CN1384203A - 具有高度延伸专一性的dna低温循环延伸反应方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有高度延伸专一性的DNA低温循环延伸反应的方法,该方法采用低温DNA扩增体系,使用短于25bp的引物得到有用的特异性产物,供测序或其他分析之需,本发明可用于大规模高保真PCR和自动荧光DNA循环测序反应。

Description

具有高度延伸专一性的DNA低温循环延伸反应方法
本发明涉及生物工程，更具体地说涉及DNA低温循环延伸反应。
一般加热到95℃(高于其变性温度Tm)时，双链DNA就会变性，产生两条互补的单链DNA片断。在酶促DNA聚合反应时，当引物结合到单链模板中的互补序列上后，会延伸产生新的DNA链。重新加热到95℃时，新合成的DNA将和模板分离。单链模板在退火后又可与寡核苷酸引物结合，在有足够活性的DNA聚合酶和四种dNTP的存在下，新一轮的酶促DNA聚合反应得以进行。上述反应通常选用热稳定的DNA聚合酶一它能经受95℃的高温，并在55-72℃时有聚合活性。这样在每次高温变性之后不必加入额外的聚合酶。当一种过量的引物和模板混和，经过若干次温度循环后，单链DNA靶片断的数目将以每次循环增加一倍的速度扩增。当反应体系中存在链终止物，即四种ddNTP(包括ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)或其类似物时，将产生许多长短不同的单链DNA片断。这些片断的5’端有相同的引物，3’端为特定的ddNTP或其类似物，ddNTP类似物可用荧光染料标记。以上就是利用荧光染料标记的DNA链终止物进行自动DNA测序的原理。
在上述体系中加入一对引物，即一个正向引物和一个反向引物，它们分别与双链DNA靶序列的两端互补，这样，新合成的DNA链可作为后续聚合反应的模板。当热循环重复若干次时，靶片断的拷贝数呈指数增长。以上就是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的原理。
实际操作时，不管是PCR反应，还是利用荧光染料标记的DNA链终止物进行自动DNA测序，都使用热稳定的DNA聚合酶，比如栖热水生菌(Thermusaquaticus)DNA聚合酶(Taq)，它能承受95℃的高温。但热稳定聚合酶通常进行性较低，而且在某些条件下，特别是在待扩增或测序DNA模板存在GC富含区时，会丧失其序列特异的聚合酶活性。因此，有人尝试用热不稳定DNA聚合酶进行低温循环测序反应(Fuller)和低温PCR反应(Iakobashvili和Lapidot)，热不稳定DNA聚合酶一般比热稳定DNA聚合酶有更高的忠实性和进行性。Fuller声称终浓度为40％(v/v)甘油或乙二醇可降低模板DNA的Tm值，使变性和延伸反应得以在80℃以下进行，从而可以使用包括Bca和Klenow片断的DNA聚合酶进行扩增反应。同时，Iakobashvili和Lapidot发现即使在高浓度的甘油下，Klenow片段仍不适合低温循环引物延伸反应。但是如果反应在37℃-70℃进行，在反应体系中加入4.85M脯氨酸和17％(w/v)甘油，可以保护Klenow片断的活性。然而，不管是Fuller还是Iakobashvili和Lapidot的低温PCR方法，都没有投入实际应用，也没有迹象表明它们能产生高质量的序列特异PCR产物，或者可以产生适合测序的反应产物。Iakobashvili和Lapidot并没有证实低温PCR产物是序列特异的，特别是使用20-25bp长的引物时。即使当引物长度为30-35bp时，Klenow片段可获得低温PCR产物，但也没有证据表明其序列特异性。由于大多数用于PCR或测序反应的引物小于30bp，所以迫切需要找到一种低温DNA扩增体系，使得使用短于20bp的引物能得到有用的特异性产物，以供测序或其他进一步分析之需。
本发明的目的是提供一种低温DNA扩增体系，使该体系能使用短于25bp的引物能得到有用的特异性产物，以供测序或其他分析之需。
本发明另一目的是提供稳定的即用反应预混和物，它可用于大规模高保真PCR和自动荧光DNA循环测序反应。
本发明是这样实现的，一种延伸专一性的DNA低温循环延伸方法包括：
a.在反应体系中含有低浓度的甘油或乙二醇，存在有一种模板，一对长度短于或长于25bp的引物和一种野生型或修饰后的中等热稳定DNA聚合酶的即用型反应混合物，当温度在变性温度(～70℃)和退火温度(约37℃)之间循环时DNA聚合酶能重复延伸引物，得到序列特异性扩增产物；
b.扩增双链DNA片断直接用于循环测序反应，该循环测序反应包括加入大大过量引物、四种标准荧光标记的ddNTP终止物、一种中等热稳定的DNA聚合酶、适量四种ddNTP混合物及含有15％(V/V)甘油的缓冲体系，在80℃以下重复环引物延伸反应若干次，得荧光标记ddNTP终止的不同长度延伸产物；
反应在甘油的浓度为5-35％，最适浓度为15％的溶液中进行；
中等热稳定DNA聚合酶反应温度为37℃-70℃，最适反应温度为65±1℃；
中等热稳定DNA聚合酶与Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸至少存在95％同源性；
正向引物和反向引物的长度可短于或长于25bp；
反应体系中重复热循环多次，双链DNA的指定区域得到扩增；
