CN111286548B - 基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合。引物组合由120条引物组合，120条引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：120所示。相比于illumina公司的ForenSeqTM DNA Signature PrepKit，本发明提供的试剂盒中包含41个新的Y‑STR基因座，能提供更多新的遗传信息。而且本发明提供的复合扩增体系中所有Y‑STR基因座的最大扩增子长度都小于300bp，而ForenSeqTM DNA Signature PrepKit中有约29.1％(7/24)基因座的最大扩增子长度大于300bp，不利于降解检材的分析。实验证明，采用本发明提供的试剂盒检测标准品2800M中68个基因座的STR分型，分型结果准确。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合，尤其涉及基于二代测序技术检测67个Y-STR基因座和Amelogenin基因座的试剂盒及其使用的引物组合。
背景技术
短串联重复(short tandem repeat，STR)是由2～6bp重复单位串联组成且广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，是目前法医个体识别和亲子鉴定应用最广泛的遗传标记。人类Y染色体短串联重复(Y-chromosome short tandem repeats，Y-STR)具有父系遗传、缺乏重组、分型简单、信息量大、多态性高等特点，是研究人类的起源进化、民族差异、种族差异、群体及地区分布等的有力工具。因此，Y染色体STR基因座多态性研究可为法医学个体识别和亲权鉴定提供重要手段，在诸如父系家族的亲权鉴定、混合斑男性成分的检测、不同男性个体混合物的分析、追溯父系迁移历史及重构同一父系家族等方向都具有独特的应用价值。
目前，荧光标记多重扩增结合毛细管电泳(fluorescent labeled multiplexPCR-capillary electrophoresis，PCR-CE)是STR分型的主流技术；常用的商业化Y-STR分型试剂盒有
Y23(Promega)、
Y(Promega)、
Yfiler(ThermoFisher Scientific)和
Yfiler Plus(Thermo Fisher Scientific)等。研究发现，基于PCR-CE分型时，相同片段长度的等位基因中存在重复区域序列结构不一致的情况。
二代测序技术(second generation sequencing，SGS)又称为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)，具有测序通量高、速度快的优点。NGS不仅能从长度多态性上对STR基因座进行分析，还能从序列上发掘STR基因座的遗传多态性。随着NGS测序成本越来越低、测序读长逐渐的增加，NGS对STR分型技术也越来越成熟。近年来，NGS技术已经应用于法医学STR分型研究。相比于PCR-CE分型，NGS技术在Y-STR基因座的分析中具有很多优势：1、样本输入量低，使得微量样本及降解样本检材的分型研究变为可能；2、准确性高，能够全部覆盖基因座的每个碱基并通过产出高测序深度保证Y-STR基因座各等位基因的高概率精确判断的严谨性；3、能够获得Y-STR等位基因间的核苷酸差异信息，由于核心重复结构存在差异或扩增区段内存在变异(侧翼序列的碱基突变或插入缺失)，序列长度相等的等位基因可能是具有遗传稳定性的完全不同的等位基因，这种Y-STR序列多态性是个体识别分析的宝贵资源；4、成本低，通过对每个样本检材添加标签一次可以同时对多个样本进行平行测序，既节约时间又降低测序成本。
目前，基于法庭科学领域运用最多的NGS系统为Illumina公司的MiSeq FGxTM系统和Thermo Fisher公司的Ion Torrent PGMTM系统，但针对以上平台的二代测序商业化STR分型试剂盒的研发尚处于起步阶段，主要有PowerSeq Auto system(Promega，Madison，WI,USA)、ForenSeqTMDNA Signature Prep Kit(Illumina，San Diego，CA，USA)和Precision IDGlobalFiler NGS STR Kit(Termo Fisher，Waltham，MA，USA)。但以上试剂盒涉及的Y-STR相对较少，三个试剂盒分别包含了1个Y-STR基因座、26个Y-STR基因座、2个Y-STR基因座。同时存在试剂盒价格昂贵，配套的数据分析软件只能针对各自开发试剂盒，参数的设置相对固定，只能对固有基因座的测序数据进行分析，不利于法医学实际应用。因此，构建一种适用于当前主流二代测序检测平台MiSeq FGxTM系统及开放性测序数据分析软件STRaitRazor、MyFLq等，且能容纳更多Y-STR基因座的复合扩增体系具有一定的意义。
发明内容
本发明的目的是制备检测更多Y-STR基因座的试剂盒，提高了父系亲缘关系分析能力和鉴定效能。
本发明首先保护引物组合，可包括引物1—引物120；引物1—引物120均为单链DNA分子，核苷酸序列依次可如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：120所示。
所述引物组合具体可由引物1—引物120组成。
上述任一所述的引物组合中，引物1—引物120的摩尔比具体可为0.03：0.03：0.075：0.075：0.056：0.056：0.188：0.188：0.038：0.038：0.113：0.113：0.019：0.019：0.038：0.038：0.075：0.075：0.03：0.03：0.03：0.03：0.023：0.023：0.045：0.045：0.019：0.019：0.03：0.03：0.038：0.038：0.03：0.03：0.038：0.038：0.056：0.056：0.023：0.023：0.15：0.15：0.03：0.03：0.03：0.03：0.023：0.023：0.015：0.015：0.019：0.019：0.113：0.113：0.15：0.15：0.068：0.068：0.03：0.03：0.045：0.045：0.068：0.068：0.023：0.023：0.045：0.045：0.038：0.038：0.094：0.094：0.038：0.038：0.03：0.03：0.038：0.038：0.038：0.038：0.019：0.019：0.023：0.023：0.045：0.045：0.03：0.03：0.045：0.045：0.045：0.045：0.075：0.075：0.03：0.03：0.056：0.056：0.113：0.113：0.045：0.045：0.038：0.038：0.019：0.019：0.023：0.023：0.045：0.045：0.023：0.023：0.045：0.045：0.03：0.03：0.019：0.019：0.045：0.045。
上述任一所述的引物组合可用于扩增68个基因座。
本发明还保护一种基于68个基因座的复合扩增体系，可包括上述任一所述引物组合。
所述复合扩增体系可由上述任一所述引物组合组成。
