CN1863927A - 核酸检测分析 - Google Patents

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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Abstract

用于测定基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，其包括在形成包含潜在甲基化位点的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5－甲基－胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；提供包含第一捕获序列的第一发夹，所述第一捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，提供包含第二捕获序列的第二发夹，所述第二捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；允许第一发夹和第二发夹杂交至修饰的核酸模板；连接杂交的第一和第二发夹以形成跨越修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的探针；消化修饰的核酸模板以获得探针；以及检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。

Description

核酸检测分析
技术领域
本发明涉及核酸检测分析并且尤其涉及利用亚硫酸氢盐发夹的改进的寡核苷酸分析。本发明还涉及利用这些分析区分核酸中包含5-甲基胞嘧啶碱基的特定碱基序列的方法。
背景技术
许多方法目前可用于特定核酸分子的检测。这些方法一般依赖于靶核酸和核酸探针之间序列-依赖的杂交，所述靶核酸和核酸探针长度范围可从短的寡核苷酸(20个碱基或更少)至数千碱基的序列(kb)。
从核酸序列的群体内扩增特定序列的最广泛使用的方法为聚合酶链式反应(PCR)(Dieffenbach C和Dveksler G eds.PCR Primer：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在该扩增方法中，通常互补链上以及位于所扩增区两端的长度15至30个核苷酸用于起始对变性单链DNA的DNA合成。变性、引物杂交和利用热稳定DNA聚合酶进行DNA链合成的连续循环使得引物间的序列呈指数扩增。RNA序列可通过利用反转录酶产生cDNA拷贝为第一拷贝而扩增。扩增的DNA片段可通过各种方法检测，包括凝胶电泳、和标记探针的杂交、允许后续鉴定的标记引物的应用(例如通过酶连分析)、在与靶DNA杂交后产生信号的荧光-标记引物的应用(例如Beacon和TaqMan系统)。
同PCR一样，已开发许多其他技术用于特定序列的检测和扩增。一个实例为连接酶链式反应(Barany F Genetic disease detection andDNA amplification using cloned thermostable ligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991))。
对于直接检测，靶核酸最常见是根据大小通过凝胶电泳分离并且在和靶序列互补的探针杂交之前转移至固相支持物(Southern和Northern印迹法)。探针可以是天然的核酸或例如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)的类似物。探针可直接标记(例如用32P)或可使用间接的检测方法。间接的方法通常依赖于″标记物″例如生物素或地高辛掺入探针并随后通过例如酶-联底物转化或化学发光的方法检测探针。
已广泛应用的用于核酸直接检测的另一种方法为″夹心″杂交。该方法中，捕获探针偶联至固相支持物，而溶液中的靶核酸与结合的探针杂交。洗去未结合的靶核酸而利用和靶序列杂交的第二探针检测结合的核酸。检测可应用以上所述的直接或间接方法。″支链DNA″信号检测系统为运用夹心杂交原理的一个实例(Urdea MS等.Branched DNAamplification multimers for the sensitive，direct detection of humanhepatitis viruses.Nucleic Acids Symp Ser.1991；(24)：197-200)。
运用用于核酸序列直接检测的核酸杂交的快速发展的领域为DNA微阵列(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays.Cell102：9-15(2000)；Watson A New tools.A new breed of high techdetectives.Science 289：850-854(2000))。该方法中，将单独的核酸种类固定至网格模式的固相支持物，所述核酸的范围从寡核苷酸至较长的序列例如cDNA克隆。标定的或标记的核酸群体随后与阵列杂交并且定量与阵列中每个点的杂交水平。即使采用其他的检测系统，最常见的是放射性-或荧光-标记的核酸(例如，cDNA)用于杂交。