反应体系中存在ddNTP或其类似物时，用单一引物重复扩增，得不同长度的特异性延伸终止；
中等热稳定DNA聚合酶可为野生型或修饰后的源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus DNA聚合酶，或者氨基酸序列与Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸序列至少95％同源的中等热稳定DNA聚合酶；
即用反应混和物含有一种中等热稳定DNA聚合酶，它与一部分或所有与酶促DNA引物延伸反应有关的成分预先混合，在80℃以下进行低温循环引物延伸反应或含有ddNTP类似物的特异延伸终止反应；
即用反应混和物中中等稳定DNA聚合酶可为野生型或修饰后源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶，或者氨基酸序列与Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶的氨基酸序列至少存在95％同源的中等热稳定DNA聚合酶；
即用反应混和物为干粉或预先配制的溶液；
即用混和物预先分装在微离心管或多孔反应板中；
即用型混和物用于大规模自动PCR扩增或大规模自动DNA测序反应。
本发明涉及中等热稳定DNA聚合酶的应用，以及引入低浓度的甘油或乙二醇作为降低双链DNA的变性温度的试剂，这样能使引物低温扩增得到序列特异性产物。具有高度进行性的中等热稳定DNA聚合酶在70℃以上会快速失活，而且该酶促反应的最适温度在65℃，本反应体系的循环温度恰好在37℃到70℃之间。所以引入该酶既可以克服热稳定DNA聚合酶(如Taq及其突变型)的缺点，同时也可以克服一些热不稳定DNA聚合酶(如Klenow片断)的缺点。
甘油和乙二醇降低DNA的变性温度的程度一般与其终浓度成比例。例如溶液中甘油的浓度每升高一个百分点，双链DNA的变性温度约下降0.4到0.5℃。本发明发现在离体条件下，低浓度的甘油或乙二醇能增加中等热稳定DNA聚合酶的序列专一性活性。在高浓度条件下，例如大于20％，无论甘油还是乙二醇对这些聚合酶的活性有明显的抑制作用。通过合适的滴度实验，获得了甘油或乙二醇的最适浓度，使双链DNA在70℃几乎完全变性。这样中等热稳定DNA聚合酶的活性在低温序列特异性循环引物延伸反应时可得到保持。
本发明首先发现在最适酶促反应温度65℃，当甘油的最终浓度在20％(v/v)以下时，中等热稳定DNA聚合酶的5’-3’聚合活性增强(图1)；但高浓度的甘油会抑制其活性。当甘油浓度升高到40％，这类DNA聚合酶一般失去其2/3的聚合活性。
在反应体系中存在40％甘油作为降低DNA变性温度的试剂时，利用中等热稳定的DNA聚合酶进行低温热循环延伸反应，产生了长短不一的非特异性扩增产物(图2)。
在反应体系中存在35％甘油作为降低DNA变性温度的试剂时，利用中等热稳定的DNA聚合酶(比如突变的Bst或Bca)进行低温热循环延伸反应，当靶片断长度为250或400bp时，没有获得任何扩增产物；但对较长的靶片断(1kb和2kb)，仅能得到非特异性的扩增产物(图3)。
当反应体系中存在低浓度的甘油(如15％，v/v)时，利用中等热稳定的DNA聚合酶(比如突变的Bst或Bca)进行低温热循环延伸反应，能获得长度从250bp到2kb的序列特异性扩增产物(图3)。
由此可见，，当反应体系中存在低浓度的甘油或乙二醇(如15％，v/v)作为降低DNA变性温度的试剂时，利用中等热稳定的DNA聚合酶进行低温热循环延伸反应，能获得序列特异性扩增产物。中等热稳定的DNA聚合酶包括野生型Bst、突变型Bst和Bca DNA聚合酶等，它们的最适反应温度在65℃左右，容易在70℃左右失活的聚合酶。在本低温循环延伸反应体系中，短于或长于25bp的引物都可获得序列特异性的扩增产物(图4)。但是Klenow片断不能产生可用于进一步分析的足量PCR扩增产物(图4)；而热稳定Taq酶的突变体(如AmpliTaqTM和ThermoSequenaseTM)在测序反应时，无法获得可用于进一步分析的序列特异性扩增产物。在最适条件下的高温(95℃变性)循环扩增反应中，这两种酶一般能延伸退火在模板上的引物，但对富含GC的模板例外。与利用中等热稳定的DNA聚合酶进行的低温循环延伸反应相比，在高温下的热稳定DNA聚合酶的低进行性比较突出，特别是GC富含模板的测序反应。热稳定的DNA聚合酶在模板GC富含区的下游无法产生序列特异性的ddNTP终止物，而中等热稳定的DNA聚合酶能成功地克服相应序列(图5)。
当利用中等热稳定的DNA聚合酶进行上述低温热循环延伸反应时，退火和延伸温度可都在45℃进行，也可以分别在37℃和50℃进行(图6)。因此，以下条件A和B都可用于低温循环反应，从而有效地获得特异性扩增产物：
(A)70℃ 30秒，45℃ 4分钟，共35个循环；
(B)70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分钟，共35个循环。
在利用荧光染料标记的ddNTP终止物的自动循环测序反应中，条件B更合适些。
当本发明用于DNA循环测序反应时，反应体系包括一个引物、含15％甘油的反应体系，和一个中等热稳定的DNA聚合酶。在ddNTP或其类似物(可荧光标记)存在下，单链寡核苷酸引物延伸后产生长短不一的特异性终止。上述引物可以是纯化的单链或双链DNA片断，也可以是未纯化的上述双链低温PCR产物。由于应用本发明获得的产物具有高度序列特异性，所以用作测序模板时，没必要从反应混和物中分离PCR产物。