所述引物1—引物120在上述任一所述复合扩增体系中的浓度分别可为0.03μM、0.03μM、0.075μM、0.075μM、0.056μM、0.056μM、0.188μM、0.188μM、0.038μM、0.038μM、0.113μM、0.113μM、0.019μM、0.019μM、0.038μM、0.038μM、0.075μM、0.075μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.019μM、0.019μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.056μM、0.056μM、0.023μM、0.023μM、0.15μM、0.15μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.023μM、0.023μM、0.015μM、0.015μM、0.019μM、0.019μM、0.113μM、0.113μM、0.15μM、0.15μM、0.068μM、0.068μM、0.03μM、0.03μM、0.045μM、0.045μM、0.068μM、0.068μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.038μM、0.038μM、0.094μM、0.094μM、0.038μM、0.038μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.038μM、0.038μM、0.019μM、0.019μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.03μM、0.03μM、0.045μM、0.045μM、0.045μM、0.045μM、0.075μM、0.075μM、0.03μM、0.03μM、0.056μM、0.056μM、0.113μM、0.113μM、0.045μM、0.045μM、0.038μM、0.038μM、0.019μM、0.019μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.03μM、0.03μM、0.019μM、0.019μM、0.045μM和0.045μM。
上述任一所述复合扩增体系还可包括进行PCR扩增反应所需的试剂。所述“进行PCR扩增反应所需的试剂”不包括PCR扩增反应所需的引物。
上述任一所述复合扩增体系可为20μL，由10μL 2×Master Mix、上述任一所述引物组合和模板组成。2×Master Mix具体可为德国QIAGEN公司的产品。所述模板具体可为浓度为1ng/μL的标准品2800M的水溶液或样品的基因组DNA。所述样品可为人口腔拭子。所述标准品2800M具体可为Promega公司的产品，产品目录号为DD7251。
含有上述任一所述引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的用途可为(h1)-(h5)中的至少一种：(h1)STR分型；(h2)Y-STR分型；(h3)个体识别；(h4)亲权鉴定；(h5)种族推断。
本发明还保护上述任一所述复合扩增体系或上述任一所述试剂盒的制备方法；该制备方法包括将上述任一所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为(h1)-(h5)中的至少一种：(h1)STR分型；(h2)Y-STR分型；(h3)个体识别；(h4)亲权鉴定；(h5)种族推断。
本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系的应用，可为(h1)-(h5)中的至少一种：(h1)STR分型；(h2)Y-STR分型；(h3)个体识别；(h4)亲权鉴定；(h5)种族推断。
上述任一所述68个基因座具体可由Amelogenin、DYS19、DYS385a/b、DYF387S1a/b、DYS388、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYF399S1、DYF404S1a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS443、DYS444、DYS446、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS459a/b、DYS460、DYS481、DYS485、DYS504、DYS505、DYS508、DYS510、DYS518、DYS520、DYS522、DYS527a/b、DYS531、DYS533、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS576、DYS587、DYS593、DYS596、DYS612、DYS617、DYS622、DYS626、DYS627、DYS630、DYS635、DYS641、DYS643、DYS644、DYS645、DYS710、DYS720、Y-GATA-A10和Y-GATA-H4组成。其中，Amelogenin为性别决定基因座。DYF399S1包含三个分型片段。DYS385a/b、DYF387S1a/b、DYF404S1a/b、DYS459a/b和DYS527a/b均包含两个分型片段。
本发明提供的试剂盒可以检测68个基因座(包括67个Y-STR基因座和1个性别决定基因座Amelogenin)。相比于illumina公司的ForenSeqTM DNA Signature Prep Kit，本发明提供的试剂盒中包含41个新的Y-STR基因座，能提供更多新的遗传信息。而且本发明提供的复合扩增体系中所有Y-STR基因座的最大扩增子长度都小于300bp，而ForenSeqTM DNASignature Prep Kit中有约29.1％(7/24)基因座的最大扩增子长度大于300bp，不利于降解检材的分析。本发明提供的试剂盒是本发明的发明人经过大量实验摸索获得的，试剂盒中的引物具有不可替换性；即引物被替换后，部分基因座将会被抑制且抑制效果不可预知。实验证明，采用本发明提供的试剂盒检测标准品2800M中68个基因座的STR分型，分型结果准确。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为67个Y-STR基因座的PCR扩增产物的长度范围分布。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
标准品2800M为Promega公司的产品，产品目录号为DD7251。
PCRPurification Kit为德国QIAGEN公司的产品，产品目录号为Y5-28006。
3.0Fluorometer定量仪为Thermo Fisher Scientific公司的产品。QubitTM dsDNA HSAssay Kit为Thermo Fisher公司的产品，货号为Q32854。TruSeq DNA PCR-Free HT LibraryPrep Kit为Illumina公司的产品，产品目录号为FC-121-3003。KAPA Library QuantificationKit为KAPA公司的产品，产品目录号为KK4824。MiSeq reagent kit v3-600 cycles测序试剂为Illumina公司的产品，货号为MS-102-3003。MiSeq FGx二代测序仪为Illumina公司的产品。
实施例1、基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒的制备
一、68个基因座的筛选
本发明的发明人通过查阅文献和现有二代测序STR分型产品获得大量候选的Y-STR基因座，然后根据中国人群STR群体遗传多态性分析结果，最终筛选获得68个基因座，包括67个Y-STR基因座和1个性别决定Amelogenin基因座。
67个Y-STR基因座分别为：DYS19、DYS385a/b、DYF387S1a/b、DYS388、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYF399S1、DYF404S1a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS443、DYS444、DYS446、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS459a/b、DYS460、DYS481、DYS485、DYS504、DYS505、DYS508、DYS510、DYS518、DYS520、DYS522、DYS527a/b、DYS531、DYS533、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS576、DYS587、DYS593、DYS596、DYS612、DYS617、DYS622、DYS626、DYS627、DYS630、DYS635、DYS641、DYS643、DYS644、DYS645、DYS710、DYS720、Y-GATA-A10、Y-GATA-H4；其中，DYS385a/b、DYF387S1a/b、DYF404S1a/b、DYS459a/b、DYS527a/b分别包含两个分型片段，DYF399S1包含三个分型片段。
