CN105177146A - 人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，可在单个反应中多重扩增Y染色体上27个低突变率STR基因座。本发明通过设计独特的基因座排布方式及特异性的引物序列，将27个基因座分为4组，每组分别标记不同的荧光标记。本发明的复合扩增系统为市面上检测基因座数量最多的Y-STR试剂盒之一，而且包含的基因座全部为低突变率Y-STR基因座，更加适合男性家系排查。该复合扩增系统引物特异性好、温度耐受范围广、检材适应性强。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，可应用于建库排查、亲权鉴定及DNA家谱构建等方面。
背景技术
STR遗传标记又称微卫星DNA，其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由2～6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。
Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座已有220多个，将已发现的Y染色体STR遗传标记与常染色体STR遗传标记相比，大多数Y染色体STR遗传标记具有复杂重复结构，含有两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体遗传多态性。Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。
法医上将突变率高于1％的基因座称为快速突变基因座(RapidlyMutatingY-STR)。快速突变基因座具有较高的相关男性区分能力，而且一般具有较高的多态性，但基因座突变率较高会干扰某些情况的Y-STR家系排查。
目前法医上利用Y-STR进行建库，主要功能是家系排查，缩小嫌疑人范围，而非认定嫌疑人。在中国，特别是农村，主要是家族聚居的方式，在Y-STR建库的实际操作过程中，往往只对一个大家族中一个或者几个成员进行采样建库，这样在花费较小的情况下就能利用Y-STR快速缩小侦查范围，然后通过比对常染色体STR，对嫌疑人进行认定。由于Y-STR建库采样的一个或几个人即代表了整个家系的Y-STR信息，这就存在一种不利的情况：嫌疑人属于此家系一员，但与建库对象Y-STR有3个或更多基因座分型不一致，此时容易将嫌疑人所属的真实家系排除。如果建库试剂盒中快速突变基因座较多，那么这种可能性会变得非常高。另一方面，由于Y-STR建库主要目的不是认定嫌疑人，不需要区分相关男性，因而快速突变基因座的优势在这里用处不大。所以，不建议在这种情况下使用快速突变率的基因座。然而，低突变率基因座往往多态性较低，不利于家系之间的区分。因此，需要基因座的数量要多，同时基因座的多态性要高，以保证Y-STR试剂盒具有足够高的整体多态性。
目前，市面上主流试剂盒有Plus、Y23、GoldeneyeY26、AGCUDatabaseY24等荧光检测试剂盒(见表1)，基因座数量分别为17个、27个、23个、26个、24个。法医学常用的的基因座数量较少，累积个体识别率较低，已被确认在某些特定的人群中具有非常低的多态性。Plus、Y23分别含有7个和2个快速突变基因座。AGCUDatabaseY27拥有27个低突变率基因座，为市面上基因座数量最多的Y-STR试剂盒之一，同时是5色荧光系统，相比同为27个基因座(6色荧光系统)的Plus，应用门槛更低。相比AGCUDatabaseY24，不仅基因座数量更多，基因座Marker覆盖的等位基因范围更大，减少了等位基因越界的风险，而且其他方面的性能也有较大改善。
表1.市面上主流Y-STR荧光检测试剂盒
发明内容
本发明的目的在于提供一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，该试剂盒具有高分辨率、低突变率的特点，能够满足Y-STR建库进行家系快速排查的需求。
本发明为实现上述目的，采用如下技术方案实现：
通过对Y染色体STR基因座的基因多态性和突变率统计的研究，选择低突变率(小于1％)，同时多态性高的基因座，并综合考虑其他因素，最后筛选出DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643，共27个Y染色体STR基因座。
首先针对上述27个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物。引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃。扩增产物长度在75-500bp之间，对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形尖锐峰高正常的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。引物序列、其对应编号以及扩增系统中各条引物浓度见表2：
表2.AGCUDatabaseY27引物信息
DYS389I和DYS389II、DYS527a和DYS527b、DYS385a和DYS385b的扩增引物相同。
根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522为第一组；DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b为第二组；DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458为第三组；DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643为第四组。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。
将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条(例如，表2中引物序列编号为奇数的全部标记荧光，而编号为偶数的全部不标记荧光)，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择6-FAM(6-羧基荧光素)或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX(六氯-6-甲基荧光素)，或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX(羧基-X-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子。试剂盒设有内标，内标由一组大小固定且不同的DNA片段组成，内标用SIZ作为橙色荧光标记物。将4组27个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述27个基因座复合扩增。
Y染色体STR基因座的扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳。聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2min；94℃30S、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃30min。
本发明的荧光标记复合扩增试剂盒，不同基因座引物之间的相互干扰少，扩增特异性和扩增灵敏度高；本发明的荧光标记复合扩增试剂盒具有较好的温度耐受性，使用不同质量的PCR扩增仪均可获得较好的扩增结果。
除了特异性的荧光引物，本试剂盒还包含表3所示的以下成份。
表3：
