JPH0630799A - 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 - Google Patents
遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置Info
- Publication number
- JPH0630799A JPH0630799A JP4183452A JP18345292A JPH0630799A JP H0630799 A JPH0630799 A JP H0630799A JP 4183452 A JP4183452 A JP 4183452A JP 18345292 A JP18345292 A JP 18345292A JP H0630799 A JPH0630799 A JP H0630799A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- rna
- probe
- exonuclease
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
Abstract
(57)【要約】
【目的】 検体ＤＮＡを高感度で検出する手法を提供す
る。 【構成】 蛍光標識ＤＮＡプローブ１１を検体７に対合
（ハイブリダイズ）させ、二本鎖対合体８を形成し、二
本鎖対合体８を特異的に分解する酵素により対合したＤ
ＮＡプローブを順次分解脱離させることをくり返し、検
体ＤＮＡと対合するＤＮＡプローブだけを高速分解し、
短小化されたＤＮＡプローブ２０を増幅生産したのち、
短小化ＤＮＡプローブ２０を未反応ＤＮＡプローブ２１
と識別して検出して、検体ＤＮＡ７を高感度で検出す
る。 【効果】 反応の温度を上下することなく、数分間に検
体ＤＮＡを数桁上回る短小化ＤＮＡプローブを生成で
き、迅速な検体ＤＮＡの検出ができる。
る。 【構成】 蛍光標識ＤＮＡプローブ１１を検体７に対合
（ハイブリダイズ）させ、二本鎖対合体８を形成し、二
本鎖対合体８を特異的に分解する酵素により対合したＤ
ＮＡプローブを順次分解脱離させることをくり返し、検
体ＤＮＡと対合するＤＮＡプローブだけを高速分解し、
短小化されたＤＮＡプローブ２０を増幅生産したのち、
短小化ＤＮＡプローブ２０を未反応ＤＮＡプローブ２１
と識別して検出して、検体ＤＮＡ７を高感度で検出す
る。 【効果】 反応の温度を上下することなく、数分間に検
体ＤＮＡを数桁上回る短小化ＤＮＡプローブを生成で
き、迅速な検体ＤＮＡの検出ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子あるいはＤＮＡの
高感度検出方法及び検出装置に関する。
高感度検出方法及び検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子上の特定の塩基配列を識別して病
気の診断を行う方法、ＤＮＡ診断あるいは遺伝子診断、
が普及してきている。通常、検出の対象となるＤＮＡの
コピー数は少ないため、高感度の検出方法が要求され
る。従来、微量のＤＮＡ検出には放射性同位元素標識し
たＤＮＡプローブが用いられていた。すなわち、検体で
あるＤＮＡをアガロースゲルを使用して電気泳動し、そ
のサイズにより分離し、セルロースフィルターなどに分
離したＤＮＡのパターンを転写し固定する。次いで放射
性元素で標識ＤＮＡプローブをふりかけ、相補配列を持
つＤＮＡに対合（ハイブリダイズ）させる。フィルター
にフィルム等を密着させると、ＤＮＡプローブが対合
（ハイブリダイズ）した所からβ線等が放射され、その
位置がフィルムに転写され検出することができる。放射
性同位元素標識による検出は高感度であるが取扱がやっ
かいである難点があった。そこで、酵素反応を用いて検
出しようとする配列をもつＤＮＡ部位のコピー数を増幅
する手法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ポリメラーゼ チ
ェーン リアクション（Polymerase Chain Reaction)
（ＰＣＲ法））、が開発され用いられている（文献 Sci
ence 242,229(1988)）。この方法では、目的とする領域
をはさむ二本鎖ＤＮＡの両側にそれぞれ相補鎖合成プラ
イマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用
いて相補鎖合成をくりかえすもので（１０の５乗）から
（１０の６乗）倍の増幅ができるため、蛍光標識などで
も十分ＤＮＡの検出が可能となる。ＰＣＲ法では耐熱性
酵素と温度を上げ下げする熱サイクル装置を用いて相補
鎖合成と二本鎖ＤＮＡの分離およびプライマーの対合
（ハイブリダイゼーション）を繰り返すもので２つのＤ
ＮＡ相補鎖を増幅するプライマーが不可欠である。
気の診断を行う方法、ＤＮＡ診断あるいは遺伝子診断、
が普及してきている。通常、検出の対象となるＤＮＡの
コピー数は少ないため、高感度の検出方法が要求され
る。従来、微量のＤＮＡ検出には放射性同位元素標識し
たＤＮＡプローブが用いられていた。すなわち、検体で
あるＤＮＡをアガロースゲルを使用して電気泳動し、そ
のサイズにより分離し、セルロースフィルターなどに分
離したＤＮＡのパターンを転写し固定する。次いで放射
性元素で標識ＤＮＡプローブをふりかけ、相補配列を持
つＤＮＡに対合（ハイブリダイズ）させる。フィルター
にフィルム等を密着させると、ＤＮＡプローブが対合
（ハイブリダイズ）した所からβ線等が放射され、その
位置がフィルムに転写され検出することができる。放射
性同位元素標識による検出は高感度であるが取扱がやっ
かいである難点があった。そこで、酵素反応を用いて検
出しようとする配列をもつＤＮＡ部位のコピー数を増幅
する手法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ポリメラーゼ チ
ェーン リアクション（Polymerase Chain Reaction)
（ＰＣＲ法））、が開発され用いられている（文献 Sci
ence 242,229(1988)）。この方法では、目的とする領域
をはさむ二本鎖ＤＮＡの両側にそれぞれ相補鎖合成プラ
イマーをハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用
いて相補鎖合成をくりかえすもので（１０の５乗）から
（１０の６乗）倍の増幅ができるため、蛍光標識などで
も十分ＤＮＡの検出が可能となる。ＰＣＲ法では耐熱性
酵素と温度を上げ下げする熱サイクル装置を用いて相補
鎖合成と二本鎖ＤＮＡの分離およびプライマーの対合
（ハイブリダイゼーション）を繰り返すもので２つのＤ
ＮＡ相補鎖を増幅するプライマーが不可欠である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ増幅法では、最
初は目的とするＤＮＡを鋳型にＤＮＡコピーを作るが数
サイクル後には合成されたコピーが鋳型となり、ねづみ
算式にコピー数が増える。このため増幅用プライマーが
少しでも対合（ハイブリダイズ）できる所があればＤＮ
Ａの増幅が始まり、あとは自動的に増幅されるため汚染
などに弱い難点があった。また、増幅するには２つのプ
ライマーを用意するなどの必要もあり、変異の大きなウ
ィルスの検出では、ウィルスの検出に都合のよい、便利
な増幅領域を見つけるのに苦労するなどの難点があっ
た。そこで、ＰＣＲ増幅法に代わる目的とするＤＮＡ部
所の高感度検出方法の開発が望まれていた。本発明の目
的は、このような状況に鑑み、ＰＣＲ増幅法に代わり、
検体の情報を担うＤＮＡプローブの増幅法を提供し、高
感度な遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置を実現するこ
とにある。
初は目的とするＤＮＡを鋳型にＤＮＡコピーを作るが数
サイクル後には合成されたコピーが鋳型となり、ねづみ
算式にコピー数が増える。このため増幅用プライマーが
少しでも対合（ハイブリダイズ）できる所があればＤＮ
Ａの増幅が始まり、あとは自動的に増幅されるため汚染
などに弱い難点があった。また、増幅するには２つのプ
ライマーを用意するなどの必要もあり、変異の大きなウ
ィルスの検出では、ウィルスの検出に都合のよい、便利
な増幅領域を見つけるのに苦労するなどの難点があっ
た。そこで、ＰＣＲ増幅法に代わる目的とするＤＮＡ部
所の高感度検出方法の開発が望まれていた。本発明の目
的は、このような状況に鑑み、ＰＣＲ増幅法に代わり、
検体の情報を担うＤＮＡプローブの増幅法を提供し、高
感度な遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置を実現するこ
とにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記目的は、ＤＮＡある
いはＲＮＡの二本鎖部分を末端から切り出して分解する
酵素を用い、ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖部分の少な
くとも片方の鎖部分が蛍光あるいは色素で標識されたＤ
ＮＡあるいはＲＮＡオリゴマーとし、ＤＮＡあるいはＲ
ＮＡプローブを検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの存在下で短
小化し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを
検出することで達成される。上記の二本鎖部分を末端か
ら分解する酵素として、エクソヌクレアーゼ活性を持つ
酵素を使用し、エクソヌクレアーゼIII、λエクソヌク
レアーゼ、ヌクリアーゼＢａｌ ３１などが使用でき
る。要約すると蛍光体あるいは色素などで標識された対
合力の弱い部分と検体と相補的な配列をもち対合力の強
い部分とからなるＤＮＡプローブを含む、二本鎖ＤＮ
Ａ、ＲＮＡあるいはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを端か
ら分解するエクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を用いる
ことにより達成される。より具体的には、ＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブと検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれぞ
れ対合させるプロセスと、エクソヌクレアーゼ活性酵素
による２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解するプロセ
スと、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを検
出するプロセスと、からなる遺伝子検出方法であり、蛍
光あるいは色素で標識されたＤＮＡあるいはＲＮＡプロ
ーブを使用することができる。
いはＲＮＡの二本鎖部分を末端から切り出して分解する
酵素を用い、ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖部分の少な
くとも片方の鎖部分が蛍光あるいは色素で標識されたＤ
