CN1493701A

CN1493701A - Y染色体多色荧光复合扩增试剂盒

Info

Publication number: CN1493701A
Application number: CNA031357555A
Authority: CN
Inventors: 侯一平; 张; 石美森; 李英碧; 应斌武; 吴谨; 颜静
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2003-09-04
Filing date: 2003-09-04
Publication date: 2004-05-05
Anticipated expiration: 2023-09-04
Also published as: CN1243106C

Abstract

一种Y染色体多色荧光复合扩增试剂盒，其特征是由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、MgCl₂和等位基因分型标准物混合物构成，所述引物混合物由四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及对应于A、B、C、D四组Y染色体特异STR基因座的加尾引物混合而成。各组份的用量比为：引物混合物中荧光公共引物各0.25～0.35ml(400nM)，加尾引物各0.25～0.35ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；缓冲液3.25～4.25ml；MgCl₂2.5～3.5ml(2.25mM)；等位基因分型标准物混合物总量16ml(40nM)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量。

Description

Y染色体多色荧光复合扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于体外一次性复合扩增Y染色体上的多个DNA目的片段的试剂盒。

背景技术

STR是短串联重复序列的简称，是一类核心序列为2～6个bp长的串联重复序列，其片段长度在几十个bp至几百个bp之间。由于其片段短，扩增效率高、对PCR的条件要求也相对较低，即使是法医学上常见的细胞已经被破坏，DNA降解严重的腐败检材或是放置时间很长的检材，同样可以用PCR技术扩增出特异的DNA片段来进行基因分型，达到个人认定的目的。由于STR分型具有上述这些十分突出的优越性，因此，几乎全世界的司法鉴定DNA实验室都在采用这一技术，并已经基本上取代了其他DNA分析方法。

人类Y染色体是小的近端着丝粒染色体.它由长臂(Yq)和微小的短臂(YP)两部分组成。Y染色体(除拟常染色体区外)在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父系遗传特征；序列的变异完全由累积的突变所致，并非重组引起。由于Y染色体的这些特点，使得对Y染色体上多态性遗传标记，如Y染色体特异短串联重复序列(Y-STR)的研究不仅在人类学、古生物学等方面意义重大，而且在法医学的个人识别及亲子鉴定中亦具有重要而独特的应用价值，可以应用于多种法医学领域，如男女混合斑检验、不同男性个体成分混合物(斑)分析、父权鉴定等等。

然而，应用于法医学实践的Y染色体遗传标记位于Y染色体的非重组区，整个非重组区相当于一个遗传标记。因此Y染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则。为了达到足够的排除概率和个人识别概率，就必须不断的增加新的Y染色体遗传标记。另一方面，实际检案对法医DNA分析有明确的时间要求，急需快速高效的检测方法。因此，亟待开发高复合程度的Y-STR复合体系，将更多变异度高的基因座复合起来一次扩增以满足法医学个人识别和亲权鉴定的需要。

复合扩增(Multiplex PCR)又称为多重PCR，即在一个反应体系中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程。它可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂。并且满足同时分析不同DNA序列的需要，特别是在法医学鉴定中可以用极微量的检材同时扩增出多个遗传标志而更显其优越性。因此，Y染色体STR基因座的复合扩增一直是国内外相关实验室研究的重点。

基于检测体系的不同，目前世界上将复合扩增主要可以分为两大类：银染复合扩增和荧光复合扩增。银染复合扩增是复合扩增后的产物利用普通电泳槽分离，进行硝酸银染色检测的方法。方法简单，成本较低，在普通实验室可以开展这个项目。但由于所得结果只是单种颜色，故其复合扩增试剂盒的位点数不能太多，一般1次复合扩增的位点不能超过4个，否则会因为不同位点的扩增产物互相重叠，难以区分检材的基因型。再加上所得结果是用肉眼观察，所以其灵敏度受到一定的限制。

