CN102703583A

CN102703583A - 具有改善鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

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Publication number: CN102703583A
Application number: CN2012100794596A
Authority: CN
Inventors: 郑卫国; 葛斌文
Original assignee: Wuxi Agcu Scientech Inc
Current assignee: Wuxi Agcu Scientech Inc
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102703583B

Abstract

本发明提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，用其进行DNA基因的检测不仅能扩增分析市售试剂盒能够分析的17种STR基因座DYS391、DYS389

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、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，而且能同时扩增分析STR基因座DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一个，提高了系统的累计个体识别力和累积非父排除率，总体上提高个体的鉴别力。

Description

具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，一般地涉及在个体中检测短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat，简称STR)多态性所采用的扩增试剂盒。具体地，本发明涉及一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒。

背景技术

人类基因组DNA中有3×10⁹bp，其中10％是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短又可以分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星，其中重复单位仅由2-7个碱基对组成的叫微卫星，又称它为短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat，简称STR)，这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，也就是说，STR基因座具有极高的个体鉴定能力，所以常作为遗传标记而被用于DNA分析技术中法医个体识别、亲缘关系鉴定，同时也是DNA数据库建立的主流技术。同时，STR基因座的片段小、容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。由于这些优点STR基因座的分型研究与筛选已在国内外人类学、医学遗传学和法医学及各相关领域中得到了广泛的应用。

在实践中，DNA检验流程一般包含DNA提取、基因座扩增和电泳分析三大步骤，同时，在基因座扩增时，为观察扩增反应的情况，通常会对基因座所对应的引物进行荧光标记，这样就能实现实时跟踪，对在线反应过程进行监控，并在后续可结合相应的软件对产物进行分析。

人类Y染色体是小的近端着丝粒染色体，它由长臂和微小的短臂两部分组成。Y染色体，除拟常染色体区外，在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父系遗传特征，同时序列的变异完全由累积的突变所致，并非重组引起。由于Y染色体的这些特点，Y染色体STR基因座(简称Y-STR)遗传标记作为一种工具已经被广泛应用于法医鉴定、亲权鉴定、失踪人员鉴定、人类迁移进化研究、历史和家系进化研究等多个领域。已发现的Y-STR基因座已有400多个，常用来检测的Y-STR基因座有9个欧洲最小单倍型基因座，包括DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393和2个美国DNA分析方法技术工作组(Scientific WorkingGroup on DNA Analysis Methods，简称SWGDAM)推荐的基因座，包括DYS438、DYS439。

在法医鉴定与亲子鉴定领域，DNA分析主要依赖商业化的试剂盒进行。第一个Y-STR试剂盒是由ReliaGene Technologies在2001年研发的Y-PLEX^TM6，可复合扩增DYS19、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393、DYS385a/b；2002年ReliaGene Technologies又研发了可复合扩增DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS438、DYS392的Y-PLEX^TM5，到2003年9月ReliaGeneTechnologies推出了整合了Y-PLEX^TM6和Y-PLEX^TM5所有基因座在内的Y-PLEX^TM12。同年10月，Promega公司推出了PowerPlex Y试剂盒，可复合扩增12个基因座，其中包括DYS19、DYS385a/b、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439。2004年秋，Applied Biosystems公司(简称AB公司)发布了包含17个Y-STR基因座的yfiler^TM试剂盒，其在PowerPlex Y的基础上增加了另外5个具有高度多态性的Y-STR基因座，即DYS456、DYS458、DYS635、Y GATAH4、DYS448。Yfiler试剂盒是目前可复合扩增Y-STR最多的商品化试剂盒。

然而，长期的DNA检验试验表明，STR基因座的遗传多态性在种族间存在一定差异，各个基因座之间的差别也很大。即使是在美国FBI推荐的13个核心基因座中，也有部分基因座遗传多态性不高，或者在不同人群间的差异较大，由此给DNA检验技术的应用及其效率造成一定影响。甚而，应用于法医学实践的Y染色体遗传标记位于Y染色体的非重组区，整个非重组区相当于一个遗传标记，因此Y染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则。所以，为了达到足够的排除概率和个人识别概率，就必须不断的增加新的Y染色体遗传标记。所以，为了提高个人鉴别能力，Y-STR试剂盒就需在现有基础上增加多个具有高度遗传多态性的新的Y染色体遗传标记。

