CN110592078A - 一种用于牛性状扩增子测序的引物组 - Google Patents

一种用于牛性状扩增子测序的引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于牛性状扩增子测序的引物组。本发明提供的引物组合由序列表的序列1至序列210所示的单链DNA组成。本发明的发明人基于扩增子测序的特点和优势，对牛的相关性状进行引物设计，通过引物序列靶向地捕获目标区域，进而进行牛相关性状检测。此项技术能够节约大量的时间和成本，反应重数高，测序深度高进而准确性高，靶向地检测、验证和筛选遗传变异。基于此项技术得到的引物组能够准确进行牛优良品种选育。

Description

一种用于牛性状扩增子测序的引物组
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于牛性状扩增子测序的引物组。
背景技术
扩增子测序是一种高靶向性的目标区域测序方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异，通过PCR产物(扩增子)的超高深度测序可以有效地识别和分析变异特征。扩增子测序利用设计的引物序列靶向地捕获目标区域，然后进行高通量测序(NGS)，分析测序结果，得到相应信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于牛性状扩增子测序的引物组。
本发明首先保护引物组合，由序列表的序列1至序列210所示的单链DNA组成。
所述引物组合中，每条引物的摩尔浓度可相同。每条引物的摩尔浓度具体可为0.2μM。
所述引物组合的用途为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
本发明还保护引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
以上任一所述测序文库为扩增子测序文库。
以上任一所述检测牛性状相关SNP位点基因型通过扩增子测序实现。
以上所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
以上所述试剂盒还包括构建测序文库所需的其他试剂。
本发明还保护一种扩增子测序文库的构建方法，包括如下步骤：采用所述引物组合对待测样本核酸进行多重PCR扩增，将扩增产物进行末端修复、接头连接和连接产物PCR扩增后得到所述扩增子测序文库。
所述末端修复、接头连接和连接产物PCR扩增可使用商购文库构建试剂盒实现。本发明的实施例中，采用MGIEasy DNA文库制备试剂盒制备测序文库。
本发明还保护一种检测牛性状相关SNP位点基因型的方法，包括如下步骤：按照前文所述方法制备扩增子测序文库；对所述扩增子测序文库进行测序，得到牛性状相关SNP位点基因型。
以上任一所述牛性状相关SNP位点信息见表1。
本发明还保护所述引物组合或所述试剂盒或所述方法在牛性状检测中的应用。
本发明还保护所述引物组合或所述试剂盒或所述方法在牛品种选育中的应用。
以上任一所述牛性状具体可包括身体性状、生殖性状、疾病性状或生产性状。
本发明建立的方法和适用于Illumina测序平台(Illumina MiSeq基因测序仪)或华大测序平台(MGISEQ-2000基因测序仪)。
本发明的发明人基于扩增子测序的特点和优势，对牛的相关性状进行引物设计，通过引物序列靶向地捕获目标区域，进而进行牛相关性状检测。此项技术能够节约大量的时间和成本，反应重数高，测序深度高进而准确性高，靶向地检测、验证和筛选遗传变异。基于此项技术得到的引物组能够准确进行牛优良品种选育。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于牛性状扩增子测序的引物组的制备
对牛基因组(UMD3.1版本)进行大量序列分析和功能分析，筛选105个牛性状相关SNP位点，并对其进行扩增子引物设计，设计的引物经过大量筛选，得到用于牛性状扩增子测序的引物组(由105对引物组成)，如表1所示。表1中所示位点为与牛的身体性状、生殖性状、疾病性状或生产性状相关的位点，例如：编号为2的位点(18_58067310)为奶牛产犊性状相关位点；编号为77的位点(26_42807171)为牛脂肪和脂肪酸代谢性状相关位点；编号为34的位点(27_2620088)为牛成年体重性状相关位点。
表1
实施例2、牛性状扩增子测序
一、建库及测序
1、将实施例1中的各条引物采用水或TE缓冲液溶解后配置为10×储存液(存储液中，每条引物的浓度为0.2μM)。
2、提取待测牛离体血液样本的基因组DNA，并采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒(Thermo Fisher)对基因组进行定量。
