CN1247796C - 转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分的定量检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分含量的检测方法和检测试剂盒。该方法包括：(i)抽提DNA；(ii)将抽提的DNA作为模板，用(a)PEP特异性引物对和(b)外源基因特异性引物对分别进行PCR扩增；(iii)将各扩增产物分别与第一探针和第二探针杂交，并测定杂交所产生的可检测信号；(iv)分析测定数据，从而定量地检测出油菜籽或其加工产品中转基因成分含量。本发明可准确、简便地定量检测油菜籽及其加工产品中转基因成分。

Description

转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分的定量检测

技术领域

本发明涉及产品检测技术，更具体地，本发明涉及定量检测转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，转基因作物迅速商品化，并通过贸易进入国际市场。生物技术的发展显著地提高了农产品的产量和质量，在一定程度上缓解了人口增长、自然资源匮乏、可耕作土地面积减少和不可预期的自然灾害带来的影响等。然而，转基因农作物的安全性问题引起人们极大的关注。

世界上许多国家如欧盟、日本、澳大利亚、新加坡等国家，纷纷以立法或其他形式对转基因生物及其加工产品进行严格的管理，例如：要求进口转基因产品进入本国市场时，当转基因成分含量超过一定限量时应加贴标签，以供消费者选购时参考，欧盟规定转基因成分高于1％时应加贴标签，日本规定转基因成分高于5％时应加贴标签。

近年来，我国每年要从加拿大等国进口几百万吨油菜籽，其中有相当数量的油菜籽是转基因产品。然而，目前国内外尚没有对转基因油菜籽及其加工产品的定量检测的报道。

本领域迫切需要开发对转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分进行定量检测的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效、准确、简便的检测转基因油菜籽或其产品中中转基因成分的方法。

本发明的另一目的是提供相应的检测试剂盒。

本发明的再一目的是提供有关的引物对和探针。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测油菜籽及其加工产品中转基因成分的检测试剂盒，它含有：

(a)PEP特异性引物对，所述的PEP特异性引物对特异性地扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因：

(b)外源基因特异性引物对，所述外源基因特异性引物对特异性地扩增外源基因；

(c)标准参照物；

(d)第一探针，所述第一探针与PEP基因的扩增产物特异性结合；

(e)第二探针，所述的第二探针与外源基因的扩增产物特异性结合。

在一优选例中，所述的外源基因选自下组：GOX基因，CP4-EPSPS基因，FMV 35S基因，PAT基因。

在另一优选例中，所述标准参照物是转基因油菜籽与非转基因油菜籽的DNA混合物，其中在各混合物中转基因油菜籽DNA的含量为0.1％，0.5％，1％、2％、或5％。

在另一优选例中，所述的PEP特异性引物选自下组：

GCT AGT GTA GAC CAG TTC TTG          SEQ ID NO：1

CAC TCT TGT CTC TTG TCC TC           SEQ ID NO：2

CCA GTT CTT GGA GCC GCT TGA          SEQ ID NO：3

AAG GGC CAG TCC AAA TGC AGA          SEQ ID NO：4

所述的外源基因特异性引物选自下组：

GTC TTC GTG TTG CTG GAA CCG TT       SEQ ID NO：5

GAA CTG GCA GGA GCG AGA GCT          SEQ ID NO：6

所述的第一探针是：

CAG GTC GCT ATG CGA CTG CGG AGA CA   SEQ ID NO：7

所述的第二探针是：

TGC TCA CGT TCT CTA CAC TCG CGC TCG  SEQ ID NO：8。

在另一优选例中，所述的探针是Taqman型荧光探针。

在本发明的第二方面，提供了一种检测油菜籽或其加工产品中转基因成分的方法，它包括以下步骤：

(i)抽提油菜籽或其加工产品的DNA；

(ii)将抽提的DNA作为模板，用(a)PEP特异性引物对和外源基因特异性引物对分别进行PCR扩增，其中，所述的PEP特异性引物对特异性地扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，所述外源基因特异性引物对特异性地扩增外源基因；