与用于基因组分型分析的微阵列的应用有关的一个问题是在分析单独位点前其通常必须以某些方式进行预-扩增。大多数方法依赖于靶序列的PCR扩增。然而，当反应混合物中引物组数目为n个靶序列时，所有2n2+n种可能的探针组合对会产生非特异性的扩增产物(Landegren和Nilsson.Locked on target：strategies for future gene diagnostics.Ann.Med.1997；(29)：585-590)。为了应用该技术，已开发了挂锁(padlock)探针。用这些探针，非特异性反应产生线性化分子而特异的杂交事件产生二聚分子，其可通过核酸外切酶的应用而与线性化分子区分(Nilsson等.Padlock probes：circularised oligonucleotides for localDNA detection.1994；Science 92650；2085-2088)。然而，对于基因组变异的特异性检测而言，一般将使用四个探针用于每一个多态性位点的检测，而造成整个基因组扫描将产生非常大量的探针。
另一种最新的技术，分子反转探针(MIP)已证实在单个试管中产生高水平的倍增(multiplexing)。已报道在单个试管中可倍增超过1000个探针(Hardenbol等.Nature Biotechnology，21：673-678)。然而，挂锁探针和MIP方法都需要很长的＞110bp寡核苷酸的合成，而大多数商业经销商无法实现。
目前，检测如前列腺癌的GSTP1基因启动子中发现的DNA中甲基化变化的方法的选择取决于DNA的亚硫酸氢盐修饰后所述序列的PCR扩增。亚硫酸氢盐-处理的DNA中，胞嘧啶转化成尿嘧啶(由此PCR过程中以胸腺嘧啶扩增)而甲基化的胞嘧啶是非-反应性的并且仍是胞嘧啶(Frommer M，McDonald LE，Millar DS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL.A genomic sequencing protocol whichyields a positive display of 5-methyl cytosine residues in individual DNAstrands.PNAS 89：1827-1831(1992)；Clark SJ，Harrison J，Paul CL和Frommer M.High sensitivity mapping of methylated cytosines.NucleicAcids Res.22：2990-2997(1994))。由此，亚硫酸氢盐处理后，包含5-甲基胞嘧啶碱基的DNA序列将与对应的未甲基化DNA不同。可选择非-特异性扩增目的基因组区域的引物以检测其甲基化状态，或该引物可用来选择性地扩增其中特定的胞嘧啶被甲基化的序列(HermanJG，Graff JR，Myohanen S，Nelkin BD和Baylin SB.Methylation-specificPCR：a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.PNAS 93：9821-9826(1996))。
用于胞嘧啶甲基化检测的备选方法包括用其酶切受位点特异的DNA甲基化作用阻断的限制性内切酶消化，随后对该目的区域使用Southern印迹法和杂交探测。该方法受条件的限制，其中DNA的显著比例部分(通常＞10％)在原位被甲基化并且其中要有足够的DNA，约1至5μg可用于检测。酶切受位点特异的DNA甲基化作用阻断的限制性内切酶消化后用位于限制性酶位点侧翼的引物进行PCR扩增。该方法可利用较少量的DNA，但是除了DNA甲基化外的原因引起的任何不完全酶切消化都可能产生假阳性信号。
本发明人目前开发了利用寡核苷酸发夹进行甲基化核酸的灵敏和特异性检测的方法，其大大减少了与非-靶序列的非特异性扩增有关的问题并且提高了可在单个反应试管中进行倍增的水平。此使得该技术可理想地用于甲基化模式的整个基因组分析并且还适合机器操作。
发明概述
第一方面，本发明提供了用于检测基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
(a)在形成包含潜在甲基化位点的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
(b)提供包含第一捕获序列的第一发夹，所述第一捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
(c)提供包含第二捕获序列的第二发夹，所述第二捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
(d)允许第一发夹和第二发夹杂交至修饰的核酸模板；
(e)连接杂交的第一和第二发夹以形成跨越修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的探针；
(f)消化该修饰的核酸模板；以及
(g)检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
第二方面，本发明提供了用于确定基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
(a)在形成包含修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
(b)提供包含第一捕获序列的第一发夹，所述第一捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的一侧的侧翼区域互补；
