CN1754001A - 检测沙眼衣原体的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种检测沙眼衣原体的方法，包括以从样品中获得的DNA作为模板进行PCR并检测扩增产物。其中，用于PCR的引物对是根据对应于SEQ ID NO：1所示碱基序列的NO.5157到5201和5245到5276位的碱基序列设计的，以扩增这两个区域之间的碱基序列。由此提供了一种具有较高敏感性和专一性的快速检测沙眼衣原体的方法。

Description

检测沙眼衣原体的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的方法及试剂盒。

背景技术

沙眼衣原体是一种非淋球菌尿道炎病原体，一种检测其的方法是通过基因扩增方法对沙眼衣原体细胞中的多拷贝的隐蔽性质粒的部分序列进行扩增，并检测扩增产物的方法参见(日本专利Nos.2719225和3127135)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有较高敏感性和专一性的快速检测沙眼衣原体的方法及试剂盒。

本发明的发明人发现，如果使用根据沙眼衣原体的隐蔽性质粒pLGV440的特定区域设计的引物进行PCR，沙眼衣原体就可以被快速的检测，由此完成本发明。

本发明提供了一种检测沙眼衣原体的方法，包括使用从样品中获得的DNA作为模板进行PCR并检测扩增产物，其中用于PCR的引物对是根据对应于SEQID NO：1的核苷酸序列中5157到5201位和5245到5276位的核苷酸序列设计的，扩增这两个区域之间的核苷酸序列(本发明的检测方法)。

本发明还提供了应用于本发明的方法的试剂盒，也就是，通过使用从样品中获得的DNA作为模板进行PCR以检测沙眼衣原体的试剂盒，该试剂盒包括根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的5157到5201位和5245到5276位的核苷酸序列设计的引物对，扩增这两个区域之间的核苷酸序列(本发明的检测试剂盒)。

本发明中，所述引物对优选由具有SEQ ID NO：2，3或4的核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：5或6的核苷酸序列的寡核苷酸组成，更优选由具有SEQ ID NO：3的序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：5的序列的寡核苷酸，或具有SEQ ID NO：4的序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO：6的序列的寡核苷酸组成。

本发明还提供了包含下述寡核苷酸和标记物的杂交探针，所述寡核苷酸根据对应于核苷酸序列SEQ ID NO：1的5210到5245位区域的核苷酸序列设计的。

核苷酸序列SEQ ID NO：1是沙眼衣原体隐蔽性质粒pLGV440的核苷酸序列(GenBank登录号X06707)，本领域技术人员在考虑到个体差异或其他类似因素导致的核苷酸序列差异的情况下，能够很容易地鉴定并识别出具有突变的pLGV440的菌株中也存在的相应于核苷酸序列SEQ ID NO：1中的相应核苷酸所表示的区域。

附图简述

图1显示了一种扩增产物的产生时间过程(实时PCR的检测结果)：a：无拷贝，b：2个拷贝，c：20个拷贝，d：200个拷贝，和e：2000个拷贝。

实施本发明的最佳方式

(1)本发明的检测方法

本发明的检测方法是一种包括将从样品中获得的DNA作为模板进行PCR并检测扩增产物的沙眼衣原体检测方法，其中PCR所使用的引物对是根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中5157到5201位核苷酸和5245到5276位核苷酸的区域的核苷酸序列设计的，以使这两个区域之间的核苷酸序列被扩增。

样品没有特别的限制，只要包含或可能包含沙眼衣原体即可。这样的例子包括尿，尿道拭子，子宫颈拭子等等。可以从这些样品中，在可以制备沙眼衣原体隐蔽性质粒的条件下用常规方法提取出DNA。

本发明的检测方法中的PCR可以根据常规的PCR程序进行，除了样品中获得的DNA用作模板并应用特定的引物对之外。

本发明中的引物对是根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中5157到5201位核苷酸的区域(第一区域)的核苷酸序列和对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中5245到5276位核苷酸的区域(第二区域)设计的，因此这两个区域之间的核苷酸序列可被扩增。