荧光复合扩增是在普通复合扩增PCR的其中一条引物(任何PCR反应都必须有两条引物)一端加上荧光标记，利用STR分型技术主要检测平台——自动激光荧光遗传检测仪进行检测PCR扩增产物。荧光标记STR分型技术所需检材量少，对陈旧、腐败检材适用性强，结果准确、灵敏度高，自动化程度高、可重复性强等。用一种颜色的荧光素标记一组3或4个STR位点(其扩增片段不能相重叠)，另一种颜色的荧光素标记另一组3或4个STR位点，多种荧光素则可以标记多组不同的STR位点。加在一起，就可以达到1次检测12至16个STR位点，其个人识别力则会大大提高。基于以上几个原因，荧光复合扩增已成为目前法医学领域用得非常普遍和先进的复合扩增方法。

荧光复合扩增的技术核心主要在于引物结构与荧光标记的位置。近年来，Y染色体STR复合扩增的文献发表了许多，大多是将原始的用于单独扩增的引物直接复合扩增，并用荧光标记。但是，随着复合扩增体系中引物数量的增加，引物之间的相互影响越严重，反应动力学变得越复杂，成为进一步增加复合扩增位点的瓶颈和难点。由于大都采用荧光标记检测，多色荧光体系包含至多6-8个基因座，整个体系的效能不高，大大浪费了有限的检测范围。Butler等人开发出的针对Y染色体STR五色荧光复合扩增体系，一次可以检测20个基因座。他们从整体的观念出发将所有基因座引物重新设计，既调整了基因座扩增片断大小，又使其具有相近的退火温度，从而得到良好的扩增效率。但是由于重新设计引物，得到的资料与原始引物的兼容性受到了巨大考验，比如引物结合区突变问题，必须重新考察。因而探索在不降低灵敏度的情况下复合更多的位点、条件易于优化的新方法对于法医复合扩增的进一步发展很有必要。

迄今为止，商品化的Y染色体STR复合扩增试剂盒只有一个：Y-plexTM 6(Reliagene Technologies，Inc)双色荧光标记了六个基因座：DYS19、DYS385、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393。其在法医学应用实践中还存在以下问题：(1)这些STR基因座都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的，有的基因座在中国群体的基因频率分布较差，个人识别能力较低。(2)此外，Y-plexTM 6提供的STR基因座还远远满足不了法医实际工作的需要。(3)国外商品化试剂盒价格昂贵。

本申请人曾在中国发明专利申请02133812.4号中公开了一种复合扩增STR的引物设计方法，该方法以两条非人类的基因组序列

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)，

作为一对短引物；同时，在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物对的5′端分别加上该对短引物，得到长引物对。上述方法中短引物的选取是关键，在选定短引物之后，一个待扩增的基因座的长引物也就相应被选定。这是因为，长引物中的能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物实际上就是可以与待扩增基因座的人类基因组特异性结合的原始引物，它由待扩增基因座的人类基因组序列所决定，且因待扩增基因座的序列的不同而不同。在上述方法中，所设计的长、短引物能够用于在同一PCR反应体系中同时对四个基因座的目的基因进行复合扩增。在复合扩增的第一阶段，利用长引物扩增出同时带有目的基因片段和与短引物配对的非人类基因组序列的产物；而在复合扩增第二阶段，则利用一对短引物对多个基因座的目的基因片段同时进行扩增。利用上述方法设计的引物能够大量扩增目的基因片段，且无需在实验过程中繁琐地调整各对引物的浓度，简化了整个实验过程，从而具有优点。

与上述引物设计方法相对应，本申请人又在中国发明专利03117426.4号中提供了一种Y染色体复合扩增银染试剂盒，该试剂盒由是由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl₂)、DNA聚合酶、Mgcl₂、A基因座长引物、B基因座长引物、C基因座长引物、D基因座长引物以及人工等位基因分型标准物构成。利用该试剂盒，就能方便地同时对Y染色体上的任意四个STR基因座进行复合扩增，同时，利用该试剂盒提供的等位基因分型标准物，还可以方便地检测扩增结果。