(c)提供包含第二捕获序列的第二发夹，所述第二捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的另一侧的侧翼区域互补；
(d)允许第一发夹和第二发夹杂交至修饰的核酸模板使得在潜在的甲基化位点没有互补碱基；
(e)将碱基或数个碱基插入第一发夹和第二发夹之间；
(f)连接杂交的发夹以形成跨越修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的探针；
(g)消化该修饰的核酸模板；以及
(h)检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
第三方面，本发明提供了用于确定基因组核酸上潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
(a)在形成包括含有潜在甲基化位点的核酸的两条互补链的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
(b)提供包含第一捕获序列和第二捕获序列的第一发夹，第一捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，而第二捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
(c)提供包含第三捕获序列的第二发夹，所述第三捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
(d)提供包含第四捕获序列的第三发夹，所述第四捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
(e)允许第一、第二和第三发夹杂交至修饰的核酸模板；
(f)连接杂交的发夹以形成跨越修饰的核酸模板两条链中潜在甲基化位点的探针；
(g)消化该修饰的核酸模板；以及
(h)检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
第四方面，本发明提供了用于确定基因组核酸上潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
(a)在形成包括含有潜在甲基化位点的核酸两条互补链的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
(b)提供包含第一捕获序列和第二捕获序列的第一发夹，第一捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，而第二捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
(c)提供包含第三捕获序列的第二发夹，所述第三捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
(d)提供包含第四捕获序列的第三发夹，所述第四捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点的另一侧的侧翼区域互补；
(e)允许第一、第二和第三发夹杂交至修饰的核酸模板使得在修饰的核酸模板的至少一条互补链的潜在甲基化位点没有互补碱基；
(f)将至少一个碱基插入第一发夹和第二发夹之间；
(g)连接杂交的发夹以形成跨越修饰的核酸模板两条链中潜在甲基化位点的探针；
(h)消化该修饰的核酸模板；以及
(h)检测该线性探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
第五个方面，本发明提供了用于确定基因组核酸上潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
(a)在形成包括含有潜在甲基化位点的核酸两条互补链的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
(b)提供包含第一捕获序列和第二捕获序列的第一发夹，第一捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，而第二捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
(c)提供包含第三捕获序列和第四捕获序列的第二发夹，第三捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补，而第四捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
(d)允许第一和第二发夹杂交至修饰的核酸模板的两条链；
(e)连接杂交的发夹以形成跨越修饰的核酸模板两条链中潜在甲基化位点的环状探针；
(f)消化该修饰的核酸模板；以及
(g)检测该环状探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
第六个方面，本发明提供了用于确定基因组核酸上潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
(a)在形成包括含有潜在甲基化位点的核酸两条互补链的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
