CN109439765A

CN109439765A - 一种同时检测60个常染色体及y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN109439765A
Application number: CN201811384603.0A
Authority: CN
Inventors: 葛斌文; 黄春丽; 高智勇; 张明航; 赵晓芳; 苏雪峰; 王宇峰
Original assignee: Jiangsu Biomedical Ltd By Share Ltd; Jiangsu Su Bo Biomedical Science And Technology Nanjing Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Biomedical Ltd By Share Ltd; Jiangsu Su Bo Biomedical Science And Technology Nanjing Co Ltd
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2038-11-20
Also published as: CN109439765B

Abstract

本发明公开了一种同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，采用聚合酶链式反应，复合扩增60个基因座，其扩增产物用基因测序仪进行检测。本发明可同时检测60个常染色体及Y染色体基因座，这是目前用毛细管电泳法一次反应检测STR基因座最多的，一次反应可同时完成常染色体STR和Y染色体STR建库；本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类男性血液或口腔细胞；本试剂盒具有较强的扩增特异性和较高的温度耐受性。

Description

一种同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

短串联重复序列(简称STR)也称微卫星DNA，是一类广泛存在于原核及真核生物基因组中的核苷酸重复序列。其一般由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。

近年来，全国公安机关DNA数据库的库容量突飞猛进，利用DNA数据库直接破获的案件越来越多。常规DNA数据库是“一对一、点对点”的比对模式，需要相应的参照比对样本才能进行认定或者排除，而Y-STR数据库则是“以点带面”的比对模式，比中嫌疑人所属的家系即可极大缩小侦查范围。用于比对的Y-STR基因座数量影响比对的效率。公安机关对于用于建库的Y-STR基因座有推荐数量，包括20个必选(DYS19， DYS385a，DYS385b，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS391，DYS392，DYS393， DYS437，DYS438，DYS439，DYS456，DYS458，DYS448，DYS635，Y_GATA_，H4， DYS481，DYS533和DYS576)，15个优选基因座(DYS460，DYS549，DYF387S1a， DYF387S1b，DYS449，DYS518，DYS627，DYS570，DYS527a，DYS527b，DYS447， DYS444，DYS557，DYS643和DYS596)。常染色体基因座目前可以入库的基因座D7S820， D1S1656，D12S391，D21S11，CSF1PO，D5S818，PentaD，D19S433，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，D6S1043，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D18S51，D2S1338和 PentaE共20个。

目前常染色体建库和Y染色体建库多数还是分开进行，至少需要两次实验。少数如无锡中德美联(有同时检测34个DNA基因座(15个常染色体STR基因座，1个性别基因座以及18个Y-STR基因座)的六色试剂盒(专利201510477236.9)，和检测同时检测39 个位点的试剂盒，其中18个A-STR、20个Y-STR及性别(Amel)位点(专利 201810051679.5)，宁波海尔施基因科技公司的Compass人类DNA身份鉴定试剂盒同时检测15个常染色体基因座、17个Y染色体基因座及1个性别基因座Amel，这三种产品都是采用六色荧光标记，受检测片段大小限制，一次检测满足不了常染20个STR 基因座、Y染色体建库35个STR基因座的要求。

发明内容

本发明提供一种同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，并应用于人类常染色体，Y染色体基因座复合扩增，具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点，可用于中国人群个体识别、性犯罪等男女混合斑中男性罪犯个体识别、亲子鉴定等，一次反应满足常染色体DNA建库及Y染色体DNA建库需求。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，采用聚合酶链式反应，复合扩增60个基因座，其扩增产物用基因测序仪进行检测。

本申请采用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座，具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点。

上述60个基因座包括39个Y基因座、20个常染色体基因座及1个性别基因座。

39个Y基因座包括36个Y-STR基因座和3个极低突变频率的YIndel基因座，36 个Y-STR基因座为DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS533，DYS627，DYS391， DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448，DYS518，DYS460，DYS459，DYS19， DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a，DYS385b，DYS393，DYS570，DYS390， DYS438，Y_GATA_H4，DYS449，DYS645，DYS549，DYS447，DYS444，DYS643， DYS557，DYS596，DYS527a和DYS527b；3个极低突变频率的YIndel基因座为 rs771783753，rs759551978和rs199815934。

