CN110904220B - 检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110904220B CN110904220B CN201911349470.8A CN201911349470A CN110904220B CN 110904220 B CN110904220 B CN 110904220B CN 201911349470 A CN201911349470 A CN 201911349470A CN 110904220 B CN110904220 B CN 110904220B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- region
- oligonucleotide pair
- seq
- primer set
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 101150010738 CYP2D6 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 238000007838 multiplex ligation-dependent probe amplification Methods 0.000 claims 1
- 108010001237 Cytochrome P-450 CYP2D6 Proteins 0.000 abstract description 33
- 102100021704 Cytochrome P450 2D6 Human genes 0.000 abstract description 33
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102100021702 Putative cytochrome P450 2D7 Human genes 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 101000896586 Homo sapiens Cytochrome P450 2D6 Proteins 0.000 description 6
- 101000896576 Homo sapiens Putative cytochrome P450 2D7 Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 101710205841 Ribonuclease P protein component 3 Proteins 0.000 description 4
- 102100033795 Ribonuclease P protein subunit p30 Human genes 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 3
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108010066783 cytochrome P-450 CYP2D7P Proteins 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940005529 antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000000071 blow moulding Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子学生物检测领域,更具体的,涉及检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的检测领域。本发明提供了一种寡核苷酸组合在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途,其可特异性地检测CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因拷贝数变异中的一种或更多种,与此同时,本发明还提供了所述寡核苷酸对组合物、包含所述寡核苷酸对组合物的试剂盒以及用于检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域,具体地,涉及CYP2D6基因多态性和拷贝数的检测领域。
背景技术
CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶,CYP2D6是位于第22号染色体上,其含有9个外显子和8个内含子,总长5400bp左右,是一个完整的功能性基因。有研究发现,CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因,分别称为CYP2D7P基因和CYP2D8P基因,CYP2D7P基因与CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性,而且带有TATA盒,但是由于在外显子1的第226位点上插入了一个胸腺嘧啶(T),从而改变了读码框架,使转录提前终止;CYP2D8P基因是一个含有多个断裂点的突变假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人体足迹中均不表达,只有CYP2D6在肝、肠、肾和人脑中表达。
现代研究发现,肝脏中CYP2D6的含量仅占P450肝脏蛋白总量的2%,但是它却参与代谢约25%的临床用药,包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异,主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。为了简化基因型解释和提高表型预测,临床药物基因组学实施联盟(CPIC)根据“activity score”(AS)ystem将等位基因的活性分数分为全功能型等位基因(分数值1),功能减少型等位基因(分数值0.5),无功能型等位基因(分数值0),将所有等位基因活性分数相加得到AS值,根据AS值评估各类CYP2D6型别人群的活性分数确定PM(弱代谢型,AS值0)、IM(中间代谢型,AS值=0.5)、EM(正常代谢型AS值1-2)和UM(超快代谢型AS值>=2)4种代谢类型。
CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2,其中CYP2D6*2为C2850T突变。中国人群中五种常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因拷贝数变异。CYP2D6*3为A2549del缺失突变,CYP2D6*4为C100T和G1846A共同突变,CYP2D6*5为整个基因缺失突变,CYP2D6*10为C100T突变,此外还有整个基因的拷贝数变异。