(b)提供包含第一捕获序列和第二捕获序列的第一发夹，第一捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，而第二捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
(c)提供包含第三捕获序列和第四捕获序列的第二发夹，第三捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补，而第四捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
(d)允许第一和第二发夹杂交至修饰的核酸模板的两条链使得在修饰的核酸模板的至少一条互补链的潜在甲基化位点没有互补碱基；
(e)将至少一个碱基插入第一发夹和第二发夹之间；
(f)连接杂交的发夹以形成跨越修饰的核酸模板两条链中潜在甲基化位点的环状探针；
(g)消化该修饰的核酸模板；以及
(h)检测该环状探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
基因组核酸可为DNA或RNA。优选基因组核酸为DNA。
优选潜在的甲基化位点为5′侧翼为鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)，本领域中称为CpG双联体。
修饰试剂优选亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。更优选该试剂为亚硫酸氢钠，一种在水存在时将胞嘧啶修饰为尿嘧啶的试剂。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)与胞嘧啶的5，6-双键很容易反应而形成磺化胞嘧啶反应中间体，其易受脱氨基作用的影响，并且在水存在时产生尿嘧啶亚硫酸盐。必要时，可在温和的碱性条件下除去亚硫酸盐，引起尿嘧啶的生成。因此，可能所有的胞嘧啶都将转化为尿嘧啶。然而，任何甲基化的胞嘧啶由于甲基化的保护而不能经修饰试剂进行转化。
在一种优选的形式下，第一、第二或第三发夹的至少一个包含允许连接步骤后探针扩增的通用引物。
在另一种优选的形式下，第一、第二或第三发夹的至少一个包含允许探针捕获的捕获位点。
在另一种优选的形式下，第一、第二或第三发夹的至少一个包含可裂解的位点。优选地，该可裂解的位点为核酸酶限制性位点或尿嘧啶碱基。
在一种优选的形式下，第一或第二发夹的互补序列跨越潜在的甲基化位点。
在另一种优选的形式下，第一、第二或第三发夹的互补序列不跨越潜在的甲基化位点。
发夹优选通过使用能连接单链DNA的合适的酶而连接。合适的连接酶的实例包括但不限于，Ampligase(Epicentre various cat#′s)、T4DNA连接酶(NEB cat#M0202)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA连接酶(NEB cat#M0208)、DNA连接酶(E.coli，NAD)(NEBcat#M0205)。然而，可理解的是其他连接酶也适用于本发明。
第五和第六个方面中，发夹优选连接于第一和第二捕获序列或其附近以及第三和第四捕获序列或其附近。
当一个或多个碱基插入发夹之间时，优选使用DNA聚合酶。合适的聚合酶的实例包括但不限于，Taq聚合酶Stoffel片段、Taq聚合酶、Advantage DNA聚合酶、AmpliTaq、Amplitaq Gold、Titanium Taq聚合酶、KlenTaqDNA聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Accuprime Taq聚合酶、DNA聚合酶1、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Klenow大片段、Klenow外切-DNA聚合酶、BstB聚合酶或任何合适的DNA聚合酶。然而，可理解的是其他的聚合酶也适用于本发明。该形式下，优选碱基插入反应在单个核苷酸类型的情况下进行并且每个核苷酸类型单独反应。因此，特定碱基的插入将指示修饰的DNA模板上互补碱基的同一性。
优选，修饰的DNA模板通过使用Uracil N DNA糖基化酶(UDG或UNG)而消化。由于该处理的DNA模板可能包含尿嘧啶，可通过用UDG处理除去模板。然而，可理解的是基本上不消化探针的任何其他酶切消化方法也适用于本发明。核酸模板除去的一个好处是任何随后的探针扩增将具有更低的本底并且允许更精确的扩增和随后的检测。此外核酸模板的除去降低了可能非特异性形成的人为产物的量。
检测探针和确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点甲基化状态的合适的方法包括但不限于，在第一和第二发夹之间错配碱基的掺入、探针的特异性扩增。现有许多可用的检测系统来检测所需样品的后生成的状态。检测系统包括但不限于：
I.合适标记的扩增的核酸杂交至微阵列类型的装置，其可选择10-＞60,000个单独组分。阵列可由位于任何合适的固体表面如玻璃、塑料、云母石、尼龙、珠子、磁珠、荧光珠或膜上的嵌入核酸(INA，参见WO03/051901)、PNA或核苷酸或修饰的核苷酸阵列组成。
II.Southern印迹类型的检测系统。
III.特异的或多个基因组扩增片段的实时定量PCR或任何变形如分子信标(molecular beacons)、scorpions等等。
IV.利用荧光珠、酶偶联物、放射性珠等等的检测系统。