但是，由于上述试剂盒仍然属于银染复合扩增的试剂盒，在对扩增结果进行检测时，必然存在着前面述及的费时、自动化程度不高，准确性较差等弊病，虽然其对实验设备的要求不高，符合当前中国大多数分子生物学实验室的需要，但却不能满足已经具有自动激光荧光遗传检测仪的实验室的更高要求。因此，上述现有试剂盒仍然有待改进。

发明内容

本发明的目的是在沿用上述现有引物设计方法和试剂盒的基本思路的基础上，重新提供一种用于荧光复合扩增的试剂盒。

本发明的试剂盒是由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、MgCl₂和等位基因分型标准物混合物构成，所述引物混合物由四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及对应于A、B、C、D四组Y染色体特异STR基因座的加尾引物混合而成，其中，四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4中的荧光公共引物YA和YB1、YB2、YB3、YB4为：

YA(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，

YB1(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)

YB2(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)

YB3(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)

YB4(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；

分别加于荧光公共引物YB1、YB2、YB3、YB4的5′端的F1、F2、F3、F4为荧光标记物；

对应于A组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)为分别在A组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)而得到的基因组序列；

对应于B组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)为分别在B组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)而得到的基因组序列；

对应于C组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)为分别在C组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB 3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)而得到的基因组序列；

对应于D组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)为分别在D组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)而得到的基因组序列；

所述等位基因分型标准物混合物由A、B、C、D四组Y染色体特异STR基因座中的各个基因座的等位基因分型标准物混合而成；

在本发明试剂盒中，各组份的用量比为：引物混合物中四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4各0.25～0.35ml(400nM)，32条对应于16个Y染色体特异STR基因座的加尾引物各0.25～0.35ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；缓冲液3.25～4.25ml；MgCl₂2.5～3.5ml(2.25mM)；等位基因分型标准物混合物总量16ml(40nM)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量。

在进一步阐述本发明的内容之前先对以下四个基本术语加以说明：

原始引物：将与人类基因组寡核苷酸序列相对应，单基因座PCR产生Y染色体特异片段的引物称之为原始引物P1、P2。

公共引物：将专用于Y-STR复合扩增，序列不与人类基因组同源的特异序列引物称之为公共引物YPA、YPB。

加尾引物：将专用于Y-STR复合扩增，由公共引物分别加上原始引物构成的引物称之为加尾引物，其在复合扩增反应中所起的作用相当于前述专利申请中的长引物。

荧光公共引物：将专用于Y-STR复合扩增荧光检测，序列不与人类基因组同源的特异序列引物称之为荧光公共引物YA、YB，其在复合扩增反应中所起的作用相当于前述专利申请中的短引物。

在上述荧光公共引物中，YA由YPA的5′端加上特异序列GTTCTT构成，YB由YPB的5′端加上荧光标记物(荧光分子)构成。

在本发明中，上述公共引物YPA、YPB的设计是极为关键的，其设计需要考虑以下几个方面的要素：(1)、公共引物与人类基因组序列无同源性；(2)、所有位点同时得到扩增，即所有引物对的退火温度须相近；(3)、公共引物之间与特异引物之间不能形成引物二聚体；(4)、不形成二级结构。

与本申请人在前述专利申请中给出的扩增方法相类似，本发明中应用加尾序列引物方法的基本思路是：选取一对非人类基因组的短DNA片段，让其作为针对同一组，如A组中的四个不同基因座的公共引物对YPA和YPB1，并在能够与人类基因组寡核苷酸序列结合的原始引物P1、P2的5′端分别加上该对公共引物，从而得到加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)。对于同一组中的四个不同基因座来说，四个待扩增基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)因原始引物P1、P2的不同而不同。

依次类推，也可以选取另外三对非人类基因组的短DNA片段，即YPA和YPB2、YPA和YPB3、YPA和YPB4，并得到分别对应于B、C、D组基因座(每组基因座中均包含四个不同的基因座)的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)、YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)、YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)。