Bst-II DNA聚合酶是Bst-I DNA聚合酶的突变体，它无论以即用型混合液或以干粉形式，在室温下都有高度稳定性，至少可保存8周。因此本发明可应用于大规模自动荧光DNA测序反应。
附图说明：
图1是甘油对Bst-II DNA聚合酶5′-3′聚合活性的影响
纵轴为剩余活性％
横轴为甘油浓度％(V/V)。
图2是在40％甘油下进行低温扩增反应
M GeneRulerTM DNA Ladder(MBI，Fermentus)
1、在40％甘油下低温PCR(模板：16ng/ul)
2、在40％甘油下低温PCR(模板：160ng/ul)。
图3是不同长度的模板在35％甘油(泳道1)或15％甘油(泳道2)中的低温热循环延伸反应。
扩增产物长度：A 250bp；B 400bp；C 1Kb；D 2Kb
图4中等热稳定DNA聚合酶和Klenow片段在17聚和30聚引物下的低温循环扩增反应：
A：用17聚引物进行的反应：
A1：Klenow片段用lakobashvili和Lapidot体系，
A2：Klenow片段用Bst反应体系，
A3：Bst-1用Bst反应体系，
A4：Bst-11用Bst反应体系，
A5：Bca用Bst反应体系；
B：用30聚引物进行的反应：
B1：Klenow片段用lakobashvili和Lapidot体系，
B2：Klenow片段用Bst反应体系，
B3：Bst-1用Bst反应体系，
B4：Bst-11用Bst反应体系，
B5：Bca用Bst反应体系；
图5是利用定温储存的Bst-11 DNA聚合酶预混和液进行高得真低温循环测序反应。A和B表示使用相同引物的同一模板的两种自动荧光DNA测序结果。
图6是在不使用甘油或使用15％甘油时，中等热稳定DNA聚合酶Bst-11在不同反应温度下进行低温循环延伸反应：
1、未使用甘油；70℃30秒，37℃4分钟，共35个循环；
2、未使用甘油；70℃30秒，37℃20秒，45℃3分钟，共35个循环；
3、未使用甘油；70℃30秒，37℃20秒，50℃3分钟，共35个循环；
4、未使用甘油；70℃30秒，37℃20秒，60℃3分钟，共35个循环；
5、使用15％甘油；70℃30秒，37℃4分钟，共35个循环；
6、使用15％甘油；70℃30秒，37℃20秒，45℃3分钟，共35个循环；
7、使用15％甘油；70℃30秒，37℃20秒，50℃3分钟，共35个循环；
8、使用15％甘油；70℃30秒，37℃20秒，60℃3分钟，共35个循环；9、使用15％甘油；70℃30秒，45℃4分钟，共35个循环。
实施例1  甘油对Bst-II DNA聚合酶5’-3’聚合活性的影响
用以下方法确定在不同浓度的甘油中Bst-II DNA聚合酶的剩余活性(聚合酶根据美国专利No.6,165,765制备)：
(A)在0.5ml离心管中加入：
管号 1  2  3  4  5  6  7
5x反应缓冲液(μl) 5  5  5  5  5  5  5
dNTP(每种1mM)(μl) 1  1  1  1  1  1  1
小牛胸腺DNA(μl) 1  1  1  1  1  1  1
5x反应缓冲液：100mM Tris-Cl(pH 8.5)，100mM MgCl2；
小牛胸腺DNA：1.5μg/μl，经Dnase I活化。
以上混和物先用Speed-Vacuum真空抽干，再将如下试剂加入上述离心管，以获得不同浓度的甘油浓度：
(1)甘油：
管号 1  2  3  4  5  6  7
甘油浓度(v/v) 0  10％  15％  20％  30％  40％  50％
α-32P-dATP(ul) 1  1  1  1  1  1  1
聚合酶(0.36ug/ul)(ul) 1  1  1  1  1  1  1
甘油(80％储液)(ul) 0  3.1  5.0  6.9  10.6  14.4  18.1
ddH2O(ul) 28  24.9  23.0  21.1  17.4  13.6  9.9
总体积(ul) 30  30  30  30  30  30  30
(B)上述离心管65℃温育30分钟，将反应混和物分别滴加在DE-81滤膜上，干燥后用液闪测定每张滤膜的放射性活度(X1)。滤膜用0.3M Na2HPO4室温清洗三次，每次10分钟。室温晾干后再次测定每张滤膜的放射性活度(X2)。掺入率即为X2/X1。
剩余活性％＝甘油存在时放射性活度掺入率/没有甘油存在时放射性活度掺入率
如图1所示，当甘油浓度小于20％(v/v)时，能增加Bst-II DNA聚合酶的活性。但高浓度的甘油对酶活性有抑制作用。
实施例2    40％甘油(v/v)对利用中等热稳定DNA聚合酶进行的低温循环延伸反应的影响
本实验选用Bst-II DNA聚合酶。
模板：pBluescript(+)
正向引物：5’GTAAAACGACGGCCAGT 3’
反向引物：5’AACAGCTATGACCATG 3’
反应步骤：
(A)在0.2ml离心管中加入：
模板(16ng/ul或160ng/ul               1ul
正向引物(10pmol/ul)                  2.5ul
反向引物(10pmol/ul)                  2.5ul
