CN1432061A

CN1432061A - 使用双链核酸为模板扩增核酸的方法

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Publication number: CN1432061A
Application number: CN01810370A
Authority: CN
Inventors: 纳富继宣; 长岭宪太郎
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2003-07-23
Anticipated expiration: 2021-03-30
Also published as: EP1275715A1; AU2001244677A1; EP1275715B1; HK1054967A1; US20030207292A1; ES2464132T3; JP4726381B2; WO2001077317A1; EP2253717A9; EP2253717B1; EP2253717A1; US8017357B2; CN100422323C; EP1275715A4; ES2546450T3

Abstract

本发明提供了核酸合成法，其包括在确保使用引物为起点进行互补链合成反应的条件下保温双链核酸模板的步骤。该方法包括使用任意引物，使将与能等温扩增模板核酸的引物退火的区域处于确保碱基配对的条件之下的步骤。任意引物起始互补链合成反应，所述反应使用双链核酸作为模板，还使用了催化包括双链核酸去稳定化和链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶，从而提供了可经受碱基配对的区域。

Description

使用双链核酸为模板扩增核酸的方法

技术领域

本发明涉及合成核酸的方法，所述核酸包含与模板双链核酸互补的核苷酸序列。

背景技术

用于合成核酸的模板依赖型PCR(聚合酶链反应)法极大地推动了最新生物科学领域内的研究。该PCR法能使用少量模板指数式扩增含有与模板核酸互补的核苷酸序列的核酸。PCR法是目前广泛应用于克隆或检测基因的工具。在PCR法中，将含有互补核苷酸序列的一对引物用于靶核苷酸序列的两端。将引物对设计成一个引物能与另一个引物所提供的延伸产物退火。通过重复与彼此的延伸产物退火和互补链合成反应来进行合成反应，从而获得指数式扩增。

在PCR法中，通过一些方法制备单链核酸模板，并使引物与模板退火。由于模板依赖型DNA聚合酶需要引物作为复制起点，因此，在PCR法中，为了使引物与模板退火，必需制备单链模板。将双链模板核酸转变为单链的步骤通常被称为变性。一般通过加热进行变性。由于合成核酸所需的其它反应组分，包括DNA聚合酶是抗热的，可通过混合所有反应组分，再加热反应混合物来进行退火和相继的互补链合成反应。然而，包括热处理步骤的常规方法具有下述问题。

首先，在PCR法中，在每个循环中都必须进行双链核酸的变性和引物的退火。为此，需要有控制温度的特殊机制。例如，尽管已研究出监测PCR过程中反应产物增加的方法，但使用常规的分析仪器无法实施该方法，因此，必须提供具有能控制温度以进行PCR法的机制以及能监测反应的机制的仪器。因此，如果能在恒温下进行核酸合成的所有反应，使用常规的分析仪器就可以容易地监测反应。这种便利的方法不仅可以简化仪器，也可以简化实验操作。然而，目前还不知道该方法的反应原理。

PCR的反应特异性取决于引物退火的特异性。引物有望在接近解链温度的高温下与具有足够特异性的单链核酸退火。当模板以不够高的特异性退火和非特异性退火时，经常会发生所得的非-特异性互补链合成反应。由于PCR法伴随着复杂的温度变化，反应混合物可能会暴露于易于发生非-特异性反应的温度下。这是与PCR法有关的非-特异性反应的诱因之一。

已有人提出几种解决温度-依赖型非-特异性反应所存在的问题的方法。例如，一个已付诸实践的方法使用了DNA聚合酶，该酶在某个温度或低于该温度时不起作用。具体地说，据报道有人使用了对温度敏感的DNA聚合酶抑制剂，抗DNA聚合酶的抗体，或DNA聚合酶的变体等。另外，还已知一种方法，其中将反应组分置于被隔板隔开的区室中，所述隔板在高温下可熔解，使得所述组分只能在加热至足够高的温度之后才能混合。在所有事件中，由于PCR法伴有复杂的温度变化，需要使用特殊的组分来防止非特异性反应。

还已知使用靶序列为模板，扩增具有与靶序列互补之序列的DNA的方法，例如链置换扩增(SDA)法(Pro.N.A.S.，89，pp.392-396；1992，Nucleic Acid，Res.，20，pp.1691-1696；1992)。在SDA法中，当使用与某个核苷酸序列的3’-方向互补的引物作为合成起点来合成互补链时，独特的DNA聚合酶能够合成可置换5’-方向双链区域的互补链。当下文述及“5’-方向”或“3’-方向”时，这两个术语指的是模板链的方向。该方法之所以被称为链置换扩增是因为5’-方向的双链部分被新合成的互补链所置换。

在SDA法中，通过在与引物退火的序列中插入限制性酶识别序列，可以省略PCR法中所必需的改变温度的步骤。即限制性酶提供的切口给出3’-OH基团，成为互补链合成的起点。从此起点开始进行链置换和互补链合成，所合成的互补链作为单链被解离，并在随后的互补链合成中用作模板。因此，SDA法不需要PCR法中必需的复杂的温度控制。

尽管温度控制在SDA法中不是必需的，但是当将双链核酸用作模板时，制备引物退火所需的单链仍需要热处理。另外，该方法既需要能提供切口的限制性酶，也需要具有链置换活性的DNA聚合酶。需要另外一种酶导致费用的增加。另外，为了导入切口并且不裂解双链(即仅裂解一条链)，必须将dNTP衍生物，如α-硫代dNTP用作合成底物，从而使双链中的一条链对酶消化具有抗性。因此，通过SDA获得的扩增产物具有不同于天然核酸的构型。因此，在基因克隆中限制性酶裂解和扩增产物的使用受到限制。dNTP衍生物的使用也会导致费用的增加。

已知一种无需复杂的温度控制的核酸扩增法，即基于核酸序列的扩增(NASBA)，也就是所谓的TMA/转录介导的扩增法。NASBA是一种反应系统，其中使用DNA聚合酶，以靶RNA为模板，并使用添加有T7启动子的探针进行DNA合成。使用第二个探针将合成的DNA制备成双链，使用T7 RNA聚合酶进行转录。将所得双链DNA用作模板以扩增大量RNA(Nature，350，pp.91-92，1991)。NASBA中使用T7RNA聚合酶的转录在等温下进行。然而，NASBA需要RNA作为模板，因此不能应用于双链核酸。如果双链核酸被制备成单链，即可进行该反应；然而，在这种情况下，需要类似于PCR的复杂的温度控制。另外，必需联合使用多种酶，例如逆转录酶，RNaseH，DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶，与SDA法相同，这在经济上是不利的。因此，已知的核酸扩增反应法具有复杂的温度控制问题或必需使用多种酶的问题。

为了在已知的核酸合成法中解决温度控制问题，有人在特定的条件下使用引物作为合成起点来合成互补链(国际公开号Hei 11-509406的公开日文译文；WO97/00330)。该方法显现出这样一个事实，即在动态平衡(动力学)状态下发生具有互补核苷酸序列的核酸的杂交。在现有技术的方法中，据信有可能发生使用引物作为合成起点的互补链合成反应，甚至在导致完全变性的温度或更低温度下也是如此。本文所用术语“完全变性”指的是使大多数双链模板核酸变成单链的条件。

在此报道中，当将引物和具有链置换活性的DNA聚合酶与双链模板核酸混合，并升高温度时，在不会导致模板核酸变性的温度下会观察到互补链的合成。然而，不经过热循环的互补链合成的反应效率显著低于经过热循环的PCR法中所得的反应效率。实际上，本发明人进行了补充试验，进一步证实确实发生了反应，但通过此方法获得的反应产物的量未达到实际核酸合成法的可用水平。

如上所述，目前尚未报道过无需控制温度和不会使反应特异性和效率变差的核酸合成反应。

发明内容

本发明的目的是提供使用双链核酸为模板的核酸合成法，其中该方法不需要改变温度，并且不会导致合成效率，可操作性，特异性等变差。更具体地，本发明的目的是提供新的核酸合成法，其中通过在恒温下使作为模板的双链核酸与诸如引物和DNA聚合酶的反应组分一起保温来进行反应。本发明的另一个目的是提供利用该合成法有效扩增核酸的方法。

为了使用双链核酸为模板，不经热循环进行互补链合成，本发明人研究了是否能在恒温条件下，使用引物作为合成起点来进行互补链合成反应。基于双链核酸和引物之间的动态平衡的已知的互补链合成方法(国际公开号Hei11-509406的已公开的日文译文；WO97/00330)不需要改变温度。然而，如上文所述，使用此方法难以获得在实践中可以使用的合成效率。因此，本发明人将此方法与等温核酸合成反应联合，以基于动态平衡有效进行互补链合成，而不会使特异性变差。结果，发明人发现能够获得通过已知方法不能达到的高水平的扩增效率，从而完成了本发明。即本发明涉及下列核酸合成法和以此为基础的核酸扩增法。

[1]使用双链核酸为模板合成核酸的方法，其中所述方法包括：

a)在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化伴随着链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶存在时，保温双链核酸模板和任意引物，使得与引物退火的靶模板核酸区域处于能使该区域经受碱基配对的条件下，所述引物能在恒温下扩增模板核酸；

b)使能在恒温下扩增模板核酸的引物与步骤a)中获得的，处于能使其经受碱基配对的条件之下的区域退火；和

c)使用引物作为合成起点进行互补链合成。

[2]根据[1]的方法，其中步骤a)在存在解链温度调节剂时进行。

[3]根据[2]的方法，其中解链温度调节剂是至少一种选自下列的化合物：甜菜碱，脯氨酸，二甲基亚砜和三甲胺-N-氧化物。

[4]合成核酸的方法，其中构成双链核酸模板之特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接，所述模板由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括：

a)在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化伴随着链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶存在时，保温双链核酸模板和任意引物，使得与第二引物退火的靶模板核酸区域处于能使该区域经受碱基配对的条件下；

b)使第二引物与步骤a)中获得的，处于能使其经受碱基配对的条件之下的区域退火，并使用第二引物为起点进行互补链合成，其中第二引物的3’-末端与限定构成特定区域的一条链的3’-方向的区域退火，第二引物的5’-末端含有与使用引物为起点而获得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；

c)使步骤b)中合成的第二引物延伸产物的区域处于能使该区域经受碱基配对的条件下，所述区域将与第一引物退火，其中第一引物的3’-末端与限定使用第二引物为起点获得的延伸产物中的所述区域的3’-方向的区域退火；

d)使第一引物与步骤c)中获得的，处于能使其经受碱基配对的条件之下的区域退火，并使用第一引物为起点进行互补链合成；和

e)使步骤d)中合成的第一引物延伸产物的3’-末端自身退火，并使用延伸产物自身为模板进行互补链合成，得到核酸，其中构成特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接。