引物的长度通常是10到40个核苷酸。并且，每个区域的位置和引物的长度优选设置为以使得Tm值应为55到70℃，因此PCR中使用的退火温度可以设置得相对高一些。此处的Tm值是用最近的相邻碱基对分析计算出的数值。组成引物对的引物优选设计成具有基本相同的Tm值。

根据第一区域设计的引物的具体的例子包括具有核苷酸序列SEQ ID NO：2(对应于核苷酸序列SEQ ID NO：1的5157到5185位核苷酸)的引物或其互补序列，具有核苷酸序列SEQ ID NO：3(对应于核苷酸序列SEQ ID NO：1的5171到5201位核苷酸)的引物或其互补序列，和具有核苷酸序列SEQ IDNO：4(对应于核苷酸序列SEQ ID NO：1的5171到5196位核苷酸)的引物或其互补序列。根据第二区域设计的引物的具体的例子包括具有核苷酸序列SEQ ID NO：6(对应于核苷酸序列SEQ ID NO：1的5276到5252位核苷酸)的引物或其互补序列，和具有核苷酸序列SEQ ID NO：7(对应于核苷酸序列SEQ ID NO：1的5276到5246位核苷酸)的引物或其互补序列。

引物对设计成使这两个区域之间的核苷酸序列可以被扩增，也就是，一条引物应该是正义引物另一条应该是反义引物。由于隐蔽性质粒是一种环形质粒，这两个区域之间有两段核苷酸序列。然而，引物通常设计成使较短的核苷酸序列被扩增。

引物对的优选例子包括具有核苷酸序列SEQ ID NO：2，3，或4的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5或6的寡核苷酸的组合。并且，引物对更优选的例子包括具有核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸的组合，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸的组合。

针对前述特定区域的引物对，领域的技术人员可以在考虑到PCR条件的基础上通过公知的方法进行设计。可以使用计算机程序设计引物对。

引物可通过混合两种或多种正义引物和反义引物中的一种或两种引物设计成混合引物。当用于引物设计的区域发生了核苷酸突变时，可以使用混合引物提高检测效率。

虽然PCR条件可以根据常规PCR方法设定，由于前述特定的引物对的使用，退火温度应设定得相对较高。退火温度通常是50到70℃。因为退火温度相对较高，在同等条件下进行退火和延伸的两步PCR的条件即可确定。

PCR反应混合物的组成的典型实例如下所示。

DNA片段                1分子或更多

引物                   100到2000nM

核苷酸                 每种100到500μM

DNA聚合酶              0.25到1.25单位/μl

Tris-HCl(pH7到9)       1到5mM

Mgcl₂                 1.5到5mM

表面活性剂或凝胶       0到25％

(终体积：25到100μl)

此外，下面给出了一个温度循环的典型例子，所述温度循环通常重复30到60次。

(1)变性：90到95℃，1到60秒

(2)退火：55到70℃，6到60秒

(3)延伸：72到75℃，6到60秒

下面给出了一个两步PCR的温度循环的典型例子，所述温度循环通常重复30到60次。

(1)变性：90到95℃，1到60秒

(2)退火和延伸：55到70℃，6到60秒

在本发明的检测方法中，延伸产物可通过常规检测扩增产物的方法检测。例如，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳检测，或通过实时PCR检测，其中PCR在底物存在下进行，该底物当与扩增产物结合时荧光发生改变(例如，荧光染料，当其与双链DNA结合时其荧光强度发生改变，设计杂交探针以使其与单链DNA杂交，并且荧光强度会因杂交引起的荧光共振能量传递而改变等等)，然后测量荧光。

根据本发明的检测方法，对于特定的区域可以设计具有相对高Tm值的引物，因而PCR中的退火温度可以相对较高。相应的，从变性温度到退火温度的降温时间可以减少。此外，高退火温度可使非特异性扩增减少。而且，也可以实施在相同条件下进行退火和延伸的两步PCR。结果是，基因的扩增更快的进行。

