CN114540474B - 一种基于暗探针技术的ngs靶向捕获方法及其在差异深度测序中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于暗探针技术的NGS靶向捕获方法及其在差异深度测序中的应用。本发明提供了一种同时检测全基因组目的区域范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序方法，包括：根据所述目的区域的核苷酸序列设计能够捕获所述目的区域内全部外显子和全部SNP位点的两组原始探针；两组原始探针中有一组同时存在标记和不标记的两种形式，另一组只存在标记形式；将两组探针按照标记探针比例不同进行配比组合然后与待测基因组文库杂交，得到捕获文库；高通量测序。本发明的暗探针捕获法比标准的外显子测序操作相同的单管反应下根据不同区域的需求控制测序覆盖度，显著提高NGS的数据利用率。本发明的暗探针方法可以作为WGS的高性价比的替代方案。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于暗探针技术的NGS靶向捕获方法及其在差异深度测序中的应用，具体涉及高通量测序文库制备，外显子和SNP位点不同目标区域探针混合比例，单管反应中的差异化捕获和测序方法。
背景技术
目前，在复杂疾病和各类遗传病研究中全外显子高通量测序和基因分型芯片被广泛采用。特别是对于GWAS相关的复杂疾病研究中，SNP基因分型芯片和全外显子测序都扮演者重要的作用。采用SNP基因分型芯片的全基因组关联研究(GWAS)分析方法对于复杂疾病的易感基因筛查取得了前所未有的成就。但是由于大多数芯片上的SNP位于非编码区内，另外基于基因分型芯片设计的GWAS目前着重关注人群中的常见变异，因此，通过GWAS发现的疾病易感位点主要集中在常见变异上，基于传统SNP分型芯片的研究可能会遗漏外显子区域内的稀有变异。因此全外显子测序也逐渐成为复杂疾病易感基因关联研究的重要工具。然而如果对于同一个样本进行基因分型芯片和外显子测序两类检测无疑大幅提高实验成本和分析时间，尤其是大样本量的GWAS研究同时采用这两种方式更不现实。目前能同时检测以上两类信息的手段只有全基因组测序技术(WGS)或者通过全外显子测序(WES)+全基因组分型芯片两种技术结合，WGS的除有价值的主要信息外，还包括其他区域的大量无分析价值数据结果。WGS成本高昂、数据分析量和存储量大。造成这种现象的关键原因是所有的区域都测相同的深度。WGS无法同时满足外显子区域测序高深度，SNP位点区适当测序深度。因此，如果有一种技术能在单次实验中同时实现高测序深度的外显子测序、适当深度的SNP位点测序，将极大的促进目前复杂疾病和遗传病的研究。同时，如果该技术能更好的控制成本，提供更加简便的操作，并且满足各类区域的测序深度差异化的需求，那么，这项技术将会替代传统的SNP分型芯片和普通全外显子测序技术成为相关研究领域的有力工具。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种在单管反应中同时捕获全外显子和SNP位点相关目标区域DNA并用于后续高通量测序(基于NGS的高通量测序)的方法。本发明称之为暗探针捕获技术。该方法可以同时捕获全外显子(WES)和SNP位点相关目标区域，也就是最小全基因组范围内有效测序区域。并能满足外显子区域的高覆盖度，SNP位点的低覆盖度，可以用于复杂疾病的易感基因研究。
第一方面，本发明要求保护一种同时检测全基因组目的区域范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序方法。
本发明所要求保护的同时检测全基因组目的区域范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序方法，可包括如下步骤：
(a1)根据所述目的区域的核苷酸序列设计两组原始探针；
所述两组原始探针分别为能够捕获所述目的区域内全部外显子的捕获探针1，能够捕获所述目的区域内全部SNP位点的捕获探针2。
(a2)制备经标记物标记的原始探针和未经标记物标记的原始探针；
所述经标记物标记的原始探针是指步骤(a1)中所述两组原始探针均经标记物标记；所述未经标记物标记的原始探针是指步骤(a1)中所述两组原始探针中的任一组未经标记物标记。
(a3)将步骤(a2)中所述经标记物标记的原始探针和所述未经标记物标记的原始探针与待测基因组文库进行杂交(在同一管液相中进行)，利用能够与所述标记物相结合的固相载体从杂交产物中分离得到捕获文库。
(a4)将步骤(a3)所得捕获文库进行高通量测序。