ＮＡあるいはＲＮＡオリゴマーとし、ＤＮＡあるいはＲ
ＮＡプローブを検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの存在下で短
小化し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを
検出することで達成される。上記の二本鎖部分を末端か
ら分解する酵素として、エクソヌクレアーゼ活性を持つ
酵素を使用し、エクソヌクレアーゼIII、λエクソヌク
レアーゼ、ヌクリアーゼＢａｌ ３１などが使用でき
る。要約すると蛍光体あるいは色素などで標識された対
合力の弱い部分と検体と相補的な配列をもち対合力の強
い部分とからなるＤＮＡプローブを含む、二本鎖ＤＮ
Ａ、ＲＮＡあるいはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを端か
ら分解するエクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を用いる
ことにより達成される。より具体的には、ＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブと検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれぞ
れ対合させるプロセスと、エクソヌクレアーゼ活性酵素
による２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解するプロセ
スと、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを検
出するプロセスと、からなる遺伝子検出方法であり、蛍
光あるいは色素で標識されたＤＮＡあるいはＲＮＡプロ
ーブを使用することができる。
【０００５】また、それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブの端部から蛍光標識された塩基位置までの長さを
変化させた複数のＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと、検
体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させ、エクソヌ
クレアーゼ活性酵素により２本鎖の末端ヌクレオチドを
順次分解し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの分子量が変化し泳動速度がそれぞれのＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブにより変化するようにして、検体ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡとエクソヌクレアーゼ活性酵素により
短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別し
て、異なる塩基配列をもつ検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの
複数個所を区別して検出する遺伝子検出方法であり、そ
れぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブにおいて、エク
ソヌクレアーゼ活性酵素による分解が前記それぞれのＤ
ＮＡあるいはＲＮＡプローブ上の所定の位置の塩基位置
より先に進行ないようにする。さらに、それぞれのＤＮ
ＡあるいはＲＮＡプローブの端部から蛍光標識された塩
基位置までの長さを変化させた複数のＤＮＡあるいはＲ
ＮＡプローブと、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを
それぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素により
２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化された
ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの分子量が変化し泳動速
度がそれぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブにより変
化するようにして、複数種の検体とエクソヌクレアーゼ
活性酵素により短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプロ
ーブを識別して、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを
区別して検出する遺伝子検出方法であり、それぞれのＤ
ＮＡあるいはＲＮＡプローブにおいて、エクソヌクレア
ーゼ活性酵素による分解が前記それぞれのＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブ上の所定の位置の塩基より先に進行な
いようにその位置の塩基に化学修飾をする。
ローブの端部から蛍光標識された塩基位置までの長さを
変化させた複数のＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと、検
体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させ、エクソヌ
クレアーゼ活性酵素により２本鎖の末端ヌクレオチドを
順次分解し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの分子量が変化し泳動速度がそれぞれのＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブにより変化するようにして、検体ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡとエクソヌクレアーゼ活性酵素により
短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別し
て、異なる塩基配列をもつ検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの
複数個所を区別して検出する遺伝子検出方法であり、そ
れぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブにおいて、エク
ソヌクレアーゼ活性酵素による分解が前記それぞれのＤ
ＮＡあるいはＲＮＡプローブ上の所定の位置の塩基位置
より先に進行ないようにする。さらに、それぞれのＤＮ
ＡあるいはＲＮＡプローブの端部から蛍光標識された塩
基位置までの長さを変化させた複数のＤＮＡあるいはＲ
ＮＡプローブと、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを
それぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素により
２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化された
ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの分子量が変化し泳動速
度がそれぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブにより変
化するようにして、複数種の検体とエクソヌクレアーゼ
活性酵素により短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプロ
ーブを識別して、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを
区別して検出する遺伝子検出方法であり、それぞれのＤ
ＮＡあるいはＲＮＡプローブにおいて、エクソヌクレア
ーゼ活性酵素による分解が前記それぞれのＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブ上の所定の位置の塩基より先に進行な
いようにその位置の塩基に化学修飾をする。
【０００６】また、それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブの蛍光標識の種類を変化させた複数のＤＮＡある
いはＲＮＡプローブと、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲ
ＮＡをそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素
により２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化
されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、複数
種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出する遺伝子検出方
法、あるいは、異なる塩基配列を有し異なる複数の蛍光
標識が標識されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを、異
なる塩基配列部分を有する検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの
複数個所にそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性
酵素で対合体を短小化して、異なる塩基配列部分を有す
る検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの複数個所を区別して検出
する遺伝子検出方法である。以上説明した遺伝子検出方
法において、ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの長さが８
塩基以上１００塩基以下とし、あるいは、ＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブの末端位置から蛍光標識された塩基ま
での長さが６塩基以下とし、あるいは、ＤＮＡあるいは
ＲＮＡプローブの末端位置からｎ塩基目と（ｎ＋１）塩
基目との間のリン酸ジエステル結合を、ホスホチオエー
トジエステル結合あるいはリン酸基を修飾した残基で置
換した結合とし、ｎを６以下とする。また、以上説明し
た遺伝子検出方法を用いた遺伝子検出装置であり、短小
化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、単
数種、あるいは複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを検
出する手段を有する。これらにより、ＤＮＡ診断法、Ｄ
ＮＡ検査装置が可能となる。
ローブの蛍光標識の種類を変化させた複数のＤＮＡある
いはＲＮＡプローブと、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲ
ＮＡをそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素