[5]根据[4]的方法，其中步骤a)中的任意引物是第一引物。

[6]根据[4]的方法，其中通过根据互补链合成反应的置换进行步骤c)，所述反应使用第四引物为起点，所述第四引物与同第二引物退火的模板区域的3’-方向退火。

[7]根据[4]的方法，其中步骤e)进一步包括通过根据互补链合成反应的置换使第一引物的延伸产物转变为单链的步骤，所述反应使用第三引物为起点，所述第三引物与同第一引物退火的模板区域的3’-方向退火。

[8]根据[4]的方法，其中第一引物的5’-末端含有与使用第一引物为起点所得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。

[9]扩增核酸的方法，其中构成双链核酸模板之特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接，所述模板由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括：

1)使通过根据[7]的方法产生的第一引物延伸产物的3’-末端自身退火，并使用延伸产物作为起点进行互补链合成反应；

2)使第二引物或第一引物与通过3’-末端自身退火而形成的环区域退火，使用引物为起点进行互补链合成；

3)通过步骤2)的互补链合成反应对3’-末端延伸产物进行链置换，以使3’-末端可经受碱基配对；

4)使用步骤3)中获得的，可经受碱基配对的置换链自身为模板，并使用其3’-末端为起点进行互补链合成反应，以置换步骤2)中使用环区域为起点而合成的互补链，从而产生单链核酸；和

5)重复步骤2)至4)以扩增所需核酸。

[10]根据[9]的方法，其中所述方法进一步包括：

6)通过步骤4)产生的单链核酸3’-末端的自身退火进行互补链合成反应；

7)使第二引物或第一引物与通过3’-末端自身退火而形成的环区域退火，使用引物为起点进行互补链合成；

8)通过步骤7)的互补链合成反应对3’-末端延伸产物进行链置换，以使3’-末端可经受碱基配对；

9)使用步骤8)中获得的，可经受碱基配对的置换链自身为模板，并使用其3’-末端为起点进行互补链合成反应，以置换步骤7)中使用环区域为起点而合成的互补链，从而产生单链核酸；和

10)重复步骤7)至9)以扩增所需核酸。

[11]检测样品中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包括进行根据[10]的扩增方法，并观察是否已产生扩增反应产物。

[12]根据[11]的方法，其中在核酸检测试剂的存在下进行根据[10]的方法，所述方法进一步包括基于检测试剂的信号变化测定是否已产生扩增反应产物。

[13]通过根据[11]的检测方法检测突变的方法，其中被扩增的核苷酸序列中的突变至少在一个3’-末端防止互补链合成，所述3’-末端是构成扩增方法的互补链合成的起点。

[14]扩增核酸的方法，其中构成模板双链核酸之特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接，所述模板双链核酸由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括在能够使用第一引物为起点合成互补链的条件下保温下列组分的步骤：

含有双链核酸模板的靶，所述模板含有待扩增的特定区域；

催化伴随着链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶；

第一引物，其3’-末端与限定构成特定区域的一条链的3’-方向的区域退火，5’-末端含有与使用引物为合成起点而获得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；

第二引物，其3’-末端与限定构成特定区域的一条链的3’-方向的区域退火，5’-末端含有与使用引物为合成起点而获得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；和

核苷酸底物。

[15]根据[14]的方法，其中组分还包括：

第三引物，它使用模板中与第一引物退火的区域的3’-方向作为起点，成为互补链合成反应的起点；和

第四引物，它使用模板中与第二引物退火的区域的3’-方向作为起点，成为互补链合成反应的起点。

[16]根据[14]的方法，其中保温在解链温度调节剂的存在下进行。

[17]根据[16]的方法，其中解链温度调节剂是至少一种选自下列的化合物：甜菜碱，脯氨酸，二甲基亚砜和三甲胺-N-氧化物。

[18]使与引物退火的靶模板核酸区域处于能使该区域经受碱基配对的条件之下的方法，所述引物能在恒温下起始扩增模板核酸的反应，其中所述方法包括在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化伴随着链置换的互补链合成的DNA聚合酶存在时，在恒温下保温模板双链核酸，任意引物，和能扩增模板核酸的引物的步骤。

在本发明中，使用了能在恒温下扩增核酸模板的引物。能在恒温下扩增核酸模板的引物指的是无需热循环的核酸扩增法中使用的引物，所述扩增法将具有与引物退火之区域的核酸用作模板，所述区域能经受碱基配对。即本发明的引物是无需热循环的核酸扩增反应所用的引物。对本发明的引物没有特别的限制，只要是能进行等温核酸扩增的引物即可。因此，不管引物是否可用于需要热循环的反应，能进行等温核酸扩增的任何引物都包括在本发明的引物中。如上所述，据报道已有人利用PCR引物在恒温下进行扩增。然而，由于该方法未能获得可实施水平的扩增，也不能说PCR引物就是能进行等温核酸扩增的引物。特别是，利用无需热循环即可连续合成互补链的方法，可以进行模板核酸的扩增。这种方法使用的引物可用作本发明的引物。

在优选实施方案中，核酸扩增法使用了如下所述的反应原理(LAMP法)，即通过以自身为模板的3’-末端区域的自身退火重复互补链合成反应。另外，可以使用已知的核酸扩增反应，即SDA法。在本发明中，术语“可经受碱基配对的区域”指的是不伴随有互补链的区域。因此，它不仅包括通过变性双链核酸产生的单链核酸，也包括部分具有单链部分的双链核酸中包含的单链核酸。

另外，在本发明中，核酸可以是DNA，RNA或其嵌合分子。核酸可以是天然核酸或人工合成的核酸。另外，本发明的核酸也可包括具有部分或完整人工构型的核苷酸衍生物，只要它能经受碱基配对即可。所述分子的例子有：骨架由硫代磷酸酯键形成的多核苷酸衍生物。构成本发明所用核酸的核苷酸的数目不受限制。在本文中，术语核酸与术语多核苷酸含义相同。另一方面，本文所用术语寡核苷酸指的是具有较少数目组成核苷酸的特定多核苷酸。一般说来，寡核苷酸指的是具有2至100，更通常为2至50个核苷酸的多核苷酸，但它并不受这些数目的限制。

本文所用的靶核苷酸序列指的是待合成的核酸的核苷酸序列。即构成本发明中待合成核酸的核苷酸序列是靶核苷酸序列。另外，当基于本发明的核酸合成法进行核酸扩增时，构成待扩增核酸的核苷酸序列是靶核苷酸序列。一般说来，从有义链的5’-方向至3’-方向来描述核酸的核苷酸序列。本发明的靶核苷酸序列不仅包括有义链，也包括其互补链即反义链的核苷酸序列。更具体地，术语“靶核苷酸序列”至少指待合成的核苷酸序列或其互补链。

本发明的核酸合成法使用双链核酸为模板。在本发明的上下文中，双链核酸是至少在含有与引物互补的核苷酸序列的区域以杂交的互补链形式存在的核酸，所述引物被用作互补链合成的合成起点。因此，本发明所用的双链核酸也包括其中有些部分不是双链的靶核苷酸序列。另外，本发明所用的双链核酸不仅可以是二聚体，也可以是两个或多个单链核酸的杂交产物，只要它能满足上述条件即可。另外，它可以是由单链多核苷酸构成的发夹环，所述多核苷酸在分子内含有互补的核苷酸序列。本发明中使用的双链核酸包括例如cDNA，基因组DNA和DNA-RNA杂交体。另外，其中插入了这些DNA的多种载体也可用作本发明中所用的双链核酸。本发明中所用的双链核酸可以是纯化的或粗的核酸。此外，本发明的方法也适用于细胞中的核酸(原位)。可使用细胞中的双链核酸作为模板进行原位基因组分析。

当将cDNA用作本发明的模板时，可在与本发明核酸合成所用条件相同的条件下进行cDNA合成。当使用RNA作为模板来合成cDNA的第一条链时，会形成DNA-RNA杂交体形式的双链核酸。使用所得双链核酸为模板，可以进行本发明的核酸合成法。当本发明的核酸合成法中所用的DNA聚合酶具有逆转录酶活性时，可在相同条件下仅使用该酶进行核酸合成。例如，Bca DNA聚合酶是具有链置换活性以及逆转录酶活性的DNA聚合酶。当然，也可以在通过合成第二条链形成完整的双链cDNA之后，使用本发明的核酸合成法。

本发明的核酸合成中使用了能催化伴随着链置换的互补链合成反应的聚合酶。本文所用的伴随着链置换的互补链合成反应指的是下列反应。即当使用引物为合成起点的互补链合成反应所用的模板与另一个多核苷酸杂交，并且呈双链形式时，互补链合成继续进行，同时从模板上分离多核苷酸的反应被称为链置换互补链合成反应。此时，分离的多核苷酸中的磷酸二酯键通常得以保留。因此，如此形成的多核苷酸具有与合成的互补链的长度相对应的长度，并且能经受碱基配对。