(iii)将各扩增产物分别与第一探针和第二探针杂交，并测定杂交所产生的可检测信号，其中所述的第一探针是与PEP基因扩增产物特异性结合的探针，所述的第二探针是与外源基因的扩增产物特异性结合的探针；

(iv)分析测定数据，从而定量地检测出油菜籽或其加工产品中转基因成分。

在另一优选例中，在步骤(iii)中，测定的可检测信号是探针与扩增产物的杂交反应中所产生的荧光信号。

在另一优选例中，在步骤(ii)中还包括将标准参照物作为模板，用(a)PEP特异性引物对和(b)外源基因特异性引物对分别进行PCR扩增；并且在步骤(iii)中还包括将标准参照物的扩增产物分别与第一探针和第二探针杂交，并测定杂交所产生的可检测信号，从而制得标准曲线；其中，所述的标准参照物是转基因油菜籽与非转基因油菜籽的DNA混合物，其中在各混合物中转基因油菜籽DNA的含量为0.1％，0.5％，1％、2％、或5％。

在另一优选例中，在步骤(iv)中，将测定的数据与标准曲线进行比较，从而定量检测油菜籽或其加工产品中转基因成分。

在另一优选例中，所述的PEP特异性引物选自下组：

GCT AGT GTA GAC CAG TTC TTG          SEQ ID NO：1

CAC TCT TGT CTC TTG TCC TC           SEQ ID NO：2

CCA GTT CTT GGA GCC GCT TGA          SEQ ID NO：3

AAG GGC CAG TCC AAA TGC AGA          SEQ ID NO：4

所述的外源基因特异性引物选自下组：

GTC TTC GTG TTG CTG GAA CCG TT       SEQ ID NO：5

GAA CTG GCA GGA GCG AGA GCT          SEQ ID NO：6

所述的第一探针是：

CAG GTC GCT ATG CGA CTG CGG AGA CA    SEQ ID NO：7

所述的第二探针是：

TGC TCA CGT TCT CTA CAC TCG CGC TCG   SEQ ID NO：8。

在本发明的第三方面，提供了一种寡核苷酸片段，它具有选自SEQ ID NO：1-8的核苷酸序列。

附图说明

图1是PEP基因的PCR检测的电泳图谱。其中，各泳道如下：：M：DNA分子量标记DL2000，Takara；1：转基抗草甘膦油菜籽；2：转基因抗草丁膦油菜籽；3：非转基因油菜籽；4：油菜籽粕；5：大豆；6：玉米；7：水稻；8：小麦；9：拟南芥菜；10：空白对照.。

图2A和2B是用GOX引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的线性图和对数图。其中，从上至下的各样品是：1)5％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；2)2％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；3)1％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；4)0.5％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；5)0.1％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品。

图3A和3B是用PEP引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的线性图和对数图。其中，从上至下的各样品是：1)5％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；2)2％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；3)1％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；4)0.5％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；4)0.1％转基因抗草甘膦油菜籽DNA样品；

图4是本发明一个实例中的转基因抗草甘膦油菜籽的定量检测标准曲线。

具体实施方式

在进行PCR定量检测时，需要检测该作物本身固有的内源特异参照基因。通过检测内源特异参照基因，测定样品中转基因作物和非转基因作物的模板总量，这是进行定量检测的基础。所以寻找油菜合适的内源特异参照基因对转基因作物的检测具有十分重要的意义。例如，用于转基因大豆检测的内源特异标记基因可选用Lectin基因，用于转基因玉米检测的内源特异标记基因可选用Zein基因或IVR基因，本发明人经过广泛而深入的研究，通过序列特异性分析和和PCR检测分析的方法，确定了PE3-PEPCase(PEP)基因是优选的油菜的内源参照基因。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“PEP特异性引物”指能特异性地扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因或其片段的引物。

如本文所用，术语“外源基因特异性引物”指能特异性地扩增出转入植物的外源基因或其片段的引物。应理解，外源基因特异性引物随外源基因的不同而变化。例如，当外源基因是GOX基因时，选用的外源基因特异性引物就是GOX基因特异性引物，即能特异性地扩增GOX基因或其片段的引物。