dNTP(每种2.5mM)                      4ul
5x反应缓冲液                         5ul
(B)上述溶液用Speed-Vacuum真空抽干，并将下列试剂加入：
ddH2O                               11.75ul
80％甘油                             11.25ul
Bst-II DNA聚合酶(1U/ul)              2ul
(C)如下操作低温循环：
70℃  30秒
45℃  4分钟
共35个循环。
用1％琼脂糖胶电泳，溴化乙锭染色，检测反应产物。
图2的结果表明，在仅存在40％甘油作为降低双链DNA变性温度的试剂时，无论是用高浓度或是低浓度的模板，只能获得长度不一的非特异性循环扩增产物。
实施例3    使用低浓度甘油对利用中等热稳定DNA聚合酶的低温循环反应的影响
本实验旨在表明将甘油浓度降至15％(v/v)，也能有效降低DNA的变性温度，从而可利用中等热稳定的DNA聚合酶获得特异性的循环延伸反应产物。
本实验选用Bst-II DNA聚合酶。
本实验选用四套不同的模板和引物，用来代表不同长度的待扩增DNA片段：
模板A：   pBluescript(+)，10ng/ul
正向引物：5’GTAAAACGACGGCCAGT 3’
反向引物：5’AACAGCTATGACCATG 3’
模板B：   水稻基因组BAC DNA，10ng/ul
正向引物：5’CTTAATTTAAGGTTCCGTG 3’
反向引物：5’GCATTGGTAAGCAATGG 3’
模板C：   探针DNA，50ng/ul
正向引物：5’ACAAAGCACTGAACCTG 3’
反向引物：5’TGGGACCTATCGTGTTG 3’
模板D：   水稻基因组BAC的亚克隆，50ng/ul
正向引物：5’CGAATTCCTGCAGCC 3’
反向引物：5’GAACTAGTGGATCCCCC 3’
低温循环延伸反应如下操作：
(A)在0.2ml离心管中加入以下试剂：
模板(A，B，C或D)                              1ul
正向引物(A，B，C或D)(10pmol/ul)          2.5ul
反向引物(A，B，C或D)(10pmol/ul)          2.5ul
dNTP(每种2.5mM)                          4ul
5x反应缓冲液                             5ul
(B)上述混和物用Speed-Vacuum真空抽干，再在离心管中加入以下试剂，从而在反应体系中获得35％或15％终浓度的甘油：
1. 35％甘油的体系：               2.15％甘油的体系：
ddH2O                 12.1ul     ddH2O                   18.3ul
80％甘油               10.9ul     80％甘油                 4.7ul
Bst-II DNA聚合酶(1U/ul)2ul        Bst-II DNA聚合酶(1U/ul)  2ul
(C)低温热循环反应步骤如下：
70℃  30秒
45℃  4分钟
共35个循环
反应产物在1％琼脂糖凝胶上样电泳，并用溴化乙锭染色。从35％甘油的体系中获得的反应产物上样在泳道1，从15％甘油体系中获得的反应产物上样在泳道2。
图3的实验表明，在反应体系中存在35％甘油作为降低DNA变性温度的试剂时，当扩增的靶DNA片段较小时(250bp或400bp)，无法获得扩增产物(图3-A1和B1)；当扩增的DNA靶片段较长的(1Kb或2Kb)，酶促热循环反应同时产生了特异性和非特异性的产物(图3-C1和D1)。
在反应体系中存在15％甘油作为降低DNA变性温度的试剂时，扩增的靶DNA片段在250bp到2Kb的范围内，都能用中等热稳定的DNA聚合酶通过低温热循环获得特异性扩增产物(图A2，B2，C2和D2)。
图3.不同长度的模板在35％甘油(泳道1)或15％甘油(泳道2)中的低温热循环延伸反应。
扩增产物长度：A.250bp；B.400bp；C.1Kb；D.2Kb
根据以上反应的结果，反应体系中使用低浓度的甘油(比如终浓度约15％)作为降低DNA变性温度的试剂时，可以用中等热稳定的DNA聚合酶获得特异性延伸反应。
实施例4利用几种中等热稳定DNA聚合酶进行双链模板低温热循环延伸反应
设计本实验旨在表明，本发明中的中等热稳定DNA聚合酶及其低温热循环反应体系可用于不同长度的引物的特异性延伸反应，不管引物的长度大于或小于20bp。
本实验选用的聚合酶是Bst-I(系野生型，根据美国专利5,834,254制备)、Bst-II和Bca(TaKaRa公司)。Klenow片段(Sigma Chemical公司)用作热不稳定DNA聚合酶的对照(Iakobashvili和Lapidot)。
模板为水稻基因组BAC B414f7。
两对引物分别是：
A：17聚正向引物：5’TAG CTA TCT AAC TTA ATT TA3’，
   17聚反向引物：5’TTG TTT CTC TGA TGC ATT GG3’，
B：30聚正向引物：5’TAG CTA TCT AAC TTA ATT TAA GGT TCC GTG3’，