本发明还提供一种适于杂交检测的杂交探针。这样的杂交探针例子包括含有寡核苷酸和标记物的探针，该寡核苷酸是根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的核苷酸数5210到5245的区域的核苷酸序列设计的。这种寡核苷酸可以与正义或反义链互补。

杂交探针的寡核苷酸链的长度和Tm值可以根据杂交条件适当的确定。寡核苷酸的长度通常是25到45个核苷酸，Tm值通常是50到70℃。当杂交探针用于实时PCR时，寡核苷酸Tm值优选设置比引物的Tm值高2到5℃以致于探针可以在引物杂交前先行与目标序列杂交。这样的寡核苷酸的例子包括具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的寡核苷酸。

杂交探针可以在杂交条件下杂交不被抑制的方式进行标记。实时PCR的杂交探针优选通过在与单链DNA杂交时荧光强度发生改变的方式进行标记。

在本发明的检测方法中，扩增产物优选通过使用本发明的杂交探针的检测方法进行检测。

(2)本发明的检测试剂盒

本发明的检测试剂盒是一种适用于本发明的检测方法的试剂盒，也就是，一种以从样品中获得的DNA作为模板进行PCR检测沙眼衣原体的试剂盒，其特征在于包括根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的5157到5201位核苷酸和5245到5276位核苷酸的区域的序列设计的引物对，以使这两个区域之间的核苷酸序列可以被扩增。

该引物对如上文本发明检测方法中所述。

在本发明的试剂盒中，所述的引物可以单独地，或以混合物形式包括于引物对中。

本发明的试剂盒除了引物对之外还包括用于PCR和/或检测扩增产物所需试剂。这些试剂的例子包括前述的杂交引物。

实施例

下面，将参考下述实施例更具体地解释本发明。

实施例1：通过PCR检测

从沙眼衣原体的隐蔽性质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：1，GenBank登录号X06707)的第一区域(5157到5201位核苷酸)和第二区域(5245到5276位核苷酸)，选择了具有高GC含量(48到55％)和高Tm值(63到65℃)(通过最近相邻碱基对方法计算出)的核苷酸序列。也就是，选择3种类型的上游引物(SEQ ID NO：2，3和4)和2种类型的下游引物(SEQ ID NO：5和6)作为目标结合序列。然后，合成具有这些目标结合序列的寡核苷酸作为引物。

表1

上游(正向)引物：

CT-F5157-29：cag tca cac cca aaa gct ctg gga gca tg(SEQ IDNO：2)

CT-F5171-31：agc tct ggg agc atg ttc tta gtc tca gca g(SEQID NO：3)

CT-F5171-26：agc tct ggg agc atg ttc tta gtc tc(SEQ ID NO：4)

下游(反向)引物：

CT-R5276-25：tcg cgt agg gct tag aat cac ctt c(SEQ ID NO：5)

CT-R5276-31：tcg cgt agg gct tag aat cac ctt ctc gta c(SEQID NO：6)

使用包括前述上游和下游扩增引物(SEQ ID NOS：2-5，3-5和4-6)的组合的三种引物进行PCR。反应混合物(25uL)包含了1x基因Taq缓冲液，0.625U Gene Taq聚合酶(Nippon Gene)，dGTP，dCTP，dATP和dUTP各0.2mM，上游和下游引物各0.5μM，和2到2000拷贝沙眼衣原体细胞基因组DNA(ATCC菌株CT-VR878)。为确定适当的反应温度，使用了温度梯度作为在iCycler(BIORAD)中扩增反应的退火温度进行PCR扩增。反应温度如下所示：95℃4分钟，(95℃30秒，62到72℃梯度30秒，72℃30秒)x50循环，然后72℃7分钟。扩增的出现通过将产物上3％琼脂糖凝胶电泳进行确认。