进一步地，步骤(a1)中，所述两组原始探针中的各探针在与所述目的区域结合时，探针间呈叠瓦片式，即在所述目的区域上的任何两个相邻的探针均满足上游探针的下游有一个或多个(如2-16个)核苷酸与下游探针的上游重叠(相同)，在与所述目的区域结合时，两个相邻探针的重叠部分会择其一与所述目的区域结合。
进一步地，步骤(a2)中，所述未经标记物标记的原始探针为未经标记物标记的所述捕获探针2。
第二方面，本发明要求保护一种对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法。
本发明所提供的对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法，可包括前文第一方面所述方法中的步骤(a1)-(a3)。
在第一方面和第二方面中，所述目的区域可为全基因组，也可为全基因组中的一部分。
在本发明的具体实施方式中，所述全基因组为人类基因组DNA标准品；具体为人类基因组DNA标准品NA12878。所述捕获探针1为人类全外显子探针，具体为上海赢生物科技有限公司的QuarXeqHuman All Exon Probes 3.0，货号Y1009A(生物素标记)。所述捕获探针2为人类SNP探针，具体为上海迪赢生物科技有限公司的QuarXeq Human SNP Probes 1.0，货号为Y1011A。
在本发明的具体实施方式中，WES探针(即所述捕获探针1)针对的目的区域为使用NCBI Ref-Seq数据覆盖目前已知所有外显子区域；SNP探针(即所述捕获探针2)针对的目的区域为使用多个Genome-wide association study(GWAS)计划数据库交叉分析后覆盖20万个单核苷酸多态性位点(SNP)区域。
在本发明的具体实施方式中，所述标记物为生物素；所述“能够与所述标记物相结合的固相载体”为标记有链霉亲和素的磁珠。所述经标记物标记的原始探针为：经生物素标记的所述捕获探针1(对应实施例中的WES探针)和经生物素标记的所述捕获探针2(对应实施例中的SNP探针)。所述未经标记物标记的原始探针为未经生物素标记的所述捕获探针2(对应实施例中的SNP探针)。
第三方面，本发明要求保护成套探针。
本发明所要求保护的成套探针由前文所述的经标记物标记的原始探针和所述未经标记物标记的原始探针组成。
进一步地，所述成套探针既可为各探针分别独立包装。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
(A1)前文第二方面所述的对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法或利用该方法所获得的捕获文库或前文第三方面所述的成套探针在同时检测全基因组目的区域范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序中的应用。
(A2)前文第三方面所述的成套探针在对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获中的应用。
(A3)前文第一方面所述的同时检测全基因组目的区域范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序方法或前文第二方面所述的对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法或利用前文第二方面所述方法获得的捕获文库或前文第三方面所述的成套探针在如下任一中的应用：
X1)遗传病检测；
X2)制备遗传病检测产品；
X3)癌症检测；
X4)制备癌症检测产品；
X5)全基因组关联分析检测；
X6)制备全基因组关联分析检测产品。
在本发明中，所述高通量测序可为二代测序(基于NGS的高通量测序)。
实验证明：本发明所提供的同时检测全基因组范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序方法比标准的外显子测序操作相同的单管反应下根据不同区域的需求控制测序覆盖度，显著提高NGS的数据利用率。相比全基因组测序的数据量要求更低，测序成本更低。全基因组测序的有用信息基本都包含。因此本发明的暗探针方法可以作为WGS的高性价比的替代方案。在GWAS等复杂疾病的基础研究、消费级基因检测、新生儿遗传病筛查等领域有着广泛的应用价值。
附图说明
图1为使用NA12878标准品作为捕获目标在15Gb的测序数据量情况下，外显子探针(WES)与不同SNP暗探针组合后的区域的覆盖度分布。其中，A为WES+SNP探针组合；B为WES+Dark4探针组合；C为WES+Dark8探针组合；D为WES+Dark16探针组合。