在本发明中，我们选取了四对结构相似，片段大小一致(每条引物间相差5个碱基)，物理动力学特性相似的公共引物，即YPA和YPB1、YPA和YPB2、YPA和YPB3、YPA和YPB4。可以看出，在这四对公共引物中，实际上仅包含了五条公共引物，这是本发明的关键所在。因为在PCR反应过程中，引物越多，引物间相互的反应(如形成引物二聚体)的可能性就越大；引物之间的碱基构成相差越大，引物间相互反应的可能性就越大。因此，本发明尽量减少了公共引物的数目。

当我们在四条公共引物YPB1、YPB2、YPB3、YPB4的5′端分别标记四种不同颜色的荧光标记物F1、F2、F3、F4，并在公共引物YPA的5′端加上特殊序列GTTCTT时，就由四对公共引物YPA和YPB1、YPA和YPB2、YPA和YPB3、YPA和YPB4重新形成了四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4。本发明中所选取的四对公共引物及由其进一步形成的四对荧光公共引物如下：

YPA 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′ YA 5′-GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′

YPB1 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′ YB1 5′-F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′

YPA 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′ YA 5′-GTTCTT-ATTTAGGTGACTATAGAATAC-3′

YPB2 5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′ YB2 5′-F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′

YPB3 5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′ YB3 5′-F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′

YPB4 5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′ YB4 5′-F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′

此处，在公共引物YPA的5′端加上了特殊序列GTTCTT，其目的是有效地抑制扩增反应过程中的“双尖峰”。

本发明的试剂盒中包含了根据上述四对公共引物制作出的16个基因座的加尾引物，这16对(共32条)加尾引物中所含的原始引物P1、P2可以通过互联网上公开的人类基因组数据库检索获得。

在进行复合扩增反应时，可在PCR反应体系中同时加入本试剂盒中分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、Mgcl2，并加入常规反应所需的四种脱氧核苷三鳞酸。该反应体系进行第一轮PCR反应时(经历变性、退火、延伸的一次循环过程)，公共引物不会与人类基因组序列结合，所扩增的DNA片段由各加尾引物中所含的原始引物P1、P2决定。第一轮反应结束后，在待扩增基因座产生的具有目的基因片段和公共引物的扩增产物将作为第二轮PCR反应的模板继续扩增。扩增所用引物仍然是各加尾引物，所得到的产物是同时具有目的基因片段和与公共引物配对的非人类基因组序列。我们将上述以加尾引物作为反应引物的第一轮和第二轮PCR反应称之为第一阶段的反应，其目的在于：在加尾的原始引物基础上，有效的保证整个体系的特异性，以及与原始引物资料的兼容性。

从第三轮PCR反应开始，荧光公共引物将作为上述各个扩增基因座的引物。在经历多轮(如30轮)PCR循环反应之后，上述第一阶段的产物就会被扩增至上百万倍。在利用自动激光荧光遗传分析仪检测PCR产物时，实际检测的是由荧光标记引物延伸产物的单链，5′端标记荧光分子，3′末端延伸的模板是反向引物序列。由于我们在原来公共引物的5′端标记了荧光染料，因此可以通过标记的荧光检测到复合扩增的各个基因座。在本发明中，我们将上述以荧光公共引物对作为反应引物的PCR反应称之为第二阶段的反应。

与本申请人的前述专利申请相类似，在本发明的上述设计思路中，第一阶段和第二阶段的反应是在同一反应体系中进行的，而不是截然地分成两次反应。实际上，即使是在第三轮及第三轮之后的PCR反应中，仍然存在着上述第一阶段的反应，只是其所占比例极低而已。因为荧光公共引物浓度比加尾引物浓度高几十倍，竞争抑制了加尾引物扩增目的基因的DNA。另外，在进行第一阶段的PCR扩增反应时，相对于多个待扩增基因座且序列不同的多对加尾引物同时参与反应，引物间的反应与竞争在所难免，从而大大降低了PCR扩增的效率。但是，就本发明来说，第一阶段的PCR反应仅仅是上述复合过程的开端，只需产生少量同时具有目的基因的DNA片段和非人类基因组序列的产物，即生成少量用于第二阶段的PCR反应的模板。因此上述弊端对整个复合扩增反应过程产生的影响是极其微弱的。由于在此后进行的第二阶段扩增中，就每一组基因座来说，参与反应的引物只有一对，即荧光公共引物对，不存在引物间的竞争与抑制，也无需调整引物间的浓度，从而大大提高了各基因座的扩增效率。这样就完成了由多对特异引物同时扩增多个特异性基因片段，到一对公共引物同时扩增多个特异性基因片段转换。