   30聚反向引物：5’TTG TTT CTC TGA TGC ATT GGT AAG CAA TGG3’.
低温反应体系(以下称Bst体系)如下操作：
(A)在0.2ml离心管中加入如下试剂：
模板(5ng/ul)                         1ul
正向引物(15pmol/ul)                  2.5ul
反向引物(15pmol/ul)              2.5ul
dNTP(每种2.5mM)                  4ul
5x反应缓冲液                     5ul
(B).将上述组分真空抽干，并将如下试剂加入离心管中：
80％甘油                         4.7ul
DNA聚合酶(4U/ul)                 2ul
ddH2O                           18.3ul
(C)如下操作热循环：
70℃  30秒
37℃  20秒
50℃  3分钟
共35个循环。
用1％琼脂糖凝胶上样检测反应产物，并用溴化乙锭染色。
另外也采用了Iakobashvili和Lapidot建议的Klenow片段的反应体系(含Tris-HCl缓冲液的4.5M脯氨酸和17％甘油，以下称Iakobashvili和Lapidot体系)，它的反应产物与Bst体系的反应产物一起上样检测(图4)。
图4.中等热稳定DNA聚合酶和Klenow片段在17聚和30聚引物下的低温循环扩增反应。
A：用17聚引物进行的反应：
   A1：Klenow片段用Iakobashvili和Lapidot体系，
   A2：Klenow片段用Bst反应体系，
   A3：Bst-I用Bst反应体系
   A4：Bst-II用Bst反应体系，
   A5：Bca用Bst反应体系；
B：用30聚引物进行的反应：
   B1：Klenow片段用Iakobashvili和Lapidot体系，
   B2：Klenow片段用Bst反应体系，
   B3：Bst-I用Bst反应体系
   B4：Bst-II用Bst反应体系，
   B5：Bca用Bst反应体系；
分子量标准参照物：
M1：λDNA/Hind III，
M2：DL 2,000(TaKaRa公司，DNA片段分别为2000，1000，750，500，250，100bp.)
图4表明中等热稳定DNA聚合酶，即野生型的Bst-I、突变型的Bst-II和Bca，在Bst反应体系中，不管用17聚(A3-A5)还是30聚(B3-B5)引物，都能产生特异性扩增产物；而热不稳定的Klenow片段不管用17聚还是用30聚引物，无论在Bst反应体系(A2和B2)还是在Iakobashvili和Lapidot体系(A1和B1)中，都没有特异性扩增产物。
实施例5利用室温储存的Bst-II DNA聚合酶预混和液进行高保真低温循环测序反应
本发明可以利用遗传修饰的中等热稳定DNA聚合酶(象Bst-II)对有富含GC区的模板进行测序反应，而常用的热稳定DNA聚合酶(如AmpliTaqTM和ThermoSequenaseTM)由于其低进行性，无法获得可用于测序的扩增产物。并且含有或不含有引物的预配制反应混和液能在微离心管或酶标板中25℃至少保存8个星期。
例：(以下称Bst-II循环测序反应)
选用Bst-II作为DNA聚合酶。
模板：bg08，存在GC富含区，为水稻基因组BAC 129的亚克隆
引物R：5’GAA TTG GAG CTC CAC CGC GG3’
预混和荧光标记ddNTP：包括适量的R6G-ddATP、ROX-ddCTP、TAMRA-ddUTP和Bodipy F1-14-ddGTP，购自NENTM Life Sciences Products。
测序反应按以下步骤进行：
(A)将下列试剂加入0.2ml离心管，并在24℃以下用Speed-Vacuum真空抽干：
引物(10pmol/ul)                           1.5ul
dNTP(每种2.5mM)                           1ul
5×RB                                     5ul
预混和荧光标记ddNTP                       4ul
Bst-II DNA聚合酶(10U/ul)                  1ul
(B)在上述离心管中加入：
ddH2O             16.3ul
80％甘油           4.7ul
在23℃-25℃保存含上述成份的离心管8星期。
(C)反应前，在预混和液中加入2.5ul模板(150ng/ul)和1.5ul引物。
(D)充分混匀后进行如下热循环反应：
70℃ 30秒，
37℃ 20秒，
45℃ 4分钟，
总计35个循环。
(E)加入2.5ul 3M NaOAc(pH5.2)和55ul 95％乙醇。将离心管上下颠倒数次，室温放置20分钟，以沉淀延伸产物。
(F)在室温下12,000g离心20分钟。
(G)吸去上清，沉淀用120ul 70％乙醇洗涤。
(H)将离心管上下颠倒数次，室温放置15分钟，12,000g离心10分钟。
(I)45℃烘干沉淀，并用1.2ul上样缓冲液溶解(去离子甲酰胺∶溶有50mg/ml蓝色葡聚糖的25mM EDTA(pH8.0)为5∶1).