二、引物组合的制备
1、人工设计并合成用于扩增每个基因座的引物(要求扩增长度最好300bp以下)，然后进行PCR扩增，获得每个基因座的特异性扩增产物。
2、综合单个基因座的扩增条件，选择适宜扩增程序，进行复合扩增。由于复合的基因座数目较多，引物间相互抑制情况复杂，所以需要一一排除，找出这些基因座，重新设计并合成引物。此外，不同基因座的引物之间还会形成引物二聚体，降低引物的扩增效率，也需要重新设计并合成引物。
3、初次复合扩增时，各个引物在反应体系中的浓度均为0.2μM；之后对引物浓度进行调整，获得进行PCR扩增时各个引物的最佳浓度。
经过上述步骤，获得引物组合。引物组合由120条引物组成，用于检测68个基因座。各个基因座的名称、扩增基因座对应的引物名称和引物的核苷酸序列依次见表1中第1列、第2列和第3列。进行PCR扩增时各个引物的最佳浓度见表1中第5列。
表1
各个基因座对应的引物在hg38人类参考基因组(hg38人类基因组的信息见网址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.2bit)中的PCR扩增产物的长度和核苷酸序列详见表2。各个STR基因座的PCR扩增产物的长度范围分布见图1。
表2
三、基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒的制备
基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒包括引物混合物；引物混合物由步骤二制备的120条引物混合而成。
实施例2、实施例1制备的试剂盒检测标准品2800M的STR分型及其应用
一、实施例1制备的试剂盒检测标准品2800M的STR分型
1、DNA样本准备
取标准品2800M，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μL的标准品2800M水溶液。
2、PCR扩增
以标准品2800M水溶液为模板，采用实施例1步骤三制备的引物混合物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为20μL，由10μL 2×Master Mix(德国QIAGEN公司)、1μL标准品2800M水溶液、引物混合物和无核酶水组成。该反应体系中，各个引物的浓度见表1中第5列。
反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃2min，72℃2min，28个循环；72℃5min；4℃保存。
3、纯化和定量
(1)取PCR扩增产物，按照
PCR Purification Kit的说明书步骤进行纯化，得到PCR纯化产物。
(2)将PCR纯化产物按照QubitTM dsDNA HS Assay Kit说明书，采用
3.0Fluorometer定量仪进行定量，得到PCR纯化产物的浓度。
4、文库制备
取PCR纯化产物，按照TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit的说明书操作步骤依次进行末端修复、末端修复产物纯化、连接A-tail、连接Adapter和连接产物的纯化，然后按照KAPA Library Quantification Kit的说明书步骤进行文库定量及文库标准化，完成文库制备。
5、上样测试
取步骤4制备的文库，使用MiSeq reagent kit v3-600 cycles测序试剂于MiSeqFGx二代测序仪上进行测序。
6、数据分析
测序结束后仪器自动生成fastq文件，使用STRait Razor 3.0软件对fastq文件进行数据分析。运行STRait Razor 3.0软件之前，在notepad中录入68个基因座基因配置文件。基因座基因配置文件如下：①基因座名称，②Y，③正向引物后12个碱基，④反向引物前12个碱基的反向互补序列，⑤该基因座核心序列的两个重复单元，⑥一个重复单元的碱基数，⑦侧翼序列碱基数，各部分之间用Tab键隔开。按照这种格式依次对68个基因座进行录入。68个基因座基因配置文件录入完成后，运行STRait Razor 3.0软件，生成allsequences.txt文件。该文件给出了①基因座名称，②基因分型，③扩增子碱基数，④扩增子序列信息，⑤测序深度五个部分。根据国际法医遗传学会(International Societyfor Forensic Genetics，ISFG)发表的关于Y-STR基因座的STR序列指南(https://strider.online)和NIST STR数据库(https://strbase.nist.gov/y_strs.htm)Y染色体STR情况说明对67个Y-STR基因座的序列构建核心重复结构。
实验结果见表3。结果表明，标准品2800M得到了完整的STR分型，完全能够满足法医STR检验的要求。
表3-1
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
表3-2
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目。
二、采用实施例1制备的试剂盒的应用——口腔拭子样本的基因座分型
样本一、样本二和样本三为3名汉族男性无关个体的口腔拭子的基因组DNA，浓度均为1ng/μL。3名汉族男性均知情同意。
将步骤一中的标准品2800M水溶液替换为样本一、样本二或样本三，其它步骤均不变。
检测结果见表3。结果表明，样本一、样本二和样本三均获得了完整的STR分型结果。
实施例3、实施例1制备的试剂盒的准确性验证
1、取1ng标准品2800M、样本一、样本二或样本三(见实施例2中步骤二)，按照
Yfiler Plus PCR Ampl ifcation Kit(Thermo Fisher Scientific)的说明书步骤进行毛细管电泳检测，得到各个基因座的等位基因基因型。
分型结果见表4。
表4
注：M为毛细管电泳检测技术的分型结果，E为二代测序技术的分型结果。
2、按照实施例2中步骤一的方法检测标准品2800M、样本一、样本二或样本三，得到各个基因座的等位基因基因型。
分型结果见表4。
结果表明，实施例1制备的试剂盒与
Yfiler Plus PCR Ampl ifcationKit重合的基因座，在标准品2800M、样本一、样本二和样本三中的分型结果完全一致。
实施例4、实施例1制备的试剂盒中引物具有不可替换性
实施例1制备的试剂盒是本发明的发明人经过大量实验获得的，主要包括扩增各个基因座引物的反复调试和引物浓度的摸索。由于复合的基因座数目较多，引物间相互抑制情况复杂，所以试剂盒中用于扩增各个基因座的引物不可替换。
1、设计并合成表5中第2列所示的、用于扩增65个STR基因座的引物，然后混合，获得引物混合物1。设计并合成表5中第4列所示的、用于扩增66个STR基因座的引物，然后混合，获得引物混合物2。
其中扩增DYS19、DYS388、DYS389I、DYS389II、DYS392、DYS449、DYS459a/b、DYS485、DYS504、DYS531、DYS626和DYS627的引物不同。
表5
2、取标准品2800M，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μL的标准品2800M水溶液。