により２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化
されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、複数
種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出する遺伝子検出方
法、あるいは、異なる塩基配列を有し異なる複数の蛍光
標識が標識されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを、異
なる塩基配列部分を有する検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの
複数個所にそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性
酵素で対合体を短小化して、異なる塩基配列部分を有す
る検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの複数個所を区別して検出
する遺伝子検出方法である。以上説明した遺伝子検出方
法において、ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの長さが８
塩基以上１００塩基以下とし、あるいは、ＤＮＡあるい
はＲＮＡプローブの末端位置から蛍光標識された塩基ま
での長さが６塩基以下とし、あるいは、ＤＮＡあるいは
ＲＮＡプローブの末端位置からｎ塩基目と（ｎ＋１）塩
基目との間のリン酸ジエステル結合を、ホスホチオエー
トジエステル結合あるいはリン酸基を修飾した残基で置
換した結合とし、ｎを６以下とする。また、以上説明し
た遺伝子検出方法を用いた遺伝子検出装置であり、短小
化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、単
数種、あるいは複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを検
出する手段を有する。これらにより、ＤＮＡ診断法、Ｄ
ＮＡ検査装置が可能となる。
【０００７】
【作用】蛍光標識付きのＤＮＡプローブは検体ＤＮＡと
対合（ハイブリダイズ）し、二本鎖を有する対合体を形
成する。この対合体に、二本鎖ＤＮＡの末端塩基を削り
取る活性を持つ酵素、即ちエクソヌクレアーゼ活性を持
つ酵素（例えば、エクソヌクレアーゼIII（ Exonucleas
e III ）、λエクソヌクレアーゼ（ λ Exonuclease
）、ヌクリアーゼＢａｌ ３１（ Exonuclease Ｂａｌ
３１ ）など）を作用させると、二本鎖部分の３'末端か
らヌクレオチドは順次削り取られてゆく。ＤＮＡプロー
ブがバイブリダイズして安定に二本鎖として存在するに
は一定の長さが必要であるが、端からヌクレオチドが削
り取られて短くなると、短小化したＤＮＡプローブ（場
合によっては蛍光標識部分だけになる）は検体ＤＮＡか
ら遊離していく。残された検体ＤＮＡには過剰に存在す
る新しいＤＮＡプローブ分子がハイブリダイズして二本
鎖を形成する。これは再びエクソヌクレアーゼ活性を持
つ酵素、エクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）で分解
される。このようにＤＮＡプローブは検体ＤＮＡとエク
ソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）の存在下で、その長
さが短くなっていく。この反応は非可逆的に進行するの
で一定時間後には検体ＤＮＡコピー数をはるかに上回る
短小化された蛍光標識ＤＮＡプローブが生成する。短小
化された蛍光標識ＤＮＡプローブを電気泳動などで長さ
分離して検出することにより、高感度で検体ＤＮＡの有
無を調べることができる。検査の正確さを増すために、
異なる塩基配列を持つ蛍光標識ＤＮＡプローブを検体Ｄ
ＮＡの複数個所に対合（ハイブリダイズ）させ、対合体
を短小化して、異なる塩基配列を持つ検体ＤＮＡの複数
個所を区別して検出することもできる。すなわち、これ
らプローブの標識蛍光体を変えたり、蛍光体あるいは色
素などで標識された対合力の弱い部分の長さを変化さ
せ、短小化後のＤＮＡプローブサイズが変化するように
して電気泳動等により長さを分離し、各プローブを区別
して検出することができる。要約すると、蛍光標識ＤＮ
Ａプローブを検体に対合（ハイブリダイズ）させ、二本
鎖を形成し、二本鎖を特異的に分解する酵素によりＤＮ
Ａプローブを分解脱離させることをくり返し行ない、検
体ＤＮＡと対合するＤＮＡプローブだけを高速分解し、
短小化されたＤＮＡプローブを増幅生産できることにな
る。
対合（ハイブリダイズ）し、二本鎖を有する対合体を形
成する。この対合体に、二本鎖ＤＮＡの末端塩基を削り
取る活性を持つ酵素、即ちエクソヌクレアーゼ活性を持
つ酵素（例えば、エクソヌクレアーゼIII（ Exonucleas
e III ）、λエクソヌクレアーゼ（ λ Exonuclease
）、ヌクリアーゼＢａｌ ３１（ Exonuclease Ｂａｌ
３１ ）など）を作用させると、二本鎖部分の３'末端か
らヌクレオチドは順次削り取られてゆく。ＤＮＡプロー
ブがバイブリダイズして安定に二本鎖として存在するに
は一定の長さが必要であるが、端からヌクレオチドが削
り取られて短くなると、短小化したＤＮＡプローブ（場
合によっては蛍光標識部分だけになる）は検体ＤＮＡか
ら遊離していく。残された検体ＤＮＡには過剰に存在す
る新しいＤＮＡプローブ分子がハイブリダイズして二本
鎖を形成する。これは再びエクソヌクレアーゼ活性を持
つ酵素、エクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）で分解
される。このようにＤＮＡプローブは検体ＤＮＡとエク
ソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）の存在下で、その長
さが短くなっていく。この反応は非可逆的に進行するの
で一定時間後には検体ＤＮＡコピー数をはるかに上回る
短小化された蛍光標識ＤＮＡプローブが生成する。短小
化された蛍光標識ＤＮＡプローブを電気泳動などで長さ
分離して検出することにより、高感度で検体ＤＮＡの有
無を調べることができる。検査の正確さを増すために、
異なる塩基配列を持つ蛍光標識ＤＮＡプローブを検体Ｄ
ＮＡの複数個所に対合（ハイブリダイズ）させ、対合体
を短小化して、異なる塩基配列を持つ検体ＤＮＡの複数
個所を区別して検出することもできる。すなわち、これ
らプローブの標識蛍光体を変えたり、蛍光体あるいは色
素などで標識された対合力の弱い部分の長さを変化さ
せ、短小化後のＤＮＡプローブサイズが変化するように
して電気泳動等により長さを分離し、各プローブを区別
して検出することができる。要約すると、蛍光標識ＤＮ
Ａプローブを検体に対合（ハイブリダイズ）させ、二本
鎖を形成し、二本鎖を特異的に分解する酵素によりＤＮ
Ａプローブを分解脱離させることをくり返し行ない、検
体ＤＮＡと対合するＤＮＡプローブだけを高速分解し、
短小化されたＤＮＡプローブを増幅生産できることにな
る。
【０００８】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。検体例と
して簡単に入手できる一本鎖ＤＮＡ、Ｍ１３ファージを
用いた。ここでは一本鎖ＤＮＡの例を示すが、検体がウ
ィスルなどの一本鎖ＲＮＡでも同様に検出できる。検体
と相補配列をもつＤＮＡプローブを作製する。変異の激
しいウィスルなどの場合には塩基配列が良く保存されて
いる領域を選んでＤＮＡプローブを作成する。本実施例
では、図１に示すような種々のタイプの蛍光標識された
ＤＮＡプローブを使用することができる。本実施例での
蛍光標識されたＤＮＡプローブは、図１（ａ）から図１
（ｅ）に示すように、検体ＤＮＡと良く対合する部分で
ある対合領域６と、色素あるいは蛍光標識２が標識され
ている対合力の弱い標識領域５とからなる。図１（ａ）
から図１（ｅ）において、Ｘ及びＹはそれぞれ、塩基
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔを表わし、Ｚは色素あるいは蛍光標識が
結合された有機物分子鎖を表わしている。図１（ａ）の
ＤＮＡプローブ１１は、蛍光標識２が５’端に標識さ
れ、図１（ｂ）のＤＮＡプローブ１２は、５’端から５
塩基目に蛍光標識２が標識され、図１（ｃ）のＤＮＡプ
ローブ１３は、５'末端および５'末端から５塩基目に蛍
光標識２が標識され、図１（ｄ）のＤＮＡプローブ１４
は、蛍光標識２が５’端に、５'末端から５塩基目に蛍
光標識２とは異なる蛍光標識３が標識されている例であ
る。図１（ａ）、図１（ｂ）、図１（ｄ）において、標
識領域５に蛍光標識２あるいは３がさらに単数又は複数
個標識されていてもよい。さらに、図１（ａ）から図１
（ｄ）において、標識領域５に対合力の弱いプリンヌク
レオシド（イノシン、アデノシン、グアノシンなど）、
あるいはピリミジンヌクレオシド（シチジン、ウリジン
など）を含んでいてもよい。図１（ｅ）のＤＮＡプロー
ブ１５は、対合領域６の３’端に、蛍光標識が結合され
た有機物分子鎖Ｚが結合されている例である。有機物分
子鎖Ｚに結合される蛍光標識は、１種類の蛍光標識が単
数あるいは複数個、または複数種類の蛍光標識が単数あ
るいは複数個が結合されたものであってもよい。
して簡単に入手できる一本鎖ＤＮＡ、Ｍ１３ファージを
用いた。ここでは一本鎖ＤＮＡの例を示すが、検体がウ
ィスルなどの一本鎖ＲＮＡでも同様に検出できる。検体
と相補配列をもつＤＮＡプローブを作製する。変異の激
しいウィスルなどの場合には塩基配列が良く保存されて
いる領域を選んでＤＮＡプローブを作成する。本実施例
では、図１に示すような種々のタイプの蛍光標識された
ＤＮＡプローブを使用することができる。本実施例での
蛍光標識されたＤＮＡプローブは、図１（ａ）から図１
（ｅ）に示すように、検体ＤＮＡと良く対合する部分で
ある対合領域６と、色素あるいは蛍光標識２が標識され
ている対合力の弱い標識領域５とからなる。図１（ａ）
から図１（ｅ）において、Ｘ及びＹはそれぞれ、塩基
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔを表わし、Ｚは色素あるいは蛍光標識が
結合された有機物分子鎖を表わしている。図１（ａ）の
ＤＮＡプローブ１１は、蛍光標識２が５’端に標識さ
れ、図１（ｂ）のＤＮＡプローブ１２は、５’端から５
塩基目に蛍光標識２が標識され、図１（ｃ）のＤＮＡプ
ローブ１３は、５'末端および５'末端から５塩基目に蛍
光標識２が標識され、図１（ｄ）のＤＮＡプローブ１４
は、蛍光標識２が５’端に、５'末端から５塩基目に蛍
光標識２とは異なる蛍光標識３が標識されている例であ
る。図１（ａ）、図１（ｂ）、図１（ｄ）において、標
識領域５に蛍光標識２あるいは３がさらに単数又は複数
個標識されていてもよい。さらに、図１（ａ）から図１
（ｄ）において、標識領域５に対合力の弱いプリンヌク
レオシド（イノシン、アデノシン、グアノシンなど）、
あるいはピリミジンヌクレオシド（シチジン、ウリジン
など）を含んでいてもよい。図１（ｅ）のＤＮＡプロー