与诸如SDA之类的方法中所用的类型相同的DNA聚合酶可用作催化链置换互补链合成的聚合酶。如果模板的5’-方向存在双链区域，已知的独特聚合酶通过使用引物作为合成起点置换双链区域来合成互补链，所述引物与某个核苷酸序列的3’-方向区域互补。根据本发明，还使用了互补链合成所需的底物。

在本发明中，将任意引物与双链核酸混合，在确保使用引物为起点合成互补链的条件下保温混合物。本发明的任意引物使得将与恒温下的核酸扩增反应所用的引物退火的区域做好碱基配对的准备。因此，任意引物必须能启动模板双链核酸的互补链合成，所述合成使用核苷酸链的互补链为模板，所述模板与扩增反应所用的引物退火。另外，使用本发明的任意引物作为合成起点的互补链合成中的链延伸应该朝着与扩增反应所用引物退火的区域进行。换句话说，引物可在该区域的任意部分提供合成起点，所述区域用作互补链合成中的模板，所述互补链合成使用扩增反应所用的引物为起点。任意引物可含有与任意区域互补的核苷酸序列，只要它满足上述标准即可。例如，扩增反应所用的一个引物也可用作任意引物。由于必需反应组分数目的减少，引物的使用是本发明的优选实施方案之一。

通过在使用任意引物为起点的互补链合成中置换双链核酸两条链中的一条链，可以确保与扩增反应所用引物进行碱基配对。通过选择参数，可在不改变温度的情况下进行合成反应，这是本发明的一大特征。允许使用双链核酸为模板，通过任意引物进行互补链合成反应的条件实际上与进行下列组合所需的条件相同：

i)通过任意引物给模板双链核酸提供合成起点；和

ii)使用合成起点继续进行互补链合成反应。

据信仅当与引物退火的区域为单链时，引物才能给核酸链提供合成起点。因此，以前当将双链核酸用作模板时，核酸需经受变性，即在引物退火之前将核酸转变为单链的步骤。然而，通过在以某种方式使双链去稳定化但不完全转变为单链的条件下保温模板和引物可提供合成起点。这种使双链去稳定化的条件的例子包括加热双链核酸几乎达到解链温度(下文简称为Tm)。或者，添加Tm调节剂也是有效的。

在缓冲液的存在下进行包括一系列步骤的反应，所述缓冲液能提供适于酶反应的pH，以及退火引物和维持酶催化活性所需的盐，酶的防腐剂，必要时还可提供解链温度(Tm)调节剂等。本发明中使用了具有缓冲作用的，pH范围为中性至弱碱性的缓冲液。根据所用DNA聚合酶的类型来调节pH。为了维持酶活性和改变核酸解链温度(Tm)而添加的盐的例子包括KCl，NaCl，(NH₄)₂SO₄等。酶防腐剂包括牛血清白蛋白和糖。

另外，典型的解链温度(Tm)调节剂包括甜菜碱，脯氨酸，二甲基亚砜(下文简称为DMSO)，甲酰胺和三甲胺-N-氧化物(TMANO)。当使用解链温度(Tm)调节剂时，可以在有限的温度范围内调节上述寡核苷酸的退火。另外，甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)和四烷基铵盐因其等稳定化作用，能有效改善链置换的效率。在反应溶液中添加浓度约为0.2至约3.0M，优选约0.5至约1.5M的甜菜碱有望能增强本发明的核酸扩增。由于这些解链温度调节剂能降低解链温度，可通过考虑反应条件，如盐浓度和反应温度，凭经验选择能给出所需严紧度和反应性的条件。

通过利用Tm调节剂可以容易地选择适于酶反应的温度条件。可根据引物和靶核苷酸序列的关系改变Tm。因此，优选调节Tm调节剂的量，以使维持酶活性的条件与符合本发明标准的保温条件相一致。根据本发明的内容，本领域技术人员可以根据引物核苷酸序列容易地选择需添加的Tm调节剂的适当量。例如，可根据退火核苷酸序列的长度，GC含量，盐浓度和Tm调节剂的浓度确定Tm。

假设这种条件下引物与双链核酸的退火是不稳定的。然而，当将DNA与能催化链置换互补链合成的聚合酶一起保温时，使用不稳定的引物作为合成起点能进行互补链合成。当进行互补链合成时，合成的互补链与模板核酸之间的杂交在此过程中变得更加稳定。下列DNA聚合酶可催化互补链合成，所述合成使用引物作为模板双链核酸的合成起点。

催化链置换互补链合成反应的DNA聚合酶在本发明的核酸合成法中起着核心作用。所述DNA聚合酶包括下文所列的那些酶。另外，本发明中还可使用这些酶的多种突变体，只要它们具有依赖于-序列的互补链合成活性和链置换活性即可。所述突变体包括仅含有具有催化活性之结构的截短形式的酶，或已通过氨基酸突变修饰其催化活性，稳定性或热稳定性的突变酶等。

Bst DNA聚合酶

Bca(外切-)DNA聚合酶

DNA聚合酶I的Klenow片段

Vent DNA聚合酶

Vent(外切-)DNA聚合酶(无外切核酸酶活性的Vent DNA聚合酶)

DeepVent DNA聚合酶

DeepVent(外切-)DNA聚合酶(无外切核酸酶活性的DeepVent DNA聚合酶)

Φ29噬菌体DNA聚合酶

MS-2噬菌体DNA聚合酶

Z-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)

KOD DNA聚合酶(TOYOBO)

在这些酶中，特别优选Bst DNA聚合酶和Bca(外切-)DNA聚合酶，因为它们具有高水平的热稳定性和高催化活性。根据本发明，在相同条件下进行使用引物作为双链核酸和互补链合成反应的合成起点的步骤。由于所述反应经常需要一些加热，因此优选使用热稳定性酶。可在使用热稳定性酶的多种条件下进行反应。

例如，Vent(外切-)DNA聚合酶是具有链置换活性的高热稳定性酶。据报道添加单链-结合蛋白能加速由DNA聚合酶催化的链置换互补链合成反应(Paul M.Lizardi等，Nature Genetics 19，225-232，July，1998)。通过将该方法应用于本发明，有望通过加入单链-结合蛋白来加速互补链合成。当使用Vent(外切-)DNA聚合酶时，T4基因32作为单链-结合蛋白是有效的。

当使用缺乏3’-5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶时，本领域已知这样一种现象，其中甚至当反应到达模板的5’-末端，并且在合成的链中加入额外的核苷酸时，互补链合成也未终止。本发明中不优选这种现象，因为接下来的互补链合成从已合成的3’-末端互补链序列开始。然而，通过DNA聚合酶添加至3’-末端的核苷酸很有可能是核苷酸“A”。因此，应该选择互补链合成所用的序列，以从3’-末端的A开始合成，从而避免因错误添加单个-dATP核苷酸带来的问题。或者，甚至当3’-末端在互补链合成过程中突出时，可通过3’→5’外切核酸酶活性将其消化成平端。例如，可以联合使用具有这种活性的天然Vent DNA聚合酶与Vent(外切-)DNA聚合酶以克服上述问题。

与上述DNA聚合酶不同，常规用于PCR等的DNA聚合酶，如Taq聚合酶PCR在一般条件下基本上不表现出链置换活性。然而，这种DNA聚合酶可用于本发明，只要在确保链置换的条件下使用它们即可。

有人报道了这样一种现象，其中通过在使双链核酸变得不稳定的条件下保温引物来合成互补链(国际公开号Hei 11-509406的公开日文译文；WO97/00330)。然而，在报道的条件下，仅有望实际产生痕量的合成产物。尽管在理论上可以通过利用双链核酸的去稳定化，使用引物为合成起点来进行互补链合成，但反应不如使用单链核酸为模板的反应那样有效。当与需要改变温度的互补链合成反应，如PCR法联合时，利用双链的去稳定化的互补链合成反应的效率会影响所有互补链合成反应；因此，难以达到在实践中可用的反应效率。据信这正是已知方法扩增效率不足的原因。

另一方面，本发明基于以下发现，通过将基于双链核酸去稳定化的互补链合成反应应用于核酸扩增反应，可以补偿基于双链核酸去稳定化的互补链合成的低效率，其中所述核酸扩增反应提供能与原先在恒温下进行的扩增反应所用的引物退火的区域。由于本发明利用在恒温下进行的核酸扩增反应，如果将与引物退火的区域置于确保碱基配对的条件下，随后会进行不需要双链去稳定化的互补链合成反应。因此，可使基于双链去稳定化的互补链合成反应低效率的影响最小化。通过联合使用这两种方法，首次获得实践可用水平的合成效率。换句话说，基于双链去稳定化的互补链合成反应可用作提供与引物退火的区域的反应，所述引物是等温下进行的核酸扩增反应所用的引物。相反，难以将该反应应用于需要热循环的核酸扩增反应。

例如，在本发明的核酸等温扩增法中，需要使3’-末端自身退火，并用作互补链合成反应的模板。即本发明的主要特征是不需要改变温度，尤其是当使用下述引物时，其最佳用途得以体现。本发明人设想出使用具有特殊构型的引物的核酸扩增法。在下文中，将该方法描述为LAMP(环-介导的等温扩增)法。根据LAMP法，模板多核苷酸的3’-末端与其自身退火以用作互补链合成的起点，使用与如此形成的环退火的引物，以进行等温互补链合成反应。本发明人发现不需要变性双链模板。