图2为使用NA12878标准品作为捕获目标在15Gb的测序数据量情况下SNP覆盖深度。
图3为捕获结果中，不同覆盖度下WES+SNP二元暗探针和NA12878标准品SNP位点一致性分布。
图4为WES+SNP二元暗探针共捕获时SNP与WES对比测序深度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、WGS所需的全外显子、SNP位点液相捕获探针的制备
1、人类全外显子探针使用上海迪赢生物科技有限公司的QuarXeq Human AllExon Probes 3.0，货号Y1009A(生物素标记)，下文均称为WES。WES探针所述目的区域为使用NCBI Ref-Seq数据覆盖目前已知所有外显子区域。
2、人类SNP探针使用上海迪赢生物科技有限公司的QuarXeq Human SNP Probes1.0，货号为Y1011A。该探针是使用多个Genome-wide association study(GWAS)计划数据库交叉分析后覆盖20万个单核苷酸多态性位点(SNP)的捕获探针，同时包含标准的生物素标记探针和不带生物素标记的暗探针(完全相同的探针，区别只有是否有Botin标记)，带有Biotin标记的探针下文均称为SNP探针。
实施例2、WES探针的浓度调整与配比
对实施例1的两类探针组按照不同浓度和配比进行混合。最终制备出WES所需的探针(WES探针在固定浓度下，调整SNP探针浓度和生物素标记比例，最终产品，WES探针使用300ng，SNP(包含有和没有biotin标记的探针)总量为100ng)，操作如下：
对WES+SNP部分采用暗探针竞争结合方案的优化，取3μL用生物素标记的SNP探针原液(50ng/μL)，加入3μL不带生物素标记的SNP暗探针，混匀后即为命名为SNP-Dark2x，取3μL的SNP-Dark2，加入3μL不带生物素标记的SNP暗探针，混匀后命名为SNP-Dark4x。取3μL的SNP-Dark4，加入3μL不带生物素标记的SNP暗探针，混匀后命名为SNP-Dark8x。取3μL的SNP-Dark8x，加入3μL不带生物素标记的SNP暗探针，混匀后命名为SNP-Dark16x。
实施例3、二元组合式探针(WES+SNP,WES+SNP-Dark4x，WES+SNP-Dark8x，WES+SNP-Dark16x)的液相杂交捕获及测序
1、取200ngNA12878 DNA人类基因标准品(一种人类基因组DNA标准品，CoriellInstitute)进行建库和探针测试优化，文库的构建所用试剂盒为QuarPrep Ultra DNALibrary Kit，货号L1001A，上海迪赢生物科技有限公司。
2、启动Covaris S220 system(一种超声波DNA破碎仪)：确保新鲜的去离子水超过Covaris槽上level12；事先预冷并脱气半小时。加入200ngNA12878 DNA人类基因标准品，并用新鲜的去离子水补全体积到50μl，然后加入到Covaris micro Tube，贴壁慢慢打出液体，小心不要在tube底部产生气泡。
3、在Covaris S220或M220上的超声条件设置如下表1所示。
表1、在Covaris S220或M220上的超声条件
4、将超声产物全部转移至PCR管中，在冰上加入5.7μL的无核酸酶水，9.8μL的末端修复缓冲液(蓝盖1号管)和4.5μL的末端修复酶(蓝盖2号管)，吹打混合均匀。
5、放置于PCR仪上20℃孵育30min，不适用热盖。
6、加入120μL的AMPure磁珠(QuarPrep Ultra DNA Library Kit中的产品)(确保在室温平衡30分钟以上)混合均匀。室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上。
7、放置于磁力架上静置澄清后弃上清液。200μL的80％乙醇(当天配制)，静置1分钟后弃上清。再次加入200μL的80％乙醇(当天配制)，静置30秒后弃上清，快速离心后弃去残余乙醇，室温放置3分钟。
8、磁力架上取下管子，加入42μL的无核酸酶水重悬磁珠，在加入6μL加尾缓冲液(绿盖3号管)和2μL的加尾混合液(绿盖4号管)，用旋涡混匀仪充分混合均匀，30℃孵育30min，不加热盖。加入90μL的纯化结合液(黄盖5号管，室温平衡30分钟)充分混合均匀。纯化步骤同6-7。
9、从磁力架上取下管子，加入29.3μL的无核酸酶水重悬磁珠，在加入15.7μL的连接混合液(橙盖6号管)和5μL的接头混合液(棕盖7号管)。用旋涡混匀仪充分混合均匀。放置于PCR仪上20℃孵育15min，不加热盖，4℃暂存。加入70μL的纯化结合液(黄盖5号管)，纯化步骤同6-7，最后用20μL的无核酸酶水洗脱。
