CN106834456A - 一种采用新型荧光标记方法标记的y‑str复合扩增检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种采用新型荧光标记方法标记的y‑str复合扩增检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用新型荧光标记方法标记的Y‑STR复合扩增检测试剂盒及其使用方法，Y‑STR复合扩增检测试剂盒采用聚合酶链式反应，以复合扩增引物进行27个Y‑STR基因座的复合扩增；扩增产物采用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测；27个Y‑STR基因座包括20个常规的低突变率基因座以及7个快速突变型基因座；新型荧光标记方法是在引物5′端第一个碱基用常规染料标记，第六个碱基用短激发波长荧光染料标记，以实现荧光能量转移，该方法产生的信号强度比常规方法高2‑10倍，可以得到更加稳定均衡和更高的灵敏度的扩增结果。

Description

一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂 盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
短串联重复序列(简称STR)也称微卫星DNA，是一类广泛存在于原核及真核生物基因组中的核苷酸重复序列。其一般由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。
人类Y染色体的遗传多态性具有多个研究优势，如在遗传过程中不与另外的染色体发生重组，而突变是多样性改变的唯一因素，使得按年代先后发生的各种稳定的单倍型得以保存和进化，从而能够构建出很清楚的Y染色体基因进化谱系树；Y染色体的序列结构特征能稳定地由父亲传给儿子并为男性所特有，具有父系遗传特点；非重组区域具有较低的群体内多态性和较高的群体间变异，易产生人群特异性的单倍型，从而使得其分布方式具有极高的地理特异性；Y染色体非重组区域发生回复、平行突变的概率非常低，增加了Y染色体基因谱系树的可靠性；非重组区域突变率相对稳定，能够很好的区分群体间亲缘关系，STR的突变率高，能够很好区分近代人群个体之间的亲缘关系。
早期的Y-STR复合扩增体系中仅包含有12个左右的Y-STR基因座，而随着DNA作为鉴定手段的应用愈加广泛、数据比对的增加和Y-STR父系遗传的特性不断研究，这就需要更多的基因座来提供更多的信息量以满足各方面的需求，比如在亲子鉴定、失踪人口比对时，为了避免误判的发生，往往需要辅助多种试剂盒进行联合使用，以达到检测的准确度要求。另外，随着我国DNA数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用也愈发的重要，这就需要STR试剂盒在基因座位上具有较高的兼容性。
表1是目前市场上同类型的Y染色体STR试剂盒。目前市场上国产试剂盒一般采用FAM、HEX、TAMRA、ROX和ATTO633这5种荧光染料对引物和内标进行标记，测序仪采用的是单一激光，波长为488nm，而这些荧光染料激发波长却分布在500nm到650nm之间。随着染料激发波长的变大，相同量荧光标记产物，被测序仪激光激发产生的荧光信号逐渐减少，TAMRA和ROX荧光效率远远低于FAM和HEX。特别的，ROX染料标记比FAM标记，相同量的产物，信号强度只有四分之一到八分之一，在这样大的荧光效率差异下，获得各个荧光通道间的较好的均衡性以及较高的灵敏度变的很困难。
表1.与市面上主流商业化常Y-STR荧光检测试剂盒基因座对比
注：+表示被包括的基因座，-表示不包括的基因座
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒及其使用方法，应用于人类Y染色体27个STR基因座的复合扩增，具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点，满足中国人群个体识别、性犯罪等男女混合斑中男性罪犯个体识别，亲子鉴定，Y染色体DNA建库需求。
本发明的技术方案如下：
一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，包括：
所述Y-STR复合扩增检测试剂盒采用聚合酶链式反应，以复合扩增引物进行27个Y-STR基因座的复合扩增；扩增产物采用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测；
所述27个Y-STR基因座包括20个常规的低突变率基因座DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437，DYS385a，DYS385b；以及7个快速突变型基因座DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS449和DYS518；
所述复合扩增引物包括27个Y-STR基因座对应的引物对序列，所述引物对序列包括SEQ ID NO.01-SEQ ID NO.48。
在上述技术方案中，所述27个Y-STR基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物采用新型荧光染料标记方法进行标记；该27对引物按一定浓度混合，构成复合扩增引物。
在上述技术方案中，所述新型荧光染料标记方法为在引物5′端第1个碱基用FAM、HEX、TAMRA和ROX中的一种进行标记；其中，用FAM、TAMRA和ROX标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记；用HEX标记的引物，引物5′端第六个碱基用HEX进行标记。
在上述技术方案中，在所述复合扩增引物中，其中的DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同。