目前测量CYP2D6基因多态性和拷贝数的方法主要有PCR荧光定量、直接测序法、PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测,液相和固相芯片法等。直接测序法、PCR-单链构象多态性分析检测无法检测拷贝数变异,目前的PCR法仅检测多态性或者拷贝数变异的其中一种,且由于假基因同源性高的原因灵敏度低。而液相或固相芯片法能够同时检测多态性和拷贝数变异,但需要采购配套的液态或固态芯片耗材以及专用的芯片读取仪器,需要合成探针芯片,成本高,且需要和其它基因一起设计,探针芯片不能太少,不能单独用来检测CYP2D6,灵敏度均不高,检测结果可重复性差。
因此,本领域需求一种能够同时检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数,并且灵敏度高,不需要专用的仪器,以及成本低的产品。
发明内容
有鉴于此,在第一方面,本发明提供了一种寡核苷酸对组合物在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途,所述寡核苷酸对组合物包括所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组;其中,
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第一区域、第二区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为如SEQ ID NO:1~5所示;
所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第二区域、第一区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为如SEQ ID NO:6~10所示;
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域,所述第三区域为标签序列,在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。
所述测序引物和所述标签序列是本领域技术人员根据所选择的具体测序平台能够通过常规方法所确定。
所述标签序列是4-12个N碱基,例如可以是8个N碱基。
标签序列的目的是通过分子溯源,还原原始分子,例如如果同一起点和终点的相同序列,这个分子标签序列一致,则判为同一分子,不同分子标签序列,则为不同分子,进而能够去除PCR扩增偏倚,提高准确性,利于准确的判断拷贝数。
在一个具体实施方案中,当使用Illumina平台时,其测序引物可以是例如,ACACGACGCTCTTCCGATCT。
使用本发明的组合物能够同时检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数,并如实施例所示,本发明的组合物对57例样品进行检测,分别检测出了CYP2D6基因的多态性和拷贝数,不需要专用的仪器,成本低。
进一步地,所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ IDNO:11所示的序列,所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ IDNO:12所示的序列。
通过使用上述序列,能够使得以RPP30对应的扩增子(2倍体)为基准参照,通过CYP2D6与RPP30的分子数的比较能够更准确的推断CYP2D6的拷贝数。
在第二方面,本发明还提供了一种寡核苷酸对组合物,其包括:所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组;其中,
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第一区域、第二区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为:
GAGAACAGGTCAGCCACCACTATGCA(SEQ ID NO:1),
GCTGGATGAGCTGCTAACTGAGCACA(SEQ ID NO:2),
GGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGA(SEQ ID NO:3),
CCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAA(SEQ ID NO:4),
GGGGTCACCAGGAAAGCAAAGACA(SEQ ID NO:5);
所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第二区域、第一区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为:
CAGGTTCTCATCATTGAAGCTGCTCTC(SEQ ID NO:6),
GGATGACCTGGGACCCAGCCCAG(SEQ ID NO:7),
GTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGC(SEQ ID NO:8),
GACGCCCCTTTCGCCCCAACGGT(SEQ ID NO:9),
CCATGGTGGCTGGGCCGGGGC(SEQ ID NO:10);
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域,所述第三区域为标签序列,在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。
进一步地,所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ IDNO:11所示的序列,所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ IDNO:12所示的序列。
进一步地,所述寡核苷酸对组合物进一步包括扩增引物。
所述寡核苷酸对组合物的第一区域即是测序引物,还是扩增引物的靶标序列。
所述扩增引物可以由本领域技术人员根据寡核苷酸对组合物的第一区域的序列以及所使用的测序芯片的种类进行常规设计而得到。
进一步地,所述扩增引物还具有条形码(Barcode)序列,目的是区分样品,多样品混合检测时能够从测序数据中拆分样品,从而区分每个样品的测序数据。
在一个具体实施方案中,所述扩增引物例如可以是:
正向:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG;
负向:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Barcode]GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