本发明涉及使用引物的核酸合成法，所述引物可等温扩增核酸，引物是由至少两个区域X2和X1c构成的寡核苷酸，其中X1c与X2的5’-方向相连。

在本文中，X2被定义为具有与核酸的任意区域X2c互补的核苷酸序列的区域，所述核酸具有特定的核苷酸序列。

另外，X1c被定义为具有与核酸区域X2c 5’-方向的任意区域基本上相同的核苷酸序列的区域，所述核酸具有特定的核苷酸序列。

在下文给出的解释中，引物被用作第一引物和第二引物。第一引物与使用第二引物为起点合成的延伸产物退火以用作互补链合成反应的起点，反之亦然。通过使用引物作为合成起点的核酸合成法制备的合成产物能进行下述核酸扩增。本发明涉及核酸合成法，其中构成双链模板核酸之特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接，所述模板核酸由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括下列步骤。在本文中，某个核苷酸序列1和至少一个与其互补的核苷酸序列2存在于相同链上的条件被称为在单链上含有多个互补核苷酸序列的条件。

a)在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化伴随着链置换的互补链合成反应的DNA聚合酶存在时，保温模板双链核酸和任意引物，使得与引物退火的靶模板核酸区域处于能使该区域经受碱基配对的条件下，所述引物能在恒温下扩增模板核酸；

b)使第二引物与步骤a)中获得的，能经受碱基配对的区域退火，并使用第二引物为起点进行互补链合成，其中第二引物的3’-末端与限定构成特定区域的一条链的3’-方向的区域退火，第二引物的5’-末端含有与使用引物为起点而获得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；

c)使步骤b)中合成的第二引物延伸产物的区域处于能使该区域经受碱基配对的条件之下，所述区域将与第一引物退火；

d)使第一引物与步骤c)中获得的，能经受碱基配对的区域退火，并使用第一引物为起点进行互补链合成，其中第一引物的3’-末端与限定延伸产物中的所述区域的3’-方向的区域退火，所述延伸产物是使用第二引物为起点获得的；和

e)使步骤d)中合成的第一引物延伸产物的3’-末端自身退火，并使用延伸产物为模板进行互补链合成，得到核酸，其中构成特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接。

在上述反应中，只有步骤a)是通过双链核酸的去稳定化获得的。将扩增反应所用引物(即第二引物)的延伸产物(在此步骤中已获得退火区域)用作随后反应的模板。应指出的是：由于催化链置换互补链合成反应的DNA聚合酶不仅与扩增反应所用的引物一起使用，而且本发明的互补链合成始终都在使用该酶，因此如果仅退火引物，在互补链合成反应前方出现的双链构型不会阻止反应。

另外，在本发明中，此步骤之后的反应原先在恒温下进行，不依赖于利用低效双链核酸去稳定化的互补链合成。即，在使用步骤a)中所用引物作为合成起点进行互补链合成之后，才开始在恒温下进行核酸扩增反应。

甚至在开始于等温下进行核酸扩增反应之后，反应系统中存在的靶核苷酸序列的引物也可能根据双链核酸的去稳定化，导致互补链的合成。不能否认有可能会出现这种反应，勿庸置疑，这种反应的出现有助于改善整个反应的效率。在本发明的核酸扩增反应中，无需在扩增反应的同时发生基于双链核酸去稳定化的互补链合成反应。

在上述反应的步骤c)中利用外部引物是有利的。在本文中，外部引物提供互补链合成反应的起点，所述反应朝着与靶核苷酸序列退火的引物(与外部引物相反，该引物被称为内部引物)进行。因此，与外部引物退火的区域是内部引物5’-方向(模板的3’-方向)的区域。含有至少其3’-方向可用作引物的核苷酸序列的寡核苷酸可用作外部引物。第一引物和第二引物相当于此例子中的内部引物。

另一方面，内部引物在其3’-末端含有双链核酸模板的核苷酸序列，所述序列与待合成区域的核苷酸序列互补。内部引物通常作为由两个引物组成的引物套被使用。然而，如果待合成的区域含有相同核苷酸序列的重复，这两个引物可含有相同的核苷酸序列。可设计引物套，使一个内部引物可与另一个内部引物的延伸产物退火。当至少已知待扩增区域两端的核苷酸序列时，用作引物的核苷酸序列的测定方法也是众所周知的。

如果内部引物是3’-方向可与靶核苷酸序列退火的引物，可在内部引物的5’-方向添加任意核苷酸序列。可在内部引物的5’-方向添加任意序列这一事实，给本发明的核酸合成方法带来很多变化。具体例子将在下文描述。

本发明的内部引物可被嵌套。即可与第二靶核苷酸序列退火的第二内部引物套可进一步与能与第一靶核苷酸序列退火的第一内部引物套联合。在此联合中，第一靶核苷酸序列包含在第二靶核苷酸序列内。当将内部引物嵌套时，可设计外部引物，使其与第二内部引物的5’-方向(模板的3’-方向)退火。

内部引物通常含有两个引物的组合，而外部引物的数目可以是任意的数目。一般说来，本发明的外部引物含有两个引物，籍此提供互补链合成反应的起点，所述反应朝着与各个内部引物退火的区域进行。然而，即使仅将外部引物应用于内部引物中的任一个，也可进行本发明的方法。或者，多个外部引物可以与一个内部引物一起使用。在所有情况下，当伴随着朝着与内部引物退火的区域进行的互补链合成时，可以有效产生使用内部引物为合成起点的互补链合成反应的产物。

将由本发明的外部引物驱动的互补链合成设计成在使用内部引物为合成起点合成互补链之后开始。当内部引物的浓度高于外部引物的浓度时，最容易达到此目的。具体地说，当引物浓度的差异通常约为2至50倍，优选约为4至10倍时，主要进行的是自内部引物开始的互补链合成。另外，通过将外部引物的解链温度(Tm)设置为低于内部引物的Tm，即可控制互补链合成反应的时机。当所有其它条件不变时，理论上可根据退火的互补链的长度和构成碱基对的核苷酸的组合来计算解链温度(Tm)。因此，本领域技术人员可容易地从本发明说明书公开的内容中得出所需的反应条件。

另外，也可使用被称为邻接堆积的现象来调节外部引物退火的时机。邻接堆积是当将不能独立退火的寡核苷酸置于与双链部分相邻的位置时，所述寡核苷酸就能够退火的现象(Chiara Borghesi-Nicoletti等，Bio Techniques 12，pp.474-477(1992))。即将外部引物置于与内部引物相邻的位置，设计外部引物，使其在保温条件下不能独立退火。因此，仅当内部引物退火时，外部引物才能退火。因此，内部引物的退火必然占绝对优势。根据这一原理，实施例中描述了设置一系列反应所需引物寡核苷酸的核苷酸序列的例子。

在下文所述的解释中，将一个内部引物中的X2和X1c暂时称为F2和F1c，另一个内部引物中的X2和X1c称为R2和R1c。将用于解释的内部引物暂时称为FA和RA。FA和RA中的一个是本发明的第一引物，另一个起第二引物的作用。构成FA和RA的区域如下：

X2 X1c

FA F2 F1c

RA R2 R1c

在本发明的核酸扩增法中，通过上述步骤a)至c)，重要的是产生了在其3’-末端具有F1区域的核酸，所述F1可与相同链上的F1c部分退火，形成含有F2c区域的环，并通过使F1区域与相同链上的F1c退火来经受碱基配对。通过根据本发明的核酸合成反应，可以提供这种核酸构型，本发明利用了具有下列构型的内部引物。反应的细节如上所述。

即本发明的核酸扩增反应所用的内部引物至少由上述两个区域X2和X1c构成，并含有寡核苷酸，其中X1c与X2的5’-方向相连。

在本文中，决定本发明内部引物之构型的，具有特定核苷酸序列的核酸指的是：当将本发明的内部引物用作引物时，成为模板的核酸。当根据本发明的合成方法进行核酸扩增时，具有特定核苷酸序列的核酸是待扩增的双链核酸或其衍生物。具有特定核苷酸序列的双链核酸指的是：其中至少一部分的核苷酸序列是清楚的，或者其序列可以经推测而得知的核酸。核苷酸序列应该被清楚阐明的部分是上述X2c区域及其5’-方向的X1c区域。

这两个区域可以相互连接或者独立存在。由产物核酸自身退火而形成的环部分的状态取决于这两个区域的相对位置。优选这两个区域必需分开，以使产物核酸的自身退火比两个分子之间的退火更容易发生。因此，两个区域之间间隔核苷酸序列的优选长度一般为0至500个核苷酸。然而，在一些情况下，彼此靠得太近的区域对形成所需的自身退火的环不利。更具体地，环必需具有能与新引物退火的结构和平滑的链置换互补链合成反应起点。因此，更优选将引物设计成使X2c区域和位于其5’-方向的X1c区域之间的距离约为0至100个核苷酸，更优选约为10至70个核苷酸。本文列举的距离值不含X1c和X2的长度。环部分的核苷酸长度进一步包括对应于X2的长度。

另外，本文表征构成本发明所用引物的核苷酸序列所使用的术语“相同的”和“互补的”包含不完全相同和不完全互补的例子。更具体地，与某个序列相同的序列也包括与能同某个序列退火的核苷酸序列互补的序列。另一方面，互补序列指的是在严紧条件下退火并提供互补链合成起点的序列。在本发明中，术语“相同的”指的是核苷酸序列的同源性为例如90％或更高，通常为95％或更高，更优选为98％或更高。术语“互补的”指的是与互补序列相同的核苷酸序列。即当核苷酸序列与互补序列的同源性为例如90％或更高，通常为95％或更高，更优选为98％或更高时，可以称其为“互补的”。另外，当互补的核苷酸序列用作互补链合成的起点时，3’-末端的至少一个核苷酸必需与互补序列完全一致。

构成本发明所用内部引物的X2和X1c区域一般连续排列，而不将它们互相重叠。或者，如果X2和X1c享有共同的核苷酸序列，可将它们以部分重叠的方式进行排列。X2应该无一例外地被置于3’-末端以用作引物。另一方面，如下所述将X1c置于5’-末端，从而为使用X1c作为模板合成的互补链的3’-末端提供引物功能。将使用寡核苷酸作为合成起点而获得的互补链用作下一步反向互补链合成的模板，最终，本发明的内部引物部分也被拷贝成互补链的模板。拷贝的3’-末端含核苷酸序列X1，并与位于相同链的X1c退火以形成环。