10、在新的PCR管中加入25μL的PCR混合液(粉盖8号管)，5μL的前PCR引物混合液(白盖9号管)和20μL的步骤9的洗脱DNA(QuarPrep Ultra DNA Library Kit中的产品)，混合均匀。按照如下表2所示的PCR条件执行PCR扩增：
表2、PCR条件
11、在PCR管中加入70μL的AMPure磁珠，纯化步骤同6-7，最后用30μL的无核酸酶水洗脱，并使用Qubit或其他测量方法标定产物浓度。
12、取750ng的来自步骤11的Pre-PCR文库，补水至50μl，加入90μlAMPure磁珠进行纯化，纯化步骤同6-7。
13、向晾干的AMPure磁珠中加入7.1μl的封闭液(黄盖16号管)，和5μl的无核酸酶水，振荡混均，简短离心，室温静置2min，放置于磁力架上，待样品澄清，取上清转移到全新的0.2mL PCR管、八连管或96孔板中。混合均匀后放置于PCR仪上，95℃5min，65℃5min，65℃Hold。PCR带热盖模式运行。
14、在1.5mL EP管中制备如下杂交混合液，配制多个反应独立反应体系：依次加入6.9μL杂交液1(浅紫色盖10号管)、3.45μL杂交液2(绿盖11号管)和2.65μL杂交液3(蓝盖15号管)，使用旋涡混匀仪剧烈震荡5秒后快速离心，放置于65℃金属浴或水浴孵育5min。再加入0.5μL的探针保护液(橙盖17号管)和实施例2中制备的某组合捕获探针(WES+SNP，WES+SNP-Dark4x，WES+SNP-Dark8x或WES+SNP-Dark16x)。使用旋涡混匀仪剧烈震荡2秒后快速离心。转移全部18.5μL的杂交探针混合溶液到步骤13的文库混合液中(一直保持在PCR仪上操作)，轻轻吹打10次。密封好管盖，在65℃杂交16-24小时。
15、杂交混合液65℃孵育约16-24小时后，继续进行实验。实验前将洗液3(橙盖14号管)放置65℃金属浴预热(每个样本需要600μl)。然后，在漩涡震荡器上震荡混匀已室温平衡30分钟以上的DynabeadsMyOne Streptavidin T1磁珠(QuarPrep Ultra DNA LibraryKit中的产品)，每个反应吸取50μl DynabeadsMyOne Streptavidin T1磁珠到1.5mlLoBind管中。加200μl的洗液1(棕盖12号管)；在漩涡振荡器上震荡5秒钟，充分混匀磁珠，快速离心；把管子放在磁力架上；去除上清液；重复上述磁珠清洗步骤总共3次清洗；最后用200μl的洗液1(棕盖12号管)重悬磁珠，室温放置待用。
16、确保步骤14的反应剩余杂交体系体积不低于20μL，然后直接在PCR仪上打开PCR管，将杂交混合液吸出，加入到步骤15所得磁珠混悬液中，震荡混匀5秒。室温将管子放置在垂直旋转器上旋转孵育30分钟。从旋转器上取下1.5ml LoBind管，简短离心后，放置磁力架5分钟，待液体清澈后，吸走上清。加200μl的洗液2(黄盖13号管)来重悬磁珠，在振荡器上混匀5秒钟，室温孵育15分钟，每间隔5分钟，在漩涡振荡器上振荡一次。
17、简短离心后，放置磁力架，待液体清澈后，吸走上清液。放置65℃的金属浴或PCR仪上，马上加200μl的在步骤15预热好的洗液3(橙盖14号管)，在金属浴上吹吸10次使磁珠完全混匀，65℃孵育10分钟。简短离心，快速放置磁力架上，液体清流澈后立刻吸走上清。此处注意操作要尽快，以免液体温度下降过多。重复上述65℃磁珠清洗步骤总共3次清洗。最后一次吸走上清后再简短离心，再用20μL的移液器吸走残余液体。
18、确保步骤17没有残余液体后，加40μL无核酸酶水重悬磁珠，上下吹打均匀后取19μL磁珠悬液加入新的PCR管，剩余部分暂时放-20℃保存。在19μL的磁珠混悬液中加入25μL的PCR混合液(粉盖8号管)，1μL的后PCR引物混合液(粉盖18号管)和5μL的Index引物(QuarPrep Ultra DNA Library Kit中的产品)(无标记白盖or 96孔板)。上下吹打混合均匀，注意不要快速离心。放置于PCR仪上，按照如下表3所示PCR条件执行PCR扩增。
表3、PCR条件
19、将50μL混匀AMPure XP磁珠(QuarPrep Ultra DNA Library Kit中的产品)加入PCR反应管中，纯化步骤同6-7，最后用30μL的Low TE缓冲液(QuarPrep Ultra DNALibrary Kit，中的产品)洗脱，得到纯化产物，即捕获后文库。
20、将步骤19得到的纯化产物上机测序，使用Illumina公司HiSeq X Ten NGS平台进行测序，采用2×150bp双端测序模式。测序数据量应大于10Gb(15Gb最佳)。