在上述技术方案中，所述27个Y-STR基因座分为以下四组，第一组：DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS391，DYS533和DYS627；第二组：DYS460，DYS458，DYS19，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a和DYS385b；第三组：DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448和DYS518；第四组：DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4和DYS449；其中，第一组的引物5′端第一个碱基用FAM、第六个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用HEX、第六个碱基用HEX标记；第三组的引物5′端第一个碱基用TAMRA、第六个碱基用FAM标记；第四组的引物5′端第一个碱基用ROX、第六个碱基用FAM标记。
在上述技术方案中，所述Y-STR复合扩增检测试剂盒适用的样品DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA，所述男性基因组DNA的提取检材的来源包括男性的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。
本发明还公开了一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将所述Y-STR复合扩增检测试剂盒的盒内试剂与样品DNA混合、装入PCR扩增管，然后置于热循环仪上，进行PCR扩增，PCR扩增的扩增程序为95℃3分钟94℃5秒钟；60℃1分钟，26-28个循环；60℃终延伸10分钟；最后4-16℃保持；扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件进行数据的分析。
本发明的有益效果是：
1、同时复合扩增27个基因座，包含目前常用的20个低突变率基因座：DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I/II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437和DYS385a/b；还包括7个快速突变型基因座：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a/b，DYS449和DYS518；
2、采用新型荧光标记方法进行标记，荧光效率高，确保了更快的扩增速度、更好的均衡性和更高的灵敏度；
3、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类男性血液或口腔细胞；
4、本试剂盒中的特异性引物，具有较强的扩增特异性(除各基因座的扩增峰外，不存在干扰分析结果的杂峰)和较高的温度耐受性(温度耐受范围较广，保证在使用不同品牌或质量的PCR扩增仪时均能得到较好的扩增结果)；对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌这十种不同种属物种的DNA进行检测，无扩增峰出现，本发明具有良好的种属特异性。
附图说明
图1是Y-STR检测试剂的STR位点排布图；
图2是实施例2中本发明试剂盒27个基因座等位基因分型标准物图；
图3是实施例2中本发明扩增男性DNA标准品扩增图；
图4是实施例3中本发明扩增男女混合样本扩增图；
图5是实施例4和实施例5中本发明所用的双荧光标记方法的扩增灵敏度图；
图6是实施例4和实施例5中使用常规单荧光标记方法的扩增灵敏度图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如图所示，本发明公开一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，包括：
所述Y-STR复合扩增检测试剂盒采用聚合酶链式反应，以复合扩增引物进行27个Y-STR基因座的复合扩增；扩增产物采用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测；
所述27个Y-STR基因座包括20个常规的低突变率基因座DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437，DYS385a，DYS385b；以及7个快速突变型基因座DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS449和DYS518；
所述复合扩增引物包括27个Y-STR基因座对应的引物对序列，所述引物对序列包括SEQ ID NO.01-SEQ ID NO.48。
在上述技术方案中，所述27个Y-STR基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物采用新型荧光染料标记方法进行标记；该27对引物按一定浓度混合，构成复合扩增引物。
在上述技术方案中，所述新型荧光染料标记方法为在引物5′端第1个碱基用FAM、HEX、TAMRA和ROX中的一种进行标记；其中，用FAM、TAMRA和ROX标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记；用HEX标记的引物，引物5′端第六个碱基用HEX进行标记。
在上述技术方案中，在所述复合扩增引物中，其中的DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同。
在上述技术方案中，所述27个Y-STR基因座分为以下四组，第一组：DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS391，DYS533和DYS627；第二组：DYS460，DYS458，DYS19，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a和DYS385b；第三组：DYS576，DY8437，DYS439，DYS392，DYS448和DYS518；第四组：DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4和DYS449；其中，第一组的引物5′端第一个碱基用FAM、第六个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用HEX、第六个碱基用HEX标记；第三组的引物5′端第一个碱基用TAMRA、第六个碱基用FAM标记；第四组的引物5′端第一个碱基用ROX、第六个碱基用FAM标记。