ブ１５は、対合領域６の３’端に、蛍光標識が結合され
た有機物分子鎖Ｚが結合されている例である。有機物分
子鎖Ｚに結合される蛍光標識は、１種類の蛍光標識が単
数あるいは複数個、または複数種類の蛍光標識が単数あ
るいは複数個が結合されたものであってもよい。
【０００９】本発明の第一の実施例を図１（ａ）のＤＮ
Ａプローブ１１を用いた場合について説明する。図２
（ａ）から（ｆ）に、蛍光標識ＤＮＡプローブを検体に
対合（ハイブリダイズ）させ、二本鎖を形成し、二本鎖
を特異的に分解する酵素によりＤＮＡプローブを分解脱
離させることをくり返し、検体ＤＮＡと対合するＤＮＡ
プローブだけを高速分解し、短小化されたＤＮＡプロー
ブを増幅生産するプロセスの模式図を示す。このような
プロセスで生起する反応を、図２（ａ）から（ｆ）に基
づき説明する。図２（ａ）に示すように、一本鎖にされ
た検体７と、図１（ａ）のＤＮＡプローブ１１（蛍光標
識２が１個だけ５’端に標識されている。）とが混合さ
れ、所定の条件に保持され、対合反応が開始される。こ
の結果、図２（ｂ）に示すように、ＤＮＡプローブ１１
と検体７との対合体８と、未反応のＤＮＡプローブ２１
が反応により生じる。検体７の数は少なく、この検体７
の数より十分に過剰にＤＮＡプローブ１１を使用するの
で、未反応のＤＮＡプローブ２１は過剰に残存する。こ
の状態で、ＤＮＡの３’端からヌクレオチドを削るエク
ソヌクレアーゼIII（ Exonuclease III ）を添加する。
エクソヌクレアーゼIIIの触媒作用により、対合体８の
二本鎖部分のＤＮＡプローブ１１は、その３’端からヌ
クレオチドが順次削られていき（対合体８の二本鎖部分
のうち検体ＤＮＡの３’端は蛍光標識２の存在のための
末端分解反応は進行しない。）、図２（ｃ）に示すよう
に、ＤＮＡプローブ１１の長さがは短小化され、短小化
されたＤＮＡプローブ２０となる。与えられている条件
下で短小化されたＤＮＡプローブ２０と検体７との対合
体９の対合力が弱く安定して存在できなくなると、蛍光
標識２が標識されている短小化されたＤＮＡプローブ２
０は対合体９から離れ遊離していく。短小化されたＤＮ
Ａプローブ２０は対合する塩基対の数が少なくなると
（蛍光標識２が標識されている５’端だけで、一本鎖に
された検体７と対合する場合も有る。）、検体ＤＮＡと
対合（ハイブリダイズ）する対合力は弱いので、互いに
遊離して、図２（ｄ）に示すように、一本鎖にされた検
体７と、過剰の未反応のＤＮＡプローブ２１と、遊離し
た短小化されたＤＮＡプローブ２０（蛍光標識２が標識
されている５’端だけからなる場合も有る。）の混合状
態となる。この混合状態は遊離した短小化されたＤＮＡ
プローブ２０の存在を除けば、実質的に図２（ａ）の状
態と同じであるので、図２（ｅ）に示すように、一本鎖
にされた検体７は再び対合体８を形成し、エクソヌクレ
アーゼIIIの触媒作用により、対合体８の二本鎖部分の
ＤＮＡプローブ１１は、その３’端からヌクレオチドが
順次削られていき、図２（ｃ）に示すのと同様に、ＤＮ
Ａプローブ１１の長さがは短小化され、短小化されたＤ
ＮＡプローブ２０を生じ、短小化されたＤＮＡプローブ
２０が遊離していき、図２（ｆ）に示すように、短小化
されたＤＮＡプローブ２０の数は増幅して行く。この増
幅は、過剰の未反応のＤＮＡプローブ２１が存在し、エ
クソヌクレアーゼIIIが酵素活性を保持している限り続
く。
Ａプローブ１１を用いた場合について説明する。図２
（ａ）から（ｆ）に、蛍光標識ＤＮＡプローブを検体に
対合（ハイブリダイズ）させ、二本鎖を形成し、二本鎖
を特異的に分解する酵素によりＤＮＡプローブを分解脱
離させることをくり返し、検体ＤＮＡと対合するＤＮＡ
プローブだけを高速分解し、短小化されたＤＮＡプロー
ブを増幅生産するプロセスの模式図を示す。このような
プロセスで生起する反応を、図２（ａ）から（ｆ）に基
づき説明する。図２（ａ）に示すように、一本鎖にされ
た検体７と、図１（ａ）のＤＮＡプローブ１１（蛍光標
識２が１個だけ５’端に標識されている。）とが混合さ
れ、所定の条件に保持され、対合反応が開始される。こ
の結果、図２（ｂ）に示すように、ＤＮＡプローブ１１
と検体７との対合体８と、未反応のＤＮＡプローブ２１
が反応により生じる。検体７の数は少なく、この検体７
の数より十分に過剰にＤＮＡプローブ１１を使用するの
で、未反応のＤＮＡプローブ２１は過剰に残存する。こ
の状態で、ＤＮＡの３’端からヌクレオチドを削るエク
ソヌクレアーゼIII（ Exonuclease III ）を添加する。
エクソヌクレアーゼIIIの触媒作用により、対合体８の
二本鎖部分のＤＮＡプローブ１１は、その３’端からヌ
クレオチドが順次削られていき（対合体８の二本鎖部分
のうち検体ＤＮＡの３’端は蛍光標識２の存在のための
末端分解反応は進行しない。）、図２（ｃ）に示すよう
に、ＤＮＡプローブ１１の長さがは短小化され、短小化
されたＤＮＡプローブ２０となる。与えられている条件
下で短小化されたＤＮＡプローブ２０と検体７との対合
体９の対合力が弱く安定して存在できなくなると、蛍光
標識２が標識されている短小化されたＤＮＡプローブ２
０は対合体９から離れ遊離していく。短小化されたＤＮ
Ａプローブ２０は対合する塩基対の数が少なくなると
（蛍光標識２が標識されている５’端だけで、一本鎖に
された検体７と対合する場合も有る。）、検体ＤＮＡと
対合（ハイブリダイズ）する対合力は弱いので、互いに
遊離して、図２（ｄ）に示すように、一本鎖にされた検
体７と、過剰の未反応のＤＮＡプローブ２１と、遊離し
た短小化されたＤＮＡプローブ２０（蛍光標識２が標識
されている５’端だけからなる場合も有る。）の混合状
態となる。この混合状態は遊離した短小化されたＤＮＡ
プローブ２０の存在を除けば、実質的に図２（ａ）の状
態と同じであるので、図２（ｅ）に示すように、一本鎖
にされた検体７は再び対合体８を形成し、エクソヌクレ
アーゼIIIの触媒作用により、対合体８の二本鎖部分の
ＤＮＡプローブ１１は、その３’端からヌクレオチドが
順次削られていき、図２（ｃ）に示すのと同様に、ＤＮ
Ａプローブ１１の長さがは短小化され、短小化されたＤ
ＮＡプローブ２０を生じ、短小化されたＤＮＡプローブ
２０が遊離していき、図２（ｆ）に示すように、短小化
されたＤＮＡプローブ２０の数は増幅して行く。この増
幅は、過剰の未反応のＤＮＡプローブ２１が存在し、エ
クソヌクレアーゼIIIが酵素活性を保持している限り続
く。
【００１０】本発明の第二の実施例を図１（ｆ）のＤＮ
Ａプローブ１６を用いた場合について説明する。本実施
例では、図１（ｆ）に示す構造を有するＤＮＡプローブ
１６、即ち、２８マー（ｍｅｒ）のＤＮＡプローブを用
いた。５'末端および５'末端から５塩基目に蛍光標識２
をいれた。５'末端だけあるいは５塩基目以外に蛍光標
識を入れてもよい。実施例で５塩基目に蛍光体をいれた
のはエクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）による末端
分解反応をここで停止させるためである。即ち、エクソ
ヌクレアーゼによる分解がプローブ上の一定位置の核酸
単位より先に進行ないようにこの部位の核酸（５'末端
から５塩基目の核酸）に化学修飾をしたＤＮＡプローブ
となっている。エクソヌクレアーゼによる分解がプロー
ブ上の一定位置の塩基位置より先に進行ないようにする
には、図１（ａ）から（ｄ）（ｆ）に示す標識領域５と
対合領域６の間のリン酸ジエステル結合を、ホスホチオ
エートジエステル結合あるいはリン酸基を修飾した残基
で置換することにより、この位置で前記の分解を確実に
停止させることができる。５'末端および５'末端から５
塩基目には蛍光標識分子２が付着しており、検体ＤＮＡ
と対合（ハイブリダイズ）する対合力は弱い。この部分
を標識領域と呼ぶ。この標識領域の部分の長さを変化さ
せることで、複数のＤＮＡプローブを識別可能とするこ
とができる。この領域の長さが長くなると対合力が強く
なりエクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）による末端
分解後も検体ＤＮＡから遊離しなくなる。蛍光標識領域
の長さは６マー以下が好ましい。また、標識領域５に対
合力の弱いイノシンを入れたり、長さによる泳動速度に
差は出るが対合力のない、蛍光標識が結合された有機物
分子鎖でこの標識領域を構成して、エクソヌクレアーゼ
（ Exonuclease ）による末端分解後に検体ＤＮＡから
遊離しやすくすることもできる。３'末端側には２３マ
ーからなる相補ＤＮＡをもつが、この領域は検体ＤＮＡ
と良く対合する部分で、対合領域と呼ぶことにする。こ
の対合領域の長さと蛍光標識領域との合計長さ、すなわ
ち、ＤＮＡプローブの長さは、室温で安定にハイブリダ
イズさせるには８〜１０マー以上がよく、１００マー以
下であることが好ましい。これは、上記の合計長さが長
くなるとＤＮＡプローブ自身で自己対合反応を起こす確
率が高まるからである。より高温でハイブリダイズさせ
る場合には長くする必要がある。十分安定な二本鎖を形
成させるために実施例では２３マーとした。動作温度の
選択は重要で、ＤＮＡプローブの対合領域がＤＮＡ検体
の相補鎖に完全にあえば対合し、合わないときや標識部
だけの短いＤＮＡプローブになった時にはまったく結合
しない温度がよい。この観点から温度は高めがよいがエ
クソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）の使用可能な温度
範囲内である必要がある。例えば、エクソヌクレアーゼ
III（ Exonuclease III ）では、動作温度は３７度Ｃか
ら４０度Ｃが好適である。
Ａプローブ１６を用いた場合について説明する。本実施
例では、図１（ｆ）に示す構造を有するＤＮＡプローブ
１６、即ち、２８マー（ｍｅｒ）のＤＮＡプローブを用
いた。５'末端および５'末端から５塩基目に蛍光標識２
をいれた。５'末端だけあるいは５塩基目以外に蛍光標
識を入れてもよい。実施例で５塩基目に蛍光体をいれた
のはエクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）による末端
分解反応をここで停止させるためである。即ち、エクソ
ヌクレアーゼによる分解がプローブ上の一定位置の核酸
単位より先に進行ないようにこの部位の核酸（５'末端
から５塩基目の核酸）に化学修飾をしたＤＮＡプローブ
となっている。エクソヌクレアーゼによる分解がプロー
ブ上の一定位置の塩基位置より先に進行ないようにする
には、図１（ａ）から（ｄ）（ｆ）に示す標識領域５と
対合領域６の間のリン酸ジエステル結合を、ホスホチオ
エートジエステル結合あるいはリン酸基を修飾した残基
で置換することにより、この位置で前記の分解を確実に
停止させることができる。５'末端および５'末端から５
塩基目には蛍光標識分子２が付着しており、検体ＤＮＡ
と対合（ハイブリダイズ）する対合力は弱い。この部分
を標識領域と呼ぶ。この標識領域の部分の長さを変化さ
せることで、複数のＤＮＡプローブを識別可能とするこ
とができる。この領域の長さが長くなると対合力が強く
なりエクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）による末端
分解後も検体ＤＮＡから遊離しなくなる。蛍光標識領域