(J)95℃变性3分钟，立即放在冰上。
(K)将所有样品加到4.5％测序胶(6M尿素)上，利用ABI PRISMTM 377DNA测序仪收集数据。并用相应的Instrument File分析。
作为对照，相同的模板和引物用常用的商品化测序试剂盒ABI PrismTMBigDyeTM terminator cycle sequencing kit(ABI公司，使用AmpliTaq DNA聚合酶)和DYEnamicTM ET terminator cycle sequencing kit(Amersham公司，使用ThermoSequenaseTM DNA聚合酶)按各自公司提供的步骤进行反应。
图5的测序结果表明，用含有AmpliTaq DNA聚合酶的ABI PrismTMBigDyeTM terminator cycle sequencing kit对存在GC富含区的模板进行测序时，无法获得特异性的终止(图5A)。与之相反，已经在25℃预混和液中保存8个星期的Bst-II DNA聚合酶能成功地产生特异性的荧光标记ddNTP终止，使测序反应得以进行(图5B)。与ABI AmpliTaq试剂盒相似，AmershamDYEnamicTM ET terminator cycle sequencing kit同样在自动荧光DNA测序时无法克服模板中的GC富含区。
总之，Bst-II循环测序反应体系能以即用型混和物的形式在室温下至少保持稳定8周，最适合大规模高保真自动DNA测序，尤其适合模板中的GC富含区。
图5 GC富含区的DNA测序——使用AmpliTaq的ABI PrismTM BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing Kit(A)与Bst-II DNA聚合酶测序系统(B)测序效果的比较。
图5A和B表示使用相同引物的同一模板的两种自动荧光DNA测序结果。所有测序反应使用ABI 377测序仪。图5A的阴影区表示被计算机认为不合格的部分序列。A＝使用AmpliTaqTM的ABI PrismTM BigDyeTM TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit的测序结果；B＝使用Bst-II循环测序反应的结果。
实施例6利用中等热稳定DNA聚合酶进行的热循环延伸反应最适温度的确定
本实验旨在确定在反应混合液使用15％甘油作为降低DNA变性稳定的试剂时，中等热稳定DNA聚合酶循环引物延伸反应的最适温度。
本实验选用Bst-II DNA聚合酶。
模板：一个水稻基因组BAC DNA
正向引物：5’CTT AAT TTA AGG TTC CGT G 3’
反向引物：5’GCA TTG GTA AGC AAT GG 3’
低温PCR如下操作：
(A)在0.2ml离心管，加入：
模板(10ng/ul)               1ul
正向引物(10pmol/ul)         2.5ul
反向引物(10pmol/ul)         2.5ul
dNTP(每种2.5mM)             4ul
5x反应缓冲液                5ul
(B)上述混和物用Speed-Vacuum真空抽干，并在离心管中加入以下试剂：
    甘油终浓度(v/v)     0％     15％
    ddH2O     23ul     18.3ul
    80％甘油     0ul     4.7ul
    Bst-II DNA聚合酶(1U/ul)     2ul     2ul
(C)    如下操作热循环引物延伸反应：
    步骤1     步骤2     步骤3     步骤4     步骤5
70℃  30秒 70℃  30秒 70℃  30秒 70℃ 30秒 70℃  30秒
37℃  4分钟 37℃  20秒 37℃  20秒 37℃ 20秒 45℃  4分钟
35个循环 45℃  3分钟 50℃  3分钟 60℃ 3分钟 35个循环
35个循环 35个循环 35个循环
反应产物用1％琼脂糖凝胶上样电泳，并用溴化乙锭染色(图6)。
图6.在不使用甘油或使用15％甘油时，中等热稳定DNA聚合酶Bst-II在不同反应温度下进行的低温循环延伸反应。
1.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 4分钟，共35个循环；
2.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 3分钟，共35个循环；
3.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分钟，共35个循环；
4.未使用甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，60℃ 3分钟，共35个循环；
5.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 4分钟，共35个循环；
6.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，45℃ 3分钟，共35个循环；
7.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分钟，共35个循环；
8.使用15％甘油；70℃ 30秒，37℃ 20秒，60℃ 3分钟，共35个循环；
9.使用15％甘油；70℃ 30秒，45℃ 4分钟，共35个循环；
图6表明，对于中等热稳定的DNA聚合酶(象Bst-II)，在使用15％甘油作为降低DNA变性温度试剂的反应体系中，最为有效的热循环引物退火和延伸可都在45℃进行(泳道9)，也可以分别在37℃和40℃-45℃进行。尽管反应步骤3和5都能获得特异性产物，但对于荧光标记的自动DNA测序反应终止物来说，步骤3(70℃ 30秒，37℃ 20秒，50℃ 3分钟，共35个循环)效果更好(泳道7)。
实施例7利用含有Bst-II DNA聚合酶的即用预混和液得到的低温循环扩增产物进行直接测序
本实验表明低温引物延伸反应的预配混和物，其中包含一种中等热稳定的DNA聚合酶(有时也可加入引物)，能在使用前于23℃至25℃分别保存在微离心管或96孔板中至少8周。并且扩增反应产物不经纯化能直接用于自动DNA测序反应。
反应采用Bst-II DNA聚合酶，
模板：H525d9，水稻基因组BAC DNA：
正向引物：5’TTT CAG GGT CCC TTA TAT CTC 3’，
反向引物：5’TCG CTT CTC CTC ATA ATC GAT 3’。
