CN113186265A - 一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long‑range PCR方法及试剂盒。其方法包含：步骤1.基因组DNA提取，步骤2.LR‑PCR法特异性扩增CYP2D6基因，步骤3.扩增产物纯化，步骤4.产物文库构建。相对于多重PCR检测，该检测方法无需设计特别多对的引物，而且在PCR过程中减少非特异性条带的扩增，有效的对多态性变异条带进行了富集。在本发明引物扩增条件下，扩增出结果的条带清晰、单一。与定制化芯片杂交捕获技术相比，Long‑rangePCR可以明显缩短时间，大大降低成本。

Description

一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法 及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测CYP2D6基因多态性变 异的Long-range PCR方法、引物组及试剂盒。
背景技术
CYP2D6代谢酶是细胞色素P450家族中的成员之一,细胞色素P450蛋白 是一种单加氧酶，催化许多参与药物代谢和合成胆固醇、类固醇和其他脂质 的反应。这种蛋白质定位于内质网，代谢多达25％的常用药物。其底物包括 抗抑郁药，抗精神病药，镇痛药和抗毒药，β肾上腺素能阻滞剂，抗心律失常 药和止吐药。CYP2D6在所有参与药物代谢的细胞色素P450基因家族中是唯 一不能被诱导的酶，这种酶具有广泛的多态性且这种多态性对酶的药物代谢 功能具有重要影响。CYP2D6的这种多态性和药物代谢功能所表现的对个体活 性的差异在遗传药理学上具有重要意义。
CYP2D6代谢酶参与的多种药物代谢，如肾上腺素受体阻断剂普萘诺尔， 美托诺尔等；抗心律失常药普罗帕酮，抗抑郁药文法拉辛，氟西汀等；抗精 神失常药氟哌啶醇，奋乃静等及多种其他常见药物的代谢。CYP2D6代谢酶对 药物使用过程中造成的个体差异及不良反应的这种现象，是由CYP2D6基因 调控的。
CYP2D6基因位于22号染色体短臂，编码9个外显子。该基因在人类群 体中高度多态；某些等位基因导致代谢者表型差，其特征是代谢酶底物的能 力下降。一些代谢表型差的个体由于在该基因存在变异导致机体没有功能蛋 白。该基因拷贝数的变化也可导致不同的代谢表型，具有超快代谢表型的个 体可以有3个或更多的基因活性拷贝。目前已经有两百多个变异或多态性位 点被证实与药物有关。
目前大多数检测CYP2D6基因药物代谢产品及技术主要是检测通过常规PCR技术检测一个或几个常见的多态性位点，检测位点的通量较低，而随着 研究及技术的深入越来越多的位点变异或多态性将被证实与药物代谢相关。 液相杂交芯片的成本高，不适宜推广应用。且该基因部分区域在基因组上存 在高度同源区域，针对这部分区域内的位点单独设计引物或者探针进行检测 时，容易被基因组同源区域所干扰，从而影响结果的判定与解读。且目前大 部分检测产品都对待测样本起始DNA量要求较高。
中国专利201611107790.9公开了一种用于快速检测CYP2D6基因多态性的 核酸、试剂盒及方法，具体用于对CYP2D6*10基因C100T和G4268C、 CYP2D6*14基因G1758A的位点多态性进行检测，但并未对全基因序列进行扩 增检测，无法更全面准确的评估变异风险。本发明提供用实时荧光定量PCR快 速检测CYP2D6基因多态性的检测试剂盒能够用于临床多种类型样本的检测， 以便对疾病进行及时、有针对性的治疗或预防，降低医疗成本，节约社会资源。
发明内容
为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于，提供一种能够用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法，该方法可对全基因序列进行扩 增检测，能更全面准确的评估变异风险，以便进行及时、有针对性的治疗或预防， 降低医疗成本，节约社会资源。
本发明采用如下的技术方案：
一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法，所述方法 包括：步骤1.基因组DNA提取、步骤2.LR-PCR法特异性扩增CYP2D6基因、 步骤3.扩增产物纯化和步骤4.产物文库构建；
所述步骤1.提取待测样本的基因组DNA，所述待测样本类型包括：血液、 组织、唾液、口腔拭子或毛发，并测定浓度；
所述步骤2.以测定浓度的待测样本基因组DNA为PCR模板，以如下引 物组为PCR引物：Forward Primer:CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT，
Reverse Primer:TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC，
按照如下体系配置反应：
Figure BDA0002944637670000031
将所配置的PCR反应体系充分涡旋震荡混匀并短暂离心后，将PCR管 放置于PCR仪上，运行PCR程序。
Figure BDA0002944637670000032
优选地，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳质检：配置0.5％琼脂糖凝 胶，取产物2μl进行电泳，电压120V，电泳时间40分钟。
优选地，所述步骤3.扩增产物纯化，将质检合格的PCR扩增产物用贝克 曼AmpureXP磁珠进行纯化，得到纯化后的长片段产物并进行浓度测定，用 于后续文库构建。