在本发明试剂盒中，等位基因分型标准物是进行结果检测时分型的对照物，是一个非常重要的组份。等位基因分型标准物是指用于STR分型的已知序列的DNA片段群。为了实现实验室之间的分型标准化与质量控制，国际法医遗传学会(International Society of Forensic Genetics，ISFG)于1994年推荐了按核心序列串联重复拷贝数命名常染色体等位基因的原则，在序列分析为基础构建的人类等位基因分型标准物对照下，可以避免按分子量测定值计算DNA片段长短所产生的误差。国内外可重复性分析结果表明：只要将等位基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同的设备，不同的电泳方法，均可得到一致的可重复性结果。

由于本发明试剂盒中的加尾引物是在互联网上基因数据库中公布的原始引物(P1、P2)的基础之上加入了一段非人类基因组序列的公共引物，因此不能再采用原基因数据库引物的扩增产物作本发明的分型标准物。所以，在本发明试剂盒中，针对各个待扩增基因座分别提供了等位基因分型标准物，即由荧光公共引物分别扩增各基因座的等位基因凝胶浸泡液，各等位基因PCR产物混合起来制成。

采用原始引物直接复合扩增荧光检测，可以成功的复合6-8个基因座，需要引物浓度在0.1～1μM之间。而我们使用加尾引物复合扩增方法的预实验已经证明：该方法大大降低了特异引物的浓度，是用原始引物进行复合扩增引物浓度的5～50分之一，理论上复合的基因座数量至少应该是它们的5倍。此外，分辨率和准确率高，可以分辨1个bp的长度，采用分子质量内标及等位基因分型标准物(ladder)，避免了因电泳引起的误差，具有很好的重复性。可见加尾引物复合扩增方法还有很大的潜力，为大规模Y-STR复合扩增的研究提供了一个行之有效的方法。

本发明试剂盒能够高效率地对Y染色体上四组共16个STR基因座进行复合扩增，通过自动荧光测序仪进行检测分型，达到高自动化水平，实验结果准确、可重现性好的目的。另外，本发明试剂盒中所采用的Buffer缓冲液、DNA聚合酶和Mgcl₂等试剂均可直接采用现有的市售产品，如中国华美公司生产的产品，相应可以实现试剂的国产化。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

具体实施方式

本实施例中的试剂盒是针对A、B、C、D四组共16个STR基因座制作的。本实施例中的试剂盒由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、MgCl₂和等位基因分型标准物混合物构成，所述引物混合物由四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及对应于A、B、C、D四组Y染色体特异STR基因座的加尾引物混合而成，其中，四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4中的荧光公共引物YA和YB1、YB2、YB3、YB4为：

YA(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，

YB1(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)

YB2(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG 3′)

YB3(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)

YB4(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；

分别加于荧光公共引物YB1、YB2、YB3、YB4的5′端的F1、F2、F3、F4为荧光标记物。在本实施例中，上述荧光标记物F1、F2、F3、F4分别为现有的蓝、绿、黄、红色荧光标记物FAM、JOE、NED和ROX。其中，蓝色荧光标记物FAM的结构式为

绿色荧光标记物JOE的结构式为

黄色荧光标记物NED的结构式为

红色荧光标记物ROX的结构式为

在本实施例中，对应于A组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)为分别在A组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)而得到的基因组序列。