可用本发明方法检测的外源基因没有特别限制，可以是任何外源基因，例如GOX基因，CP4-EPSPS基因，FMV 35S基因，PAT基因等。

本发明还提供了用于检测油菜籽及其加工产品中转基因成分的标准参照物，它们分别含有一定比例的分别提取纯转基因抗草甘膦油菜籽和非转基因油菜籽的DNA。在本发明的一个实例中，将分离的DNA均稀释到30ng/ul，按体积比例将两利DNA混合，配成转基因抗草甘膦油菜籽DNA含量分别占5％、2％、1％、0.5％、0.1％的DNA溶液，作为定量检测的DNA参照样品。

可用于本发明的DNA提取技术没有特别限制，可以是本领域常用的各种提取技术。一种优选的方法是磁珠提取法，例如用Promega公司生产的磁珠法DNA提取试剂盒提取油菜籽中的DNA。

本发明通过检测油菜内源参照基因PEP测定样品中油菜DNA的总模板量，通过检测外源基因，如抗草甘膦油菜外源基因GOX测定样品中转基因抗草甘膦油菜总DNA的模板量，然后以转基因抗草甘膦油菜DNA的模板量除以油菜总DNA的模板量，从而计算出样品中转基因抗草甘膦油菜含量的百分比。外源基因GOX和内源基因PEP的检测分别同时在两个反应管内进行，反应体系和反应条件均相同。通过实验绘制出ΔCt值(Ct_GOX-Ct_PEP)与转基因成分含量百分比的标准曲线。通过与标准曲线的比对，就可定量确定同一或相同条件下测定的未知油菜籽及其加工产品中转基因成分。

反应体系中模板量的测定是通过PCR扩增，与特异性探针结合，并根据结合所发出的可检测信号进行检测。可用于本发明的可检测信号没有限制，可以是任何核酸检测领域中常用的检测信号。可检测信号的种类取决于探针上所用的标记物。可用于本发明的标记物没有特别限制，可以是核酸检测领域常用的各种标记物，其中包括(但并不限于)：生物素-亲和素、地高辛、放射性同位素、荧光标记等。优选的探针是Taqman型探针。

在本发明的一个实例中，针对转基因油菜籽的定量检测设计出检测内源基因PEP和外源基因GOX的引物和探针。检测PEP基因和GOX基因的PCR产物片段长度均为121bp，符合定量PCR检测的引物设计要求；检测转PEP和GOX基因的TaqMan探针5’端均采用荧光激发染料FAM标记，3’端均采用荧光淬灭染料TAMRA标记。

结果表明，本发明方法可以满足进口转基因油菜籽的定量检测需求，有利于对转基因油菜籽及其加工产品进行标识。此外，采用本发明的统一的参照样品有利于消除不同的实验室间的测试差异。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.材料和仪器

1.1植物材料

转基因抗草甘膦油菜籽标样：由进口加拿大转基因抗草甘膦油菜籽播种后筛选鉴定出的植株所收获的种子，为抗草甘膦除草剂的转基因油菜，种籽纯度为100％。

加拿大转基因油菜籽加工成的菜籽粕：来源于上海青浦炼油厂；

国产阴性非转基因菜籽：来源于安徽省六安粮油公司；

国产阴性非转基因菜籽粕：来源于安徽省安庆地区炼油厂。

1.2 试剂

1.2.1 DNA提取的有关试剂

1)电泳专用琼脂糖；

2)TAE(50×)：242g Tris-碱，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/l EDTA(pH8.0)，溶于水中，定容至1L；

3)液氮；

4)70％乙醇；

5)TE(pH8.0)：量取10mL 1mol/L Tris·HCl(pH8.0)和2mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加水定容至1000mL。分装后高压灭菌备用；

6)溴化乙锭：10mg/mL；

7)100-2000bp ladder DNA Marker：大连宝生物公司产品；

8)6×Loading Buffer：Promega公司产品；

9)总DNA回收试剂盒：上海华舜化学试剂公司产品。

10)Promega磁珠法DNA提取试剂盒，CAT No.：#FF3750。

1.2.2 PCR反应的有关试剂

1)10×Buffer(5μl)：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·HCl pH8.3室温，15mmol/L MgCl₂：Promega公司产品；