V.任何其他的扩增体系如连接酶链式反应等等。
VI.等温核酸扩增技术如链置换扩增(SDA)、滚环扩增。
本发明之前，利用亚硫酸氢盐处理、两个′侧翼′发夹的特异性杂交，发夹间任选的碱基插入、两个发夹的连接、随后通过模板核酸的除去还没有实现基因组核酸中目的位点的检测。经处理的核酸用作第一和第二发夹比对的支架或模板，并且随后除去。相比之下，大多数现有技术的分析方法需要核酸模板的捕获和保留。
本发明的一个优点为所用方法不需要基因组核酸的扩增。
整个说明书中，除非上下文另外所需，单词″包括(comprise)″，或如″包括(comprises)″或″包括(comprising)″的变形理解为表示包含所述组成要素、整体或步骤或组成要素、整体或步骤组，而不排除任何其他的组成要素、整体或步骤或组成要素、整体或步骤组。
已包括在本发明说明书中的文献、条例、材料、装置、论文等等的任何论述仅仅是为了提供该本发明的背景。不认为任何或所有的这些内容构成现有技术基础的一部分，或者成为本发明相关领域中的公知常识，就如其在本发明改进之前就存在于澳大利亚一样。
为了更清楚地理解本发明，将参考以下附图和实例描述优选的形式。
附图说明
图1显示核酸外切酶III的浓度和连接酶的浓度对发夹特异性的影响(根据第六个方面)。
图2显示甲基化的、未甲基化的和50％甲基化的+50％未甲基化的DNA混合物的检测(根据第六个方面)。
图3显示聚合酶对发夹反应的影响(根据第六个方面)。
图4显示聚合酶/连接酶的浓度的影响(根据第六个方面)。
图5显示利用直接针对甲基化DNA序列的发夹引物的发夹反应的灵敏度(根据第三方面)。
图6显示基因组DNA上的发夹反应(已知在所查询的位点未甲基化)(根据第六个方面)。
图7显示发夹反应(根据第二方面)。
图8显示本发明第一方面的实例。
图9显示本发明第二方面的实例。
图10显示本发明第三方面的实例。
图11显示本发明第四方面的实例。
图12显示本发明第五个方面的实例。
图13显示本发明第六个方面的实例。
图14为本发明的亚硫酸氢盐发夹方法的图示。
图15显示连接依赖的反应。
图16显示阵列标记的检测系统。
实施本发明的方式
材料和方法
发夹
每个发夹可以是寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其选自DNA、RNA，锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、嵌入核酸(INA)、环己烷基核酸(CNA)和其混合物以及其杂化物，以及其磷原子修饰物，例如但不限于硫代磷酸酯、磷酸甲酯、亚氨基膦酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯。非天然存在的核苷酸包括但不限于，其中包含DNA、RNA、PNA、INA、HNA、MNA、ANA、LNA、CNA、CeNA、TNA、(2′-NH)-TNA、(3′-NH)-TNA、α-L-Ribo-LNA、α-L-Xylo-LNA、β-D-Xylo-LNA、α-D-Ribo-LNA、[3.2.1]-LNA、双环-DNA、6-氨基-双环-DNA、5-表-双环-DNA、α-双环-DNA、三环-DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺-DNA、β-D-吡喃核糖基-NA、α-L-吡喃来苏糖基-NA、2′-R-RNA、α-L-RNA或α-D-RNA、β-D-RNA的核苷酸。此外，不含磷的化合物可用于连接核苷酸例如但不限于，甲基亚胺甲基、甲乙酸盐(formacetate)、硫代甲乙酸盐(thioformacetate)和连接基团包括酰胺。尤其核酸和核酸类似物可包含一个或多个嵌入剂假核苷酸。
优选发夹为DNA寡核苷酸。
基因组核酸
基因组核酸可以为获自植物、动物、微生物例如细菌、真菌、酵母和病毒的DNA或RNA。优选核酸为DNA，更优选来自动物或人的基因组DNA，或动物或人细胞的感染物的核酸。
DNA的亚硫酸氢盐处理
以下陈述了有效的核酸亚硫酸氢盐处理的一个例证性方案。该方案基本上保留所有经处理的DNA。该方法此处也相当于Human GeneticSignature(HGS)的方法。可以理解的是样品或试剂的体积或量可以改变。
用于亚硫酸氢盐处理的优选方法可在此处引入作为参考的美国10/428310或PCT/AU2004/000549中查找。
向如果需要可用合适的限制性酶预-消化的2μg的DNA中加入2μl(1/10体积)的3M NaOH(50ml水中6g，新鲜配制)至终体积20μl。该步骤使双链DNA分子变性为单链形式，因为亚硫酸氢盐试剂优选与单链分子反应。混合物在37℃孵育15分钟。在室温上温度的孵育可用于提高变性效率。
孵育后，依次加入208μl的2M的偏偏亚硫酸氢钠(20ml水中7.6g以及416ml 10N的NaOH；BDH AnalaR#10356.4D；新鲜配制)和12μl的10mM醌醇(50ml水中0.055g，BDH AnaIR#103122E；新鲜配制)。醌醇为还原剂并且有助于还原试剂的氧化。也可使用其他的还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(氢醌)或其他合适的还原剂。样品用200μl矿物油覆盖。矿物油的覆盖阻止了试剂的蒸发和氧化，但不是必需的。样品随后在55℃过夜孵育。或者样品可在热循环仪中如下循环：孵育约4小时或如下过夜：步骤1，PCR仪中循环55℃/2小时；步骤2，95℃/2分钟。步骤1可在从约37℃至90℃的任何温度下进行并且可改变时间为从5分钟至8小时。步骤2可在从约70℃至约99℃的任何温度下进行并且可改变时间为从约1秒至60分钟，或更长。