预混和荧光标记ddNTP：包括适量的R6G-ddATP、ROX-ddCTP、TAMRA-ddUTP和Bodipy F1-14-ddGTP，购自NENTM Life Sciences Products。
实验按以下步骤进行：
(A)在0.2ml离心管中加入下列试剂，然后在24℃以下真空抽干：
正向引物(10pmol/μl)          2μl
反向引物(10pmol/μl)          2μl
dNTP(每种2.5mM)               2μl
5x反应缓冲液                  5μl
Bst-II DNA聚合酶(10U/μl)     1μl
抽干后，在离心管中加入下述试剂：
ddH2O                        16.3μl
80％甘油                      4.7μl
反应预混和物可在23℃至25℃至少保存8周。
(B)使用时，将下述试剂加入到预混和物中：
模板(2.5ng/μl)                1μl
ddH2O                         3μl
(C)充分混匀后，如下操作低温热循环反应：
70℃ 30秒，
37℃ 20秒，
45℃ 4分钟，
共35个循环。
(D)将纯化的扩增产物测序：
(1)热循环反应结束后，将反应产物上样在1％低熔点琼脂糖胶上电泳；
(2)电泳后，切下合适大小的琼脂糖胶块，称重；
(3)分别加入0.04倍质量的25×Conc.缓冲液(Roche公司)，65℃熔化15分钟；
(4)再在45℃温育5分钟，按1U/100mg的酶量加入琼脂糖酶(1U/μl，Roche公司)，继续温育；
(5)1小时后，加入1/10体积3M NaOAc(pH5.2)。冰上放置15分钟，12,000g在4℃离心15分钟；
(6)上清用等体积的酚—氯仿抽提两次，再用等体积的氯仿再抽提一次。12,000g离心5分钟；
(7)收集水相上清，加入3体积95％乙醇，冰上放置15放置后，12,000g在4℃离心15分钟，用250μl 70％乙醇清洗，抽干后溶于20μlddH2O。
(8)用正向引物按上述5(c)到(k)的方法，使用以即用型反应预混和物形式保存的含Bst-II DNA聚合酶的高保真低温循环测序系统测序。
另外，7.(c)的扩增产物可不经回收，稀释后直接用于Bst-II测序系统，如下所述。
(1)将下列试剂加入0.2ml离心管，并在24℃以下用Speed-Vacuum真空抽干：
dNTP(每种2.5mM)                         1ul
5×RB                                   5ul
预混和荧光标记ddNTP(NENTM)             4ul
Bst-II DNA聚合酶(10U/ul)                1ul
抽干后，在离心管中加入下述试剂：
ddH2O                       0.35ul
80％甘油                     4.7ul
可在23℃至25℃保存含上述成份的离心管至少8星期。
(2)反应前，在预混和液中加入以下试剂：
稀释20倍的反应产物[7.(c)]             1ul
正向引物(10pmol/ul)                   1.5ul
ddH2O                                1.5ul
(3)充分混匀后进行如下热循环反应：
70℃ 30秒，
37℃ 20秒，
45℃ 3分钟，
总计35个循环。
反应结束后，产物如《5.利用室温储存的Bst-II DNA聚合酶预混和液进行高保真低温循环测序反应》所述经沉淀、洗涤后上样分析。上述两种方法的DNA序列相同。测序结果表明，利用中等热稳定DNA聚合酶进行的低温循环延伸反应能得到高度特异性的扩增产物，可不经纯化直接测序。

Claims (13)

1.一种延伸专一性的DNA低温循环延伸方法包括
a.在反应体系中含有低浓度的甘油或乙二醇，存在有一种模板，一对长度短于或长于25bp的引物和一种野生型或修饰后的中等热稳定DNA聚合酶的即用型反应混合物，当温度在变性温度(~70℃)和退火温度(约37℃)之间循环时DNA聚合酶能重复延伸引物，得到序列特异性扩增产物；
b.扩增双链DNA片断直接用于循环测序反应，该循环测序反应包括加入大大过量引物、四种标准荧光标记的ddNTP终止物、一种中等热稳定的DNA聚合酶、适量四种ddNTP混合物及含有15％(V/V)甘油的缓冲体系，在80℃以下重复环引物延伸反应若干次，得荧光标记ddNTP终止的不同长度延伸产物。
2、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于反应在甘油的浓度为5-35％，最适浓度为15％的溶液中进行。
3、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于中等热稳定DNA聚合酶反应温度为37℃-70℃，最适反应温度为65±1℃。
4、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于中等热稳定DNA聚合酶与Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸至少存在95％同源性。
5、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于正向引物和反向引物的长度可短于或长于25bp。
6、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于反应体系中重复热循环多次，双链DNA的指定区域得到扩增。
7、根据权利要求1所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于反应体系中存在ddNTP或其类似物时，用单一引物重复扩增，得不同长度的特异性延伸终止。
8、根据权利要求1b所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于中等热稳定DNA聚合酶可为野生型或修饰后的源自Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus DNA聚合酶，或者氨基酸序列与Bacillus stearothermophilus、Bacilluscaldotenax或Bacillus caldolyticus的聚合酶的氨基酸序列至少95％同源的中等热稳定DNA聚合酶。
9、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用反应混和物含有一种中等热稳定DNA聚合酶，它与一部分或所有与酶促DNA引物延伸反应有关的成分预先混合，在80℃以下进行低温循环引物延伸反应或含有ddNTP类似物的特异延伸终止反应。