2)10×Mg²⁺(25mM)：Promega公司产品：

3)10×dNTP(2mM)：Promega公司产品；

4)引物：上海生工生物工程公司合成，先配成100μM供-20℃储存，稀释为终浓度5μM供使用：

5)探针：上海申友生物技术公司合成，稀释成20μM供使用；

6)Taq DNA聚合酶，5unit/μl：Promega公司产品；

7)超纯水(dd H₂O)：Easy Pure纯水仪制得。

8)TaqManTM PCR Core Regent Kit Cat No.：N808-0228美国AppliedBiosystems生产。

1.3 仪器设备

1)PCR扩增仪：美国MJ RESEARCH Minieycler PTC-150型；

2)定量PCR扩增仪：美国生物技术公司ABI Prism Sequence Detector 7700型；

3)电泳仪：美国Continental Lab Products 75.2314型；

4)凝胶成像系统：美国BIO-RAD Gel DOC-2000型；

5)离心机：德国Eppendorf 5415D型；

6)核酸蛋白分析仪：德国Eppendorf Biophotometer型；

7)微量加样器：德国Eppendorf产品有2.5、10、20、100、200、1000μl等规格；

8)天平：德国Sartorius；

9)高压灭菌锅：日本Tomy SS-325型。

10)DNA冷冻浓缩仪：美国CentriVap Console Labconco产品。

2.方法

2.1菜籽粕总DNA的提取

使用Promega磁珠法DNA提取试剂盒，具体操作程序如下：

1)称取150mg样品，转移到1.5ml离心管；

2)加入400ul Lysis Buffer A和5ul RNse A。涡旋混匀；

3)加入200ul Lysis Buffer B涡旋混匀10-15秒；

4)22-25C温浴10分钟；

5)加入600ul沉淀液，涡旋混匀；

6)13000g，离心10分钟；

7)转移上清至1.5ml离心管；

8)用力混匀PMPs试剂瓶，以确保磁粒被充分悬浮起来，向上清中加入50ul磁珠缓冲液，涡旋混匀；

9)加入0.8体积异丙醇，颠倒混匀10-15次，22-25C温浴5分钟，在离心管架上保留1min，弃上清；

10)加入250ul Lysis Buffer B，颠倒混匀2-3次，将离心管在离心管架上保留1min，弃尽液体：

11)用70％的乙醇洗液1ml悬浮磁粒，在离心管架上保留1min，弃尽液体；重复3次，然后用枪头吸尽液体；

12)用冷冻浓缩仪抽干液体；

13)加入100ul双蒸水，振荡混匀，65C温育10min。将离心管在离心管架上保留1min，小心将液体转移至另一新管中。

14)取1ul做PCR。

2.2 PCR测试

2.2.1 引物设计

本实验所用的引物序列和扩增片段长度见表1。

                    表1本实验所用的引物序列和扩增片段长度

基因名称	引物序列	SEQID NO：	扩增产物长度(bp)
				PEP	正义P1：5′-GCT-AGT-GTA-GAC-CAG-TTC-TTG-3′反义P2：5′-CAC-TCT-TGT-CTC-TTG-TCC-TC-3′	12	248
18S核糖体RNA	正义P1：5′-TCT-GCC-CTA-TCA-ACT-TTC-GAT-GGT-A-3′反义P4：5′-AAT-TTG-CGC-GCC-TGC-TGC-CTT-CCT-T-3′	910	137
				PEP基因定量检测引物及探针	正义P5：5′-CCA-GTT-CTT-GGA-GCC-GCT-TGA-3′反义P6：5′-AAG-GGC-CAG-TCC-AAA-TGC-AGA-3′PROBE1：FAM-5′-CAG-GTC-GCT-ATG-CGA-CTG-CGG-AGA-CA-3′-TAMRA	347	121
GOX基因定量检测引物及探针	正义P7：5′-GTC-TTC-GTG-TTG-CTG-GAA-CCG-TT-3′反义：P8：5′-GAA-CTG-GCA-GGA-GCG-AGA-GCT-3′PROBE2：FAM-5′-TGC-TCA-CGT-TCT-CTA-CAC-TCG-CGC-TCG-3′-TAMRA	568	121