偏亚硫酸氢钠处理后除去油，并且如果DNA浓度较低则加入1μ1tRNA(20mg/ml)或2μl的糖原。这些添加剂是任选的并且可用于在DNA以低浓度存在时提高通过用靶DNA共-沉淀而获得的DNA的产量。当核酸量＜0.5μg时通常需要用于更有效的核酸沉淀的添加剂作为载体的应用。
异丙醇提纯处理如下进行：800μl水加入样品，混合且随后加入1ml的异丙醇。水或缓冲液降低反应器中亚硫酸氢盐的浓度至该盐不会与目的靶核酸一起沉淀的水平。如此处公开的，稀释通常为约1/4至1/1000，只要盐浓度稀释至所需范围之下。
样品再次混合且置于4℃至少5分钟。样品在微量管中离心10-15分钟并且沉淀物用70％的ETOH洗涤2次，每次进行离心。该洗涤处理除去了与核酸一起沉淀的任何残留的盐。
干燥沉淀物且随后重悬于pH7.0-12.5的合适量如50μl的T/E(10mM Tris/0.1mM EDTA)中。pH10.5的缓冲液认为是特别有效的。由于需要悬浮核酸，样品在37℃至95℃孵育1分钟至96个小时。
聚合酶和连接酶的添加
聚合酶将添加正确的碱基即G(与甲基化的互补)或A(与未甲基化的互补)。
连接酶将随后连接G或A碱基并且形成环形。
亚硫酸氢盐处理的DNA随后用尿嘧啶N DNA糖基化酶裂解，其也使环形线性化。
线性DNA随后用一对通用引物扩增。
随后在微-阵列平台上利用存在于发夹引物中的独特的DNA序列(Zip密码)检测(由于Zip密码仅告知复合物在阵列上的空间去向而不杂交至亚硫酸氢盐处理的DNA的互补链，用传统的方法检测不到NB)。
NB引物1和3除了包含不同的Zip密码(蓝和黄条)以及引物1具有末端碱基G，其检测甲基化的存在，而引物3具有末端碱基A，其检测甲基化的缺乏，其序列是一致的。此使得产物在微-阵列上是空间分离的(参见图15)。此意味着在同样的反应器中可同时检测C或T的存在。因此，数以千计的不同基因组位点可在一个反应器中查询并且根据其唯一的Zip密码进行分离。
连接和扩增发夹后，其随后定位至通过每个亚硫酸氢盐发夹引物组内所含的内部Zip-密码而预先确定的微阵列设计上的特定位置(图16)。
结果
核酸外切酶III浓度和连接酶浓度对发夹特异性的影响
利用甲基化的DNA序列进行实验。图1显示连接酶酶浓度和核酸外切酶III浓度对发夹反应性能的影响。如图中可见的如果使用过量的核酸外切酶(10个单位)，该反应并不有效。反之如果使用过少的酶(2个单位)，则降低了反应的特异性而产生A、T和C泳道中出现的非特异性扩增(参见图1A)。如果一些泳道(用星号表示)为作为聚合酶两次拷贝该环形结果的靶条带的二聚物，就会见到上面的条带。
此外将连接酶浓度从每个反应5U提高至每个反应10U降低了该方法的特异性，而再次产生A、T和C泳道中非特异性的检测(1b)。黑体字表示最优的核酸外切酶的浓度。一纳克(ng)甲基化的寡核苷酸用作靶。10ng的每个发夹和0.1单位的Stoffel DNA聚合酶一起用于该反应中。Ampligase酶以5和10单位使用。箭头标明PCR产物的校正大小。
具体的，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液    1.0μl
发夹#1(10ng/μl)       1.0μl
发夹#2(10ng/μl)       1.0μl
Stoffel聚合酶          0.1μl
Ampligase              1.0μl或2μl
dG/dA/dT/dC(1mM)       1.0μl(dG/dA/dT/dC加至单独的管中)
水                     3.9μl或2.9μl
反应如下所述进行孵育：
20℃4分钟，95℃2分钟，50℃15分钟，55℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
核酸外切酶处理：
  10U ExoIII/2U Exol   5U ExoIII/2UExol   2U ExoIII/2UExol
  ExoIII   0.05μl   0.025μl   0.01μl
  Exo   0.1μl   0.1μl   0.1μl
  T/E   0.85   0.875   0.89
1μl的上述反应混合物加至合适的管中。样品随后在37℃孵育14分钟，接着95℃2分钟且最后37℃1分钟。
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液                   2.5μl(Promega)
水                                    19.0μl
通用P1                                1.0μl
通用P2                                1.0μl
dNTPs                                 1.2μl
Taq                                   0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(25个循环)。
甲基化的、未甲基化的以及50％甲基化+50％未甲基化DNA混合物的检测