3、以标准品2800M水溶液为模板，分别采用引物混合物1和引物混合物2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。每条引物在反应体系的浓度均为0.2μM。
4、同实施例2步骤一中3。
5、同实施例2步骤一中4。
6、同实施例2步骤一中5。
检测结果见表6。结果表明，实施例1制备的试剂盒中的引物被替换后，部分基因座被抑制且引物混合物1和引物混合物2的抑制情况不同。
表6
注：N与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目；“-”表示未获得基因型。
上述结果表明，实施例1制备的试剂盒中引物具有不可替换性，本发明的发明人经过大量实验摸索，才获得了试剂盒中的引物组合及引物浓度。
<110>公安部物证鉴定中心
<120>基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合
<160>120
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
ctgggcaccc tggttatatc aa 22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>2
acaggcttga ggccaaccat 20
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>3
tcactatgac tactgagttt ctgtt 25
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>4
ggacaaggag tccatctggg 20
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>5
accatgccaa acaacaacaa aga 23
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>6
ctatctattc caattacata gtcctcct 28
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>7
ccattttacc cctaacaaga a 21
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>8
ggactgggaa agcagaaca 19
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>9
cggagctttt agtgagcca 19
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>10
ttcatgtgag ttagccgttt ag 22
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>11
tgaggaacac aattatccct g 21
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>12
tatccaactc tcatctgtat tatcta 26
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<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>13
cctgcatttt ggtacccca 19
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>14
agtcctgaga cagtgtatcc gc 22
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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tcattcaatc atacacccat 20
<210>16
<211>16
<212>DNA
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<400>16
aggcaggcag ataggc 16
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<211>22
<212>DNA
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aaaagccaag aaggaaaaca aa 22
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>18
aaacctacca atcccattcc tt 22
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>19
gtggtcttct acttgtgtca atac 24
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>20
aactcaagtc caaaaaatga gg 22
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<211>17
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>21
ccaaaagccc aacagga 17
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>22
caggagaaaa gaacccagaa 20
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<212>DNA
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<400>23
ccatgatgga acaattgcag 20
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<212>DNA
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<400>24
ggcttaagaa atttcaacgc ata 23
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<212>DNA
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ctatgggcgt gagtgcatg 19
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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attcatagat aagtagatag acatcattca 30
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<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>27
agtggggaat agttgaacgg taa 23
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>28
ggaagtggag gttgtggtga gt 22
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<211>26
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>29
gtacttccta ggttttcttc tcgagt 26