2.2.2 PCR反应体系

定量PCR测试的反应体系见表2；定性PCR测试的反应体系见表3。

              表2定量PCR测试的反应体系

试剂名称	50μl反应体系	25μl反应体系
			10×Buffer	5.0	2.5
10×Mg2+(25Mm)	10.0	5.0
			DATP(10mM)	1.0	0.5
DGTP(10mM)	1.0	0.5
			DUTP(10mM)	1.0	0.5
DCTP(10mM)	1.0	0.5
			UNG酶(1U/ul)	0.5	0.25
Gold Taq酶(5U/ul)	0.5	0.25
			正义引物(5uM)	4.0	2.0
反义引物(5uM)	4.0	2.0
			探针(20uM)	1.0	0.5
H2O	19.0	9.5
			模板	2.0	1.0(约30ng DNA)

            表3定性PCR测试的反应体系

试剂名称	50μl反应体系	25μl反应体系
			10×Buffer	5.0	2.5
10×dNTP	5.0	2.5
			10×Mg2+	5.0	2.5
Taq酶	0.4	0.2
			正义引物(5uM)	1.0	0.5
反义引物(5uM)	1.0	0.5
			H2O	30.6	15.3
模板	2.0	1.0(约30ng DNA)

2.2.3 PCR反应循环参数

定量PCR反应循环参数：50℃ 10min；95℃ 10min；95℃ 15Sec，60℃ 1min，循环50次。

定性PCR反应循环参数：95℃ 3min；94℃ 20Sec，54℃ 40Sec，72℃ 40Sec，循环40次；最后在72℃延伸10Min。

2.3 定性PCR产物的凝胶电泳检测

1)配制琼脂糖凝胶

将50×TAE稀释成1×TAE溶液，用1×TAE配置琼脂糖(浓度为2％)，凝胶用微波炉蒸煮融化，待降温至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为5‰，倒入电泳槽凝胶板中凝固：

2)点样

取20μl PCR扩增产物，加2μl上样缓冲液点样行电泳，并加入DNA分子标记同时电泳，以判断PCR产物片段的大小。

3)电泳条件

电压根据电泳槽的长度而定3-5V/cm，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。

4)结果

电泳检测结果用凝胶分析成像系统或紫外检测仪记录。

2.4 PCR产物的测序

PCR产物用上海华舜生物技术公司PCR产物胶回收试剂盒回收纯化，PCR产物送上海基康生物技术公司测序。

实施例1

油菜特异内标基因的确定

作为内源特异标记基因需要满足以下两个条件：(1)该作物所有品种都存在该基因：(2)其它生物没有该基因，或不存在扩增该基因的特异靶序列。本发明人通过在GenBank中反复寻找，找到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvatc-Carboxylase，PE3-PEPCase，PEP)基因可满足上述两个条件，该基因表达的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是光合作用卡尔文循环中的一个关键酶，该基因在GcnBank中的编号为：D13987，通过GenBank的Blast功能寻找该基因的同源基因，发现该基因具有很高的特异性，其它基因与该基因的同源性很小。

实施例2

PGR引物和产物的特异性分析

根据对PEP基因的同源性比较分析，本发明人选择该基因与其它基因同源程度较低的3626bp～3883bp区域的序列设计引物，将设计出的引物P₁和P₂(SEQID NO：1和2，见表1)分别在GenBank中寻找同源基因。

搜寻结果表明，除了油菜PEP基因能与之互补配对外，未见有其它基因能与这两对引物互补配对，可见设计的引物特异性较强。

同时，将被P₁和P₂引物扩增出扩增产物的靶序列输入GenBank寻找同源序列。搜寻结果表明，除PEP基因外未见有其它基因序列与之相同。所以被扩增的PCR产物的靶序列具有很高的特异性。