本发明所用的内部引物是符合两个要求的寡核苷酸：(1)能够形成与靶核苷酸序列互补的碱基对，和(2)能在碱基对的3’-末端提供-OH基团，以用作互补链合成的起点。引物的骨架不局限于由磷酸二酯键构成的那些骨架。例如，引物可含有硫代磷酸酯。另外，核苷酸可以是任何核苷酸，只要它能形成互补的碱基对即可。一般说来，有五种类型的天然核苷酸，即A，C，T，G和U；然而，也包括例如类似物，如溴脱氧尿苷。本发明中所用的寡核苷酸不仅可用作合成起点，也优选可用作互补链合成的模板。

本发明中所用内部引物由具有适当长度的核苷酸组成，使得能在下述多种类型的核酸合成反应中的给定条件下，通过维持所需特异性与互补链进行碱基配对。具体地，引物含有5至200个核苷酸，更优选10至50个核苷酸。已知的能催化序列-依赖型核酸合成的聚合酶所能识别的引物的最小长度为5个核苷酸左右。因此，退火部分的长度必须为至少5个核苷酸或更长。另外，为了确保核苷酸-序列特异性的高可能性，优选使用含有10个或更多个核苷酸的引物。另一方面，难以化学合成过长的核苷酸序列。因此，举例说明的上述引物长度是优选的范围。例举的引物长度仅对应于与互补链退火的部分。本发明的内部引物至少含有两个区域，即X2和X1c。因此，应将上文例举的引物长度理解为其对应于构成内部引物的每个区域的长度。

另外，可使用已知的标记物标记本发明使用的内部引物。所述标记物包括具有结合能力的配体，如地高辛和生物素；酶；荧光物质；发光物质和放射性同位素。另外，将内部引物中的核苷酸转变为荧光类似物的技术是已知的(WO95/05391；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，6644-6648，1994)。

另外，可将本发明所用内部引物固定在固相上。或者，用具有结合能力的配体，如生物素标记内部引物的任意部分，然后经由结合配对物，如固定化的亲和素间接地对其进行固定化。当将固定化的内部引物用作合成起点时，将合成的核酸产物固定于固相上，从而能容易地分离所述产物。通过核酸-特异性指示剂或通过进一步杂交经标记的探针，可以检测出分离的产物。或者，通过用任意限制性酶消化核酸以回收所需的核酸片段。

本文所用术语“模板”指的是能用作互补链合成的模板的核酸。尽管具有与模板互补的核苷酸序列的互补链是对应于模板的链，但这两者的关系仅仅是相关而已。具体地说，作为互补链被合成的链能用作模板。换句话说，互补链也可用作模板。

本发明的内部引物可含有除上述两个区域以外的区域。具体地说，分别将X2和X1c置于3’-末端和5’-末端，而将任意序列置于这两个区域之间。所述任意序列包括例如限制性酶识别序列，被RNA聚合酶识别的启动子，编码核酶的DNA等。通过插入限制性酶识别序列，可将本发明的合成产物，即由互补的核苷酸序列连接而成的单链核酸消化成两个长度相同的双链核酸。通过插入被RNA聚合酶识别的启动子序列，可使用本发明的合成产物为模板，将所述产物转录成RNA。另外，通过再插入编码核酶的DNA，就可以建立转录物的自身-裂解系统。上述所有另加的核苷酸序列仅当序列形成于双链核酸中时才起作用。因此，这些序列不会在以环的形式出现的本发明的单链核酸中起作用。另加的序列仅在核酸延伸继续进行，且序列与互补核苷酸序列退火而不会形成任何环之后，才能首次起作用。

当本发明所用内部引物与启动子在能转录所合成的区域的方向上连接时，重复具有相同核苷酸序列的本发明的反应产物实现了高效转录系统。通过联合使用转录系统与适当的表达系统，也可以翻译成蛋白质。即可以将其应用于在细菌或动物细胞中，或在体外转录并翻译成蛋白质。

可以化学合成本发明所用的多个引物。或者，用限制性酶等消化天然核酸以进行修饰或连接，从而含有上述核苷酸序列。

下文将参照图1至4描述通过联合使用上述内部引物FA和RA，以及具有链置换活性的DNA聚合酶以进行双链核酸扩增反应的基本原理。根据实施例，扩增引物套由内部引物FA和RA组成，另外，RA用作本发明的任意引物。

上述任意引物(图1-(1)中的RA)首先与模板双链核酸上的X2c(对应于R2c)退火，以用作互补链合成的起点。在这种条件下，双链核酸是不稳定的，引物直接用作双链核酸上的互补链合成起点。在图1-(2)中，使用RA作为起点合成的互补链置换了模板双链核酸的一条链，与扩增反应所用引物FA退火的F2c区域做好碱基配对的准备(图1-(2))。

通过使FA与做好碱基配对准备的F2c区域退火来进行互补链合成。在本文中，从FA的5’-方向(模板的3’-方向)起始互补链合成的外部引物F3也与该区域退火(图2-(4))。将外部引物设计成可在每个内部引物的5’-方向(模板的3’-方向)起始互补链合成。外部引物还具有较高的Tm，使用浓度比内部引物的低。因此，与内部引物相比，外部引物总是以较低的可能性起始互补链合成。使用外部引物F3作为起点的互补链合成的结果是：使用内部引物FA作为起点合成的延伸产物被置换，并以单链形式被释放出来(图2-(5))。使用所述单链为模板，RA和对应于RA的外部引物R3互相退火并起始互补链合成(图3-(6))。结果，RA的延伸产物具有能使3’-末端F1与其自身在分子内退火的结构(图3-(8))。在图3-(6)中，链的5’-末端与其自身在分子内退火。然而，由于5’-末端不能用作互补链合成的起点，因此用此结构不能起始扩增反应。仅当合成了图3-(6)中所示链的互补链，随后，提供了在其3’-末端与其自身退火的结构时，才能起始扩增反应(图3-(8))。可将这些反应步骤称为本发明扩增反应的初始步骤。

下文将参照图中所示的图解说明具体描述本发明的核酸扩增。将自身退火的3’-末端F1(图3-(8))用作互补链合成的起点。与3’-末端的退火发生在F1和F1c之间，因此，有可能会与也含有F1c的FA竞争退火。然而，在实际应用中，存在于相同链上的相邻区域中的互补核苷酸序列F1/F1c优先互相退火。因此，优先起始使用其自身链作为模板的互补链合成反应。通过此反应合成核酸，其中靶核苷酸序列已在单链上相连。另外，可与内部引物FA退火的F2c存在于通过3’-末端F1自身退火而形成的成环区域内。FA与此部分退火之后，起始互补链合成(图3-(8))。自与环退火的FA起始的互补链合成置换了使用其自身作为模板，自3’-末端起始的互补链合成产物，3’-末端再次做好自身-退火的准备(图4-(9))。随后的反应包括使用其自身3’-末端为起点，其自身链作为模板的互补链合成，以及使用环部分为起点和内部引物FA或RA为起点的互补链合成的可供选择的步骤。如上所述，核酸扩增反应包括使用其自身链作为模板的重复的3’-末端延伸，以及自与环部分退火的引物起的新起始的延伸的可供选择的步骤。

另一方面，关于使用其自身链为模板，使用与其环部分退火的寡核苷酸作为起点延伸合成的与单链核酸互补的核酸链，也在这种合成的核酸链上合成具有多个在单链上相连的互补核苷酸序列的核酸。具体地说，例如，自环部分起的互补链合成到达图4-(9)中所示的R1时即已完成。然后，使用被核酸合成置换的3’-末端作为起点新起始另一个互补链合成(图4-(9))。反应逐渐到达在先前的步骤中身为合成起点的环部分以再次起始置换。因此，起始自环部分起的合成的核酸也被置换，结果产生了在自身链上退火的3’-末端R1(图4-(11))。3’-末端R1在与相同链上存在的R1c退火之后起始互补链合成。当该反应中的F被认为是R，而R被认为是F时，反应与图3-(8)中所示的相同。因此，图4-(11)中所示的结构用作继续进行自身-延伸过程和另一个核酸的合成的新核酸。

如上所述，根据本发明的方法，持续提供能起始另一个延伸的核酸的反应与核酸的伸长同时进行。由于核酸被进一步延伸，在链的末端和同一条链的内部都能产生多个成环序列。当这些成环序列通过包括链置换的合成反应做好碱基配对的准备时，内部引物与成环序列退火，并用作产生新核酸的合成起点。通过使自链的内部区域起始的合成与自链末端起始的链合成相结合，可以获得更有效的扩增。如上所述，通过使用LAMP法可进行伴随着新核酸合成的链延伸。另外，根据LAMP法，新产生的核酸自身延伸，导致新产生其它核酸。理论上，这一系列反应不断地继续，因此可获得极有效的核酸扩增。另外，可在等温反应条件下进行本发明的方法。

在本文中，积累的反应产物具有这样一种结构，其中F1和R1之间的核苷酸序列及其互补序列以多个数目相互连接。含有F2-F1(F2c-F1c)或R2-R1(R2c-R1c)的核苷酸序列的区域在重复单位序列的两端继续。例如，图4-(10)显示出核苷酸序列自5’-方向以(R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c)的次序相连的状态。这是因为本发明的扩增反应基于以下原理进行，即使用内部引物为合成起点自F2(或R2)起始扩增，接着，通过使用3’-末端自身作为合成起点的互补链合成反应自F1(或R1)起延伸产物。