本实施例试剂盒所针对的A组待扩增基因座分别为DYS434、Y-GATA-A10、DYS438和DYS439。

与此相对应，加尾引物YPA-A(P1)和YPB1-A(P2)为分别在能够与A组基因座DYS434、Y-GATA-A10、DYS438和DYS439的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB1而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS434的原始引物为

P1：5’-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3’

P2：5’-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3’；

Y-GATA-A10的原始引物为

P1：5’-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’

P2：5’-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’；

DYS438的原始引物为

P1：5’-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’

P2：5’-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’；

DYS439的原始引物为

P1：5’-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’

P2：5’-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’；

因此，引物混合物中对应于A组DYS434、Y-GATA-A10、DYS438和DYS439基因座的加尾引物分别为

YPA-DYS434(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′

YPB1-DYS434(P2) ：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3′

YPA-Y-GATA-A10(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3’

YPB1-Y-GATA-A10(P2)：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3’

YPA-DYS438(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3’

YPB1-DYS438(P2) ：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3’

YPA-DYS439(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3’

YPB1-DYS439(P2) ：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3’。

在本实施例中，对应于B组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-B(P1)和YPB2-B(P2)为分别在B组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)而得到的基因组序列。

本实施例试剂盒所针对的B组待扩增基因座分别为DYS453、DYS513、DYS19和DYS463。

与此相对应，加尾引物YPA-B(P1)和YPB1-B(P2)为分别在能够与B组基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB2而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS453的原始引物为

P1：5′-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′

P2：5′-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′；

DYS513的原始引物为

P1：5′-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′

P2：5′-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′；

DYS19的原始引物为

P1：5′-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′

P2：5′-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′；

DYS463的原始引物为

P1：5′-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′

P2：5′-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′；

因此，引物混合物中对应于B组DYS453、DYS513、DYS19和DYS463基因座的加尾引物分别为

YPA-DYS453(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′

YPB2-DYS453(P2)：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′

YPA-DYS513(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′

YPB2-DYS513(P2)：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′

YPA-DYS19(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′

YPB2-DYS19(P2) ：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′

YPA-DYS463(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′

YPB2-DYS463(P2)：5′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′。

在本实施例中，对应于C组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)为分别在C组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB 3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)而得到的基因组序列。

本实施例试剂盒所针对的C组待扩增基因座分别为DYS456、DYS520、DYS447和DYS552。

与此相对应，加尾引物YPA-C(P1)和YPB3-C(P2)为分别在能够与C组基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB3而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS456的原始引物为

P1：5’-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3’

P2：5’-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3’；

DYS520的原始引物为

P1：5’-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3’

P2：5’-ACCATCATGCCCTGCAATA-3’；

DYS447的原始引物为

P1：5’-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3’

P2：5’-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3’；

DYS552的原始引物为

P1：5’-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3’

P2：5’-AACACCTGATGCCTGGTTG-3’；

因此，引物混合物中对应于C组DYS456、DYS520、DYS447和DYS552基因座的加尾引物分别为

YPA-DYS456(P1)： 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3′

YPB3-DYS456(P2)：5′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3′

YPA-DYS520(P1)： 5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3′

YPB3-DYS520(P2)：5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-ACCATCATGCCCTGCAATA-3′

YPA-DYS447(P1) ：5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3′

YPB3-DYS447(P2)：5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3′

YPA-DYS552(P1) ：5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3′

YPB3-DYS552(P2)：5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-AACACCTGATGCCTGGTTG-3′。

在本实施例中，对应于D组Y染色体特异STR基因座的加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)为分别在D组基因座中的四个基因座的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4：

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)而得到的基因组序列。

本实施例试剂盒所针对的D组待扩增基因座分别为DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510。

与此相对应，加尾引物YPA-D(P1)和YPB4-D(P2)为分别在能够与D组基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510的原始引物P1、P2的5′端加上公共引物YPA、YPB4而得到的基因组序列。互联网上GDB基因数据库中公布的DYS523原始引物为