优选地，所述步骤4.产物文库构建，将步骤3得到的纯化产物进行高通量 测序文库构建，步骤为：1)片段化；2)末端修复；3)连接接头和4)文库PCR 放大。
优选地，所述步骤1)片段化：将纯化产物100-300ng，使用如下体系及程 序进行片段化：
Figure BDA0002944637670000041
配置的反应体系管置于37℃恒温金属浴或者PCR仪内孵育20min，反应 完成后立即用1.8X Ampure XP磁珠进行纯化，加30μL Nuclease-Free H2O得 到纯化后的终产物。
优选地，所述步骤2)末端修复：片段化产物按照如下反应体系进行末端修 复，配置完成后置于PCR仪运行37℃25分钟，65℃失活20分钟，4℃保存。
Figure BDA0002944637670000042
优选地，所述步骤3)连接接头：按照如下反应体系配置连接接头反应体 系，配置好的反应在室温反应25分钟后，进行产物纯化，得到纯化后的连接 接头产物。
Figure BDA0002944637670000043
优选地，所述步骤4)文库PCR放大：按照如下反应体系配置PCR反应 体系。
Figure BDA0002944637670000051
按照如下设置PCR程序，反应完成的产物进行磁珠纯化，并测定浓度， 用于上机测序。
Figure BDA0002944637670000052
本发明还提供用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR引物组， 所述引物组为：
Forward Primer:CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT
Reverse Primer:TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC
本发明还提供用于上述检测方法的CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR试剂盒，所述试剂盒包括所述PCR引物、高保真Phanta酶、片段化酶、末 端修复酶、连接酶、扩增酶mix和缓冲液。
具体地，所述试剂盒包括扩增酶混合液，扩增缓冲液，扩增引物混合液及阳 性对照样品。扩增酶混合液组成包括，高保真聚合酶，扩增酶混合液中酶的浓度 为1U/μL，dNTP及酶稀释液；扩增缓冲液中包含100mM+Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、 15mM Mg2+，甜菜碱，500mM KCl；扩增引物混合液包括特异性扩增CYP2D6 基因的正向引物及反向引物各10μM，溶解于lowTE缓冲液中。阳性对照样品为 含CYP2D6基因全长的载体质粒，包含CYP2D6*2(886C>A)多态性位点。
本发明的检测方法中，产物片段化方法可以为物理打断法，也可以为酶切打 断法，具体方法根据检测平台的适应性而定。
本发明的检测方法中，测序技术不仅限制于二代测序技术(二代测序平台也 不限制，如life平台，华大平台，illimina平台等)，也可以为一代测序技术或者 三代测序技术，如PacBio，Nanopore等平台。文库构建方法根据不同的测序平 台采用不同的建库方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.相对于多重PCR检测，本发明检测方法无需设计特别多对的引物，而且 在PCR过程中减少非特异性条带的扩增，有效的对多态性变异条带进行了富集。
2.在本发明引物扩增条件下，扩增出结果的条带清晰、单一。
3.与定制化芯片杂交捕获技术相比，本发明Long-range PCR可以明显缩短 时间，时间缩短了60％以上，成本也大大降低了。
附图说明
图1 CYP2D6基因全长扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图中，从左向右为Lane1：15000bpmarker,Lane2：CYP2D6基因全长产物。
图2安捷伦2100分析仪检测文库片段大小分布图。
具体实施方式
为了使得本发明更清楚明晰，以下结合附图和实施例对本发明做进一步阐述。 这些实施例仅用于解释说明本发明，并不用于限定本发明。
实施例1用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法
1.引物设计
在NCBI或者UCSC上提取CYP2D6基因上下游及附近序列，用Primer5.0 设计特异性扩增引物，正向引物为CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT，反应引物为 TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC，其他特异性扩增产物也使用于本专利。对 设计好的特异性引物经过巢氏PCR结合sanger测序验证引物特异性扩增 CYP2D6基因。
2.DNA提取
对收集临床样本进行DNA提取，提取方法可以为磁珠提取法，也可以为商 用的过柱提取法。提取的DNA通过ThermoNanoDrop微量紫外分光光度计或者 Qubit荧光计进行浓度质检，NanoDrop测定的A260/A280比值应在1.8-2.0之间， A260/A230的比值应为2.0以上。
3.Long-PCR扩增体系50ul反应体系
按照以下体系配置Long-PCR扩增体系，以高保真Phanta酶为扩增酶，加入 4M甜菜碱增强扩增特异性。(见表1)