の長さは６マー以下が好ましい。また、標識領域５に対
合力の弱いイノシンを入れたり、長さによる泳動速度に
差は出るが対合力のない、蛍光標識が結合された有機物
分子鎖でこの標識領域を構成して、エクソヌクレアーゼ
（ Exonuclease ）による末端分解後に検体ＤＮＡから
遊離しやすくすることもできる。３'末端側には２３マ
ーからなる相補ＤＮＡをもつが、この領域は検体ＤＮＡ
と良く対合する部分で、対合領域と呼ぶことにする。こ
の対合領域の長さと蛍光標識領域との合計長さ、すなわ
ち、ＤＮＡプローブの長さは、室温で安定にハイブリダ
イズさせるには８〜１０マー以上がよく、１００マー以
下であることが好ましい。これは、上記の合計長さが長
くなるとＤＮＡプローブ自身で自己対合反応を起こす確
率が高まるからである。より高温でハイブリダイズさせ
る場合には長くする必要がある。十分安定な二本鎖を形
成させるために実施例では２３マーとした。動作温度の
選択は重要で、ＤＮＡプローブの対合領域がＤＮＡ検体
の相補鎖に完全にあえば対合し、合わないときや標識部
だけの短いＤＮＡプローブになった時にはまったく結合
しない温度がよい。この観点から温度は高めがよいがエ
クソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）の使用可能な温度
範囲内である必要がある。例えば、エクソヌクレアーゼ
III（ Exonuclease III ）では、動作温度は３７度Ｃか
ら４０度Ｃが好適である。
【００１１】検体を数百コピー含むTBEバッファー液中
に０．１pmol（ピコモル）のＤＮＡプローブを含む液、
０．５μｌ（マイクロリットル）を混合し、所定の条件
下で対合反応を行なう。次いで、エクソヌクレアーゼII
I（ Exonuclease III ）を１ユニット注入し、１０分間
反応させる。エクソヌクレアーゼIII（ ExonucleaseIII
）１ユニットは二本鎖ＤＮＡの３'末端に作用し３０分
間に約１nmol（ナノモル）の核酸分子を解離させる能力
をもつ。短小化されたＤＮＡプローブの数の増幅の原理
は第１の実施例で説明したのと全く同じである。反応生
物は液体クロマトグラフ、ゲル電気泳動あるいはキャピ
ラリー電気泳動などの分離手段を用いて未反応のＤＮＡ
プローブと分離され、蛍光検出器を用いて検出される。
ゲル電気泳動を用いる場合、実時間蛍光式ＤＮＡシーケ
ンサー等を用いることもできるが泳動路長は３〜４ｃｍ
でよい。本実施例では６％アクリルアミドゲル電気泳動
を用いた。すなわち、ＤＮＡシーケンサーに短泳動路長
のゲル板を装着し１μｌ（マイクロリットル）の反応生
成物を電気泳動ウェルに注入した。分離泳動路長は４ｃ
ｍとした。図３は得られた測定結果である。短小化され
たＤＮＡプローブ２０にもとづく電気泳動ピーク３０
と、未反応のＤＮＡプローブ２１にもとづく電気泳動ピ
ーク３１が検出されるが、短小化されたＤＮＡプローブ
２０は未反応のＤＮＡプローブ２１と泳動速度が異なる
ので、短小化されたＤＮＡプローブを計測する際に、過
剰に存在する未反応ＤＮＡプローブに邪魔されることは
ない。さらに元のＤＮＡプローブの長さを長くすると分
離は容易になる。前述したように、標識領域の長さ、あ
るいは標識の種類（例えば、蛍光体の種類）を変化さ
せ、短小化プローブの分子量が変化し泳動速度が各ＤＮ
Ａプローブにより変化するようにして、あるいは標識か
らの信号の種類（例えば、蛍光波長）が変化し各ＤＮＡ
プローブにより変化するようにして、検体と酵素により
短小化されたＤＮＡプローブが何であるか識別して、複
数の何種もの検体を同時に検査することができる。もち
ろん、同様なプローブを使用して、一種類の検体につい
て、複数項目についての検査を行なうことができる。図
４（ａ）は、検体５９の複数部分について、それぞれ異
なる蛍光標識２、３、４０で標識されたＤＮＡプローブ
５０、５１、５２を対合させて、同時に複数項目につい
ての検査を行なう場合の図２（ｂ）あるいは図２（ｅ）
の状態にある対合体を示している。上記で説明したよう
に、図４（ａ）において、各プローブで標識領域の長さ
を変化させ、短小化プローブの分子量が変化し泳動速度
が各ＤＮＡプローブにより変化するようにして、検体と
酵素により短小化されたＤＮＡプローブが何であるか識
別してもよい。図４（ｂ）は複数の異なる検体６０、６
１、６２、６３を同時に検査する場合の図２（ｂ）ある
いは図２（ｅ）の状態にある対合体を示している。各検
体は、異なる蛍光標識２、３、４０、４１で標識され
た、ＤＮＡプローブ７０、７１、７２、７３と対合体を
なしている。図４（ａ）あるいは図４（ｂ）に示す対合
体は、エクソヌクレアーゼIIIの触媒作用により、図２
（ａ）から図２（ｆ）で説明したのと同様に、各ＤＮＡ
プローブは３’端よりヌクレオチドが削り取られ短小化
していき、各ＤＮＡプローブについての、短小化された
ＤＮＡプローブが対合体より遊離していき、短小化され
たＤＮＡプローブの数は増幅されていく。
に０．１pmol（ピコモル）のＤＮＡプローブを含む液、
０．５μｌ（マイクロリットル）を混合し、所定の条件
下で対合反応を行なう。次いで、エクソヌクレアーゼII
I（ Exonuclease III ）を１ユニット注入し、１０分間
反応させる。エクソヌクレアーゼIII（ ExonucleaseIII
）１ユニットは二本鎖ＤＮＡの３'末端に作用し３０分
間に約１nmol（ナノモル）の核酸分子を解離させる能力
をもつ。短小化されたＤＮＡプローブの数の増幅の原理
は第１の実施例で説明したのと全く同じである。反応生
物は液体クロマトグラフ、ゲル電気泳動あるいはキャピ
ラリー電気泳動などの分離手段を用いて未反応のＤＮＡ
プローブと分離され、蛍光検出器を用いて検出される。
ゲル電気泳動を用いる場合、実時間蛍光式ＤＮＡシーケ
ンサー等を用いることもできるが泳動路長は３〜４ｃｍ
でよい。本実施例では６％アクリルアミドゲル電気泳動
を用いた。すなわち、ＤＮＡシーケンサーに短泳動路長
のゲル板を装着し１μｌ（マイクロリットル）の反応生
成物を電気泳動ウェルに注入した。分離泳動路長は４ｃ
ｍとした。図３は得られた測定結果である。短小化され
たＤＮＡプローブ２０にもとづく電気泳動ピーク３０
と、未反応のＤＮＡプローブ２１にもとづく電気泳動ピ
ーク３１が検出されるが、短小化されたＤＮＡプローブ
２０は未反応のＤＮＡプローブ２１と泳動速度が異なる
ので、短小化されたＤＮＡプローブを計測する際に、過
剰に存在する未反応ＤＮＡプローブに邪魔されることは
ない。さらに元のＤＮＡプローブの長さを長くすると分
離は容易になる。前述したように、標識領域の長さ、あ
るいは標識の種類（例えば、蛍光体の種類）を変化さ
せ、短小化プローブの分子量が変化し泳動速度が各ＤＮ
Ａプローブにより変化するようにして、あるいは標識か
らの信号の種類（例えば、蛍光波長）が変化し各ＤＮＡ
プローブにより変化するようにして、検体と酵素により
短小化されたＤＮＡプローブが何であるか識別して、複
数の何種もの検体を同時に検査することができる。もち
ろん、同様なプローブを使用して、一種類の検体につい
て、複数項目についての検査を行なうことができる。図
４（ａ）は、検体５９の複数部分について、それぞれ異
なる蛍光標識２、３、４０で標識されたＤＮＡプローブ
５０、５１、５２を対合させて、同時に複数項目につい
ての検査を行なう場合の図２（ｂ）あるいは図２（ｅ）
の状態にある対合体を示している。上記で説明したよう
に、図４（ａ）において、各プローブで標識領域の長さ
を変化させ、短小化プローブの分子量が変化し泳動速度
が各ＤＮＡプローブにより変化するようにして、検体と
酵素により短小化されたＤＮＡプローブが何であるか識
別してもよい。図４（ｂ）は複数の異なる検体６０、６
１、６２、６３を同時に検査する場合の図２（ｂ）ある
いは図２（ｅ）の状態にある対合体を示している。各検
体は、異なる蛍光標識２、３、４０、４１で標識され
た、ＤＮＡプローブ７０、７１、７２、７３と対合体を
なしている。図４（ａ）あるいは図４（ｂ）に示す対合
体は、エクソヌクレアーゼIIIの触媒作用により、図２
（ａ）から図２（ｆ）で説明したのと同様に、各ＤＮＡ
プローブは３’端よりヌクレオチドが削り取られ短小化
していき、各ＤＮＡプローブについての、短小化された
ＤＮＡプローブが対合体より遊離していき、短小化され
たＤＮＡプローブの数は増幅されていく。
【００１２】エクソヌクレアーゼ（ Exonuclease ）に
よる短小化ＤＮＡプローブの生成速度は、検体ＤＮＡの
コピー数に比例するので定量的な評価も行ないやすい。
例えば、検体ＤＮＡの量を０．１pmol（ピコモル）とす
ると、数分間に検体ＤＮＡを２〜３桁上回る短小化ＤＮ
Ａプローブを生成できる。エクソヌクレアーゼIII（ Ex
onuclease III ）は一本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡには作
用しないので、対合したＤＮＡプローブだけが分解の対
象となる。耐熱性をもつ酵素を用い動作温度を上げた
り、必要に応じて温度を上下することにより分解脱離を
促進することができる。以上の実施例では、ＤＮＡ分子
の端からヌクレオチドを順々に切り出す過程を触媒する
酵素として、ＤＮＡの３’端からヌクレオチドを削るエ
クソヌクレアーゼIII（ Exonuclease III ）を用いて説
明したが、ＤＮＡの５’端からヌクレオチドを削るλエ
クソヌクレアーゼ（λExonuclease ）、ＤＮＡの３’お
よび５’端からヌクレオチドを分解するヌクリアーゼＢ
ａｌ ３１（ Exonuclease Ｂａｌ ３１ ）を用いても同
様のことが可能である。また、上記で説明した蛍光標識
としては、フルオレセインイソチオシアネート（ ＦＩ
ＴＣ、flourescein isothiocyanate ）、スルフォロー
ダミン１０１誘導体（ Texas Red 、surforhodamine 10
1 acid chloride 、モレキュラプローブ社製品）、テト
ラメチルローダミンイソチオシアネート（ ＴＲＩＴ
Ｃ、tetrametylrhodamine isothiocyanate ）などが使
用できる。
よる短小化ＤＮＡプローブの生成速度は、検体ＤＮＡの
コピー数に比例するので定量的な評価も行ないやすい。
例えば、検体ＤＮＡの量を０．１pmol（ピコモル）とす
ると、数分間に検体ＤＮＡを２〜３桁上回る短小化ＤＮ
Ａプローブを生成できる。エクソヌクレアーゼIII（ Ex
onuclease III ）は一本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡには作
用しないので、対合したＤＮＡプローブだけが分解の対
象となる。耐熱性をもつ酵素を用い動作温度を上げた
り、必要に応じて温度を上下することにより分解脱離を
促進することができる。以上の実施例では、ＤＮＡ分子
の端からヌクレオチドを順々に切り出す過程を触媒する
酵素として、ＤＮＡの３’端からヌクレオチドを削るエ
クソヌクレアーゼIII（ Exonuclease III ）を用いて説
明したが、ＤＮＡの５’端からヌクレオチドを削るλエ
クソヌクレアーゼ（λExonuclease ）、ＤＮＡの３’お
よび５’端からヌクレオチドを分解するヌクリアーゼＢ
