CN104164504A - 一种人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 - Google Patents
一种人类y染色体27个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，可在单个多重反应中同时扩增27个Y染色体STR基因座（包括24个低突变率Y染色体STR基因座和3个高突变率Y染色体STR基因座）。本发明通过设计独特的基因座排布方式及特异性的引物序列，将27个基因座分为4组，每组分别标记不同的荧光标记。本发明的复合扩增系统温度耐受范围广、检材适应性强、无关及近亲男性个体识别力高。
Description
技术领域
本发明涉及一种男性个体鉴定检测试剂盒，特别涉及一种可应用于法医个体识别、亲权鉴定及DNA家谱构建等方面的人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒。
背景技术
STR遗传标记又称微卫星DNA，其广泛存在于原核及真核基因组中，是一类由2～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列。不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。
Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座已有220多个，将已发现的Y染色体STR遗传标记与常染色体STR遗传标记相比，大多数Y染色体STR遗传标记具有复杂重复结构，含有两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体遗传多态性。Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。
目前，市面上主流试剂盒有AmpFlSTR Yfiler、PowerPlex Y荧光检测试剂盒，基因座数量分别为17个、12个，而且以上试剂盒均不包含高突变率基因座，故该类试剂盒只能在一定程度上应用于男性个体的家系排查，而对于有一定血缘关系的男性个体则没有鉴别能力。
由于Y染色体STR遗传标记之间的连锁遗传关系，因此Y染色体STR遗传标记的个体识别率和排除概率不能利用相互独立的遗传标记之间的乘法原则。为提高的个体识别能力，就必须不断的增加新的Y染色体STR遗传标记，组成高复合程度的扩增系统，但是，随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此探索不降低特异性及灵敏度的情况下复合更多的STR基因座，对于法医个体识别至关重要。另一方面，由于Y染色体STR遗传标记独特的特征，在实际应用中只能用于男性个体的家系排查，但无法区分同一家系中的有血缘关系的男性个体。因此，不断增加新的Y染色体STR遗传标记组成高复合程度的复扩系统的同时，亟需向系统中添加高突变率的Y染色体STR遗传标记，同时达到提高无关男性以及近亲男性之间的个体鉴别力的双重要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，试剂盒含有用于特异性扩增27个STR基因座的27组引物对，27个STR基因座为DYS549、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、DYS576、DYS19、DYS391、DYS456、DYS635、DYS533、DYS438、DYS527ab、DYS449、DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、H4、DYS458、DYS393、DYS570、DYS385ab、DYS444和DYS643。
27个STR基因座对应的引物对如下表所示：
每个STR基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。
优选的，27个STR基因座的引物对使用至少4种不同的荧光染料标记。特别的，27个STR基因座的引物对使用4种不同的荧光染料标记，根据标记的荧光染料不同分为4组，分组情况如下：
第一组：DYS549、DYS389I、DYS439、DYS389II、DYS392、DYS576、DYS19；
第二组：DYS391、DYS635、DYS456、DYS533、DYS438、DYS527ab、DYS449；
第三组：DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、H4、DYS458；
第四组：DYS393、DYS570、DYS385ab、DYS444、DYS643。
更进一步的，第一组引物对标记的荧光染料为6-FAM；第二组引物对标记的荧光染料为HEX；第三组引物对标记的荧光染料为TAMRA；第四组引物对标记的荧光染料为ROX。
Y染色体STR基因座的扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳。
优选的，聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2min；94℃30S、60℃1min、65℃1min，共29个循环；72℃10min。
本发明的有益效果是：
本发明的荧光标记复合扩增试剂盒，不同基因座引物之间的相互干扰少，扩增特异性和扩增灵敏度高；本发明的荧光标记复合扩增试剂盒具有较好的温度耐受性，使用不同质量的PCR扩增仪均可获得较好的扩增结果。
通过使用不同的荧光染料标记引物，可以进一步提高样本个体的识别力。本试剂盒将27个Y染色体STR基因座排布成四色，大大提高了每一色排布的空间利用率，同时，也尽可能的降低了荧光染料的成本。
本试剂盒是包含27个Y染色体STR基因座的高复合扩增系统，是现有市面上现有试剂盒中包含Y染色体STR基因座最多的，提高了男性个体识别力。
附图说明
图1.案件中现场检材Y-STR分型图；
图2.案件中现场检材比对的某家系中嫌疑人Y-STR分型图；