在本文最优选的实施方案中，将内部引物FA和RA用作与环部分退火的寡核苷酸。然而，仅当同时使用具有这些受限结构的寡核苷酸以及能自环部分起始互补链合成的寡核苷酸时，才能进行本发明的核酸扩增。即如果仅通过自环起始的互补链合成来置换3’-末端(其继续延伸)，会再次提供另一个环部分。由于自环部分起始的互补链合成使用了模板核酸，其中有多个互补核苷酸序列连接于单链上，因此，显然可以合成本发明所需的核酸。然而，在置换之后，所合成的核酸形成环以进行互补链合成，但不具有在随后可用于形成环的3’-末端，因此不能用作新的模板。因此，与使用自FA或RA起始合成的核酸的情况相反，无法获得指数式扩增。为此，具有类似于FA和RA的结构的内部引物可用于本发明以进行高效核酸合成。

通过在用作模板的双链核酸中加入下述组分，并在确保内部引物和外部引物退火，和使用这些引物作为起点进行互补链合成反应的条件下对它们进行保温，即可容易地进行一系列反应。保温条件如上所述。在本发明中，通过在低于变性用作模板的双链核酸所需温度的温度下保温下列组分，即可获得模板核酸的扩增反应。此时，变性模板核酸的步骤不是必需的。在本文中，变性双链核酸所需的温度指的是在快速冷却后将模板核酸转变为单链时的温度。

·四种类型的寡核苷酸：

FA，

RA，

外部引物F3，和

外部引物R3；

·催化链置换互补链合成反应的DNA聚合酶；

·用作DNA聚合酶底物的核苷酸

如反应原理的解释中所述，当将上述FA和RA用作内部引物时，使用双链核酸作为模板的本发明的核酸合成法是使用得自样品的核酸作为模板的反应所必需的。当将具有类似于FA和RA的特定结构的内部引物应用于本发明的核酸合成法时，所产生的产物的3’-末端与其自身退火，并用作使用其自身作为模板的互补链合成的起点。另外，新引物与通过上述产物3’-末端自身退火而形成的，用作合成起点的环部分退火，链置换互补链合成反应得以进行。这些反应的进行不依赖于使用双链核酸为模板的本发明的核酸合成法。

即当将FA和RA用作内部引物时，使用双链核酸为模板的本发明的核酸合成反应构成最初的反应。因此，最初的反应需要确保内部引物和外部引物退火，和使用这些引物作为起点进行互补链合成反应的条件。可在更适当的条件下进行随后的反应。然而，当为此目的需要改变温度时，不能完全利用无需变性步骤的本发明的优点。因此，在本发明中，优选在优选的条件下进行最初的反应以及所有随后的反应。

当将FA和RA用作本发明的内部引物时，重要的是应注意到仅当多个区域的相对位置保持不变时，才能进行一系列反应步骤。因此，可有效防止伴随着非-特异性互补链合成的非-特异性合成。具体地说，这有助于使产物用作随后的扩增步骤的起始物质的可能性降低，甚至当一些非-特异性反应发生时也是如此。另外，反应过程受多个不同区域控制的事实为人们提供了构建检测系统的灵活性，所述系统能确保精确地区分类似的核苷酸序列。

可利用本发明的此方面检测基因突变。在本发明使用外部引物的实施方案中，总共使用了四种引物-两种外部引物和两种内部引物。如果未能按设计方案制备构成四种寡核苷酸中所含的六个区域的核苷酸序列和靶核苷酸序列，本发明的任一个互补链合成反应都会受到抑制。用作互补链合成起点的各个寡核苷酸的3’-末端附近的核苷酸序列，和其互补核苷酸序列用作合成起点的X1c区域的5’-末端附近的核苷酸序列对互补链合成而言尤其重要。因此，如果将对互补链合成而言至关重要的核苷酸序列设计成与待检测的突变相对应，通过观察本发明合成反应的产物，即可检测出是否存在突变，例如核苷酸的缺失和插入或基因多态性，如SNP。

更具体地，当预期具有位于用作互补链合成起点的寡核苷酸的3’-末端附近，或新合成的互补链附近的突变或多态性的核苷酸成为合成起点时，应将核苷酸序列设计成与用作互补链合成模板链的5’-末端附近的序列相同。当错配存在于用作互补链合成起点的3’-末端或其附近时，核酸互补链合成反应受到显著抑制。

根据LAMP法，当自反应早期所产生的产物的末端结构开始的反应不能被多次重复时，就不能进行充分的扩增。因此，由于扩增所需的互补链合成在某些阶段受到抑制，即使发生错误的合成，使用错配也不能获得充分扩增。结果，错配有效地抑制了扩增，给出正确的结果。即使用LAMP法的核酸扩增具有精确度较高的核苷酸序列检查-机制。这些特征赋予了优于诸如PCR之类的方法的优点，这些方法仅能扩增两个区域之间的序列。

另外，当互补序列被合成，且互补序列与相同序列内新合成的X1退火以进行使用链自身为模板的合成反应时，本发明所用寡核苷酸的特征性区域X1c仅用作起点。因此，本发明的寡核苷酸不会形成环，而在现有技术中，这经常是一个严重的问题，即使产生所谓的引物-二聚体也不能避免该问题。因此，本发明中不会发生引物-二聚体导致的非-特异性扩增，这有助于改善反应特异性。

通过相对于内部引物FA而言，将外部引物的Tm设置成(外部引物F3：F3c)≤(F2c/F2)，即可有效进行核酸扩增。需要设计构成FA的各个区域，使得F1c与F1之间的退火比F2c与F2之间的退火更占优势。设计时应该考虑到Tm，构成碱基等。另外，由于F1c与F1之间的退火是分子间的反应，还应说明的是该退火很有可能占优势。无需多说，设计与FA的延伸产物退火的RA时，也应考虑类似的条件。通过确保这种关系，就很有可能获得理想的反应条件。

在本发明中，使用了术语“合成”和“扩增”核酸。本文中的核酸合成指的是核酸自用作合成起点的寡核苷酸起延伸。将除合成外还包括形成其它核酸和延伸所形成的核酸的连续反应的一系列反应总地称为“扩增”。

通过使用FA和RA作为内部引物，可在3’-末端提供F1区域，F1可与相同链上的F1c部分退火。F1区域与相同链上的F1c区域退火产生单链核酸，该单链核酸可形成环，其中含有随后可经受碱基配对的F2c区域。单链核酸可用作随后的核酸扩增反应中的重要起始物质。根据下列原理也可提供单链核酸。即使用具有下列结构的引物作为内部引物进行互补链合成：

5’-[与位于引物中的X1c区域退火的X1区域]-[处于确保碱基配对的条件之下的成环序列]-[X1c区域]-[具有与模板互补之序列的区域]-3’

针对具有与模板互补之序列的区域制备两种核苷酸序列，一种与F1互补(引物FA)，一种与R1c互补(引物RA)。另外，待合成的核酸的核苷酸序列包括自F1区域至R1c区域的核苷酸序列，和自具有与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列的R1区域至F1c区域的核苷酸序列。另一方面，可在引物中进行分子间退火的X1c和X1可以是任意序列。然而，X1c/X1区域的序列需要与引物FA和RA的不同。

首先，使用任意引物，将成为模板的双链核酸的F2区域置于确保碱基配对的条件之下。引物FA随后与可经受碱基配对的F2退火，互补链合成得以进行。此时，可将RA用作任意引物。然后，将所合成的互补链的R2c区域置于确保碱基配对的条件之下，使另一个引物与该区域退火，以制备互补链合成起点。由于所合成的互补链的3’-末端具有与引物FA互补的核苷酸序列，所述序列构成首次合成的链的5’-末端部分，因此其3’-末端具有X1区域，当随后与相同链上的X1c区域退火时，可以形成环。因此，提供了如上所述的本发明的特征性3’-末端构型，随后的反应是先前已在最合乎需要的实施方案中显示的反应系统。需注意的是与环部分退火的寡核苷酸具有与X2c区域互补的X2区域，X2区域位于3’-末端的环中，X1区域位于5’-末端。在先前的反应系统中，通过使用引物FA和RA合成与模板核酸互补的链，为核酸的3’-末端提供环构型。该方法使用短引物有效提供了本发明特征性的末端构型。另一方面，在本发明的实施方案中，从开始起，环的完整核苷酸序列就作为引物被提供，必需合成较长的引物。

另外，本发明的原理也可应用于已知的核酸扩增法，如SDA和NASBA。为了将SDA的原理应用于本发明，在本发明的上述条件下，使SDA引物套，催化链置换互补链合成反应的DNA聚合酶，限制性酶，和互补链合成必需的底物(包括赋予核酶抗性的硫代核苷酸)与成为模板的双链核酸一起保温。当任一个SDA引物通过使双链去稳定化来起始互补链合成时，被取代的模板核酸中应该与另一个引物退火的区域就处于确保碱基配对的条件。然后，进行引物退火和模板核酸互补链的合成。

接着，进行外部引物与引物的退火和互补链的合成，先前自SDA引物起合成的互补链被取代以产生单链核酸。另外，在模板核酸的5’-方向上进行使用上述任意引物的互补链合成。因此，应该与SDA引物退火的区域以及应该与外部引物退火的区域都处于确保碱基配对的条件之下。使用单链核酸作为模板，自另一个引物起合成的互补链对核酶具有抗性。因此，限制性酶仅在引物中的限制性酶识别位点处起作用，从而产生切口。使用该切口作为合成起点，重复进行互补链合成和置换以达到扩增目的。同时，SDA引物也与通过取代产生的单链核酸退火，互补链合成得以进行。

此时用作模板的核酸对核酶具有抗性，但是，由于SDA引物对核酶没有抗性，因此在所述引物中产生了通过限制性酶产生的切口。结果，在被取代的单链核酸中也获得了核酸扩增反应。因此，通过继续在此条件下保温，能相继合成双链DNA，其含有由SDA引物限定之区域的核苷酸序列，结果，获得核酸扩增。尽管SDA法的原理是已知的，本发明提供了新的发现，即通过利用基于双链去稳定化的核酸合成反应起始反应，即可消除双链核酸的变性步骤。