实施例3

PEP基因的检测

用引物P₃、P₄(SEQ ID NO：9和10，见表1)对转基因抗草甘膦油菜籽、转基因抗草丁膦油菜籽、非转基因油菜籽、油菜籽粕、大豆、玉米、水稻、小麦、拟南芥等DNA样品进行PCR检测，这些样品均能扩增出137bp的片段。上述样品都用Promcga磁珠法DNA提取试剂盒进行DNA抽提。

用引物P₁、P₂对上述样品进行PCR扩增，只在1、2、3、4号等油菜或菜籽粕样品中得到248bp的扩增条带，而5、6、7、8、9号样品未见有PCR扩增(图1)。由于所有的DNA样品用引物P₃、P₄进行PCR测试时出现137bp的扩增，引物P₃、P₄是根据真核生物18S RNA核糖体基因的保守序列设计的，所有的真核生物都会被扩增出137bp的PCR产物，所以5、6、7、8、9号样品不存在由于提取的DNA样品存在质量问题而不能扩增PEP基因的可能性。经对PEP基因的PCR扩增产物直接进行测序分析，序列结果与PEP基因两个引物之间的相应序列相一致，表明用引物P₁、P₂检测油菜内源特异参照基因PEP基因具有很高的特异性。

以上实验结果说明：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PE3-PEPCase，PEP)基因可以作为油菜内源特异参照基因。

此外，检测作物内源特异标记基因最主要的目的是为了提高转基因产品检测结果的准确性和进行转基因产品的定量检测。检测作物内源特异标记基因还有另一作用，即可鉴定产品中是否含有某种作物成分，这对防止商品掺假作伪具有很重要的意义。例如通过检测油菜内源特异标记基因，可以检测饲料中是否含有菜籽粕成分，食用植物油中是否含有菜油成分。

实施例4

转基因抗草甘膦油菜籽参照样品的制备

由于国际上转基因抗草甘膦油菜籽没有参照样品可供购买，而油菜籽由于含油量高，用碾磨机碾磨时粉末绝大部分粘附于碾磨机内腔壁上，难以彻底粉碎，加液氮碾磨，样品又容易飞溅闪失。考虑到油菜籽制备参照物质的困难，本研究将纯的转基因抗草甘膦油菜籽和非转基因油菜籽分别用Promega磁珠法DNA提取试剂盒提取DNA，并均稀释到30ng/ul，按体积比例将两种DNA混合，配成转基因抗草甘膦油菜籽DNA含量分别占5％、2％、1％、0.5％、0.1％的DNA溶液，作为定量检测的参照样品。

实施例5

转基因抗草甘膦油菜籽的定量检测标准曲线的制作

本实施例通过检测油菜内源参照基因PEP测定样品中油菜DNA的总模板量，通过检测油菜外源的GOX基因测定样品中转基因抗草甘膦油菜DNA的模板量，然后以转基因抗草甘膦油菜DNA的模板量除以油菜DNA的总模板量，计算出样品中转基因抗草甘膦油菜含量的百分比。

定量检测PEP基因的引物为P₅、P₆(SEQ ID NO：3和4，见表1)，定量检测GOX基因的引物为P₇、P₈(SEQ ID NO：5和6)，其PCR产物片段长度均为121bp，符合定量PCR检测的引物设计要求：检测PEP和GOX基因的TaqMan探针分别为Probe₁、Probe₂(SEQ ID NO：7和8)，其5’端均采用FAM标记，3’端均采用TAMRA标记。外源基因GOX和内源基因PEP的检测分别同时在两个反应管内进行，但反应体系和反应条件均与“方法”一节相同。

结果

用GOX基因的引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的图谱如图2A和2B所示，用PEP基因的引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的图谱如图3A和3B所示。通过上述GOX基因和PEP基因的两套引物和探针进行定量PCR测试，检测结果的Ct值见表4。各标准样品检测结果的ΔCt值(Ct_GOX-Ct_PEP)见表5。

Rn，或标准报告荧光信号，定义为报告荧光信号与阳性参比染料荧光信号的比值。在PCR过程中，Rn随着扩增拷贝数的增加而增加，直到达到平台期。当仪器处于读板模式时，只检测PCR完成后一个点的荧光信号，而不是PCR过程中连续的信号。