3、采用多重PCR进行扩增反应。PCR反应体系见表2。PCR反应程序见表3。
表2
步骤1制备的引物混合液 8μL
步骤2提取的牛基因组DNA模板 50ng
RNase-free water(NF water) 根据其他组分调整体积
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 20μL
总计 40μL
表3
4、磁珠(Vazyme)片段筛选去除扩增产物的杂质、基因组片段及引物二聚体，纯化产物。
5、末端修复及接头连接
(1)50ng步骤4的纯化产物到PCR管中，补充TE buffer至总体积40μL，得到样本溶液。配置末端修复反应混合液，将反应混合液的PCR管置于PCR仪上进行末端修复。末端修复反应体系见表4(MGIEasy DNA文库制备试剂盒)。末端修复反应条件见表5。
表4
表5
温度 时间
热盖(105℃) On
37℃ 30min
65℃ 15min
4℃ Hold
(2)完成步骤(1)后，向PCR管中加入5μL Adapter Mix(MGIEasy DNA文库制备试剂盒)，得到含有接头的DNA样本溶液。按照试剂盒说明书配置接头连接反应体系(表6)并进行接头连接反应。
表6
(3)完成步骤(2)后，向PCR管中加入20μL TE buffer至体积为100μL，并将产物全部转移至新的1.5mL EP管中。
6、取步骤5的产物，配置PCR反应液，进行PCR反应。
PCR反应体系见表7(MGIEasy DNA文库制备试剂盒)。PCR反应程序见表8。
表7
表8
7、完成步骤6后，使用磁珠(Vazyme)纯化产物，得到测序文库。
8、分别使用华大平台(MGISEQ-2000基因测序仪)和Illumina平台(IlluminaMiSeq基因测序仪)进行测序。
二、测序数据分析
1、数据过滤
对测序数据按照如下三个条件进行过滤：
(1)(Q＜＝5)碱基数超过该条read碱基数的50％时，去除此paired reads；
(2)去除N含量＞1％的reads；
(3)去除含有接头的reads。
在过滤时设定reads的最小长度，最小长度比最短PCR产物短5-10bp。
2、比对
采用bwa软件将测序结果比对到牛基因组(UMD3.1版本)。
比对后统计测序深度及覆盖度等信息。
3、变异检测
使用GATK软件进行变异情况分析，分为如下两种情况：
(1)已知位点基因型，直接进行比较，统计分型一致性。
(2)位点基因型未知，使用来自相同个体的不同样本进行相互比较，统计分型一致性。
对于某些位点，本身不存在变异，call变异时没有结果，如果来自相同个体的不同样本均没有该位点数据，默认分型均为0/0，一致性为100％。
三、下机数据分析
对下机数据进行数据质控分析、MAP率统计，均一化统计分析，来验证引物组的可用性。
1、质控结果
两个平台的质控结果统计见表9。
表9
结果显示，牛411重扩增子引物组的产物GC含量在50％左右，碱基分布均衡。
对于二代测序，一般要求达到Q20的碱基比例＞95％(最差＞＝90％)，Q30的碱基比例＞85％(最差＞＝80％)。本次数据的Q20和Q30数值达到数据分析的要求，分析结果可信。
一个read(读长)指一条测序结果，华大平台分析的有效reads数在97％以上，illumina平台的有效reads数在99％以上，无效信息较少。
2、MAP table
Map的含义是比对到基因图上的reads，可指示出reads属于的基因类型及每一个基因的片段数量，统计结果见表10。
表10
结果显示，华大平台和illumina平台分析的比对率和有效比对率均值均在90％以上，测出基因序列大范围的覆盖到了基因图上。
3、样本均一化统计
测序深度＞中位数(Median)*10％或者测序深度＞中位数(Median)*20％的比率数值可以说明测序深度是否均一，测序深度均一性是衡量的扩增效果的一种指标。统计结果见表11。
表11
结果显示，411重扩增子大于中位数20％的位点平均比例均在80％左右，能够提现出测序深度的均一性。
4、位点测序深度统计
数据统计结果显示，华大平台的位点检出率为100％，样本平均测序深度为30k，高于200x的位点占比为99.06％；illumina平台位点检出率为100％，样本平均测序深度为18.8k，高于200x的位点占比为99.06％。
5、基因型分型一致性分析
经过分析Illumina平台测序结果，基因型分型一致性为99.76％；华大平台测序结果，基因型分型一致性为99.29％。
上述结果说明，本发明提供的引物组可以用于牛性状相关位点的检测，全部位点均可检出，扩增子单端测序方法可行，同时适用两个测序平台。

Claims (10)