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>30
ctggcttgga attcttttac cc 22
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<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>31
aacagagttc atgctgatga caa 23
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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caaggcatag ttcaattgga ctt 23
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gtgtgaacca tttggcatgt 20
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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tcaaactcac gttgttcaag g 21
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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ctcccttaat tctatccttc acttc 25
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<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>36
ctgagcttgt accactgcac tca 23
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>37
ggggcttgct ttgcgttat 19
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>38
agacatgtgc cagggtggtc 20
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gatcgcgaga cagaaaggga g 21
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>40
tttctggccg gtctggaaa 19
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>41
gaatattttc ccttaacttg tgtg 24
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>42
cactctaggt tggacaacaa gag 23
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gtctgttgtg ggaccttgtg at 22
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<212>DNA
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<400>44
tcaactcagc ccaaaacttc tt 22
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<212>DNA
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cctgggtggt ggaggttact g 21
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<212>DNA
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<400>46
agttctggca ttacaagcat gag 23
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>47
tcttttgtca ggtgaactgg ggtaa 25
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<211>26
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>48
agcaacagag caagacttaa tcacac 26
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<212>DNA
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gaggaatctg acacctctga ca 22
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>50
gtccatatca tctatcctct gccta 25
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tgtgtgtgtg tctgtccctt taag 24
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aaaatcagaa cacagagccc ca 22
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gcagacttcg ccactacata a 21
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<212>DNA
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gcctgggtga caagagttat ac 22
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tcccctccac tcacttccct 20
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<212>DNA
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<400>56
tgggcaacag agcaaccct 19
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<212>DNA
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gcgaagtaac ccaaacgtt 19
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<212>DNA
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agagaaagaa ggagggaaag a 21
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<212>DNA
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acaatggcaa tcccaaattc 20
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gaacaaataa ggtgggatgg at 22