表1
Figure BDA0002944637670000071
将所配置的PCR反应体系充分涡旋震荡混匀并短暂离心后，将PCR管放置于 PCR仪上，运行PCR程序，反应完成的PCR产物可以在4℃暂存；(见表2)
表2
Figure BDA0002944637670000072
4.琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化
配置0.5％浓度的琼脂糖凝胶块，将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并 切胶纯化，纯化的产物进行hermoNanoDrop微量紫外分光光度计或者Qubit荧光计 进行浓度质检，测定产物浓度。
5.将纯化后产物按照0.1-0.3ug起始量进行文库构建。
5.1样本打断：
纯化好的DNA片段按照以下体系配置片段化反应，将长片段产物打断为小 片段DNA。充分吹打混匀，时离心将反应液收集至管底。随后放置PCR仪中，37℃ 20分钟，反应结束后加入36μL Ampure XP磁珠进行磁珠纯化，用无核酸酶水洗 脱，洗脱体积为30ul。(表3)
表3
Figure BDA0002944637670000081
5.2.末端修复(End Repair)及末端加“A”(A-Tailing)
向上一步纯化好的片段化产物中按以下反应体系加入片段化酶及缓冲液，充 分混匀，配置完成后置于PCR仪运行37℃25分钟，65℃失活20分钟，4℃保 存；(见表4)
表4
Figure BDA0002944637670000082
5.4.Adapter的连接(Adapter Ligation)
向上一步末端修复的产物中加入连接酶及缓冲液及华大平台接头，使总体积 为100uL，配置完成后室温反应25分钟左右，立即加入50ul Ampure XP磁珠，进 行磁珠纯化，最后加入20uL无核酸酶水洗脱。(见表5)
表5
Figure BDA0002944637670000091
5.5.PCR反应
向上一步纯化好的PCR产物中加入扩增酶及引物进行文库放大反应。(见表 6)
表6
Figure BDA0002944637670000092
按照如下设置PCR程序。(见表7)
表7
Figure BDA0002944637670000093
Figure BDA0002944637670000101
5.6.PCR产物的回收纯化
反应完成的产物参照以下步骤进行产物回收：提前30min取出AmpureXP置 于室温，使用前充分震荡混匀。置于室温，使用前充分震荡混匀。置于室温，使 用前充分震荡混匀。吸取50μL AmpureXP至上步PCR产物中，充分混匀，室温孵 育5min。瞬时离心，将离心管置于磁力架2-5min至液体澄清，用移器小心吸取并 丢弃上。保持离心管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及 管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清。重复清洗1次，尽量吸干管内液体，有少 残留在壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底 体吸干。保持离心管固定于磁力架上打开离心管管盖，室温干燥直至磁珠表面无 反光、开裂。将离心管从磁力架上取下，加入32μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻吸打至少10次至完全混匀。室温下孵育5min。瞬时离心，将离心管置于 磁力架上，静置2-5min至液体澄清至液体澄清，将30μL上清液转移到新的上清液 转移到新的1.5mL离心管。
5.7.文库定量
使用
Figure BDA0002944637670000102
dsDNA HS Assay Kit荧光定量试剂盒，按照定量的操作说明对 PCR纯化后产物进行定量。最终文库浓度在1-20ng/ul。
5.8.上机测序检测
构建好的文库在华大MGISEQ-2000平台进行上机测序检测。下机数据进行 生物信息学分析。(见表8)
表8 CYP2D6基因检测NGS下机数据质量
测序数据量 平均测序深度 CYP2D6基因覆盖度 测序均一性
1M Reads 1000X 100％ 97％
实施例2用于本发明检测方法的CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR试 剂盒及其使用范例
对收集到待检患者样本的口腔拭子样本进行基因组DNA提取，提取的DNA 质检及浓度测定后用CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR试剂盒进行 CYP2D6基因全长扩增。
取待测样本的基因组DNA1～50ng按照以下体系配置反应液，同时取阳性对 照样本DNA 20ng进行平行实验。
Figure BDA0002944637670000111
将所配置的PCR反应体系充分涡旋震荡混匀并短暂离心后，将PCR管放 置于PCR仪上，运行PCR程序。
Figure BDA0002944637670000112
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳质检：配置0.5％琼脂糖凝胶，取产物 2μl进行电泳，电压120V，电泳时间40分钟，待测样本应与阳性对照样品在电 泳图上呈现相同条带大小及亮度的PCR产物。