20个常染色体基因座为D7S820，D1S1656，D12S391，D21S11，CSF1PO，D5S818，PentaD，D19S433，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，D6S1043，D3S1358，TH01，D13S317， D16S539，D18S51，D2S1338和PentaE。

为了提高检测的准确性，扩增时，60个基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物荧光染料标记方法进行标记，将引物混合，构成复合扩增引物。

首先针对上述60个基因座目标区域的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃，扩增产物的长度范围在60-640bp，并对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形锋利、峰高较高的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。

上述DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同，DYS527a和DYS527b扩增引物相同。

引物5′端第1个碱基用FAM、TET、HEX、TAMRA、ATTO555、ATTO565、ROX、 ATTOrho101或ATTO590中的一种进行标记，其中，用TAMRA、ATTO555、ATTO565、 ROX、ATTOrho101和ATTO590标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记。

本发明提供了一种八色荧光标记方法，并应用于人类常染色体，Y染色体基因座复合扩增，具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点，满足中国人群个体识别，性犯罪等男女混合斑中男性罪犯个体识别，亲子鉴定，一次反应满足常染色体DNA建库及Y染色体 DNA建库需求。

基因座分为下列七组，第一组：rs771783753，DYS481，DYS389I/II，DYS635，DYS533， DYS627，DYS391，D7S820和D1S1656；第二组：DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448，DYS518，D12S391和D21S11；第三组：rs1759551978，DYS460，DYS459， DYS19，DYF387S1a/b，DYS456，DYS385a/b，CSF1PO和D5S818；第四组：DYS393， DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，DYS449和PentaD；第五组rs199815934， D19S433，vWA，D8S1179，TPOX，FGA和D6S1043；第六组AmelogeninX/Y，D3S1358， TH01，D13S317，D16S539，D18S51，D2S1338和PentaE；第七组DYS645，DYS549， DYS447，DYS444，DYS643，DYS557，DYS596和DYS527a/b；第一组的引物5′端第一个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用TET标记；第三组的引物5′端第一个碱基用HEX标记，第四组的引物5′端第一个碱基用TAMRA或ATTO550标记、第六个碱基用FAM标记；第五组的引物5′端第一个碱基用ATTO565标记、第六个碱基用FAM 标记；第六组的引物5′端第一个碱基用ROX或ATTOrho101标记、第六个碱基用FAM 标记；第七组的引物5′端第一个碱基用ATTO590标记、第六个碱基用FAM标记。第八色为分子量内标，按专利201610988458.1方法，以Atto633进行标记。引物5 撇端的3个碱基硫代修饰，以提高引物的稳定性。引物在上海生工合成。最终的扩增产物大小在60-610bp，60个基因座排布见图1。

引物序列、荧光标记、其对应编号以及扩增系统中各条引物浓度如表1所示：

表1

注：上游引物5撇端标记FAM，TET，HEX，TAMRA(或ATTO550)，ATTO565，ROX(或ATTOrho101)，ATTO590；中间斜体加下划线碱基以FAM修饰；上下游引物5撇端3个碱基硫代修饰。

本发明中的模板DNA为人类男性基因组DNA。通过各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法和Chelex100纯化等方法提取的DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、肌肉或组织器官等，DNA也可以是免提取的滤纸、FTA卡、棉签或纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。DNA模板量优选在0.1ng至2ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致检测时荧光信号超出检测范围，但可通过减少PCR循环数解决。

扩增采用聚合酶链式反应，反应可在一定的缓冲体系中进行，2×PCR Master MIX缓冲液组分为：4mM MgCl2，100mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，50mM KCl，16mM (NH4)₂SO₄，0.4mM dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物)，1.2g/L BSA，1.6％ NP40，1％Tween20(以上原料购自美国Sigma-Aldrich公司)及0.4U/ul热启动taq酶。

反应所需的DNA聚合酶为热启动耐热DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰。每个扩增体系(25μL)需要2.5U至5U的耐热DNA聚合酶。本发明的扩增体系除了引物混合物，PCR反应Master Mix之外，还包括毛细管电泳检测分型的带荧光标记的分子量内标和等位基因阶梯。

