体系

成分	体积
		样品文库(来自步骤9反应结束的样品)	750ng
羟甲基化文库捕获促进剂	5μl
		Hybdro-Block	2μl

1)将杂交缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃恒温混匀仪内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl杂交缓冲液置于新的200μl PCR管内，盖好管盖，置于65℃恒温混匀仪孵育待用，标记为A管；

2)取5μl RNase Block与2μl羟甲基化文库捕获探针置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上或4℃待用，标记为C管。

Hybdro-Block指的是封闭羟甲基化接头的序列，

Hydro-Adapter-1的封闭序列

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC

Hydro-Adapter-2的封闭序列

AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT

10.2探针杂交

探针设计：

对与目标区域互补的序列，设计探针时采用简并策略，由于CpG上的C存在以下3种状态：未发生甲基化，经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后转化为U对应探针上的碱基为T；发生甲基化，经经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后转化为U对应探针上的碱基为T；发生羟甲基化经，经βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后，对应探针上的碱基仍为C，因此当遇到CpG碱基时，把C改为C/T这两种简并碱基，探针上CG不超过3个，优选不含CG的序列。CA、CT、CC上的C改为T,其他位置上的A、T和G都按照碱基互补配对原则进行设计。并且控制与目标序列互补序列的TM值范围在65℃-85℃，优选75℃。探针的长度为90-120nt，优选100nt。

同时混合有针对C双链片段的的探针序列分别为

5’-3’GATTTAGTTTCGAATTGACGTTAGTTGTTAGCGGATTATGTTATGTATTGTAGGTTATAGGTTCGAATGTTGATTGGTTTATGTATGTATTGTATTGATC

1)将B管放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩(浓缩之前可以先用相同体积的水进行浓缩时间测试，计算样品单位体积减少的时间，确认浓缩速率，避免因浓缩时间过长导致过度干燥，造成样品损耗)；

2)将B管浓缩至体积小于10μl，之后用Nuclease-free water补足至10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用；

3)设置PCR仪参数如下：

Heat lid 105℃

95℃维持5min

65℃保持。

4)将PCR管B置于PCR仪上，运行以上程序；

5)PCR仪温度降至65℃时，将A管置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖；

6)5min后，将C管置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖(注意：保持A管和B管在PCR仪上不动)；

2min后，把移液器调至13μl，从A管中吸取13μl杂交缓冲液移至C管中，吸取全部B管中样品移至C管中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(16-24h)。

10.3捕获磁珠准备

1)捕获磁珠(Cap beads)从4℃取出，涡旋震荡重悬；

2)取50μl磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清；

3)从磁力架上取下PCR管，加入200μl Binding Buffer轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠；

4)置磁力架上1min，移除上清；

5)重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次；

6)从磁力架上取下PCR管，加入200μl Binding Buffer轻轻吸打6次重悬磁珠待用。

10.4捕获目标区域DNA文库

1)保持杂交产物在PCR仪上，将步骤Step8中第6步重悬后的200μl Cap beads加入到杂交产物中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；

2)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液；

3)向杂交产物内加入200μl的Wash Buffer 1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，使溶液澄清，移除上清；

4)加入200μl的65℃预热的Wash Buffer 2，轻轻吸打6次混匀，置于恒温振荡混匀仪上65℃孵育10min,800转/min进行清洗；

5)短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用Wash Buffer 2清洗2次，共计3次。最后一次彻底移除Wash Buffer 2(可用10μl移液器移除残留)；

6)保持样品在磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液(可用10μl移液器移除残留)，室温晾干；

7)向PCR管加入30μl Nuclease-free water,从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。

11.Post-PCR反应

11.1实验前准备

1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出Post PCR Buffer、Post PCR Primer(25μM，for ILM)试剂，放置冰上溶解，溶解混匀后置于冰上待用。取出Post PCR Polymerase简短离心后立即使用。

2)捕获后需要对DNA文库进行富集，根据下表配制反应体系：

表-14：Post-PCR体系

成分	体积
		来自步骤10反应结束的样品	30μl
Post PCR Buffer	18μl
		Post PCR Primer(P5和P7)(25μM)	1μl
Post PCR Polymerase	1μl
		总体积	50μl