ａｌ ３１（ Exonuclease Ｂａｌ ３１ ）を用いても同
様のことが可能である。また、上記で説明した蛍光標識
としては、フルオレセインイソチオシアネート（ ＦＩ
ＴＣ、flourescein isothiocyanate ）、スルフォロー
ダミン１０１誘導体（ Texas Red 、surforhodamine 10
1 acid chloride 、モレキュラプローブ社製品）、テト
ラメチルローダミンイソチオシアネート（ ＴＲＩＴ
Ｃ、tetrametylrhodamine isothiocyanate ）などが使
用できる。
【００１３】
【発明の効果】以上のべたように本発明によれば、検体
ＤＮＡと相補配列をもつＤＮＡプローブを相補結合さ
せ、相補結合したＤＮＡプローブを選択的に短小化でき
る。この反応は酵素により触媒されるもので、検体ＤＮ
Ａコピー数を遥かに上回る短小化されたＤＮＡプローブ
を作成でき、これを未反応のＤＮＡプローブと分離する
ことにより、高感度で検体ＤＮＡの検出を可能とする。
これにより高感度な遺伝子の検出が可能となる。本反応
は反応の温度を上下することなく、数分間に検体ＤＮＡ
を、例えば２〜３桁上回る短小化ＤＮＡプローブを生成
でき、迅速な検体ＤＮＡの検出に有効である。
ＤＮＡと相補配列をもつＤＮＡプローブを相補結合さ
せ、相補結合したＤＮＡプローブを選択的に短小化でき
る。この反応は酵素により触媒されるもので、検体ＤＮ
Ａコピー数を遥かに上回る短小化されたＤＮＡプローブ
を作成でき、これを未反応のＤＮＡプローブと分離する
ことにより、高感度で検体ＤＮＡの検出を可能とする。
これにより高感度な遺伝子の検出が可能となる。本反応
は反応の温度を上下することなく、数分間に検体ＤＮＡ
を、例えば２〜３桁上回る短小化ＤＮＡプローブを生成
でき、迅速な検体ＤＮＡの検出に有効である。
【図１】本発明の実施例で用いたＤＮＡプローブの構造
例を示す図。
例を示す図。
【図２】本発明による、酵素反応による短小化ＤＮＡプ
ローブの数の増幅のプロセスを説明する模式図。
ローブの数の増幅のプロセスを説明する模式図。
【図３】本発明の増幅反応生成物の電気泳動パターンの
一例を示す図。
一例を示す図。
【図４】短小化ＤＮＡプローブの数の増幅を複数のＤＮ
Ａプローブについて行なう場合の対合体の例を示す図。
Ａプローブについて行なう場合の対合体の例を示す図。
２、３、４０、４１…蛍光標識、５…標識領域、６…対
合領域、７…一本鎖にされた検体、８…対合体、９…対
合体、１１、１２、１３、１４、１５、１６、５０、５
１、５２、７０、７１、７２、７３…蛍光標識されたＤ
ＮＡプローブ、２０…短小化されたＤＮＡプローブ、２
１…未反応のＤＮＡプローブ、３０…短小化されたＤＮ
Ａプローブにもとづく電気泳動ピーク、３１…未反応の
ＤＮＡプローブにもとづく電気泳動ピーク、５４、６
０、６１、６２、６３…検体。
合領域、７…一本鎖にされた検体、８…対合体、９…対
合体、１１、１２、１３、１４、１５、１６、５０、５
１、５２、７０、７１、７２、７３…蛍光標識されたＤ
ＮＡプローブ、２０…短小化されたＤＮＡプローブ、２
１…未反応のＤＮＡプローブ、３０…短小化されたＤＮ
Ａプローブにもとづく電気泳動ピーク、３１…未反応の
ＤＮＡプローブにもとづく電気泳動ピーク、５４、６
０、６１、６２、６３…検体。
Claims (34)
- 【請求項１】ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖部分を末端
から分解する酵素を用いることを特徴とする遺伝子検出
方法。 - 【請求項２】ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖部分の少な
くとも片方の鎖部分が蛍光あるいは色素で標識されたＤ
ＮＡあるいはＲＮＡオリゴマーであることを特徴とする
請求項１に記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項３】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを、それぞ
れ検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの存在下で短小化し、短小
化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを検出すること
を特徴とする遺伝子検出方法。 - 【請求項４】エクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を使用
することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか
に記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項５】エクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素が、エ
クソヌクレアーゼIII、λエクソヌクレアーゼ、ヌクリ
アーゼＢａｌ ３１のいずれかであることことを特徴と
する請求項４に記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項６】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと検体ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させるプロセスと、エ
クソヌクレアーゼ活性酵素による２本鎖の末端ヌクレオ
チドを順次分解するプロセスと、短小化されたＤＮＡあ
るいはＲＮＡプローブを検出するプロセスと、からなる
遺伝子検出方法。 - 【請求項７】蛍光あるいは色素で標識されたＤＮＡある
いはＲＮＡプローブと検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれ
ぞれ対合させるプロセスと、エクソヌクレアーゼ活性酵
素による２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解するプロ
セスと、２本鎖の末端核酸分解により短小化されたＤＮ
ＡあるいはＲＮＡプローブを検出するプロセスと、から
なる遺伝子検出方法。 - 【請求項８】それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブ
の端部から蛍光標識された塩基位置までの長さを変化さ
せた複数のＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと、検体ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させ、エクソヌクレア
ーゼ活性酵素により２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分
解し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの分
子量が変化し泳動速度がそれぞれのＤＮＡあるいはＲＮ
Ａプローブにより変化するようにして、検体ＤＮＡある
いはＲＮＡとエクソヌクレアーゼ活性酵素により短小化
されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、異な
る塩基配列をもつ検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの複数個所
を区別して検出することを特徴とする遺伝子検出方法。 - 【請求項９】前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプロ
ーブにおいて、エクソヌクレアーゼ活性酵素による分解
が前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブ上の所
定の位置の塩基位置より先に進行ないようにその塩基に
化学修飾をしたことを特徴とする請求項８に記載の遺伝
子検出方法。 - 【請求項１０】それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの端部から蛍光標識された塩基位置までの長さを変化
させた複数のＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと、複数種
の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させ、エク
ソヌクレアーゼ活性酵素により２本鎖の末端ヌクレオチ
ドを順次分解し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブの分子量が変化し泳動速度がそれぞれのＤＮＡあ
るいはＲＮＡプローブにより変化するようにして、複数
種の検体とエクソヌクレアーゼ活性酵素により短小化さ
れたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、複数種
の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを区別して検出することを
特徴とする遺伝子検出方法。 - 【請求項１１】前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブにおいて、エクソヌクレアーゼ活性酵素による分
解が前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブ上の
所定の位置の塩基より先に進行ないようにその位置の塩
基に化学修飾をしたことを特徴とする請求項１０に記載
の遺伝子検出方法。 - 【請求項１２】それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの蛍光標識の種類を変化させた複数のＤＮＡあるいは
ＲＮＡプローブと、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡ
をそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素によ
り２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化され
たＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、複数種の
検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出することを特徴とする
遺伝子検出方法。 - 【請求項１３】異なる塩基配列を有し異なる複数の蛍光
標識が標識されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを、異
なる塩基配列部分を有する検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの
複数個所にそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性
酵素で対合体を短小化して、異なる塩基配列部分を有す