如从图2可见的，该系统可容易地区分甲基化和未甲基化的序列并且还可检测混合群体的存在。
1ng的甲基化寡核苷酸、未甲基化的寡核苷酸或甲基化和未甲基化寡核苷酸50％/50％的混合物用作靶。10ng的每个发夹和1单位的Stoffel DNA聚合酶一起用于反应中。Ampligase酶以5单位使用。箭头标明PCR产物的校正大小。
具体的，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液    1.0μl
发夹#1(10ng/μl)       1.0μl
发夹#2(10ng/μl)       1.0μl
Stoffel聚合酶          0.1μl(1个单位)
Ampligase              1.0μl
dG/dA/dT/dC(1mM)1.0μl(dG/dA/dT/dC加至单独的管中)
水                     3.9μl
反应如下条件进行孵育：
20℃4分钟，95℃2分钟，50℃15分钟，55℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
核酸外切酶处理：
  5U的ExoIII/2U Exol
  ExoIII*   0.025μl
  Exol   0.1μl
  T/E   0.875
将1μl的上述反应混合物加至合适的管中。样品随后在37℃孵育14分钟，接着95℃2分钟且最后37℃1分钟
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液        2.5μl(Promega)
水                   19.0μl
通用P1               1.0μl
通用P2               1.0μl
dNTPs                1.2μl
Taq                  0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(25个循环)。
聚合酶对发夹反应的作用
利用甲基化DNA序列进行实验。
图3显示了不同聚合酶对反应性能的影响。应当注意当靶浓度进一步提高时所有试验的聚合酶产生阳性信号。然而，不经进一步优化则不是所有的酶都能在低DNA浓度时使用。
结果表明产生最大灵敏度的酶为Klenow DNA聚合酶和Taq聚合酶。这两个酶随后用于进一步的试验中。
1ng的每个发夹和1个单位的DNA聚合酶一起用于反应中。箭头标明PCR产物的校正大小。
具体的，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液          1.0μl
发夹#1(1ng/μl)              1.0μl
发夹#2(1ng/μl)              1.0μl
聚合酶                       1U
Ampligase                    5U
dG/dA/dT(1mM)                1.0μl(dG/dA/dT加至单独的管中)
水                           3.9μl
模板DNA以上述合适的浓度加入。
反应如下孵育：
20℃4分钟，95℃2分钟，50℃15分钟，55℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
核酸外切酶处理：
                             5U的ExoIII/2U ExoI
ExoIII                       0.025μl
Exol                         0.1μl
T/E                          0.875
将1μl的上述反应混合物加至合适的管中。样品随后在37℃孵育14分钟，接着95℃2分钟且最后37℃1分钟
将0.5μl的尿嘧啶DNA糖基化酶加至每个反应管中并且在如下条件下进行孵育：50℃15分钟，95℃5分钟，50℃1分钟。
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液               2.5μl(Promega)
水                          19.0μl
通用P1                      1.0μl
通用P2                      1.0μl
dNTP                                    1.2μl
Taq                                     0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(25个循环)。
聚合酶/连接酶浓度的影响
利用甲基化的DNA进行实验。
图4显示这两种酶的高浓度都可产生假阳性信号，如用5个单位的连接酶和聚合酶所见的G和T泳道中均存在的条带。而使用2个单位连接酶和1个单位聚合酶时校正的G泳道中仅存在一个条带。因此精细的酶组合滴定是产生最灵敏和特异的酶组合所必需的。可以看出，2U的连接酶和1U的Klenow产生最稳定和可靠的扩增，即使在低DNA浓度时。
1ng的每个发夹和上述所用的Ampligase和聚合酶一起用于反应中。箭头表示PCR产物的校正大小。