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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tttttcctcc cttaccacag a 21
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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tctggagaag acagaacttg tca 23
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ggcaacacaa gtgaaactgc 20
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tcagctctta ccatgggtga t 21
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<400>65
gaacagcctg cccaacat 18
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<400>66
tgctttcctc aacctccc 18
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>67
agatgaatag ataggcgggt aa 22
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<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>68
aagacagagt cataaacaga ggg 23
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<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>69
gtagcaaaaa aggaaggaag aagg 24
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>70
ggaagattag ccacaacata agtaagg 27
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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ctgtctttgt ggctttgctt 20
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<211>22
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agagtgctcc ctttctttgt ag 22
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tgagtgtgga acaactccc 19
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<213>Artificial sequence
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acctatcatc tttctagcta gc 22
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>75
agcaattagg taggtaaaga ggaag 25
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>76
tttggtggca taagtggtaa 20
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gtccatagtg ccgaggtcaa 20
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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tgcaaacgac tgccatagat aa 22
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tttttctgtg ccaagccta 19
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atgttctaat gcaccttgag g 21
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aatcctggct gtgtcctcc 19
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gctgaaatgc agatattccc ta 22
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<211>22
<212>DNA
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aatctcagcc aagcaacata gc 22
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<211>22
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>84
atggcagtct catttcctgg ag 22
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<211>24
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cgaagagacc atgagaaaat tacc 24
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<211>24
<212>DNA
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aagggtttct aagttcagga gact 24
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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cttgaaccca ggaagcagac 20
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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ttatgcccaa gtgacactgc 20
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acaggtccaa aggcagcag 19
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ttcctcttcc ttttccagtt c 21
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gaagtttcac acaggttcag 20
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aaaaagggaa ctgagggaag g 21
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tgatgccttc agctttgttc t 21