图3.案件中现场检材比对的某家系中嫌疑人父亲的Y-STR分型图；
图4.缺少双亲的亲权鉴定中叔叔的Y-STR分型图；
图5.缺少双亲的亲权鉴定中侄子的Y-STR分型图。
具体实施方式
本发明所使用的27个Y染色体STR基因座的相应信息如下：
上述的基因座中，基因座名称后标记有ab的为两个基因座。
检测试剂盒的主要成分：
27个STR基因座对应的引物对如下表所示：
27个Y染色体STR基因座排布
根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：DYS549、DYS389I、DYS439、DYS389II、DYS392、DYS576、DYS19为第一组，荧光染料标记物为6-FAM；DYS391、DYS635、DYS456、DYS533、DYS438、DYS527ab、DYS449为第二组，荧光染料标记物为HEX；DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、H4、DYS458为第三组，荧光染料标记物为TAMRA；DYS393、DYS570、DYS385ab、DYS444、DYS643为第四组，荧光染料标记物为ROX。简便考虑，所有的荧光染料均标记在引物对上游引物(SEQ ID NO为奇数的引物)上；
PCR体系各组成如下表：
PCR反应程序
扩增程序如下表：
根据相关规定，用于法医鉴证时，本试剂盒检测扩增产物的方法采用毛细管遗传分析仪或凝胶电泳进行测定。当然，用于其他目的时，也可以使用其他公知的方法进行。
本试剂盒在法医个体识别中的应用
收集案件中的血斑：样本由某公安局提供
样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法样本检测结果数据比对：现场样本、嫌疑人、嫌疑人父亲扩增图谱分别见图1、2、3，分型结果比对如下表：
| 27个STR基因座名称 | AmpFlSTR Yfiler | 现场样本 | 嫌疑人 | 嫌疑人父亲 |
| DYS549 | 11 | 11 | 11 | |
| DYS389I | ● | 14 | 14 | 14 |
| DYS439 | ● | 13 | 13 | 13 |
| DYS389II | ● | 30 | 30 | 30 |
| DYS392 | ● | 12 | 12 | 12 |
| DYS576 | 18 | 18 | 19 | |
| DYS19 | ● | 14 | 14 | 14 |
| DYS391 | ● | 10 | 10 | 10 |
| DYS456 | ● | 15 | 15 | 15 |
| DYS635 | ● | 20 | 20 | 20 |
| DYS533 | 12 | 12 | 12 | |
| DYS438 | ● | 11 | 11 | 11 |
| DYS527ab | 23 | 23 | 23 | |
| DYS449 | 31 | 31 | 31 | |
| DYS481 | 28 | 28 | 28 | |
| DYS437 | ● | 14 | 14 | 14 |
| DYS390 | ● | 26 | 26 | 26 |
| DYS448 | ● | 19 | 19 | 19 |
| H4 | ● | 11 | 11 | 11 |
| DYS458 | ● | 21 | 21 | 21 |
| DYS393 | ● | 12 | 12 | 12 |
| DYS570 | 17 | 17 | 17 | |
| DYS385ab | ● | 13,15 | 13,15 | 13,15 |
| DYS444 | 12 | 12 | 12 | |
| DYS643 | 9 | 9 | 9 |
结果显示，嫌疑人和现场样本的分型一致，而嫌疑人父亲与现场样本存在DYS576高突变基因座的差异，故办案过程中就排除了嫌疑人父亲的嫌疑，而AmpFlSTR Yfiler试剂盒因为缺少DYS576，则无法区分该父子。由此可以看出试剂盒中添加Y染色体高突变基因座可以提高近亲男性之间的个体鉴别力，但因为Y染色体STR只能起到排查作用，所以现场样本和嫌疑人还得加做常染色体STR试剂盒。
本试剂盒在亲权鉴定中的应用
1)收集口腔脱落细胞：样本由某司法鉴定中提供
2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法
3)样本检测结果数据比对：叔叔和侄子扩增图谱分别见图4和5，分型结果比对如下表：
| 27个Y-STR基因座名称 | AmpFlSTR Yfiler | 侄子 | 叔叔 |
| DYS549 | 11 | 11 | |
| DYS389I | ● | 13 | 13 |
| DYS439 | ● | 12 | 12 |
| DYS389II | ● | 28 | 28 |
| DYS392 | ● | 13 | 13 |
| DYS576 | 20 | 17 | |
| DYS19 | ● | 12 | 12 |
| DYS391 | ● | 10 | 10 |
| DYS456 | ● | 17 | 17 |
| DYS635 | ● | 21 | 21 |
| DYS533 | 12 | 12 | |
| DYS438 | ● | 12 | 12 |
| DYS527ab | 22,24 | 22,24 | |
| DYS449 | 30 | 34 | |
| DYS481 | 24 | 28 | |
| DYS437 | ● | 15 | 15 |
| DYS390 | ● | 23 | 23 |
| DYS448 | ● | 20 | 20 |
| H4 | ● | 12 | 12 |
| DYS458 | ● | 15 | 17 |
| DYS393 | ● | 12 | 12 |
| DYS570 | 16 | 16 | |
| DYS385ab | ● | 12,17 | 12,17 |
| DYS444 | 13 | 13 | |
| DYS643 | 11 | 11 |