10、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用反应混和物中中等稳定DNA聚合酶可为野生型或修饰后源自Bacillus stearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacilluscaldolyticus的DNA聚合酶，或者氨基酸序列与Bacillusstearothermophilus、Bacillus caldotenax或Bacillus caldolyticus的DNA聚合酶的氨基酸序列至少存在95％同源的中等热稳定DNA聚合酶。
11、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用反应混和物为干粉或预先配制的溶液。
12、根据权利要求1a所述的延伸专一性的DNA低温循环延伸方法，其特征在于即用混和物预先分装在微离心管或多孔反应板中。
13、如权利要求1a即用型混和物用于大规模自动PCR扩增或大规模自动DNA测序反应。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191328A (zh) * 2011-04-19 2011-09-21 东南大学 基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
ATE447040T1 (de) 2002-09-03 2009-11-15 Quanta Biosciences Inc Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für die cdna-synthese
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US7981604B2 (en) 2004-02-19 2011-07-19 California Institute Of Technology Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US10041060B2 (en) 2005-12-06 2018-08-07 Synthetic Genomics, Inc. Method of nucleic acid cassette assembly
US7397546B2 (en) * 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam
US20080309926A1 (en) * 2006-03-08 2008-12-18 Aaron Weber Systems and methods for reducing detected intensity non uniformity in a laser beam
US20090148833A1 (en) * 2007-03-23 2009-06-11 Fair Isaac Corporation Devices for generating detectable polymers
FI20085450A0 (fi) 2008-05-14 2008-05-14 Arto Orpana Menetelmä DNA-juosteen syntetisoimiseksi
EP2285979B2 (en) 2008-05-27 2020-02-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
US9303287B2 (en) * 2009-02-26 2016-04-05 Dako Denmark A/S Compositions and methods for RNA hybridization applications
GB202115637D0 (en) 2021-11-01 2021-12-15 Anglia Ruskin Univ Higher Education Corporation Nucleic acid amplification method

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5455166A (en) * 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5834253A (en) * 1994-11-17 1998-11-10 Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences Bacillus stearothermophilus DNA polymerase with proof-reading 3'-5' exonuclease activity
CN1123328A (zh) * 1994-11-17 1996-05-29 中国科学院上海生物化学研究所 高温、高传真脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶(HiFi Bst)
US6165765A (en) * 1995-10-18 2000-12-26 Shanghai Institute Of Biochemistry, Chinese Academy Of Sciences DNA polymerase having ability to reduce innate selective discrimination against fluorescent dye-labeled dideoxynucleotides

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191328A (zh) * 2011-04-19 2011-09-21 东南大学 基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法
CN102191328B (zh) * 2011-04-19 2014-02-19 东南大学 基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法

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Publication number Publication date
US20030087237A1 (en) 2003-05-08

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