在优选的实施方案中,所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为GGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGA(SEQ ID NO:11)的序列,所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为CAGCCGCTCACCGTGAGTTGCCC(SEQ ID NO:12)的序列。
在第三方面,本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括如上所述的寡核苷酸对组合物。
进一步地,所述试剂盒还包括提取DNA所需试剂,用于多重连接探针扩增技术(MLPA)所需的试剂,用于PCR的其他试剂,如Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液等中的至少一种。
第四方面,本发明还提供了上述试剂盒在检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数中的用途。
在一个具体的实施方案中,所述多态性和拷贝数为选自CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因拷贝数变异中的一种或更多种。
在第五方面,本发明提供了用于检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取待测样品的DNA;
2)使用上述本发明的寡核苷酸组合或试剂盒对步骤1)获得的DNA进行MLPA;
3)将得到的产物进一步扩增之后测序;
4)分析结果。
所述将得到的产物进一步扩增,是指将所述经过MLPA得到的产物进一步扩增其拷贝数,扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应、等温扩增(例如RPA)等。
具体实施方式
实施例
1、设计引物
本发明将MLPA与测序结合在一起而设计引物,首先,本发明在CYP2D6*2(C2850T,rs16947)、*3(A2549del,rs35742686)、*4(G1846A,rs3892097)、*10(C100T,rs1065852)位点设计MLPA探针对,F引物3’端最后一个碱基为多态性位点,F和R的特异性结合序列的Tm值≧72℃,然后,F引物特异性序列5’端加上8个N碱基的分子标签序列和Illumina平台测序引物ACACGACGCTCTTCCGATCT,R引物特异性序列3’端加上Illumina平台测序引物AGATCGGAAGAGCACACGTC。再在CYP2D6基因内保守区域Exon9和CYP2D6基因外保守区域设计参照引物对。
表1、探针引物
表2、扩增引物
2、探针混合物配制
将上述引物稀释至10μM,再等量混合,稀释至0.3nM每条探针,即为探针混合物。
3、MLPA试剂盒变性连接
MLPA试剂盒为荷兰MRC-Holland公司的试剂盒。PCR仪器设置程序:98℃5min,25℃,95℃1min,60℃,54℃,54℃15min,98℃5min,15℃,98℃30s,35cycs(98℃10s,63℃15s,72℃20s),72℃20min,4℃。
血液提取人基因组DNA后,取20ng(体积不大于5μL,小于5μL补水)于0.2mL PCR管中,放置于PCR仪器上95℃,5min变性,25℃备用。
准备杂交缓冲液,按照每个样品1.5μL MLPA缓冲液(yellow cap)+1.5μL探针混合物的量进行混合,并震荡混匀,取3μL加入到已经变性好25℃备用的人基因组DNA中,放置于PCR仪器中,进行下一个程序:95℃1min,60℃。60℃孵育16~20h,进行连接反应。
配制连接反应液,按照每个样品3μL Ligase-65缓冲液A(MRC-Holland),3μLLigase-65缓冲液B(MRC-Holland),1μL Ligase-65酶(MRC-Holland),25μL ddH2O进行混合,并震荡混匀。完成连接反应后,进入下一程序54℃,取32μL混合物在PCR仪器上加入到54℃孵育的杂交反应液中,进入下一个程序54℃15min,98℃5min,15℃,温度降至15℃后即可将样品从PCR仪器中拿出来。
4、PCR扩增
准备PCR扩增Mix,PCR扩增试剂盒为NEB的Q5热启动高保真DNA聚合酶,每个样品按照下表配制:
配制后,震荡混匀,取15μL PCR混合液加入10μL连接反应液,于PCR仪器中进行下列程序:98℃30s,35cycs(98℃10s,63℃15s,72℃20s),72℃20min,4℃。PCR完成后,加入25μL(1.0×)的XP磁珠混匀,静置5min,放置于磁力架上澄清,吸弃上清,不要吸到沉淀,加入80%乙醇,吹打10次后,澄清吸弃上清,再用80%乙醇洗涤1次,吸弃上清,从磁力架上取下,于37℃烘干,时间不要超过3min,加入ddH2O混匀,静置3min,放置于磁力架上澄清,取上清,勿吸到磁珠,即为纯化好的DNA产物。DNA产物用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies)测浓度。
5、上机测序
测完浓度的样品按照等摩尔量计算进行混合,混合后测浓度,再按照所需数据量跟其它样品混样,将混合的上机样品稀释至合适浓度进行变性稀释至合适的上机浓度。使用Illumina公司的测序仪NextSeq 500测序,测序试剂盒使用NextSeq High Output Kitv2(75cycle)。
6、数据分析
根据样品Barcode序列进行样品测序数据拆分,得到每个样品的Fastq下机数据。分别对每个样品的Fastq数据进行分析,将Fastq数据进行质控,使用Trimmomatic软件剪除adapter序列、过滤低质量的reads后,得到clean reads。对clean reads按不同扩增子进行拆分并与模板序列进行比对。筛选扩增子左、右探针正确连接的reads,并根据每个reads5’端的前8随机碱基序列标签统计每个扩增子对应的唯一分子数。根据统计到的各扩增子的唯一分子数计算检测样品CYP2D6基因型别。
CYP2D6拷贝数推算主要包括如下步骤:以RPP30对应的扩增子为基准参照(2倍体),将位于CYP2D6基因9号外显子上的保守序列扩增子E9对应的分子数进行比较推断CYP2D6基因在被测样品中的拷贝数情况,即CYP2D6 E9的分子数比上RPP30的分子数,比值在0.9到1.1间则认为CYP2D6为正常的2拷贝,若比值为在1.5±0.1范围内则为3拷贝;CYP2D6基因的*2、*3、*4和*10各型别拷贝数推断方法类似,以E9的分子数为基准参照,将各型别特异的扩增子统计到的分子数与其相比较,通过比值推断CYP2D6各型别以及对应拷贝数。
7、结果分析
对57例样品进行测序,推断RPP30和CYP2D6各扩增子统计到的分子数以及型别、拷贝数,并且同时为了进一步证明通过本发明的方法所得到的结果的正确性,还通过传统的Sanger测序法对这57例样品进行结果验证,所有结果如下表1所示:
表1
/>
/>
根据CPIC指南,CYP2D6活性为0的等位基因为:*3,*4,*5;活性为0.5的等位基因为:*10;活性为1的等位基因为:*1,*2。CYP2D6代谢类型根据AS分级,0=PM,0.5=IM,1-2=NM,>2=UM。57例样品统计代谢类型如下表2所示:
表2
/>
与仅检测多态性的方法对比,6例样品存在AS值不一致,3例样品(G0000000024、G0000000037、G0000000040)代谢类型结果判定不一致,如表3所示:
表3
同时,为了进一步验证本发明的方法是否正确,将上述与多态性的方法对比结果不一致的样品进行经芯片捕获靶向测序法验证。
实验结果表示,上述6例样品经芯片捕获靶向测序法验证SNP和拷贝数,其结果和本方法一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagaacaggt cagccaccac tatgca 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctggatgag ctgctaactg agcaca 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcagtggca gggggcctgg tga 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccttacccgc atctcccacc cccaa 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggggtcacca ggaaagcaaa gaca 24
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caggttctca tcattgaagc tgctctc 27
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggatgacctg ggacccagcc cag 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtagcgtgca gcccagcgtt ggc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gacgcccctt tcgccccaac ggt 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccatggtggc tgggccgggg c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggctctgcgc ggacttgtgg aga 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cagccgctca ccgtgagttg ccc 23
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62
<210> 14
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacag 58
Claims (9)
1.一种寡核苷酸对组合物在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途,所述寡核苷酸对组合物包括所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组;其中,
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第一区域、第二区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为如SEQ ID NO:1~5所示;
所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第二区域、第一区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为如SEQ ID NO:6~10所示;
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域,所述第三区域为标签序列,在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。
2.根据权利要求1所述的用途,其中,所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ ID NO:11所示的序列,所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ ID NO:12所示的序列。
3.一种寡核苷酸对组合物,所述寡核苷酸对组合物包括:所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组;其中,
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括:第一区域、第二区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为:
GAGAACAGGTCAGCCACCACTATGCA(SEQ ID NO:1),
GCTGGATGAGCTGCTAACTGAGCACA(SEQ ID NO:2),
GGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGA(SEQ ID NO:3),
CCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAA(SEQ ID NO:4),
GGGGTCACCAGGAAAGCAAAGACA(SEQ ID NO:5);
所述寡核苷酸对的负向引物组的每一个从5’端至3’端包括:第二区域、第一区域,其中,所述第一区域为测序引物,所述第二区域的序列分别为:
CAGGTTCTCATCATTGAAGCTGCTCTC(SEQ ID NO:6),
GGATGACCTGGGACCCAGCCCAG(SEQ ID NO:7),
GTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGC(SEQ ID NO:8),
GACGCCCCTTTCGCCCCAACGGT(SEQ ID NO:9),
CCATGGTGGCTGGGCCGGGGC(SEQ ID NO:10);
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域,所述第三区域为标签序列,在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸对组合物,其中,所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ ID NO:11所示的序列,所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQ ID NO:12所示的序列。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸对组合物,其中,所述寡核苷酸对组合物进一步包括扩增引物。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸对组合物,其中,所述寡核苷酸对组合物的第一区域即是测序引物,还是所述扩增引物的靶标序列。