为了进行基于本发明的NASBA法，需联合使用NASBA法的引物以及催化链置换互补链合成反应的DNA聚合酶和RNA聚合酶。NASBA法的引物由添加有启动子序列的第一引物，和与使用第一引物为起点合成的互补链退火的第二引物构成。

首先，使用任意引物为双链模板核酸合成互补链，将应该与NASBA第一引物退火的区域置于确保碱基配对的条件之下。随后，用外部引物取代使用NASBA第一引物为起点而合成的互补链，以使其成为单链。当NASBA第二引物与所得单链退火以使其成为双链时，添加至NASBA第一引物的启动子区域成为双链。通过已成为双链的启动子区域起始使用RNA聚合酶的转录反应，使用靶核苷酸序列作为模板进行RNA合成。

可以预先包装好的试剂盒的形式提供本发明的核酸合成法或扩增法所需的多种试剂。具体地说，本发明的试剂盒包含作为内部引物和外部引物所必需的寡核苷酸，dNTP(为互补链合成的底物)，进行链置换互补链合成反应的DNA聚合酶，提供酶反应优选条件的缓冲液，另外，必要时还可包含检测合成反应产物所需的试剂等。特别是，在本发明的优选实施方案中，由于在反应过程中不需要添加试剂，可以放进反应管中的方式来提供一个反应所需的试剂，使得通过仅加入样品即可起始反应。如果建立了一种系统，使得可以在反应管中使用发光信号或荧光信号进行反应产物的检测，在反应后就不必打开和关闭管。从防止污染的观点上看，这一点十分必要。

描述本文提及的现有技术的所有出版物都列入本文作为参考。

附图简述

图1图解说明了本发明优选实施方案的反应原理的第(1)和第(2)部分。

图2图解说明了本发明优选实施方案的反应原理的第(3)至第(5)部分。

图3图解说明了本发明优选实施方案的反应原理的第(6)至第(8)部分。

图4图解说明了本发明优选实施方案的反应原理的第(9)至第(11)部分。

图5是利用HBV，HCV和PSA基因序列进行扩增反应后的电泳凝胶照片。

图6是在存在或缺乏甜菜碱时进行扩增反应之后的电泳凝胶照片。

图7是在存在脯氨酸和DMSO时进行扩增反应之后的电泳凝胶照片。

图8是显示外部引物对本发明核酸扩增法的影响的观察结果图片。垂直轴和水平轴分别表示荧光强度和反应时间。

实施本发明的最佳方式

下文将参照实施例进一步具体阐明本发明。

[实施例1]扩增HBV，HCV和PSA基因序列

使用通过将HBV，HCV和PSA基因部分序列中的每一个掺入质粒而制备的DNA(双链)为模板，进行本发明的核酸合成法。在实验中使用了四种引物-内部引物F，内部引物R，外部引物F和外部引物R。外部引物F和外部引物R分别是置换使用内部引物F和内部引物R作为合成起点所得的第一核酸所用的外部引物。

将内部引物F(或内部引物R)的浓度设置得较高，使得该引物的退火能占优势。得自掺入质粒中的HBV，HCV和PSA的，本实施例中的模板序列分别示于SEQ ID NO：1，SEQID NO：2和SEQ ID NO：3。另外，用于扩增各个模板的引物(内部引物F，内部引物R，外部引物F和外部引物R)的序列示于下文。

·HBV：

内部引物F(SEQ ID NO：4)：

5’-GATAAAACGCCGCAGACACATCCTTCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3’

内部引物R(SEQ ID NO：5)：

5’-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGACAAACGGGCAACATACCTT-3’

外部引物F(SEQ ID NO：6)：

5’-CAAAATTCGCAGTCCCCAAC-3’

外部引物R(SEQ ID NO：7)：

5’-GGTGGTTGATGTTCCTGGA-3’

·HCV：

内部引物F(SEQ ID NO：8)：

5’-GAGTGGGTTTATCCAAGAAAGGACTTTAGCCATAGTGGTCTGCGGA-3’

内部引物R(SEQ ID NO：9)：

5’-CTAGCCGAGTAGCGTTGGGTTGCTTTGCACTCGCAAGCACCCTATC-3’

外部引物F(SEQ ID NO：10)：

5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGG-3’

外部引物R(SEQ ID NO：11)：

5’-CTAGCCGAGTAGCGTTGGGTTGC-3’

·PSA：

内部引物F(SEQ ID NO：12)：

5’-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3’

内部引物R(SEQ ID NO：13)：

5’-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3’

外部引物F(SEQ ID NO：14)：

5’-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3’

外部引物R(SEQ ID NO：15)：

5’-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3’

另外，引物构型的特征简述如下。

内部引物F：

引物5’-方向区域/3’-方向区域

内部引物F与使用内部引物F合成的互补链的F1c区域相同/与模板DNA的F2c区域互补

内部引物R与使用内部引物R合成的互补链的R1c区域相同/与使用内部引物F合成的互补链的R2c区域互补

外部引物F与模板DNA的F2c区域的3’-方向相邻的F3c互补

外部引物R与使用内部引物F合成的互补链的R2c区域的3’-方向相邻的R3c互补

这些引物合成了核酸，其中掺入了各个基因的部分序列的自F1c至R1c的区域及其互补核苷酸序列重复相连于夹杂有含F2c的成环序列的单链上。下文显示了使用本发明的这些引物的核酸合成法的反应溶液的组分。

·反应溶液的组分(25μl)

20mM Tris-HCl，pH8.8

10mM KCl

10mM (NH₄)₂SO₄

4mM MgSO₄

1M甜菜碱

0.1％ Triton X-100

0.4mM dNTP

8UBst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)

引物：

1600nM内部引物F

1600nM内部引物R

400nM外部引物F

400nM外部引物R

模板：

1×10^-20mol HBV DNA

1×10^-17mol HCV DNA

1×10^-22mol PSA DNA

制备不会热变性的模板。于65℃使反应溶液反应1小时。

证实反应：在5μL上述反应溶液中加入5μL上样缓冲液，然后，上样于2％琼脂糖凝胶(0.5％TBE)。在100V下电泳0.5小时。使用φX174 Hae III作为分子大小标记。电泳之后，用溴化乙锭(本文简称为EtBr)染色凝胶以肉眼观察核酸。结果示于图6。每个泳道对应于下列样品。

泳道1：φX174 Hae III

泳道2：DNA(+)，PSA

泳道3：DNA(-)，PSA

泳道4：DNA(+)，HBV

泳道5：DNA(-)，HBV

泳道6：DNA(+)，HCV

泳道7：DNA(-)，HCV

实验结果是：甚至在使用如HBV，HCV和PSA的任何DNA作为模板时，都能观察到本发明的内部引物的扩增产物的特征性序列梯。进一步证实使用双链核酸作为模板，同时使用内部引物和外部引物，在恒温条件下可以合成核酸。

[实施例2]在存在甜菜碱时进行扩增

使用将HCV基因的部分序列掺入质粒中的DNA(1×10^-17mol)作为模板，进行本发明的核酸合成法。在实验中使用了四种引物一内部引物F，内部引物R，外部引物F和外部引物R。此时，也制备不含甜菜碱的反应溶液。

制备不会热变性的模板。于65℃使反应溶液反应1小时和2小时。

证实反应：在5μL上述反应溶液中加入5μL上样缓冲液，然后，上样于2％琼脂糖凝胶(0.5％ TBE)。在100V下电泳0.5小时。使用φX174 Hae III作为分子大小标记。电泳之后，用EtBr染色凝胶以肉眼观察核酸。结果示于图7。每个泳道对应于下列样品。

泳道1：φX174 Hae III

泳道2：DNA(-)，甜菜碱(-)，1小时

泳道3：DNA(+)，甜菜碱(-)，1小时

泳道4：DNA(-)，甜菜碱(+)，1小时

泳道5：DNA(+)，甜菜碱(+)，1小时

泳道6：φX174 Hae III

泳道7：DNA(-)，甜菜碱(-)，2小时

泳道8：DNA(+)，甜菜碱(-)，2小时

实验结果是：当反应时间为1小时时，仅在存在甜菜碱时观察到扩增。另一方面，当反应时间延长至2小时时，甚至在缺乏甜菜碱时也能观察到扩增。即可进一步证实在平常的反应系统中也可观察到扩增。

[实施例3]在存在脯氨酸或DMSO时进行扩增

使用将HCV基因的部分序列掺入质粒中的DNA(1×10^-17mol)作为模板，进行本发明的核酸合成法。在实验中使用了四种引物-内部引物F，内部引物R，外部引物F和外部引物R。此时，也制备不含甜菜碱的反应溶液。

在反应溶液中加入脯氨酸或DMSO替代甜菜碱，使得脯氨酸或DMSO的终浓度为1％或5％。反应溶液中的其它组分与上述相同。

制备不会热变性的模板。于65℃使反应溶液反应2小时。

证实反应：在5μL上述反应溶液中加入5μL上样缓冲液，然后，上样于2％琼脂糖凝胶(0.5％ TBE)。在100V下电泳0.5小时。使用φX174 Hae III作为分子大小标记。电泳之后，用EtBr染色凝胶以肉眼观察核酸。结果示于图8。每个泳道对应于下列样品。

泳道1：φX174 Hae III

泳道2：脯氨酸(+)

泳道3：DMSO(+)

泳道4：甜菜碱(-)

使用与甜菜碱具有类似作用(降低解链温度的作用)的脯氨酸或DMSO的扩增反应的结果可以进一步证实：即使使用的是脯氨酸或DMSO，也能进行扩增反应。

[实施例4]外部引物的影响

使用λDNA(SEQ ID NO：16，1×10⁵个分子)进行本发明的核酸合成法，所述DNA为线性链，并用作靶核苷酸序列。在实验中使用了四种引物-内部引物F，内部引物R，外部引物F和外部引物R。同时进行不使用外部引物F和外部引物R的反应。在所有反应系统中加入溴化乙锭(EtBr)至终浓度为0.25μg/ml。