由此，为了进一步改善市售扩增试剂盒的灵敏性和效率，申请人对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并以此为依据开发了一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，此种试剂盒目前未见报道与使用，且目前我国尚无Y-STR荧光标记检测试剂盒，因此是本领域术人员一直期望解决的问题。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对以上技术问题，对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，继而验证本发明所提供试剂盒在法医鉴定及亲子鉴定中的应用。

技术方案：

(一)具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座的确定

为实现上述目的，本发明通过对DYS19、DYS381、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS425、DYS426、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS450、DYS468、DYS522、DYS527a/b、DYS630、DYS635、DYS710和Y-GATA-H4等31个基因座在男性人群中的遗传多态性调查。最后确定DYS19、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS522、DYS527a/b、DYS635和Y-GATA-H4等24个基因座。

其中包括目前国内使用最多的AB公司出品的Yfiler试剂盒可扩增的17个基因座，如下：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b；这其中已包括9个欧洲最小单倍型和2个SWGDAM推荐基因座。在此基础上，又增加了7个具有高度多态性的Y-STR基因座，包括DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444。

这些基因座既与现有试剂盒兼容，保证已有DNA数据的共享与交流，又能够提高DNA检验系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。

(二)具有改善鉴别能力的Y-STR荧光标记复合扩增试剂盒的确定

基于以上具有改善鉴别能力的Y-STR基因座的确定，本发明还提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，包含下列17个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b；同时还包含下列7个基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一个。

进一步地，本发明所提供试剂盒同时包含下列24个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b、DYS444。

参考：24个STR基因座的等位基因范围和Genbank登记号见下表：

进一步地，每对引物具有一定的引物序列，其用于扩增相应STR基因座，其对应关系如表1所示：

表1各基因座对应引物序列及其在扩增体系中的终浓度

作为本发明的进一步改进，采用所述引物的浓度如表1中所示，这样测出的结果中没有发现非特异性峰。

进一步地，所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。

本发明一种优选的荧光染料标记的方法为：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438和DYS449，采用FAM标记；DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448和DYS527a/b，采用HEX标记；Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392和DYS522，采用TAMRA标记；DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b和DYS444，采用ROX标记；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

本发明在扩增时各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中至少2个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应。

本发明检测扩增产物的方法为采用多道或单道毛细管测序基因分析仪进行测定。

本发明所测定的基因座采集自基因组DNA样品，包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。

进一步地，所述基因组DNA样品可用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法的方法进行处理。

本发明可用于法医鉴定或亲子鉴定。

有益效果

本发明所提供试剂盒不仅能扩增分析市售试剂盒能够分析的17种STR基因座DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，而且能同时扩增分析STR基因座DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一个，提高了系统的累计个体识别力和累积非父排除率，总体上提高个体的鉴别力。

本发明所提供试剂盒与部分市售试剂盒检出的基因座对比如下表：

本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统已在无锡市公安局进行测试，测试了4500例不同来源男性样本，共检出单倍型4481个，个体识别率为99.6％；而AB公司的Yfiler试剂盒最多检出4426个，识别率为98.4％。结果表明该系统多态性高，平衡性好，灵敏度高，完全能够满足个体识别、亲权鉴定以及DNA数据库建设的需要。

附图说明

图1、Y染色体24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统等位基因分型标准物；

图2、犯罪嫌疑人的Y-STR分型图；

图3、甲家系成员的Y-STR分型图；

图4、乙家系成员的Y-STR分型图；

图5、侄子的Y-STR分型图；

图6、叔叔的Y-STR分型图。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1 基因座的确定

通过对DYS19、DYS381、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS425、DYS426、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS450、DYS468、DYS522、DYS527a/b、DYS630、DYS635、DYS710和Y-GATA-H4等31个基因座的在中国人群中的多态性调查，最后确定DYS19、DYS385a/b、DYS388、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS522、DYS527a/b、DYS635和Y-GATA-H4等24个基因座。既与现有试剂盒兼容，保证已有DNA数据的共享与交流，又能够提高DNA检验系统的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。