P5:AATGATACGGCGACCACCGA

P7:CAAGCAGAAGACGGCATACGA

3)将移液器调至40μl，轻轻吸打混匀6次，然后立即置于PCR仪上。

11.2Post-PCR实验

1)运行PCR仪程序：

Heat lid 105℃

95℃维持4min

12个循环：

98℃维持20s

60℃维持30s

72℃维持30s

72℃维持5min

4℃保持。

2)PCR结束后向样品加入55μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器轻轻吸打6次混匀；

3)室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清；

4)移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200μl 80％无水乙醇，静置30s；

5)移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％无水乙醇，静置30s后彻底移除上清(可用10μl移液器移除底部残留酒精)；

6)室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发；

7)加入25μl Nuclease-free water，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min；

8)将PCR管置于磁力架上2min；

9)用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息；

10)取1μl文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μl；

11)取1μl样品使用Agilent 2100Bioanalyzer system(Agilent DNA 1000Kit)进行片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间。

12.上机测序

对步骤11获得的序列进行测序。

13.测序结果分析

通过分析羟甲基化捕获数据，对打断后的基因组样品和人工合成的C片段按照1：10000进行混合建库、捕获和上机测序，实验结果分析过程如下：(1)数据质控过程：使用fastqc对原始测序数据其进行质控，对于接头，低质量值碱基，过短的序列，还有过多N的序列，平均质量值过低的序列等使用cutadapt去除，同时并对clean后的数据进行质控，计算Q20，Q30，QC rate等指标，以此评估clean的状态。(2)序列比对，使用bsmap将clean后的数据比对到对到参考基因组hg19.fa做BS转化后序列上。(3)文库质量评估：使用samtools和bamQC等对比对bam文件进行质控，通过文库平均长度，比对率，捕获效率，区间平均测序深度来评价文库质量。(4)羟甲基化信息获取：使用MethyDackel获取羟甲基化信息。

(1)非羟甲基化位点转化率(TAB)分析：

表-15：TAB与MHE统计结果

样品名	非羟甲基化位点转化率(TAB)	羟甲基化维持率(MHE)
			1	99.11	99.12
2	99.2	99.21
			3	99.21	99.19
4	99.21	99.1

由表-13分析得出，样本1、样本2、样本3和样本4的TAB分别为99.11％、99.2％、99.21％和99.21％，这样的数据表明未发生羟甲基化的C在经过β-GT、TET酶和亚硫酸盐处理后有99％以上的C碱基发生了转化，由C转化为U，测序读取到的对应碱基都是T，TAB计算方法：通过统计测序结果中CG位置发生甲基化的C与CA、CT和CC位置上的C的总个数和发生转化后对应位置转变为T的总个数，计算TAB(％)＝N/(M+N)×100％。N代表C片段上CG位置发生甲基化的C与CA、CT和CC位置上的C转化为T的总个数，M代表C片段上CG位置发生甲基化的C与CA、CT和CC位置上C的总个数。

(2)羟基基化维持率(MHE)分析：

由表-13分析得出样本1、样本2、样本3和样本4的MHE分别为99.12％、99.21％、99.19％、99.1％，这样的数据表明，发生羟甲基化位点碱基C未发生转化，表明β-GT的糖基化作用效率很高，较好地保护了羟甲基化位点不发生转化。MHE计算方法：通过统计通过统计测序结果中CG位置发生羟甲基化的C在经过β-GT、TET酶和亚硫酸盐处理后，不被亚硫酸盐转化C的总个数和被亚硫酸盐转化为U，测序读取到的对应碱基都是T的总个数，计算MHE(％)＝L/K×100％，L代表CG位置发生羟甲基化的C在经过β-GT、TET酶和亚硫酸盐处理后，不被亚硫酸盐转化C的总个数，k代表被亚硫酸盐转化为T的总个数。