在上述技术方案中，所述Y-STR复合扩增检测试剂盒适用的样品DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA，所述男性基因组DNA的提取检材的来源包括男性的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。
本发明还公开了一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将所述Y-STR复合扩增检测试剂盒的盒内试剂与样品DNA混合、装入PCR扩增管，然后置于热循环仪上，进行PCR扩增，PCR扩增的扩增程序为95℃3分钟；94。℃5秒钟；60℃1分钟，26-28个循环；60。℃终延伸10分钟；最后4-16。℃保持；扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件进行数据的分析。
具体来说，首先针对上述27个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃，扩增产物的长度范围为111-463bp，并对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形锋利、峰高较高的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。
根据上述27个基因座的特点，将上述基因座分为四组，第一组：DYS481，DYS389I/II，DYS635，DYS391，DYS533和DYS627；第二组：DYS460，DYS458，DYS19，DYF387S1a/b，DYS456和DYS385a/b；第三组：DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448和DYS518；第四组：DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4和DYS449。使用一种新型的荧光染料标记方法，对每对引物的其中一条进行标记。根据扩增产物的长度差异，将每组之中各基因座分开，保证两个基因座不能有重叠。
上述新型的荧光染料标记的具体方法为：在引物5′端的第一位碱基上标记TAMRA或ROX，5′端的第六位碱基上标记FAM。通过碱基位置，使得供体荧光分子(FAM)与受体荧光分子(TAMRA或ROX)靠近，产生FRET现象，从而使得TAMRA和ROX荧光效率提升8-10倍，而作为供体荧光分子的FAM并不影响TAMRA和ROX的发射波长。对于标记FAM或HEX的引物，分别在5′端第一个碱基和第六位碱基分别同时标记FAM或HEX，这种双FAM和
双HEX荧光的标记方法与普通单FAM和单HEX荧光的标记方法相比，效率可提高2-3倍。为了使整个体系背景荧光保持一致，需要使FRET的程度尽量接近一致，而第六位是荧光效率最高的位置，所以本发明所有中间荧光均选择标记在5′端第六位碱基，如表2所示，粗体和下划线标记的碱基分别为5′端第一和第六位荧光标记的碱基。
将四组引物每组分别由不同的荧光素进行标记，每对引物中只标记一条(表2中引物序列编号为奇数的全部标记荧光，而编号为偶数的全部不标记荧光)。第一组：双FAM标记(蓝色)；第二组：双HEX标记(绿色)；第三组：TAMRA-FAM标记(黄色)；第四组：ROX-FAM标记(红色)。复合扩增这四组中的27个基因座，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到40％以上。得到的引物混合物可以用于上述27个基因座复合扩增。
引物序列、荧光标记、其对应编号以及扩增系统中各条引物浓度如表2：
表2.本发明引物信息
注：加粗字体的为5′端荧光标记的碱基，下划线的为中间荧光标记的碱基，对应的荧光素为对应相同的加粗或下划线标记。
扩增采用聚合酶链式反应，反应可在一定的缓冲体系中进行，2.5×的缓冲液组分为：5mM MgCl2，125mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，125mM KCl，0.5mM dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物)，1.5g/L BSA。
反应所需的DNA聚合酶为热启动耐热DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰。每个扩增体系(25μL)需要2.5U至5U的耐热DNA聚合酶。本发明的扩增体系除了引物混合物、反应缓冲液合热启动耐热DNA聚合酶之外，还包括毛细管电泳检测分型的带荧光标记的分子量内标和等位基因阶梯。
本试剂盒适应不同检材的扩增，具有较大的退火温度范围，扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI2720、Bio-Rad T100和博日Life Pro等)采用以下的程序可以得到较好的结果。采用新的荧光标记方法，检测信号更强，扩增时间、循环相应比传统方法减少。相同引物，常规方法标记引物用量更多，扩增最佳程序为预变性95℃3分钟；94℃5秒钟、60℃1分钟，72度1min，28-30个循环；60℃终延伸30分钟；本发明引物及引物标记扩增程序：预变性95℃3分钟；94℃5秒钟、60℃1分钟，26-30个循环；60℃终延伸10分钟。
本发明中的模板DNA为人类男性基因组DNA。通过各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法和Chelex100纯化等方法提取的DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)和汗液等。DNA模板量优选在0.1ng至2ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致检测时荧光信号超出检测范围，但可通过减少PCR循环数解决。