制备不会热变性的靶。于65℃使反应溶液反应1.5小时，使用ABI 7700(Perkin Elmer)，在一段时间内观察荧光强度的变化。EtBr是特异于双链核酸的荧光染色剂。因此，荧光强度随着核酸扩增所产生的双链核酸的量的增加而增加。

测定结果示于图9。发现不含外部引物的反应系统中的扩增速率较慢。

λDNA引物的核苷酸序列

内部引物F(SEQ ID NO：17)：

CAGCCAGCCGCAGCACGTTCGCTCATAGGAGATATGGTAGAGCCGC

内部引物R(SEQ ID NO：18)：

GAGAGAATTTGTACCACCTCCCACCGGGCACATAGCAGTCCTAGGGACAGT

外部引物F(SEQ ID NO：19)：

GGCTTGGCTCTGCTAACACGTT

外部引物R(SEQ ID NO：20)：

GGACGTTTGTAATGTCCGCTCC

工业实用性

本发明提供了无需改变温度的核酸合成法，从而不会使反应的特异性和效率变差。尽管本发明使用双链核酸作为模板，但仍无需为了变性而改变温度。因此，进行核酸合成无需使用具有特殊温度控制机制的仪器。另外，根据无需热循环的本发明，有望防止因温度变化而导致的非-特异性反应。

本发明的核酸合成法可应用于基于使用引物为合成起点的原理的任何核酸合成法。特别是，当与核酸合成反应联合使用时，可获得较高的合成效率，所述合成反应基于最初不需要改变温度的原理。诸如实施例中所述的核酸扩增法当与本发明联合使用时，可以获得极好的可操作性和特异性，其中所述核酸扩增法可提供扩增产物，在其具有的构型中，3’-末端区域可与其自身部分退火。仅通过在恒温下使成为模板的双链核酸与引物和DNA聚合酶一起保温，即可获得高水平的扩增效率。本发明能进行无需改变温度，但同时能保持高特异性和高扩增效率的核酸扩增法。

由于基于本发明的核酸合成法不需要改变温度，因此可以容易地监测反应。即可以使用能提供恒温的保温机制和具有光学读数机制的仪器来监测反应。这种机制是常规光学分析仪器即能提供的一般性机制。因此，基于本发明的核酸扩增法能通过常规分析仪器进行监测。

如上所述，本发明的核酸合成法不需要复杂的温度控制，而这正是与已知方法，如PCR法有关的问题，所述合成法还能显著简化实验操作。另外，本发明还能进行不需要特殊的温度控制仪器，因此在一般情况下即可使用的核酸扩增法。另外，在本发明中，可防止因改变温度而导致的非-特异性反应。

序列表<110>荣研化学株式会社(Eiken Chemical Co，Ltd.)<120>使用双链核酸为模板扩增核酸的方法<130>E2-A0001P<140><141><150>JP 2000-111939<151>2000-04-07<160>20<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>198<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>1caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct 60ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc 120ctcatcttct tgttggttct tctggactac caaggtatgt tgcccgtttg tcctctactt 180ccaggaacat caaccacc 198<210>2<211>279<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>2gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat gagtgtcgta cagcctccag gcccccccct 60cccgggagag ccatagtggt ctgcggaacc ggtgagtaca ccggaattac cggaaagact 120gggtcctttc ttggataaac ccactctatg tccggtcatt tgggcgtgcc cccgcaagac 180tgctagccga gtagcgttgg gttgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg 240cgagtgcccc gggaggtctc gtagaccgtg catcatgag 279<210>3<211>178<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3tgcttgtggc ctctcgtggc agggcagtct gcggcggtgt tctggtgcac ccccagtggg 60tcctcacagc tgcccactgc atcaggaaca aaagcgtgat cttgctgggt cggcacagcc 120tgtttcatcc tgaagacaca ggccaggtat ttcaggtcag ccacagcttc acacaccc 178<210>4<210>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>4gataaaacgc cgcagacaca tccttccaac ctcttgtcct ccaa 44<210>5<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>5cctgctgcta tgcctcatct tctttgacaa acgggcaaca tacctt 46<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>6caaaattcgc agtccccaac 20<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>7ggtggttgat gttcctgga 19<210>8<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>8gagtgggttt atccaagaaa ggactttagc catagtggtc tgcgga 46<210>9<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>9ctagccgagt agcgttgggt tgctttgcac tcgcaagcac cctatc 46<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>10gcagaaagcg tctagccatg g 21<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>11ctagccgagt agcgttgggt tgc 23<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>12tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210>13<210>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>13tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>14tgcttgtggc ctctcgtg 18<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>15gggtgtgtga agctgtg 17<210>16<210>245<212>DNA<213>λ噬菌体(Bacteriophage lambda)<400>16ggcttggctc tgctaacacg ttgctcatag gagatatggt agagccgcag acacgtcgta 60tgcaggaacg tgctgcggct ggctggtgaa cttccgatag tgcgggtgtt gaatgatttc 120cagttgctac cgattttaca tattttttgc atgagagaat ttgtaccacc tcccaccgac 180catctatgac tgtacgccac tgtccctagg actgctatgt gccggagcgg acattacaaa 240cgtcc 245<210>17<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>17cagccagccg cagcacgttc gctcatagga gatatggtag agccgc 46<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>18gagagaattt gtaccacctc ccaccgggca catagcagtc ctagggacag t 51<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>19ggcttggctc tgctaacacg tt 22<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>20ggacgtttgt aatgtccgct cc 22

Claims

1.使用双链核酸为模板合成核酸的方法，其中所述方法包括：

a)在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化与链置换相伴的互补链合成反应的DNA聚合酶存在时，保温双链核酸模板和任意引物，使得与引物退火的靶模板核酸的区域处于能使该区域经受碱基配对的条件下，所述引物能在恒温下扩增该模板核酸；

b)使能在恒温下扩增该模板核酸的引物与步骤a)中获得的，处于能使其经受碱基配对的条件之下的区域退火；和

c)使用引物作为合成起点进行互补链合成。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)在存在解链温度调节剂时进行。

3.根据权利要求2的方法，其中解链温度调节剂是至少一种选自下列的化合物：甜菜碱，脯氨酸，二甲基亚砜和三甲胺-N-氧化物。

4.合成核酸的方法，其中构成双链核酸模板之特定区域的多个核苷酸在一条链上相互连接，所述模板由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括：

a)在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化与链置换相伴的互补链合成反应的DNA聚合酶存在时，保温双链核酸模板和任意引物，使得与第二引物退火的靶模板核酸的区域处于能使该区域经受碱基配对的条件下；

b)使第二引物与步骤a)中获得的，处于能使其经受碱基配对的条件之下的区域退火，并使用第二引物为起点进行互补链合成，其中第二引物的3’-末端与限定构成该特定区域的一条链的3’-方向的区域退火，第二引物的5’-末端含有与使用该引物为起点而获得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列；

5.根据权利要求4的方法，其中步骤a)中的任意引物是第一引物。

6.根据权利要求4的方法，其中通过根据互补链合成反应的置换进行步骤c)，所述反应使用第四引物为起点，所述第四引物与同第二引物退火的模板区域的3’-方向退火。

7.根据权利要求4的方法，其中步骤e)进一步包括通过根据互补链合成反应的置换使第一引物的延伸产物转变为单链的步骤，所述反应使用第三引物为起点，所述第三引物与同第一引物退火的模板区域的3’-方向退火。

8.根据权利要求4的方法，其中第一引物的5’-末端含有与使用第一引物为起点所得的互补链合成反应产物的任意区域互补的核苷酸序列。

9.扩增核酸的方法，其中构成双链核酸模板之特定区域的多个核苷酸在一条链上相互连接，所述模板由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括：

1)使通过根据权利要求7的方法产生的第一引物延伸产物的3’-末端自身退火，并使用延伸产物作为起点进行互补链合成反应；

5)重复步骤2)至4)以扩增所需核酸。

10.根据权利要求9的方法，其中所述方法进一步包括：

6)通过步骤4)中产生的单链核酸3’-末端的自身退火进行互补链合成反应；

10)重复步骤7)至9)以扩增所需核酸。

11.检测样品中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包括进行根据权利要求10的扩增方法，并观察是否已产生扩增反应产物。

12.根据权利要求11的方法，其中在核酸检测试剂的存在下进行根据权利要求10的方法，所述方法进一步包括基于检测试剂的信号变化测定是否已产生扩增反应产物。

13.通过根据权利要求11的检测方法检测突变的方法，其中被扩增的核苷酸序列中的突变至少在一个3’-末端防止互补链合成，所述3’-末端是构成扩增方法的互补链合成的起点。

14.扩增核酸的方法，其中构成模板双链核酸之特定区域的多个核苷酸在单链上相互连接，所述模板双链核酸由互补的核苷酸序列构成，其中所述方法包括在能够使用第一引物为起点合成互补链的条件下保温下列组分的步骤：

含有双链核酸模板的靶，所述模板含有待扩增的特定区域；

催化与链置换相伴的互补链合成反应的DNA聚合酶；

核苷酸底物。

15.根据权利要求14的方法，其中组分还包括：

16.根据权利要求14的方法，其中保温在解链温度调节剂的存在下进行。

17.根据权利要求16的方法，其中解链温度调节剂是至少一种选自下列的化合物：甜菜碱，脯氨酸，二甲基亚砜和三甲胺-N-氧化物。

18.使与引物退火的靶模板核酸区域处于能使该区域经受碱基配对的条件之下的方法，所述引物能在恒温下起始扩增模板核酸的反应，其中所述方法包括在确保使用任意引物为起点合成互补链的条件下，在能催化与链置换相伴的互补链合成的DNA聚合酶存在时，在恒温下保温模板双链核酸，任意引物，和能扩增模板核酸的引物的步骤。