本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。最终扩增程序如下：
95℃2min；
94℃30S,59℃1min,72℃1min29循环；
60℃30min；
4℃延伸。
本试剂盒检测扩增产物的方法为毛细管电泳。
本试剂盒具有很强的检材适应性包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
本试剂盒应用广泛，可用于法医个体识别、亲权鉴定(被拐卖儿童、灾难中遇害者遗体认定)及DNA家谱构建。
所述的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲子鉴定或DNA家谱构建中的应用。将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃2min；94℃30s、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃终延伸30min；4℃保温得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析基因测序仪上检测到的数据。
所述样品DNA包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA(提取检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官)，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
与同类试剂盒相比较，本试剂盒的优点及有益效果如下：
1、本试剂盒采用全部低突变率基因座，更加适合Y-STR建库家系排查。
2、本试剂盒是包含27个Y染色体STR基因座的高度复合扩增系统，为市面基因座数量最多的Y-STR检测产品之一。
3、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
4、本试剂盒通过设计特异性引物，具有较强的扩增特异性(男性样本无非特异性峰，女性样本无扩增)及温度耐受性(温度耐受范围较广，为了保证不同质量的PCR扩增仪均能得到较好的扩增结果)。
5、本试剂盒应用五色荧光系统，将27个Y染色体STR基因座排布成四色，大大提高了每一色排布的空间利用率。另外，五色荧光系统应用门槛低，便于以后荧光系统升级，增加新的荧光，可以排布更多的STR基因座，从而进一步提高样本个体识别力。
附图说明
图1.基因座排布示意图；
图2.DatabaseY2727个基因座等位基因分型标准物：AllelicLadder图；
图3.案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图(DatabaseY27)；
图4.案件中嫌疑人比对的某家系中男子Y-STR分型图(DatabaseY27)；
图5.案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图(YfilerPlus)；
图6.案件中嫌疑人比对的某家系中男子Y-STR分型图(YfilerPlus)；
图7.缺少双亲的亲权鉴定中叔叔的Y-STR分型图；
图8.缺少双亲的亲权鉴定中侄子的Y-STR分型图；
具体实施方式
实施例1.Y染色体STR基因座的筛选
通过对DYS549、DYS522、DYS389I/II、DYS439、DYS447、DYS392、DYS576、DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、DYS449、DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、H4、DYS458、DYS607、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444和DYS643共38个Y染色体STR基因座的基因多态性和突变率的研究，最后筛选出DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643，共27个Y染色体STR基因座。每个基因座相应信息见表4：
表4.DatabaseY27基因座信息
实施例2.27个Y染色体STR基因座排布
根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522为第一组，荧光染料标记物为6-FAM；DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b为第二组，荧光染料标记物为HEX；DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458为第三组，荧光染料标记物为TAMRA；DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643为第四组，荧光染料标记物为ROX，基因座排布如图1。
实施例3.27个Y染色体STR基因座特异性引物设计及不同引物浓度调试
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下复合更多的STR基因座。
(1)特异性引物设计
设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
a.引物Tm值：由于算法不一样，不同软件设计的引物Tm值不尽相同，但需要尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。
b.引物间二聚体：尽可能避免两条引物3’末端之间有连续超过3个碱基互补配对。
c.引物与模板序列非特异结合：设计过程中尽量避免引物序列与模板序列非特异区域结合。
d.引物比对：引物序列需要利用NCBI进行blast比对，除了特异性引物结合区外，匹配区域越少越好。
(2)引物验证
首先，进行引物的单扩实验，排除有非特异、扩增效率低的引物；其次，进行单色小复扩实验，即将每一组引物分别单独混合测试，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效率低的引物；最后，进行大复扩实验，即四组引物全部混合测试，在初步确定了各基因座复合扩增引物后，进行引物的初步组配，利用标准DNA以及其他实际DNA样本为模板，考察每个基因座引物的浓度及检测效率，考察非特异扩增产物，若存在，即通过调整引物序列的方式，对引物序列加以改进，最终引物序列及浓度见表2。
实施例4.调整PCR反应混合液
PCR体系中，Mg2+浓度分别测试0.5mM、1.0mM、1.5mM2.0mM、2.5mM、3.0mM6个梯度，dNTPs浓度分别测试0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.30mM、0.35mM6个梯度，热启动Taq酶含量分别测试1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U共5梯度，Tris-HCl浓度定10mM，KCl浓度定为40mM。通过设计正交实验，最终将Mg2+浓度定为2.0mM，dNTPs浓度定为0.25mM，热启动Taq酶含量2.0U，Tris-HCl浓度定10mM，KCl40mM，利用以上材料制备成反应混合液ReactionMix，加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成见表5。
表5：
实施例5.调整PCR反应程序