本试剂盒适应不同检材的扩增，具有较大的退火温度范围，扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI2720、Bio-Rad T100和博日Life Pro等)采用以下的程序可以得到较好的结果：预变性95℃ 1分钟；94℃ 2秒钟；60℃ 1分钟；26-28个循环；60℃终延伸5分钟；4-16℃保持。

在上述反应缓冲体系中按照特定的PCR程序扩增模板DNA，可以得到混合的各基因座扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物进行扩增，使得扩增产物也带有荧光标记物，并且可以在激光激发下发出能够被遗传分析仪识别的光信号，通过引物设计和不同荧光素的标记，各基因座扩增片段具有不同长度和不同的荧光标记，所以扩增产物可以在遗传分析仪上电泳分离后进行检测分析。目前只有南京溯远基因科技有限公司的溯远HONOR-100型DNA测序仪支持八色荧光检测，本发明在该机器上运行。

在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时，首先将扩增产物、分子量内标(InternalLane Standard)和甲酰胺按照一定的比例混合，随后混合物进入仪器毛细管或凝胶中进行电泳分离。分子量内标是由多条带有荧光标记的已知长度的DNA片段组成，可用来衡量PCR扩增产物片段长度，从而计算等位基因的大小，与等位基因阶梯进行比对可推测等位基因分型。电泳后的数据可以在GeneMapper、PeakScanner和GeneScan等数据分析软件上进行分析，从而得到分型的图谱和数据。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明有益效果如下：

1、可同时检测60个常染色体及Y染色体基因座，这是目前用毛细管电泳法一次反应检测STR基因座最多的，一次反应可同时完成常染色体STR和Y染色体STR建库。

2、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类男性血液或口腔细胞。

3、本试剂盒中的特异性引物，具有较强的扩增特异性(除各基因座的扩增峰外，不存在干扰分析结果的杂峰)和较高的温度耐受性(温度耐受范围较广，保证在使用不同品牌或质量的PCR扩增仪时均能得到较好的扩增结果)，对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌这十种不同种属物种的DNA进行检测，无扩增峰出现，本发明具有良好的种属特异性。

4、进一步采用了八色荧光标记，首次公开了八色荧光标记系统。

附图说明

图1为检测试剂的STR位点排布图；

图2为实施例2中本发明试剂盒60个基因座等位基因分型标准物图；

图3为实施例2中本发明扩增男性DNA标准品扩增图；

图4为实施例3中本发明扩增男女混合样本扩增图；

图5为实施例3中本发明扩增男女混合样本扩增电泳图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1.常加Y复合扩增试剂的制备

1.复合扩增检测系统位点的排布

本发明同时扩增60个基因座，分为七组，第一组：rs771783753，DYS481，DYS389I/II， DYS635，DYS533，DYS627，DYS391，D7S820和D1S1656；第二组：DYS576，DYS437， DYS439，DYS392，DYS448，DYS518，D12S391和D21S11；第三组：rs1759551978， DYS460，DYS459，DYS19，DYF387S1a/b，DYS456，DYS385a/b，CSF1PO和D5S818；第四组：DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，DYS449和PentaD；第五组rs199815934，D19S433，vWA，D8S1179，TPOX，FGA和D6S1043；第六组Amelogenin X/Y，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D18S51，D2S1338和PentaE；第七组DYS645， DYS549，DYS447，DYS444，DYS643，DYS557，DYS596和DYS527a/b。第一组的引物5′端第一个碱基用FAM；第二组的引物5′端第一个碱基用TET标记；第三组的引物5′端第一个碱基用HEX，第四组的引物5′端第一个碱基用TAMRA或ATTO550、第六个碱基用FAM标记；第五组的引物5′端第一个碱基用ATTO 565、第六个碱基用FAM标记；第六组的引物5′端第一个碱基用ROX或ATTO rho101、第六个碱基用FAM标记；第七组的引物5′端第一个碱基用ATTO590、第六个碱基用FAM标记。第八色为分子量内标，按专利201610988458.1方法，以atto 633进行标记。引物5撇端的3个碱基硫代修饰，以提高引物的稳定性。引物在上海生工合成。上述STR位点的排布方式如图1所示。