る検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの複数個所を区別して検出
することを特徴とする遺伝子検出方法。 - 【請求項１４】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの長さが
８塩基以上１００塩基以下であることを特徴とする請求
項６から請求項１３のいずれかに記載の遺伝子検出方
法。 - 【請求項１５】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの末端位
置から蛍光標識された塩基までの長さが６塩基以下であ
ることを特徴とする請求項６から請求項１４のいずれか
に記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項１６】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの末端位
置からｎ塩基目と（ｎ＋１）塩基目との間のリン酸ジエ
ステル結合を、ホスホチオエートジエステル結合あるい
はリン酸基を修飾した残基で置換した結合とし、ｎを６
以下としたことを特徴とする請求項６から請求項１５の
いずれかに記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項１７】請求項１から請求項１６のいずれかに記
載の方法を用いたＤＮＡ診断方法。 - 【請求項１８】ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖部分を末
端から分解する酵素を用いることを特徴とする遺伝子検
出装置。 - 【請求項１９】ＤＮＡあるいはＲＮＡの二本鎖部分の少
なくとも片方の鎖部分が蛍光あるいは色素で標識された
ＤＮＡあるいはＲＮＡオリゴマーであることを特徴とす
る請求項１８に記載の遺伝子検出装置。 - 【請求項２０】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを、それ
ぞれ検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの存在下で短小化し、短
小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを検出する手
段を有することを特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項２１】エクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を使
用することを特徴とする請求項１８から請求項１９のい
ずれかに記載の遺伝子検出装置。 - 【請求項２２】エクソヌクレアーゼ活性を持つ酵素が、
エクソヌクレアーゼIII、λエクソヌクレアーゼ、ヌク
リアーゼＢａｌ ３１のいずれかであることことを特徴
とする請求項２１に記載の遺伝子検出装置。 - 【請求項２３】ＤＮＡプローブあるいはＲＮＡと検体Ｄ
ＮＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させ、エクソヌクレ
アーゼ活性酵素により２本鎖の末端ヌクレオチドを順次
分解し、これにより生じた短小化されたＤＮＡあるいは
ＲＮＡプローブを検出する手段を有することを特徴とす
る遺伝子検出装置。 - 【請求項２４】蛍光あるいは色素で標識されたＤＮＡあ
るいはＲＮＡプローブと検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそ
れぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素により２
本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、これにより生じ
た短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを検出す
る手段を有することを特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項２５】それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの端部から蛍光標識された塩基位置までの長さを変化
させた複数のＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと、異なる
塩基配列部分を有する検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれ
ぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素により２本
鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化されたＤＮ
ＡあるいはＲＮＡプローブの分子量が変化し泳動速度が
それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブにより変化す
るようにして、検体ＤＮＡあるいはＲＮＡとエクソヌク
レアーゼ活性酵素により短小化されたＤＮＡあるいはＲ
ＮＡプローブを識別して、異なる塩基配列部分を有する
検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの複数個所を区別して検出す
る手段を有することを特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項２６】前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブにおいて、エクソヌクレアーゼ活性酵素による分
解が前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブ上の
所定の位置の塩基より先に進行ないようにその位置の塩
基に化学修飾をしたことを特徴とする請求項２５に記載
の遺伝子検出装置。 - 【請求項２７】それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの端部から蛍光標識された塩基位置までの長さを変化
させた複数のＤＮＡあるいはＲＮＡプローブと、複数種
の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡをそれぞれ対合させ、エク
ソヌクレアーゼ活性酵素により２本鎖の末端ヌクレオチ
ドを順次分解し、短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブの分子量が変化し泳動速度がそれぞれのＤＮＡあ
るいはＲＮＡプローブにより変化するようにして、検体
ＤＮＡあるいはＲＮＡとエクソヌクレアーゼ活性酵素に
より短小化されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別
して、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを区別して検
出する手段を有することを特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項２８】前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプ
ローブにおいて、エクソヌクレアーゼ活性酵素による分
解が前記それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプローブ上の
所定の位置の塩基より先に進行ないようにその位置の塩
基に化学修飾をしたことを特徴とする請求項２７に記載
の遺伝子検出装置。 - 【請求項２９】それぞれのＤＮＡあるいはＲＮＡプロー
ブの蛍光標識の種類を変化させた複数のＤＮＡあるいは
ＲＮＡプローブと、複数種の検体ＤＮＡあるいはＲＮＡ
をそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性酵素によ
り２本鎖の末端ヌクレオチドを順次分解し、短小化され
たＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを識別して、複数種の
検体ＤＮＡあるいはＲＮＡを検出する手段を有すること
を特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項３０】異なる塩基配列を有し異なる複数の蛍光
標識が標識されたＤＮＡあるいはＲＮＡプローブを、異
なる塩基配列部分を有する検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの
複数個所にそれぞれ対合させ、エクソヌクレアーゼ活性
酵素で対合体を短小化して、異なる塩基配列部分を有す
る検体ＤＮＡあるいはＲＮＡの複数個所を区別して検出
する手段を有することを特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項３１】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの長さが
８塩基以上１００塩基以下であることを特徴とする請求
項２３から請求項３０のいずれかに記載の遺伝子検出装
置。 - 【請求項３２】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの末端位
置から蛍光標識された塩基までの長さが６塩基以下であ
ることを特徴とする請求項２３から請求項３１のいずれ
かに記載の遺伝子検出装置。 - 【請求項３３】ＤＮＡあるいはＲＮＡプローブの末端位
置からｎ塩基目と（ｎ＋１）塩基目との間のリン酸ジエ
ステル結合を、ホスホチオエートジエステル結合あるい
はリン酸基を修飾した残基で置換した結合とし、ｎを６
以下としたことを特徴とする請求項２３から請求項３２
のいずれかに記載の遺伝子検出装置。 - 【請求項３４】請求項１から請求項１６のいずれかに記
載の方法を用いたＤＮＡ検査装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4183452A JPH0630799A (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 |
| EP19930110550 EP0578138A3 (en) | 1992-07-10 | 1993-07-01 | Gene detection method. |
| CN 93108572 CN1081719A (zh) | 1992-07-10 | 1993-07-10 | 基因检测法和基因检测仪 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4183452A JPH0630799A (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0630799A true JPH0630799A (ja) | 1994-02-08 |
Family