实施例2 荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计

本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，构建了5色荧光组合方案。

在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出基因座组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各基因座引物扩增效率等方面考虑，将24个基因座分成4组，使用FAM、HEX、TAMRA、ROX分组标记，分子量内标用第5种颜色橙色的荧光染料SIZ进行标记。经过筛选，最终确定一种优选的荧光染料标记的方法为：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438和DYS449，采用FAM标记；DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448和DYS527a/b，采用HEX标记；Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392和DYS522，采用TAMRA标记；DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b和DYS444，采用ROX标记；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种基因座组合方式使得仅需标记5种荧光就可实现这24个基因座同时检测分析。

实施例3 扩增基因座及其产物检测的实验过程

1、反应体系的配置

2、扩增热循环实验方案

(1)将PCR扩增管置于热循环仪上；

(2)选择下面推荐的程序进行扩增；

(3)扩增后的样品应避光保存；

热循环仪的扩增程序

3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)组成上样混合物〔(0.5μL AGCU Marker SIZ-500)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分析标准物(Y Allelic Ladder)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。

实施例4 24个STR基因座对应引物及其浓度的设计

先对24个基因座的单一扩增条件进行优化，即对单个基因座引物做单扩实验，加好体系之后，用PCR仪扩增，然后用遗传分析仪检测峰高，根据检测结果选择合适引物浓度。

具体实验步骤按照实施例3，其中反应体系配置时酶的加样量1.0μl，镁离子浓度2.5mM，各对引物从浓度0.02μM至1.0μM做梯度浓度，梯度间隔为0.02μM，做单扩实验以比较不同引物浓度的影响；根据检测结果，选择峰高RFU在2000-3000之间的引物浓度，用来配置复合扩增引物。

最后，根据复合扩增检测结果，对会引起非特异扩增的引物，重新设计引物，重新回到之前的单扩实验，再做复合扩增，直至复合扩增中不出现非特异扩增。根据复合扩增的结果，对引物浓度做微调。优化所得24个基因座对应的引物及其浓度如表1所述，此时各基因座峰值均衡，无特异峰。

实施例5 荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立

在分别成功地建立了24个单个基因座扩增条件的基础上，总体研究24个基因座复合扩增反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如循环次数、退火温度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，最终建立起24个基因座的复合扩增体系。

一、酶的加样量与镁离子浓度的优化

基于上述实验结果，对酶的加样量与镁离子浓度进行优化。在实验中，按照实施例3中实验步骤，其中反应体系配置时引物及其浓度按上述复扩选择结果，见表1，对酶的加样量与镁离子浓度这两个因素做正交实验进行优化，其中酶加样量取0.8μl，1.0μl，1.5μl，2μl四个水平；镁离子浓度取1.25mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM和3.0mM五个水平，根据检测结果，最后选定酶的加样量在1.0μl，酶离子浓度在2.7mM，此时，此时各基因座扩增扩增峰高RFU在2500左右，均衡性好。

二、扩增循环数的优化

基于上述实验结果，对扩增循环数进行优化。为保证酶的活性和扩增产物的量，扩增的循环数一般在28～32，反应体系中引物按表1确定后的浓度，酶、镁离子浓度按优化后的浓度，分别测试了26个循环，28个循环，30个循环，32个循环，34个循环的扩增结果。通过基因分析仪检测结果，循环数在少于28时，扩增结果偏弱，会有基因座丢失；多于32时，扩增峰太高，不利于检测。所以本发明推荐用循环数30扩增。

三、退火温度的优化与建立

基于上述实验结果，对退火温度进行优化。反应体系中引物按表1确定后的浓度，酶、镁离子浓度按优化后的浓度，循环数设置30个，测试了退火温度在55℃，57℃，59℃，61℃，63℃，65℃时的扩增结果，通过基因分析仪检测结果，在57℃，59℃，61℃这三个温度扩增均衡性、峰高都较好。本发明推荐退火温度设在59℃。

由此确立荧光标记STR复合扩增体系，如下：

反应体系的配置：

扩增程序：

本发明的荧光标记复合扩增检验系统良好的应用效果主要表现在下述几个方面：

1、系统的灵敏度高、特异性强

本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统在DNA模板量为1.0ng的条件下，可检出全部24个基因座，各基因座峰值均衡，且无非特异性峰产生。