21、利用FastQC，BWA-MEM，GATK等软件进行数据分析，计算整体捕获效率、整体覆盖度分布曲线、外显子、SNP位点相关目标区域的不同覆盖深度、外显子SNP和NA12878标准结果的一致性、WES相关SNP和NA12878标准结果的一致性，得到相应图表。
结果如图1至图4所示。
图1为使用NA12878标准品作为捕获目标在15Gb的测序数据量情况下，外显子探针(WES)与不同SNP暗探针组合后的区域的覆盖度分布。通过对比不同比例的暗探针可发现，本发明提出的暗探针方案可在不影响WES性能情况下，降低SNP探针的测序深度。
图2为使用NA12878标准品作为捕获目标在15Gb的测序数据量情况下SNP覆盖深度。由图可见，SNP位点测序深度随着暗探针比例升高而降低，达到设计预期。
图3为捕获结果中，不同覆盖度下WES+SNP二元暗探针和NA12878标准品SNP位点一致性分布。通过对比可见，本发明提出的暗探针方案可以在低测序深度区域，通过调节暗探针比例，降低测序深度的同时，取得86％-98％的一致性。
图4为WES+SNP二元暗探针共捕获时SNP与WES对比测序深度。通过对比可见，本发明提出的暗探针方案可以有效并线性的降低SNP位点相对于WES的测序深度，达到理论设计预期。
Claims (8)
1.一种同时检测全基因组目的区域范围内外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序方法，包括如下步骤：
（a1）根据所述目的区域的核苷酸序列设计两组原始探针；
所述两组原始探针分别为能够捕获所述目的区域内全部外显子的捕获探针1，能够捕获所述目的区域内全部SNP位点的捕获探针2；
（a2）制备经标记物标记的原始探针和未经标记物标记的原始探针；
所述经标记物标记的原始探针是指步骤（a1）中所述两组原始探针均经标记物标记；所述未经标记物标记的原始探针为未经标记物标记的所述捕获探针2；
（a3）将步骤（a2）中所述经标记物标记的原始探针和所述未经标记物标记的原始探针与待测基因组文库进行杂交，利用能够与所述标记物相结合的固相载体从杂交产物中分离得到捕获文库；
（a4）将步骤（a3）所得捕获文库进行高通量测序；
所述方法为非疾病诊断治疗方法；
步骤（a1）中，所述两组原始探针中的各探针在与所述目的区域结合时，在所述目的区域上的任何两个相邻的探针均满足上游探针的下游有一个或多个核苷酸与下游探针的上游重叠；
所述目的区域为全基因组。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述全基因组为人类基因组DNA标准品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述人类基因组DNA标准品为人类基因组DNA标准品NA12878。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标记物为生物素；所述固相载体为标记有链霉亲和素的磁珠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述经标记物标记的原始探针为：经生物素标记的所述捕获探针1和经生物素标记的所述捕获探针2；所述未经标记物标记的原始探针为未经生物素标记的所述捕获探针2。
6.一种对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法，包括权利要求1-5任一所述方法中的步骤（a1）-（a3）。
7.成套探针，由权利要求1-6任一中所述的经标记物标记的原始探针和所述未经标记物标记的原始探针组成。
8.如下任一应用：
（A1）权利要求6所述的对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法或利用该方法所获得的捕获文库或权利要求7所述的成套探针在同时检测全基因组目的区域范围外显子和SNP位点的靶向捕获高通量测序中的应用；所述应用为非疾病诊断治疗性应用；
（A2）权利要求7所述的成套探针在对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获中的应用；
（A3）利用权利要求6所述的对全基因组目的区域范围内全部外显子和SNP位点进行差异捕获的方法获得的捕获文库或权利要求7所述的成套探针在如下任一中的应用：
X1）制备遗传病检测产品；
X2）制备癌症检测产品；
X3）制备全基因组关联分析检测产品。
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