ΔRn，报告荧光的标准信号减去前几个PCR循环的基线信号。如同Rn，ΔRn随着扩增拷贝数的增加而增加，直到达到平台期。

Ct，或临界循环值，代表此PCR循环时，可第一次检测到高于基线的报告荧光增长。核酸序列检测软件生成Ct对所有标准品起始拷贝数的标准曲线，然后用内推法确定未知样品的起始拷贝数。

                表4对GOX基因和PEP基因进行定量检测的Ct值

检测基因	参照样品	Ct值			Ct平均值
						1	2	3
		GOX	5％	25.361					25.371	24.841	25.191
2％	26.452				26.494	26.530	26.492
			1％	28.011				27.782	27.868	27.887
0.5％	28.872				28.910	28.903	28.895
			0.1％	30.911				30.828	30.157	30.632
PEP	5％				23.697	23.934	23.802				23.811
		2％	24.467	23.977				24.252	24.232
	1％				24.310	24.159	24.212			24.227
		0.5％	23.728	24.407				24.210	24.115
	0.1％				24.415	24.361	24.187			24.321

           表5对GPX基因和PEP基因进行定量PCR检测的ΔCt值

样品	Ct		ΔCt	转基因成分含量(％)
					GOX	PEP
	参照样品5％	25.191					23.811	1.38	5％
参照样品2％			26.492	24.232	2.26	2％
	参照样品1％	27.887					24.227	3.65	1％
参照样品0.5％			28.895	24.115	4.78	0.5％
	参照样品0.1％	30.632					24.182	6.45	0.1％

将通过上述GOX基因和PEP基因的引物和探针进行定量PCR反应所得的ΔCt值经过统计学分析，可以得出得到转基因抗草甘膦油菜籽定量检测的标准曲线和线形方程(见图4)。

实施例6

转基因抗草甘膦油菜籽和菜籽粕的定量检测

运用以上建立起来的方法，对待测的转基因抗草甘膦油菜籽和菜籽样品进行检测，检测结果如表6所示。

       表6待测样品中转基因抗草甘膦油菜籽成分含量检测结果

样品	Ct		ΔCt	转基因成分含量(％)
					GOX	PEP
	油菜籽样品1	23.992					23.952	0.041	12.62
油菜籽样品2			25.477	24.156	1.321	4.96
	油菜籽样品3	25.213					24.321	0.892	6.78
菜籽粕样品1			25.598	24.025	1.573	4.13
	菜籽粕样品2	24.003					23.982	0.021	12.81
菜籽粕样品3			24.272	24.132	0.140	11.74

实施例7

检测试剂盒

制备含以下成分的、用于检测油菜籽及其加工产品中转基因成分的检测试剂盒：

(a)PEP特异性引物对，即引物P₅和P₆(SEQ ID NO：3和4)，100uM，各100微升。

(b)外源基因特异性引物对，即引物P₇和P₈(SEQ ID NO：5和6)，100uM，各100微升。

(c)标准参照物，即实施例4中制备的转基因抗草甘膦油菜籽DNA含量分别占5％、2％、1％、0.5％、0.1％的DNA溶液，DNA浓度为30ng/微升，各200微升；

(d)第一探针，FAM-5’-CAG-GTC-GCT-ATG-CGA-CTG-CGG-AGA-CA-3’-TAMRA(SEQ ID NO：7)，适量(如100ng)；

(e)第二探针，FAM-5’-TGC-TCA-CGT-TCT-CTA-CAC-TCG-CGC-TCG-3’-TAMRA(SEQ ID NO：8)，适量(如100ng)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                序列表