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<211>19
<212>DNA
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cacaccagca tggcacata 19
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<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gcctcggtga taagagtgaa 20
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<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>96
agggctgaag tgggttgt 18
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gcaagacccc atagcaaaag 20
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<212>DNA
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aagaagaatt ttgggacatg ttt 23
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taggtgacag cgcaggatt 19
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ttccctttgg ttttatgcc 19
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gcaagactcc acctcaaaag 20
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tgctgccatg taagaactgc 20
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agcagcaaaa ttcacagttg ga 22
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tgctctcttg gcttctcact ttg 23
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ctgagatcgc ctgctgct 18
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aagccatgcc tggttaaact 20
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tgcagtgagc tgtggttg 18
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ttctttggtt ttggttacgg 20
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aattgatgcc cctgttcc 18
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acttttctga atcctggaca agtg 24
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ttcctcatac tctctccctc cc 22
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agagagagag ggagagagaa cg 22
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tctggtgtgt gaaggacagc 20
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tacctatcca cctgccatc 19
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agataaatgg agatagtggg tg 22
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catcattaaa atgttatgct gagga 25
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ttacatagcc cacttgttaa acaac 25
Claims (22)
1.引物组合，由引物1—引物120组成；引物1—引物120均为单链DNA分子，核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：120所示。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：引物1—引物120的摩尔比为0.03：0.03：0.075：0.075：0.056：0.056：0.188：0.188：0.038：0.038：0.113：0.113：0.019：0.019：0.038：0.038：0.075：0.075：0.03：0.03：0.03：0.03：0.023：0.023：0.045：0.045：0.019：0.019：0.03：0.03：0.038：0.038：0.03：0.03：0.038：0.038：0.056：0.056：0.023：0.023：0.15：0.15：0.03：0.03：0.03：0.03：0.023：0.023：0.015：0.015：0.019：0.019：0.113：0.113：0.15：0.15：0.068：0.068：0.03：0.03：0.045：0.045：0.068：0.068：0.023：0.023：0.045：0.045：0.038：0.038：0.094：0.094：0.038：0.038：0.03：0.03：0.038：0.038：0.038：0.038：0.019：0.019：0.023：0.023：0.045：0.045：0.03：0.03：0.045：0.045：0.045：0.045：0.075：0.075：0.03：0.03：0.056：0.056：0.113：0.113：0.045：0.045：0.038：0.038：0.019：0.019：0.023：0.023：0.045：0.045：0.023：0.023：0.045：0.045：0.03：0.03：0.019：0.019：0.045：0.045。
3.一种基于68个基因座的复合扩增体系，由权利要求1或2所述的引物组合组成；所述68个基因座由Amelogenin、DYS19、DYS385a/b、DYF387S1a/b、DYS388、DYS389-I、DYS389-II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYF399S1、DYF404S1a/b、DYS437、DYS438、DYS439、DYS443、DYS444、DYS446、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS459a/b、DYS460、DYS481、DYS485、DYS504、DYS505、DYS508、DYS510、DYS518、DYS520、DYS522、DYS527a/b、DYS531、DYS533、DYS549、DYS552、DYS557、DYS570、DYS576、DYS587、DYS593、DYS596、DYS612、DYS617、DYS622、DYS626、DYS627、DYS630、DYS635、DYS641、DYS643、DYS644、DYS645、DYS710、DYS720、Y-GATA-A10和Y-GATA-H4组成。