1.引物组合，由序列表的序列1至序列210所示的单链DNA组成。
2.权利要求1所述的引物组合的应用，为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
3.权利要求1所述的引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
4.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(a1)或(a2)：
(a1)构建测序文库；
(a2)检测牛性状相关SNP位点基因型。
5.如权利要求2或3所述的应用，或，权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
所述测序文库为扩增子测序文库；
和/或
所述检测牛性状相关SNP位点基因型通过扩增子测序实现。
6.权利要求4或5所述的试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
7.一种扩增子测序文库的构建方法，包括如下步骤：采用权利要求1所述的引物组合对待测样本核酸进行多重PCR扩增，将扩增产物进行末端修复、接头连接和连接产物PCR扩增后得到所述扩增子测序文库。
8.一种检测牛性状相关SNP位点基因型的方法，包括如下步骤：按照权利要求7所述的方法制备扩增子测序文库；对所述扩增子测序文库进行测序，得到牛性状相关SNP位点基因型。
9.权利要求1所述的引物组合，或，权利要求4或5所述的试剂盒，或，权利要求7或8所述的方法在牛性状检测中的应用。
10.权利要求1所述的引物组合，或，权利要求4或5所述的试剂盒，或，权利要求7或8所述的方法在牛品种选育中的应用。
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Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101906479A (zh) * 2010-09-07 2010-12-08 西北农林科技大学 一种用zbtb38基因检测黄牛体型大小的方法
CN102676514A (zh) * 2012-05-30 2012-09-19 中国农业大学 与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的snp标记及其应用
CN104619863A (zh) * 2012-07-13 2015-05-13 生命技术公司 采用一组snp的人身份识别
CN104694663A (zh) * 2015-04-13 2015-06-10 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 Brca基因易感snp位点检测组合物
CN104711368A (zh) * 2015-04-13 2015-06-17 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒
CN104894279A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 α-地中海贫血基因突变检测试剂盒
CN105368930A (zh) * 2015-10-13 2016-03-02 中国农业大学 测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法
CN106399535A (zh) * 2016-10-19 2017-02-15 江苏苏博生物医学股份有限公司 一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法
CN106967723A (zh) * 2017-02-23 2017-07-21 广西壮族自治区水牛研究所 与水牛泌乳相关基因scap及其作为分子标记的应用
CN107099607A (zh) * 2017-06-12 2017-08-29 山东省农业科学院奶牛研究中心 一套同时检测93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的引物组合及试剂盒
CN107119046A (zh) * 2017-04-19 2017-09-01 中山大学 一种母血浆游离dna文库的构建方法以及父源等位基因的分型方法
CN108060261A (zh) * 2018-01-30 2018-05-22 袁隆平农业高科技股份有限公司 一种对玉米snp标记组合进行捕获测序的方法及其应用
CN109112211A (zh) * 2018-05-15 2019-01-01 广州达瑞生殖技术有限公司 一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的引物组合及方法

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101906479A (zh) * 2010-09-07 2010-12-08 西北农林科技大学 一种用zbtb38基因检测黄牛体型大小的方法
CN102676514A (zh) * 2012-05-30 2012-09-19 中国农业大学 与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的snp标记及其应用
CN104619863A (zh) * 2012-07-13 2015-05-13 生命技术公司 采用一组snp的人身份识别
CN104694663A (zh) * 2015-04-13 2015-06-10 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 Brca基因易感snp位点检测组合物
CN104711368A (zh) * 2015-04-13 2015-06-17 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒
CN104894279A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 α-地中海贫血基因突变检测试剂盒
CN105368930A (zh) * 2015-10-13 2016-03-02 中国农业大学 测序基因分型技术中测序酶切组合的确定方法
CN106399535A (zh) * 2016-10-19 2017-02-15 江苏苏博生物医学股份有限公司 一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法
CN106967723A (zh) * 2017-02-23 2017-07-21 广西壮族自治区水牛研究所 与水牛泌乳相关基因scap及其作为分子标记的应用
CN107119046A (zh) * 2017-04-19 2017-09-01 中山大学 一种母血浆游离dna文库的构建方法以及父源等位基因的分型方法
CN107099607A (zh) * 2017-06-12 2017-08-29 山东省农业科学院奶牛研究中心 一套同时检测93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的引物组合及试剂盒
CN108060261A (zh) * 2018-01-30 2018-05-22 袁隆平农业高科技股份有限公司 一种对玉米snp标记组合进行捕获测序的方法及其应用
CN109112211A (zh) * 2018-05-15 2019-01-01 广州达瑞生殖技术有限公司 一种人类胚胎Chediak-Higashi综合征LYST基因突变检测的引物组合及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZEZHAO WANG ET AL.: "Genome-Wide Scan Identifies Selection Signatures in Chinese Wagyu Cattle Using a High-Density SNP Array", 《ANIMALS》 *
曾溢滔: "《遗传病分子基础与基因诊断》", 31 December 2017, 上海科学技术出版社 *
罗洁: "《高通量测序技术在肺癌领域的应用》", 30 June 2018, 上海交通大学出版社 *

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