本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。首先，循环数测试：分别测试了28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，最佳循环为29。其次，退火温度测试：分别测试了56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，62℃，最佳温度为59度。最终扩增程序为：
95℃2min；
94℃30S,59℃1min,72℃1min29循环；
60℃30min；
4℃延伸。
本试剂盒检测扩增产物的方法为采用毛细管遗传分析仪或凝胶电泳进行测定。
实施例6.本试剂盒在Y染色体家系排查中的应用
(1)收集案件中的血斑：样本由某公安局提供。
(2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法。
(3)样本检测结果数据比对：现场嫌疑人样本、比对到某家系的某男子，分别使用DatabaseY27和YfilerPlus进行分型，扩增图谱分别见图3、4、5、6，分型结果比对如表6。
表6：
首先使用AGCUDatabaseY27进行分型和排查，现场嫌疑人样本比对到某家系，此家系中男性A分型与嫌疑人只有DYS460这一个基因座分型不一致。对此家系男性成员加做常染色体分型，进行比对。破案后，证实犯罪嫌疑人确实与此男子为同一个家系。事后，用YfilerPlus重新进行分型和排查，犯罪嫌疑人和男性A有三个基因座分型不一致，DYS460、DYS518、DYS387S1a/b。此案例中，如果使用YfilerPlus进行家系排查，因为嫌疑人与男性A有三个基因座分型不一致，很可能将此家系排除。由此可以看出，在Y-STR家系排除的应用中，试剂盒中Y染色体快速突变的基因座数量过多，将嫌疑人所在的家系误排除的风险较大，DatabaseY27因为27个基因座全部为低突变率基因座，更加适合男性家系排查。
实施例7.本试剂盒在亲权鉴定中的应用
(1)收集口腔脱落细胞：样本由某司法鉴定中提供。
(2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法。
(3)样本检测结果数据比对：叔叔和侄子扩增图谱分别见图7和8，分型结果比对如表7所示。
表7：
结果显示：叔、侄24个YSTR的检测结果完全一致，说明他们属于同一个男性家族。但是Y染色体检测的特殊性，并不能确定他们之间叔侄关系，需要进一步对常染色体，甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中一般作为常染色体鉴定结果的补充与佐证。
序列表
<110>无锡中德美联生物技术有限公司
<120>人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
<130>
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<170>PatentInversion3.3
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Claims (10)
1.人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，包含27个STR基因座的特异性扩增引物对，所述27个STR基因座为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643。
2.根据权利要求1所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：27个基因座的特异性扩增引物的序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:48所示。
3.根据权利要求2所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述特异性扩增引物浓度分别为：SEQIDNO:1~20.06μM、SEQIDNO:3~40.05μM、SEQIDNO:5~60.12μM、SEQIDNO:7~80.06μM、SEQIDNO:9~100.08μM、SEQIDNO:11~120.16μM、SEQIDNO:13~140.05μM、SEQIDNO:15~160.05μM、SEQIDNO:17~180.12μM、SEQIDNO:19~200.11μM、SEQIDNO:21~220.06μM、SEQIDNO:23~240.09μM、SEQIDNO:25~260.11μM、SEQIDNO:27~280.05μM、SEQIDNO:29~300.08μM、SEQIDNO:31~320.07μM、SEQIDNO:33~340.15μM、SEQIDNO:35~360.16μM、SEQIDNO:37~380.11μM、SEQIDNO:39~400.13μM、SEQIDNO:41~420.11μM、SEQIDNO:43~440.14μM、SEQIDNO:45~460.15μM、SEQIDNO:47~480.16μM。
4.根据权利要求2所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述特异性扩增引物分组进行荧光染料标记，每对引物中至少有一条引物的5’端用荧光染料标记。
5.根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述特异性扩增引物分组进行荧光染料标记的分组方式为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522为第一组；DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b为第二组；DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458，为第三组；DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643，为第四组。
6.根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述标记的荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中任意一种，且每组之间都不相同。
7.根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：还包括反应混合液、热启动Taq酶和sdH2O，所述反应混合液组成为：MgCl27.5mM,Tris-HCl125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2g/L。
8.权利要求1~7中任意一项所述的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲子鉴定或DNA家谱构建中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃2min；94℃30s、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃终延伸30min；4℃保温得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析基因测序仪上检测到的数据。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述样品DNA包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA，或者免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
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