(3)羟甲基化捕获率分析：

表-16A组和B组羟甲基化捕获率

由表-14分析得出，通过A和B组对照试验，A组代表封闭试剂为Enhancer，B组代表封闭试剂为cot1，结果表明：A组中样本1、样本2、样本3和样本4的捕获率分别为35.79％、26.62％、27.16％和31.33％，B组样本1、样本2、样本3和样本4的捕获率分别为7.1％、6.5％、8.2％和7.6％；经过优化后的Enhancer有效地提高了羟甲基化文库的捕获率，捕获率都在25％以上，而经过cot1封闭后羟甲基化文库捕获率都在10％以下。其原因在于打断后的基因组DNA经过βGT、TET酶和亚硫酸盐处理后，文库序列上的部分C转变为了T，而cot1只能与高拷贝的基因组序列相结合，而不能有效封闭经过转化后的羟甲基化文库中的高拷贝序列。而优化后的Enhancer在制备过程中，经过了亚硫酸盐的处理，可以与羟基化文库中的高拷贝序列相结合，并且低拷贝的单链已经被去除掉，因此Enhancer可以有针对性地对高拷贝的文库进行封闭，而不会对待捕获文库序列进行封闭。

序列表

<110> 艾吉泰康生物科技（北京）有限公司

<120> 一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法

<130> CF190065S

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 1

atcgggatgc taccgatgcc gatcaatgca atgcatgcat ggaccgatcg acattcggac 60

ctatgacctg caatgcatgg catgatccgc tgacgactga cgtcgattcg gagctagatc 120

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

gatctagctc cgaatcgacg tcagtcgtca gcggatcatg ccatgcattg caggtcatag 60

gtccgaatgt cgatcggtcc atgcatgcat tgcattgatc ggcatcggta gcatcccgat 120

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cac 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatnnnnng tgactggagt tcagacgtgt gctcttccga 60

tct 63

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 7

atcgggatgt tattgatgtc gattaatgta atgtatgtat ggattgattg atattcggat 60

ttatgatttg taatgtatgg tatgattcgt tgatgattga 100

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 8

gatttagttt cgaattgacg ttagttgtta gcggattatg ttatgtattg taggttatag 60

gttcgaatgt tgattggttt atgtatgtat tgtattgatc 100

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 9

agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 10

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 11

caagcagaag acggcatacg a 21

Claims

1.一种DNA羟甲基化目标区域捕获测序方法，所述方法包括：

(1)将DNA样品打断成片段，并分成第一样品和第二样品；

(4)将所述第二样品与接头连接；

(7)对所述混合样品进行探针捕获；

(8)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

2.根据权利要求1的方法，在步骤(4)中在所述第二样品中加入双链序列后再进行接头连接，所述双链序列为：

oligoA：5’-3’

oligoB：5’-3’

*代表羟甲基化位点，&代表甲基化位点。

3.根据权利要求1的方法，在步骤(4)中在连接接头之前有加“A”的步骤。

4.根据权利要求1的方法，所述接头的两条链为，

Hydro-Adapter-1:

GATC*GGAAGAGC*AC*AC*GTC*TGAAC*TC*C*AGTC*AC*

Hydro-Adapter-2:

AC*AC*TC*TTTC*C*C*TAC*AC*GAC*GC*TC*TTC*C*GATC*T。

5.根据权利要求1的方法，在步骤(5)中亚硫酸盐处理后包括扩增步骤，扩增引物为：

TPE1.0：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

TPE2.0：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATindexGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。

6.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，探针设计如下：对于CpG碱基，把C改为C/T这两种简并碱基，探针上CG不超过3个，优选不含CG的序列；CA、CT、CC上的C改为T,其他位置上的A、T和G都按照碱基互补配对原则进行设计。

7.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，所述探针与目标序列互补序列的TM值范围在65℃-85℃。

8.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，所述探针与目标序列互补序列的TM值为75℃。

9.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，探针的长度为90-120nt。

10.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，探针的长度为100nt。

11.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，针对所述双链片段的探针序列分别为：

12.根据权利要求1的方法，在步骤(8)后包括分析测序结果，以如下方式确定羟甲基化位点：羟甲基化水平＝测序结果的到C碱基总数/(测序结果得到C碱基总数+测序结果得到的T碱基总数)。