2.Y-STR复合扩增体系专用引物

根据上述位点设计复合扩增引物、引物序列、引物浓度及荧光素标记方式如表1所示。

3.荧光复合扩增验证系统的制备

试剂盒包括以下成份：

表2试剂盒成分

5×Primers为表1所示的110条引物按照表1所示的浓度进行混匀。

每25μL的PCR扩增体系如表3：

表3

表4为2×PCR Master Mix的组分

PCR扩增体系即为配制好进行PCR反应的各组分混合物。

MgCl₂，Tris-HCl(pH8.3，25℃)，KCl，(NH4)₂SO₄，dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物)，BSA，NP40，Tween20购自美国Sigma-Aldrich 公司，热启动taq酶购自大连宝生物。

本发明还提供了用于分析的等位基因分型标准物，等位基因分型标准物由各个基因座引物分别扩增对应等位基因的扩增产物混合组成。图2为 Allellic ladder电泳图谱。男性DNA标准品9948购自美国Promega公司。

实施例2.复合扩增验证试剂的应用

1.样本扩增

将24μL由实例1制备的DNA检验试剂加入1μL的0.5ng/μL男性DNA标准品9948，进行PCR扩增。

PCR扩增程序为：95℃ 1分钟；94℃ 2秒钟、60℃ 1分钟，26个循环；60℃终延伸5分钟；4-16℃保持。

2.PCR产物的检测

扩增反应结束后，取出反应管，用南京溯源honor1816遗传分析仪进行电泳和检测。

1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管 10μL。

2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(ladder)，短暂离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中。

3)设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳。检测大约40分钟后，电泳结束。随后，用GeneMarker软件进行数据分析，其检测结果如下图3所示，上述男性DNA标准品得到完整的STR分型。

实施例3.复合扩增验证试剂对男女血滤纸样本的扩增

将24μL由实施例1制备的DNA检验试剂加入1.2mm的男(女)血滤纸样本，按照实施例2的配置扩增体系，PCR扩增程序为：95℃1分钟；94℃2秒钟；60℃1分钟；28 个循环；60℃终延伸5分钟；4-16℃保持。按照实施例2中PCR产物的检测流程进行检测。其检测结果如图4，5所示，男性样本全部基因座检出，女性样本Y基因座未检出，常染色体分型全部检出。说明试剂盒男女DNA特异性很好。分析结果与江苏苏博YESU 21plex及Y45SE试剂盒比较(按说明书操作)，基因座相同的分型结果一致。男血滤纸分型见表5，扩增图如图4；女性样本分型结果见表3，扩增电泳图如图4。但是实验操作时间，扩增电泳时间都减少了一半。

表5男性血滤纸样本分型，与21Plex及Y45SE比较

	本发明	21PLEX	Y45SE		本发明	21PLEX	Y45SE		本发明	21PLEX	Y45SE
												rs77178375	32	NA	2	DYS439	11	NA	11	D3S1358	15,17	15,17	NA
DYS481	23	NA	23	DYS392	12	NA	12	vWA	13,16	13,16	NA
												DYS389I	11	NA	11	DYS448	20	NA	20	D7S820	11	11	NA
DYS635	23	NA	23	DYS518	40	NA	40	CSF1PO	9,11	9,11	NA
												DYS389II	27	NA	27	DYS522	NA	NA	11,12	Penta E	11	11	NA
DYS533	11	NA	11	DYS456	15	NA	15	D8S1179	11,13	11,13	NA
												DYS627	21	NA	21	DYS570	21	NA	21	D21S11	30,32.2	30,32.2	NA
DYS527	20,22	NA	20,22	DYS390	23	NA	23	D16S539	9,11	9,11	NA
												DYS576	20	NA	20	DYS438	10	NA	10	D2S1338	20,23	20,23	NA
DYS460	9	NA	9	Y_GATA_H	412	NA	12	Penta D	13,16	13,16	NA
												DYS458	17	NA	17	DYS449	34	NA	34	D19S433	13.2,14	13.2,14	NA
DYS19	16	NA	16	DYS645	8	NA	8	TH01	9	9	NA
												DYF387S1	37,40	NA	37,40	DYS437	15	NA	15	D13S317	11,17	11,17	NA
DYS444	20	NA	20	DYS447	15	NA	15	TPOX	8,11	8,11	NA
												DYS385	13,20	NA	13,20	DYS391	10	NA	10	D18S51	11,22	11,22	NA
DYS593	NA	NA	16	DYS643	10	NA	10	D6S1043	11,18	11,18	NA
												rs75955197	82	NA	2	DYS557	15	NA	15	D1S1656	11,14	11,14	NA
rs19981593	41	NA	1	DYS596	15	NA	15	D5S818	13	13	NA
												DYS393	13	NA	13	DYF404S1	NA	NA	13,17	D12S391	22	22	NA
DYS549	12	NA	12	DYS459	NA	NA	9,10	FGA	22	22	NA
																				AMEL	X,Y	X,Y	NA