在上述反应缓冲体系中按照特定的PCR程序扩增模板DNA，可以得到混合的各基因座扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物进行扩增，使得扩增产物也带有荧光标记物，并且可以在激光激发下发出能够被遗传分析仪(如ABI3100、3130、3730和3500)识别的光信号，通过引物设计和不同荧光素的标记，各基因座扩增片段具有不同长度和不同的荧光标记，所以扩增产物可以在遗传分析仪上电泳分离后进行检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时，首先将扩增产物、分子量内标(InternalLane Standard)和甲酰胺按照一定的比例混合，随后混合物进入仪器毛细管或凝胶中进行电泳分离。分子量内标是由多条带有荧光标记的已知长度的DNA片段组成，可用来衡量PCR扩增产物片段长度，从而计算等位基因的大小，与等位基因阶梯进行比对可推测等位基因分型。
电泳后的数据可以在GeneMapper、PeakScanner和GeneScan等数据分析软件上进行分析，从而得到Y-STR基因分型的图谱和数据
实施例1：Y-STR复合扩增试剂的制备
1.Y-STR复合扩增检测系统位点的排布
本发明的Y-STR试剂盒包含目前常用的20个低突变率基因座：DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533 DYS456，DYS389I/II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437和DYS385a/b；以及7个快速突变型位点：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a/b，DYS449和DYS518。
上述STR位点的排布方式如图1所示。
2.Y-STR复合扩增体系专用引物
根据上述位点设计复合扩增引物、引物序列、引物浓度及荧光素标记方式如表2所示。
3.Y-STR荧光复合扩增验证系统的制备
试剂盒包括以下成份：
5×Primers为表2所示的48条引物按照表2所示的浓度进行混匀。每25μL的PCR扩增体系如下：
下表为2.5×PCR Mix的组分
PCR扩增体系即为配制好进行PCR反应的各组分混合物。
因此，DNA检测试剂由具有表2所示浓度的复合扩增引物、浓度为5mM的MgCl2、终浓度为125mM的Tris-HCl、终浓度为125mM的KCl、终浓度为0.5mM的dNTPs、1.5mg/mL的BSA、5U/μL的DNA聚合酶和去离子超纯水组成。
Marker Orange-500按专利201610988458.1方法制备。本发明还提供了用于分析的等位基因分型标准物，各个基因座引物分别扩增对应等位基因，扩增产物组合而成。图2为Allellic ladder电泳图谱。DNA标准品DNA 9948购自美国Promega公司。热启动酶购自大连宝生物。
实施例2.Y-STR复合扩增验证试剂的应用
1.样本扩增
将24μL由实例1制备的DNA检验试剂加入1μL的0.5ng/μL男性DNA标准品M4615，进行PCR扩增。DNA标准品M4615购自苏州阅微基因技术有限公司。
PCR扩增程序为：95℃3分钟；94℃5秒钟、60℃1分钟，27个循环；60℃终延伸10分钟；4-16℃保持。
2.PCR产物的检测
扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测。
1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管10μL。
2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(ladder)，短暂离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中。
3)设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测大约40分钟后，电泳结束。随后，用Gene Mapper软件进行数据分析，其检测结果如图3所示，上述男性DNA标准品得到完整的STR分型，并且峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰，无stutter带，无非特异性人工产物出现。
实例3.Y-STR复合扩增验证试剂对男女混合斑中男性个体的识别
将24μL由实例1制备的DNA检验试剂加入1μL的男女性DNA混合物，其中，男性DNA样本M M46150.1ng，女性DNA样本9947A2ng。按照实施例2的加样体积及扩增程序进行扩增、检测。其检测结果如图4所示，上述混合样本能够检测到完整的男性DNA样本的STR分型，且对女性样本无扩增。
实施例4.Y-STR复合扩增验证试剂与市售试剂比较
1.样本扩增
187个无关男性血滤纸样本，由宿迁子渊司法鉴定所提供。样本之前经苏州阅微基因Microreader 24Y Direct ID System检测。采用5色荧光标记，多重扩增检测24个Y染色体STR基因座。阅微24Y所检测的位点中包含DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、YGATAH4、DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS576、DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643。每个样本经1.2mmHarris Micro-Punch打孔器(美国Harris公司)取一片样本，放入PCR管。按实施例2的加样体系配置，分装至PCR管。
PCR扩增程序为：95℃3分钟；94℃5秒钟、60℃1分钟，27个循环；60℃终延伸10分钟；4-16℃保持。
2.PCR产物的检测
扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3100遗传分析仪进行电泳和检测。
1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管10μL。
2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(ladder)，短暂离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中。
3)设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测大约40分钟后，电泳结束。随后，用Gene Mapper软件进行数据分析。