P1：5′-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′

P2：5′-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′；

DYS443原始引物为

P1：5′-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′

P2：5′-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′；

YGATA-A8原始引物为

P1：5′-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′

P2：5′-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′；

DYS510原始引物为

P1：5′-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′

P2：5′-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′；

因此，引物混合物中对应于D组DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510基因座的加尾引物分别为

YPA-DYS523(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′

YPB4-DYS523(P2) ：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′

YPA-DYS443(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′

YPB4-DYS443(P2) ：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′

YPA-Y-GATA-A8(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′

YPB4-Y-GATA-A8(P2)：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′

YPA-DYS510(P1) ：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′

YPB4-DYS510(P2) ：5′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′。

本实施例中的等位基因分型标准物混合物由A、B、C、D四组Y染色体特异STR基因座中的各个基因座的等位基因分型标准物混合而成。

本实施例中所采用的等位基因分型标准物按以下方式制得：用复合扩增银染体系分别扩增以上四组Y特异STR基因座各个不同基因型的个体样本，电泳分离，硝酸银染色，切下各基因座等位基因目的片段凝胶；用四对荧光公共引物分别扩增对应于A、B、C、D四组各基因座的等位基因凝胶浸泡液，将各等位基因PCR产物混合起来，制成等位基因分型标准物。

具体来说，在本实施例中，A组基因座分型标准物的序列为：DYS434：5′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-(X)-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS434)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。Y-GATA-A10：5′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3’(X)代表用该基因座(Y-GATA-A10)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。DYS438：5′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3’(X)代表用该基因座(DYS439)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。DYS439：5′-5FAM-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3’(X)代表用该基因座(DYS438)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

B组基因座分型标准物的序列为：

DYS453：5′-VIC-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-X-G-TATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS453)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS513：5′-VIC-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS434)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS19：5′-VIC-TAATACGACTCAGTATACGGACAG-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS19)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS463：5′-VIC-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS463)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

C组基因座分型标准物的序列为：

DYS456：5′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS456)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS520：5′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS520)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS447：5′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS447)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS552：5′-NED-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS552)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

D组基因座分型标准物的序列为：

DYS523：5′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS523)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS443：5′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS443)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

Y-GATA-A8：5′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(Y-GATA-A8)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

DYS510：5′-PET-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-X-GTATTCTATAGTGTCACCTAAAT-CAAGAAA-3′(X)代表用该基因座(DYS510)原始引物进行PCR扩增后构成Ladder的各个等位基因序列。

在本实施例的试剂盒中，各组份的用量比为：引物混合物中四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4各0.3ml(400nM)，32条对应于16个Y染色体特异STR基因座的加尾引物各0.3ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；缓冲液(本实施例中采用10 x Reaction Buffer)3.75ml；MgCl₂3ml(2.25mM)；等位基因分型标准物混合物总量16ml(40nM)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量。

需要说明的是，本实施例中所采用的荧光标记物F1、F2、F3、F4的具体构成可以相互更换，从而形成不同的荧光公共引物。

Claims

1、一种Y染色体多色荧光复合扩增试剂盒，其特征是由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、MgCl₂和等位基因分型标准物混合物构成，所述引物混合物由四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4以及对应于A、B、C、D四组Y染色体特异STR基因座的加尾引物混合而成，其中，四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4中的荧光公共引物YA和YB1、YB2、YB3、YB4为：

YA(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YB1(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)

YB2(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)

YB3(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)

YB4(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)而得到的基因组序列；

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)而得到的基因组序列；

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)而得到的基因组序列；

YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)

YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)而得到的基因组序列；

各组份的用量比为：引物混合物中四对荧光公共引物YA和YB1、YA和YB2、YA和YB3、YA和YB4各0.25～0.35ml(400nM)，32条对应于16个Y染色体特异STR基因座的加尾引物各0.25～0.35ml(40nM)；DNA聚合酶3000u(3u/μl)；缓冲液3.25～4.25ml；MgCl₂2.5～3.5ml(2.25mM)；等位基因分型标准物混合物总量16ml(40nM)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量。