7.一种试剂盒,所述试剂盒包括如权利要求3~6中任一项所述的寡核苷酸对组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括提取DNA所需试剂,用于多重连接探针扩增技术所需的试剂,用于PCR的其他试剂。
9.一种用于制备检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数的试剂的用途,所述检测包括以下步骤:
1)提取待测样品的DNA;
2)使用如权利要求3~6中任一项所述的寡核苷酸对组合物或如权利要求7或8所述的试剂盒对步骤1)获得的DNA进行MLPA;
3)将得到的产物进一步扩增之后测序;
4)分析结果。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911349470.8A CN110904220B (zh) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | 检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911349470.8A CN110904220B (zh) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | 检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110904220A CN110904220A (zh) | 2020-03-24 |
CN110904220B true CN110904220B (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=69827379
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911349470.8A Active CN110904220B (zh) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | 检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110904220B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112080562A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-15 | 珠海赛乐奇生物技术股份有限公司 | 检测高血压药物治疗相关基因的基因芯片和试剂盒 |
CN112695097B (zh) * | 2021-03-10 | 2022-08-19 | 厦门大学 | 一种区分cyp2d7p和cyp2d8p的cyp2d6*10遗传多态性检测试剂盒 |
CN113151441A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-23 | 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 | 一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用 |
CN113755578A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-07 | 上海普然生物科技有限公司 | 一种用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101824467A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-09-08 | 广州益善生物技术有限公司 | Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法 |
CN103409551A (zh) * | 2013-08-29 | 2013-11-27 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 用于检测hbv拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光pcr试剂盒 |
CN103898199A (zh) * | 2012-12-27 | 2014-07-02 | 上海天昊生物科技有限公司 | 一种高通量核酸分析方法及其应用 |
CN105969843A (zh) * | 2016-04-16 | 2016-09-28 | 杨永臣 | 一种基于mlpa的基因拷贝数和突变的高通量测序检测方法 |
CN106222281A (zh) * | 2016-08-10 | 2016-12-14 | 中南大学湘雅三医院 | 基于基因多态性指导儿童患者精准用药的试剂盒、应用和方法 |
CN106591425A (zh) * | 2015-10-15 | 2017-04-26 | 北京寻因生物科技有限公司 | 基于连接反应的多重靶向检测核酸指标的方法 |
CN108018344A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-11 | 美因健康科技(北京)有限公司 | 基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040096874A1 (en) * | 2002-04-11 | 2004-05-20 | Third Wave Technologies, Inc. | Characterization of CYP 2D6 genotypes |
US20050196771A1 (en) * | 2002-04-11 | 2005-09-08 | Matt Neville | Characterization of CYP 2D6 genotypes |
-
2019
- 2019-12-24 CN CN201911349470.8A patent/CN110904220B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101824467A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-09-08 | 广州益善生物技术有限公司 | Cyp2d6基因突变检测液相芯片及检测方法 |