2、系统适应于不同来源的检材

本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统对同一个体的血痕、口腔拭子、毛发及组织的DNA进行复合扩增和荧光检测，结果一致，表明该系统适应于不同来源的检材。

3、种属特异性强

本发明中24个基因座的荧光标记复合扩增检验系统检验犬、猪、马、牛、猫、鸡、鸭、鼠、鱼和大肠杆菌等，没有出现特异性扩增峰，表明该系统具有种属特异性。

实施例6 本发明所提供试剂盒在司法鉴定中的应用

本发明所提供试剂盒的一个重要应用就是对男性犯罪嫌疑人样本检测，且用常染色体比对未找到匹配结果时，结合案情情况可以选择Y-STR排除。

一、使用本发明提供能同时检测24个Y-STR基因座的试剂盒进行检测男性犯罪嫌疑人样本

对河南某市公安局家系排查案件的应用，犯罪嫌疑人S1及来自两个家系的成员(S9，S13)的样本，均为血滤纸样本。用harries 1.2mm打孔器取一片血滤纸，加到反应体系中。按照实施例2～5进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测，选用同时包含24种Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对的试剂盒，最后获得实际样品的基因分型数据，分型结果见附图2、图3、图4，分型结果对比见下表：

二、使用AB公司的Yfiler试剂盒进行检测

用Yfiler试剂盒检测时，嫌疑人与S9个体只有一个基因座有差异，即DYS385上有一个差异。与样本S13有两个基因组有差异，即DYS390和DYS385。

根据目前的国际惯例，必须有两种以上独立的遗传标记同时排除才能否定有血缘关系。德国亲子鉴定专家证人协会认为Y-STR与常染色体STR的判断标准应该相同，即要3个以上的基因座不同才能排除亲权。由上述家系排查原则，用Yfiler试剂盒检测时不能排除嫌疑人是这两个家系是同个家系的可能；而用本发明所提供试剂盒，差异的基因座增加到3个和6个，可以排除嫌疑人属于这两个家系的可能。这样也就显现了本发明提供试剂盒中由于增加了被检基因座，提高了整体的识别率和排除率，避免了时间和金钱的浪费，为案情下步的侦破提供方向。

实施例7 本发明所提供试剂盒在亲子鉴定中的应用

用本发明所提供试剂盒用于叔-侄关系的亲子鉴定

一、测定步骤如下：

1、收集亲子鉴定案件中的血斑：亲子鉴定样本由某公安局提供。

2、各种检材的基因组DNA提取：参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。

3、扩增检测：按照实施例2～5进行荧光标记、PCR扩增和遗传分析仪检测，选用同时包含24种Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对的试剂盒，侄子的分型结果见图5，叔叔的分型结果见图6，其对比结果见下表：

结果显示：叔-侄24个Y STR的检测结果完全一致，说明他们属于同一个男性家族。但是Y染色体检测的特殊性，并不能确定他们之间叔侄关系，需要进一步对常染色体，甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中一般作为常染色体鉴定结果的补充与佐证。

Claims

1.一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，包含下列17个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b，其特征在于：还包含下列7个基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS449、DYS527a/b、DYS522、DYS388、DYS447和DYS444中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其包含下列24种Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b、DYS444。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中每对所述引物具有一定的引物序列，其用于扩增相应STR基因座，对应关系为：

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物浓度为：

5.根据权利要求1、2或4所述的试剂盒，其特征在于：所述的各STR基因座采用位于该基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端用荧光染料标记。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料标记的方法为：DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438和DYS449，采用FAM标记；DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448和DYS527a/b，采用HEX标记；Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392和DYS522，采用TAMRA标记；DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b和DYS444，采用ROX标记；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

7.根据权利要求1、2或4所述的试剂盒，其特征在于：其中至少2个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用多道或单道毛细管测序基因分析仪来测定。

8.根据权利要求1、2或4所述的试剂盒，其特征为：所述基因座采集自基因组DNA样品，包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征为：所述基因组DNA样品的处理方法为Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法。

10.根据权利要求1、2、4或6所述的试剂盒在法医鉴定或亲子鉴定中的应用。