4.如权利要求3所述复合扩增体系，其特征在于：引物1—引物120在所述复合扩增体系中的浓度分别为0.03μM、0.03μM、0.075μM、0.075μM、0.056μM、0.056μM、0.188μM、0.188μM、0.038μM、0.038μM、0.113μM、0.113μM、0.019μM、0.019μM、0.038μM、0.038μM、0.075μM、0.075μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.019μM、0.019μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.056μM、0.056μM、0.023μM、0.023μM、0.15μM、0.15μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.023μM、0.023μM、0.015μM、0.015μM、0.019μM、0.019μM、0.113μM、0.113μM、0.15μM、0.15μM、0.068μM、0.068μM、0.03μM、0.03μM、0.045μM、0.045μM、0.068μM、0.068μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.038μM、0.038μM、0.094μM、0.094μM、0.038μM、0.038μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.038μM、0.038μM、0.019μM、0.019μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.03μM、0.03μM、0.045μM、0.045μM、0.045μM、0.045μM、0.075μM、0.075μM、0.03μM、0.03μM、0.056μM、0.056μM、0.113μM、0.113μM、0.045μM、0.045μM、0.038μM、0.038μM、0.019μM、0.019μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.03μM、0.03μM、0.019μM、0.019μM、0.045μM和0.045μM。
5.一种基于权利要求3中所述68个基因座的复合扩增体系，由权利要求1或2所述的引物组合和进行PCR扩增反应所需的试剂组成；所述进行PCR扩增反应所需的试剂不包括PCR扩增反应所需的引物。
6.如权利要求5所述复合扩增体系，其特征在于：引物1—引物120在所述复合扩增体系中的浓度分别为0.03μM、0.03μM、0.075μM、0.075μM、0.056μM、0.056μM、0.188μM、0.188μM、0.038μM、0.038μM、0.113μM、0.113μM、0.019μM、0.019μM、0.038μM、0.038μM、0.075μM、0.075μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.019μM、0.019μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.056μM、0.056μM、0.023μM、0.023μM、0.15μM、0.15μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.03μM、0.023μM、0.023μM、0.015μM、0.015μM、0.019μM、0.019μM、0.113μM、0.113μM、0.15μM、0.15μM、0.068μM、0.068μM、0.03μM、0.03μM、0.045μM、0.045μM、0.068μM、0.068μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.038μM、0.038μM、0.094μM、0.094μM、0.038μM、0.038μM、0.03μM、0.03μM、0.038μM、0.038μM、0.038μM、0.038μM、0.019μM、0.019μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.03μM、0.03μM、0.045μM、0.045μM、0.045μM、0.045μM、0.075μM、0.075μM、0.03μM、0.03μM、0.056μM、0.056μM、0.113μM、0.113μM、0.045μM、0.045μM、0.038μM、0.038μM、0.019μM、0.019μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.023μM、0.023μM、0.045μM、0.045μM、0.03μM、0.03μM、0.019μM、0.019μM、0.045μM和0.045μM。
7.含有权利要求1或2所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为STR分型。
8.含有权利要求1或2所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为Y-STR分型。
9.含有权利要求1或2所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为个体识别。
10.含有权利要求1或2所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为亲权鉴定。
11.含有权利要求1或2所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为种族推断。
12.权利要求3至6任一所述复合扩增体系或权利要求7至11任一所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1或2所述引物组合中的各条引物单独包装的步骤。
13.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为STR分型。
14.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为Y-STR分型。
15.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为个体识别。
16.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为亲权鉴定。
17.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系，在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为种族推断。
18.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系在STR分型中的应用。
19.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系在Y-STR分型中的应用。
20.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系在个体识别中的应用。
21.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系在亲权鉴定中的应用。
22.权利要求1或2所述引物组合或权利要求3至6任一所述复合扩增体系在种族推断中的应用。
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