无论使用那一个引物对，可以在相对较高的退火温度条件64.0到68.2℃下检测2拷贝的沙眼衣原体细胞基因组DNA。

上述结果显示前述引物序列有较好的敏感性和专一性，对于缩短反应时间是有效的。

实施例2：利用两步PCR的检测

在实施例1中使用的引物对中，引物对SEQ ID NOS：3-5和4-6用于两步PCR。反应混合物(25μL)包含1xΔTth缓冲液，0.625U ΔTth(TOYOBO)，各0.2mM的dGTP，dCTP，dATP和dUTP，各0.5μM的上游和下游引物，和2到2000拷贝的沙眼衣原体细胞基因组DNA(ATCC菌株CT-VR878)。反应温度如下所示：95℃1分钟，(95℃15秒，65或68℃20秒)x2循环，以及(90℃15秒，65或68℃20秒)x58循环。反应使用热循环器(TaKaRa)进行。扩增的出现通过将产物上3％琼脂糖凝胶电泳进行确认。

当使用引物对SEQ ID NOS：4-5时，可以在退火温度为68℃时检测2拷贝的沙眼衣原体细胞基因组DNA。当使用引物对SEQ ID NOS：6-7时，可以在退火温度65℃时检测2拷贝的沙眼衣原体细胞基因组DNA。

上述结果显示可以将两步PCR的反应时间进一步缩短。

实施例3：利用实时PCR检测

在实施例1中使用的引物对中，引物对SEQ ID NOS：3-5用于两步PCR。反应混合物(25μL)包含1xΔTth缓冲液，0.625U ΔTth(TOYOBO)，各0.2mM的dGTP，dCTP，dATP和dUTP，1μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2μM实时检测的探针(5FL-CT-5210-36：5’-caa agc tag aac aac gcc gcc ttc cat tcttga tgc-3’(SEQ ID NO：7)，5’端的c使用荧光染料标记，标记物种类：BODIPY-FL(Molecular Probe))，和2到2000拷贝沙眼衣原体细胞基因组DNA(ATCC菌株CT-VR878)。反应温度如下所示：95℃1分钟，(95℃15秒，65℃20秒)x2循环，(90℃15秒，65℃20秒)x58循环。反应在icycler(BIO-RAD)中进行。实时检测程序按照日本专利公开(特开)No.2001-286300所述。

结果显示在图1中，使用实施例中的引物对，可以在退火温度为65℃时检测2拷贝的沙眼衣原体细胞基因组DNA。

工业实用性

本发明提供了一种具有较高的敏感性和专一性的快速检测沙眼衣原体的方法。

                                序列表

<110>Arkray.Inc.

<120>检测沙眼衣原体的方法及试剂盒

<130>G849-OPC4043

<150>JP 2003-50662

<151>2003-02-27

<160>7

<210>1

<211>7501

<212>DNA

<213>沙眼衣原体

<400>1

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ggttttatat ttagagaaaa aagttcgaat tacggggttt gttatgcaaa ataaaagcaa    5580