以上缺少双亲的亲权鉴定，利用本试剂盒对叔叔和侄子的Y-STR进行了检测。结果显示，叔叔和侄子共有DYS576、DYS449、DYS481和DYS458四个STR基因座出现分型差异，而且为多步突变，根据亲子鉴定案例中，若有3个或3个以上的STR基因座不符合遗传规律，可排除亲子关系，最终可以排除该叔侄之间存在血缘关系。而AmpFlSTR Yfiler试剂盒只有DYS458存在差异，则无法排除该叔侄之间存在血缘关系。由此可见，Y试剂盒中复合更多的STR基因座可以提高男性样本间个体识别力。
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<120> 一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒
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<213> 人工引物
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aatgtggaac cagcccaaat a 21
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<212> DNA
<213> 人工引物
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ctctctctct ttctttacaa tctatcta 28
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<212> DNA
<213> 人工引物
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agcatgctgc ttcttcttct t 21
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caacccaaga agagccacac a 21
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aaagtcttca agagttcaag aag 23
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aatttatctc tatctttacc tctctatct 29
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<213> 人工引物
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tcataagtag gagctaacct ctgag 25
Claims (8)
1.一种人类Y染色体27个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有用于特异性扩增27个STR基因座的27组引物对，27个STR基因座为DYS549、DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、DYS576、DYS19、DYS391、DYS456、DYS635、DYS533、DYS438、DYS527ab、DYS449、DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、H4、DYS458、DYS393、DYS570、DYS385ab、DYS444和DYS643。
2.根据权利要求1所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：27个STR基因座对应的引物对如下表所示：
3.根据权利要求1或2所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：每个STR基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。
4.根据权利要求3所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：27个STR基因座的引物对使用至少4种不同的荧光染料标记。
5.根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：27个STR基因座的引物对使用4种不同的荧光染料标记，根据标记的荧光染料不同分为4组，分组情况如下：
第一组：DYS549、DYS389I、DYS439、DYS389II、DYS392、DYS576、DYS19；
第二组：DYS391、DYS635、DYS456、DYS533、DYS438、DYS527ab、DYS449；
第三组：DYS481、DYS437、DYS390、DYS448、H4、DYS458；
第四组：DYS393、DYS570、DYS385ab、DYS444、DYS643。
6.根据权利要求5所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：第一组引物对标记的荧光染料为6-FAM；第二组引物对标记的荧光染料为HEX；第三组引物对标记的荧光染料为TAMRA；第四组引物对标记的荧光染料为ROX。
7.根据权利要求1、2、4～6任意一项所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：Y染色体STR基因座的扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳。
8.根据权利要求7所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2min；94℃30S、60℃1min、65℃1min，共29个循环；72℃10min。
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