ID=16136030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4183452A Pending JPH0630799A (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0578138A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0630799A (ja) |
| CN (1) | CN1081719A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1158213A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-28 | Nissan Motor Company, Limited | Shifting device for an automatic transmission |
| JP2010535528A (ja) * | 2007-08-13 | 2010-11-25 | ユニバーシティ オブ ストラスクライド | 核酸配列の同定 |
| JP2015133975A (ja) * | 2009-09-24 | 2015-07-27 | シージーン アイエヌシー | 反復的エキソ核酸切断反応によるターゲット核酸配列の検出 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0842294B1 (en) * | 1994-12-23 | 2002-10-23 | Dade Behring Inc. | Detection of nucleic acids by nuclease-catalyzed product formation |
| US6503709B1 (en) | 1997-07-03 | 2003-01-07 | Id Biomedical Corporation | Methods for rapidly detecting methicillin resistant staphylococci |
| US6289229B1 (en) | 1998-01-20 | 2001-09-11 | Scimed Life Systems, Inc. | Readable probe array for in vivo use |
| ES2464132T3 (es) * | 2000-04-07 | 2014-05-30 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Procedimiento de amplificación de ácido nucleico utilizando como molde ácido nucleico bicatenario |
| CA2302827A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-12 | Michelle Furtado | Oligonucleotide and dna de-hybridization on surfaces |
| KR101163425B1 (ko) * | 2006-04-14 | 2012-07-13 | 닛본 덴끼 가부시끼가이샤 | 개체 식별 방법 및 장치 |
| JP5789720B2 (ja) * | 2013-07-31 | 2015-10-07 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子変異分析装置、遺伝子変異分析システム及び遺伝子変異分析方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8515276D0 (en) * | 1985-06-17 | 1985-07-17 | Amersham Int Plc | Nucleic acid sequencing |
| US5011769A (en) * | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
| EP0365627B1 (en) * | 1988-03-24 | 1993-12-22 | University Of Iowa Research Foundation | Catalytic hybridization systems for the detection of nucleic acid sequences based on their activity as cofactors in catalytic reactions in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
| FR2649122B1 (fr) * | 1989-07-03 | 1991-10-18 | Pasteur Institut | Perfectionnements apportes aux techniques d'amplification par reaction de polymerisation en chaine (pcr) |
| GB9009903D0 (en) * | 1990-05-02 | 1990-06-27 | Ici Plc | Assay for specific nucleic acid sequences |
-
1992
- 1992-07-10 JP JP4183452A patent/JPH0630799A/ja active Pending
-
1993
- 1993-07-01 EP EP19930110550 patent/EP0578138A3/en not_active Withdrawn
- 1993-07-10 CN CN 93108572 patent/CN1081719A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1158213A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-28 | Nissan Motor Company, Limited | Shifting device for an automatic transmission |
| US6481308B2 (en) | 2000-05-24 | 2002-11-19 | Nissan Motor Co., Ltd. | Shifting device for an automatic transmission |
| JP2010535528A (ja) * | 2007-08-13 | 2010-11-25 | ユニバーシティ オブ ストラスクライド | 核酸配列の同定 |
| JP2015133975A (ja) * | 2009-09-24 | 2015-07-27 | シージーン アイエヌシー | 反復的エキソ核酸切断反応によるターゲット核酸配列の検出 |
| US9447457B2 (en) | 2009-09-24 | 2016-09-20 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0578138A2 (en) | 1994-01-12 |
| CN1081719A (zh) | 1994-02-09 |
| EP0578138A3 (en) | 1994-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9938573B2 (en) | Methods and kits for nucleic acid sequencing | |
| KR0171629B1 (ko) | 증폭 생성물에 대한 빠른 분석 | |
| US5011769A (en) | Methods for detecting nucleic acid sequences | |
| US5871908A (en) | Process for the determination of in vitro amplified nucleic acids | |
| JP5160433B2 (ja) | 迅速並行核酸分析 | |
| US6750018B2 (en) | Method for detecting nucleic acid mutation by detecting chemiluminiscence generated with by-product of complementary strand extension reaction | |
| JP2008533983A (ja) | 多型検出法 | |
| EP0665293A2 (en) | Method of determining base sequence of nucleic acid | |
| HUP0101385A2 (hu) | Eljárás nukleinsavak detektálására PCR-módszerrel | |
| JP2010537643A (ja) | 代替的な核酸配列決定法 | |
| RU2002119394A (ru) | Анализ интенсивности флуоресценции для дуплексной и триплексной гибридизации нуклеиновых кислот в растворе с использованием флуоресцентных интеркаляторов | |
| JPH11506020A (ja) | 均質ｐｃｒハイブリダイゼーション系のための蛍光検出アッセイ | |
| JPH0630799A (ja) | 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置 | |
| JP3970816B2 (ja) | バックグラウンドを下げる蛍光ハイブリダイゼーションプローブ | |
| US20080233588A1 (en) | Analytical Method and Kit | |
| CN103124797A (zh) | 用于在相同反应容器内的细胞裂解和pcr的方法 | |
| CN103124796A (zh) | 用于pcr反应缓冲液中的细胞裂解的方法 | |
| WO2004061132A1 (en) | Compositions and methods for polynucleotide detection | |
| JP3647109B2 (ja) | Ｄｎａ検出法 | |
| WO2008021010A2 (en) | Methods for real-time quantitative pcr | |
| JP2003135098A (ja) | 遺伝子検査方法 | |
| US20040175704A1 (en) | Compositions and methods for polynucleotide sequence detection | |
| US20020058271A1 (en) | Process for detecting a nucleic acid target | |
| CN111315863A (zh) | 基于浓度的dna测序机 | |
| EP1403382A2 (en) | Improved fluorescent resonance energy transfer probes |