CN103898199A (zh) * | 2012-12-27 | 2014-07-02 | 上海天昊生物科技有限公司 | 一种高通量核酸分析方法及其应用 |
CN103409551A (zh) * | 2013-08-29 | 2013-11-27 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 用于检测hbv拉米夫定和/或阿德福韦耐药性的多重连接探针实时荧光pcr试剂盒 |
CN106591425A (zh) * | 2015-10-15 | 2017-04-26 | 北京寻因生物科技有限公司 | 基于连接反应的多重靶向检测核酸指标的方法 |
CN105969843A (zh) * | 2016-04-16 | 2016-09-28 | 杨永臣 | 一种基于mlpa的基因拷贝数和突变的高通量测序检测方法 |
CN106222281A (zh) * | 2016-08-10 | 2016-12-14 | 中南大学湘雅三医院 | 基于基因多态性指导儿童患者精准用药的试剂盒、应用和方法 |
CN108018344A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-11 | 美因健康科技(北京)有限公司 | 基于MLPA+Seq的高通量测序的肿瘤检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Olga Kondrashova等.High-Throughput Amplicon-Based Copy Number Detection of 11 Genes in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Ovarian Tumour Samples by MLPA-Seq.《PLoS One》.2015,第10卷(第11期),e0143006. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110904220A (zh) | 2020-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110904220B (zh) | 检测cyp2d6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法 | |
CN106591441B (zh) | 基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用 | |
JP6684790B2 (ja) | シーケンスに基づく検出方法 | |
WO2014101655A1 (zh) | 一种高通量核酸分析方法及其应用 | |
CA2512110A1 (en) | Compositions, methods, and systems for inferring bovine breed | |
CN106591273B (zh) | 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒 | |
US20170321270A1 (en) | Noninvasive prenatal diagnostic methods | |
Yin et al. | Challenges in the application of NGS in the clinical laboratory | |
CN111286548B (zh) | 基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合 | |
CN110564861B (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
CN113046424A (zh) | 一种用于pcr检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和pcr检测方法 | |
CN110452969B (zh) | 一种基于kasp的大鼠遗传质量监控snp标记分型方法及试剂盒 | |
CN108823294B (zh) | 基于20个单倍群d的y-snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
WO2016036553A1 (en) | Multiplexed pcr assay for high throughput genotyping | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
CN109584957A (zh) | 用于捕获α地中海贫血相关基因拷贝数检测试剂盒 | |
CN113462749A (zh) | 一种高灵敏扩增子建库试剂盒以及建库方法和应用 | |
KR101312480B1 (ko) | 돼지의 갈비뼈 수 판단용 snp 마커 및 이의 용도 | |
CN112342303A (zh) | 一种基于ngs的人类y染色体str和snp遗传标记联合检测体系及检测方法 | |
Bujakowska et al. | Efficient in silico identification of a common insertion in the MAK gene which causes retinitis pigmentosa | |
CN113564266B (zh) | Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途 | |
Clark et al. | Study of T991T polymorphism in Cuban patients with clinical diagnosis of Wilson’s disease | |
CN103131788B (zh) | 慢性牙周炎相关单核苷酸多态性检测用探针和引物、及其试剂盒 | |
CN108315396B (zh) | 一种简单便捷检测snp的新方法 | |
TWI804902B (zh) | 豬隻毛色分群之引子對組合及其方法與套組 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230802 Address after: 101125, Building 16, Yard 2, Yujing East Road, Tongzhou District, Beijing, China Patentee after: Beijing Shengwei Medical Laboratory Co.,Ltd. Address before: Lu Song road 680, high tech Industrial Development Zone, Changsha City, Hunan Province, 410205 Patentee before: Shengxiang Biotechnology Co.,Ltd. |