将质检合格的PCR扩增产物用贝克曼Ampure XP磁珠进行纯化，得到纯化 后的长片段产物并进行浓度测定，用于后续文库构建。文库构建方法根据测序技 术对应的平台进行选择。
如选择高通量测序平台则将得到的纯化产物按照步骤：1)片段化；2)末端修 复；3)连接接头和4)文库PCR放大进行高通量测序文库构建。构建好的文库 按照对应平台的文库质检，合格后进行上机测序，并分析检测数据。其中阳性样 本应检出CYP2D6*2(886C>A)位点。
本发明申请人结合说明书附图对本发明的实施示例做了详细的说明与描述， 但是本领域技术人员应该理解，以上实施示例仅为本发明的优选实施方案，详尽 的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限 制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明 的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-rangePCR引物组，其特征在于，所述引物组为：
Forward Primer:CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT
Reverse Primer:TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC。
2.一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1.基因组DNA提取、步骤2.LR-PCR法特异性扩增CYP2D6基因、步骤3.扩增产物纯化和步骤4.产物文库构建；
所述步骤1.提取待测样本的基因组DNA，所述待测样本类型包括：血液、组织、唾液、口腔拭子或毛发，并测定浓度；
所述步骤2.以测定浓度的待测样本基因组DNA为PCR模板，以如下引物组为PCR引物：Forward Primer:CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT，
Reverse Primer:TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC；
按照如下体系配置反应：
Figure FDA0002944637660000011
将所配置的PCR反应体系充分涡旋震荡混匀并短暂离心后，运行PCR程序。
Figure FDA0002944637660000012
Figure FDA0002944637660000021
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳质检：配置0.5％琼脂糖凝胶，取产物2μl进行电泳，电压120V，电泳时间40分钟。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，
所述步骤3.扩增产物纯化：
将质检合格的PCR扩增产物用贝克曼Ampure XP磁珠进行纯化，得到纯化后的长片段产物并进行浓度测定，用于后续文库构建。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，
所述步骤4.产物文库构建：将步骤3得到的纯化产物进行高通量测序文库构建，步骤为：1)片段化；2)末端修复；3)连接接头和4)文库PCR放大。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，
所述步骤1)片段化：将纯化产物100-300ng，使用如下体系及程序进行片段化：
Figure FDA0002944637660000022
配置的反应体系管置于37℃恒温金属浴或者PCR仪内孵育20min，反应完成后立即用1.8X Ampure XP磁珠进行纯化，加30μL Nuclease-Free H2O得到纯化后的终产物。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，
所述步骤2)末端修复：
片段化产物按照如下反应体系进行末端修复，配置完成后置于PCR仪运行20℃25分钟，65℃失活20分钟，4℃保存。
Figure FDA0002944637660000031
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，
所述步骤3)连接接头：
按照如下反应体系配置连接接头反应体系，配置好的反应在室温反应25分钟后，进行产物纯化，得到纯化后的连接接头产物。
Figure FDA0002944637660000032
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，
所述步骤4)文库PCR放大：
按照如下反应体系配置PCR反应体系。
Figure FDA0002944637660000033
按照如下设置PCR程序，反应完成的产物进行磁珠纯化，并测定浓度，用于上机测序。
Figure FDA0002944637660000041
10.一种用于权利要求2-9所述检测方法的CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR试剂盒，其特征在于,所述试剂盒包括所述PCR引物、高保真Phanta酶、片段化酶、末端修复酶、连接酶、扩增酶mix和缓冲液。
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