NA表示该试剂盒不包含此基因座。

表6女性血滤纸样本分型结果，与21Plex及Y45SE比较

NA表示该试剂盒不包含此基因座，-表示未检出。

Claims

1.一种同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：采用聚合酶链式反应，复合扩增60个基因座，其扩增产物用基因测序仪进行检测。

2.如权利要求1所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：60个基因座包括39个Y基因座、20个常染色体基因座及1个性别基因座。

3.如权利要求2所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：39个Y基因座包括36个Y-STR基因座和3个极低突变频率的Y Indel基因座，36个Y-STR基因座为DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS533，DYS627，DYS391，DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448，DYS518，DYS460，DYS459，DYS19，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a，DYS385b，DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，DYS449，DYS645，DYS549，DYS447，DYS444，DYS643，DYS557，DYS596，DYS527a和DYS527b；3个极低突变频率的YIndel基因座为rs771783753，rs759551978和rs199815934。

4.如权利要求2所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：20个常染色体基因座为D7S820，D1S1656，D12S391，D21S11，CSF1PO，D5S818，Penta D，D19S433，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，D6S1043，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D18S51，D2S1338和Penta E。

5.如权利要求1-4任意一项所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：扩增时，60个基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物荧光染料标记方法进行标记，将引物混合，构成复合扩增引物。

6.如权利要求1-4任意一项所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同，DYS527a和DYS527b扩增引物相同；60个基因座对应的引物对的序列依次如下：

7.如权利要求6所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：引物5′端第1个碱基用FAM、TET、HEX、TAMRA、ATTO555、ATTO 565、ROX、ATTOrho101或ATTO590中的一种进行标记，其中，用TAMRA、ATTO555、ATTO 565、ROX、ATTO rho101和ATTO590标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记。

8.如权利要求7所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：基因座分为下列七组，第一组：rs771783753，DYS481，DYS389I/II，DYS635，DYS533，DYS627，DYS391，D7S820和D1S1656；第二组：DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448，DYS518，D12S391和D21S11；第三组：rs1759551978，DYS460，DYS459，DYS19，DYF387S1a/b，DYS456，DYS385a/b，CSF1PO和D5S818；第四组：DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，DYS449和Penta D；第五组rs199815934，D19S433，vWA，D8S1179，TPOX，FGA和D6S1043；第六组Amelogenin X/Y，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D18S51，D2S1338和Penta E；第七组DYS645，DYS549，DYS447，DYS444，DYS643，DYS557，DYS596和DYS527a/b；第一组的引物5′端第一个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用TET标记；第三组的引物5′端第一个碱基用HEX标记，第四组的引物5′端第一个碱基用TAMRA或ATTO 550标记、第六个碱基用FAM标记；第五组的引物5′端第一个碱基用ATTO 565标记、第六个碱基用FAM标记；第六组的引物5′端第一个碱基用ROX或ATTO rho101标记、第六个碱基用FAM标记；第七组的引物5′端第一个碱基用ATTO590标记、第六个碱基用FAM标记。

9.如权利要求1-4任意一项所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：适用的样本DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种方法提取的男性基因组DNA，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签或纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。

10.如权利要求1-4任意一项所述的同时检测60个常染色体及Y染色体基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：扩增程序为：95℃1分钟；94℃2秒钟；60℃60秒钟；26-28个循环；60℃终延伸5分钟；4-16℃保持；扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用Genemarker片段分析软件进行数据的分析。