agtgagggac gattttatta aaattgttaa agatgtgaaa aaagatttcc ccgaattaga    5640

cctaaaaata cgagtaaaca aggaaaaagt aactttctta aattctccct tagaactcta    5700

ccataaaagt gtctcactaa ttctaggact gcttcaacaa atagaaaact ctttaggatt    5760

attcccagac tctcctgttc ttgaaaaatt agaggataac agtttaaagc taaaaaaggc    5820

tttgattatg cttatcttgt ctagaaaaga catgttttcc aaggctgaat agataactta    5880

ctctaacgtt ggagttgatt tgcacacctt agttttttgc tcttttaagg gaggaactgg    5940

aaaaacaaca ctttctctaa acgtgggatg caacttggcc caatttttag ggaaaaaagt    6000

gttacttgct gacctagacc cgcaatccaa tttatcttct ggattggggg ctagtgtcag    6060

aagtaaccaa aaaggcttac acgacatagt atacacatca aacgatttaa aatcaatcat    6120

ttgcgaaaca aaaaaagata gtgtggacct aattcctgca tcatttttat ccgaacagtt    6180

tagagaattg gatattcata gaggacctag taacaactta aagttatttc tgaatgagta    6240

ctgcgctcct ttttatgaca tctgcataat agacactcca cctagcctag gagggttaac    6300

gaaagaagct tttgttgcag gagacaaatt aattgcttgt ttaactccag aacctttttc    6360

tattctaggg ttacaaaaga tacgtgaatt cttaagttcg gtcggaaaac ctgaagaaga    6420

acacattctt ggaatagctt tgtctttttg ggatgatcgt aactcgacta accaaatgta    6480

tatagacatt atcgagtcta tttacaaaaa caagcttttt tcaacaaaaa ttcgtcgaga    6540

tatttctctc agccgttctc ttcttaaaga agattctgta gctaatgtct atccaaattc    6600

tagggccgca gaagatattc tgaagttaac gcatgaaata gcaaatattt tgcatatcga    6660

atatgaacga gattactctc agaggacaac gtgaacaaac taaaaaaaga agcgaatgtc    6720

ttttttaaaa aaaatcaaac tgccgcttct ttagatttta agaagacgct tccttccatt    6780

gaactattct cagcaacttt gaattctgag gaaagtcaga gtttggatca attattttta  6840

tcagagtccc aaaactattc ggatgaagaa ttttatcaag aagacatcct agcggtaaaa  6900

ctgcttactg gtcagataaa atccatacag aagcaacacg tacttctttt aggagaaaaa  6960

atctataatg ctagaaaaat cctgagtaag gatcacttct cctcaacaac tttttcatct  7020

tggatagagt tagtttttag aactaagtct tctgcttaca atgctcttgc atattacgag  7080

ctttttataa acctccccaa ccaaactcta caaaaagagt ttcaatcgat cccctataaa  7140

tccgcatata ttttggccgc tagaaaaggc gatttaaaaa ccaaggtcga tgtgataggg  7200

aaagtatgtg gaatgtcgaa ctcatcggcg ataagggtgt tggatcaatt tcttccttca  7260

tctagaaaca aagacgttag agaaacgata gataagtctg attcagagaa gaatcgccaa  7320

ttatctgatt tcttaataga gatacttcgc atcatgtgtt ccggagtttc tttgtcctcc  7380

tataacgaaa atcttctaca acagcttttt gaacttttta agcaaaagag ctgatcctcc  7440

gtcagctcat atatatatct attatatata tatatttagg gatttgattt tacgagagag  7500

a                                                                  7501

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

cagtcacacc caaaagctct gggagcatg                                     29

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

agctctggga gcatgttctt agtctcagca g                                  31

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

agctctggga gcatgttctt agtctc                                         26

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

tcgcgtaggg cttagaatca ccttc                                          25

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

tcgcgtaggg cttagaatca ccttctcgta c                                   31

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>7

caaagctaga acaacgccgc cttccattct tgatgc                              36

Claims (7)

1.一种用于检测沙眼衣原体的方法，该方法包括将从样品中获得的DNA作为模板进行PCR并对扩增产物进行检测，其中PCR所使用的引对物对是根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的5157到5201位和5245到5276位的核苷酸序列设计的，以扩增这两个区域之间的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中引物对由具有核苷酸序列SEQ IDNO：2，3，或4的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5或6的寡核苷酸组成。

3.根据权利要求2所述的方法，其中引物对由具有核苷酸序列SEQ IDNO：3的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸组成，或由具有核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸组成。

4.一种用于以由样品中获得的DNA作为模板进行PCR来检测沙眼衣原体的试剂盒，包括根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的5157到5201位和5245到5276位的核苷酸序列设计的，用于扩增这两个区域之间的核苷酸序列的引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述引物对由具有核苷酸序列SEQID NO：2，3，或4的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5或6的寡核苷酸组成。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中引物对由具有核苷酸序列SEQ IDNO：3的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸组成，或由具有核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸和具有核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸组成。

7.一种杂交探针，包括寡核苷酸和标记物，其中，所述寡核苷酸是根据对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列中的5210到5245位的核苷酸序列设计的。

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