<110> 中华人民共和国上海出入境检验检疫局

<120> 转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分的定量检测

<130> 025078

<160> 10

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

gctagtgtag accagttctt g                                                    21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

cactcttgtc tcttgtcctc                                                      20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ccagttcttg gagccgcttg a                                                    21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

aagggccagt ccaaatgcag a                                                     21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

gtcttcgtgt tgctggaacc gtt                                                   23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

gaactggcag gagcgagagc t                                                     21

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 寡核苷酸探针

<400> 7

caggtcgcta tgcgactgcg gagaca                                                26

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 寡核苷酸探针

<400> 8

tgctcacgtt ctctacactc gcgctcg                                               27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 9

tctgccctat caactttcga tggta                                                 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 10

aatttgcgcg cctgctgcct tcctt                                                 25

Claims (9)

1.一种用于检测油菜籽及其加工产品中转基因成分的检测试剂盒，其特征在于，它含有：

(a)PEP特异性引物对，所述的PEP特异性引物对特异性地扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；

(b)外源基因特异性引物对，所述外源基因特异性引物对特异性地扩增外源基因；

(c)标准参照物；

(d)第一探针，所述第一探针与PEP基因的扩增产物特异性结合；

(e)第二探针，所述的第二探针与外源基因的扩增产物特异性结合，

其中所述的PEP特异性引物对是：

CCA GTT CTT GGA GCC GCT TGA           SEQ ID NO：3

AAG GGC CAG TCC AAA TGC AGA           SEQ ID NO：4

并且所述的第一探针是：

CAG GTC GCT ATG CGA CTG CGG AGA CA    SEQ ID NO：7。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的外源基因选自下组：GOX基因，CP4-EPSPS基因，FMV 35S基因，PAT基因。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准参照物是转基因油菜籽与非转基因油菜籽的DNA混合物，其中在各混合物中转基因油菜籽DNA的含量为0.1％，0.5％，1％、2％、或5％。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的外源基因特异性引物对是：

GTC TTC GTG TTG CTG GAA CCG TT        SEQ ID NO：5

GAA CTG GCA GGA GCG AGA GCT           SEQ ID NO：6

所述的第二探针是：

TGC TCA CGT TCT CTA CAC TCG CGC TCG   SEQ ID NO：8。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的探针是Taqman型荧光探针。

6.一种检测油菜籽或其加工产品中转基因成分的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(i)抽提油菜籽或其加工产品的DNA；

(ii)将抽提的DNA作为模板，用(a)PEP特异性引物对和外源基因特异性引物对分别进行PCR扩增，其中，所述的PEP特异性引物对特异性地扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，所述外源基因特异性引物对特异性地扩增外源基因；

(iii)将步骤(ii)中得到的扩增产物分别与第一探针和第二探针杂交，并测定杂交所产生的可检测信号，其中所述的第一探针是与PEP基因扩增产物特异性结合的探针，所述的第二探针是与外源基因的扩增产物特异性结合的探针；

(iv)分析测定数据，从而定量地检测出油菜籽或其加工产品中转基因成分，

其中所述的PEP特异性引物对是：

CCA GTT CTT GGA GCC GCT TGA            SEQ ID NO：3

AAG GGC CAG TCC AAA TGC AGA            SEQ ID NO：4

并且所述的第一探针是：

CAG GTC GCT ATG CGA CTG CGG AGA CA     SEQ ID NO：7。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，测定的可检测信号是探针与扩增产物的杂交反应中所产生的荧光信号。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中还包括将标准参照物作为模板，用(a)PEP特异性引物对和(b)外源基因特异性引物对分别进行PCR扩增；

并且在步骤(iii)中还包括将标准参照物的扩增产物分别与第一探针和第二探针杂交，并测定杂交所产生的可检测信号，从而制得标准曲线；

其中，所述的标准参照物是转基因油菜籽与非转基因油菜籽的DNA混合物，其中在各混合物中转基因油菜籽DNA的含量为0.1％，0.5％，1％、2％、或5％。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(iv)中，将测定的数据与标准曲线进行比较，从而定量检测油菜籽或其加工产品中转基因成分，

并且，所述的外源基因特异性引物对是：

GTC TTC GTG TTG CTG GAA CCG TT         SEQ ID NO：5

GAA CTG GCA GGA GCG AGA GCT            SEQ ID NO：6

所述的第二探针是：

TGC TCA CGT TCT CTA CAC TCG CGC TCG    SEQ ID NO：8。

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