本发明对187例样本均获得完整分型，相同基因座检测结果与Microreader 24YDirect ID System检测结果一致。
实施例5.本发明与常规标记方法扩增体系的灵敏度比较
对本发明扩增男性DNA模版的灵敏度，与常规单荧光标记的引物进行对比。分别配制本发明的双荧光标记和常规单荧光标记的两组引物池，引物浓度按各自的最优条件组配，具体见下表。
单荧光标记和双荧光标记的引物分别进行灵敏度的测试，加入不同浓度的男性标准品DNA M4615(500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg)，扩增程序以各自最优程序进行，如下：
双荧光标记引物组：95℃3分钟；94℃5秒钟，60℃1分钟运行28个循环；60度10分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。
单荧光标记引物组：95℃3分钟；94℃10秒钟，60℃1分钟，72度1min，运行30个循环；60度30分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。
除了扩增程序外，其他按照实施例2的方法进行操作。检测结果：双荧光标记的灵敏度可达31.25pg，且色间峰高较均衡，如下图5所示。而常规单荧光标记灵敏度只能达到125pg，如图6所示。常规单荧光标记的引物扩增的色间均衡性和整体峰高不如双荧光标记的引物。采用双荧光标记的引物，由于信号的提高，引物用量较常规单荧光标记引物用量要少。尤其对于TAMRA和ROX这两种波长较大的荧光标记，常规单标记引物用量是双标记引物用量的数倍，然而扩增信号强度及均衡性仍不及双标记引物。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (7)

1.一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：
所述Y-STR复合扩增检测试剂盒采用聚合酶链式反应，以复合扩增引物进行27个Y-STR基因座的复合扩增；扩增产物采用单道或多道毛细管的基因测序仪进行检测；
所述27个Y-STR基因座包括20个常规的低突变率基因座DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437，DYS385a，DYS385b；以及7个快速突变型基因座DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS449和DYS518；
所述复合扩增引物包括27个Y-STR基因座对应的引物对序列，所述引物对序列包括SEQID NO.01-SEQ ID NO.48。
2.根据权利要求1所述的一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述27个Y-STR基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物采用新型荧光染料标记方法进行标记；该27对引物按一定浓度混合，构成复合扩增引物。
3.根据权利要求1或2所述的一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述新型荧光染料标记方法为在引物5′端第1个碱基用FAM、HEX、TAMRA和ROX中的一种进行标记；其中，用FAM、TAMRA和ROX标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记；用HEX标记的引物，引物5′端第六个碱基用HEX进行标记。
4.根据权利要求1或2所述的一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：在所述复合扩增引物中，其中的DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同。
5.根据权利要求1所述的一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述27个Y-STR基因座分为以下四组，第一组：DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS391，DYS533和DYS627；第二组：DYS460，DYS458，DYS19，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a和DYS385b；第三组：DYS576，DYS437，DYS439，DYS392，DYS448和DYS518；第四组：DYS393，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4和DYS449；其中，第一组的引物5′端第一个碱基用FAM、第六个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用HEX、第六个碱基用HEX标记；第三组的引物5′端第一个碱基用TAMRA、第六个碱基用FAM标记；第四组的引物5′端第一个碱基用ROX、第六个碱基用FAM标记。
6.根据权利要求1所述的一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述Y-STR复合扩增检测试剂盒适用的样品DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA，所述男性基因组DNA的提取检材的来源包括男性的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。
7.根据权利要求1-6所述的一种采用新型荧光标记方法标记的Y-STR复合扩增检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述Y-STR复合扩增检测试剂盒的盒内试剂与样品DNA混合、装入PCR扩增管，然后置于热循环仪上，进行PCR扩增，PCR扩增的扩增程序为95℃ 3分钟；94℃ 5秒钟；60℃ 1分钟，26-28个循环；60℃终延伸10分钟；最后4-16℃保持；扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件进行数据的分析。
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