具体地，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液       1.0μl
发夹#1(1ng/μl)           1.0μl
发夹#2(1ng/μl)           1.0μl
Klenow                    如上所述
Ampligase                 如上所述
dG/dT(1mM)                1.0μl(将dG/dT加至单独的管中)
水                        3.9μl
将模板DNA以上述合适的浓度加入。
反应如下条件进行孵育：
20℃4分钟，95℃2分钟，50℃15分钟，55℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
核酸外切酶处理：
                                   5U ExoIII/2U ExoI
ExoIII                             0.025μl
Exol                               0.1μl
T/E                                0.875
将1μl的上述反应混合物加至合适的管中。样品随后在37℃孵育14分钟，接着95℃2分钟且最后37℃1分钟
将0.5μl的尿嘧啶DNA糖基化酶加至每个反应管中并且在如下条件下孵育样品：50℃15分钟，95℃5分钟，50℃1分钟。
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液                      2.5μl(Promega)
水                                 19.0μl
通用P1                             1.0μl
通用P2                             1.0μl
dNTPs                              1.2μl
Taq                                0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(25个循环)。
使用针对甲基化DNA序列的发夹引物检测发夹反应的灵敏度
如图5中可见，该分析在所有试验的DNA浓度都具有很高的特异性和灵敏性。
在反应中使用1ng的每种发夹，连同以2.5和1个单位使用的Ampligase。箭头标明PCR产物的校正大小。
具体的，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液        1.0μl
发夹#1(1ng/μl)     1.0μl
发夹#2(1ng/μl)     1.0μl
发夹#3(1ng/μl)     1.0μl
Ampligase           0.5或0.2μl
水                  4.5或4.8μl
将1μl模板DNA以上述合适的浓度加入。
以如下所述条件孵育反应：
20℃4分钟，95℃2分钟，50℃15分钟，55℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
核酸外切酶处理：
                    5U ExoIII/2U Exol
ExoIII              0.025μl
Exol                0.1μl
T/E                 0.875
将1μl的上述反应混合物加至合适的管中。样品随后在37℃孵育14分钟，接着95℃2分钟且最后37℃1分钟
将0.5μl的尿嘧啶DNA糖基化酶加至每个反应管并且将样品在如下条件下孵育：50℃15分钟，95℃5分钟，50℃1分钟。
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液         2.5μl(Promega)
水                   19.0μl
通用P1               1.0μl
通用P2               1.0μl
dNTPs                1.2μl
Taq                  0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(25个循环)。
对基因组DNA的发夹反应(已知在所查询的位点未甲基化)
将10pg或1pg的每种发夹和以2.5和1个单位使用的Ampligase酶一起用于反应种。箭头标明PCR产物的校正大小(图6)。
具体的，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液       1.0μl
发夹#1                    1.0μl
发夹#2                    1.0μl
Ampligase                 0.5μl
聚合酶                    0.1μl
dG/dA/dT/dC(1mM)  1.0μl(将dG/dA/dT/dC加至分开的管中)
水                        4.4μl
加入1μl的亚硫酸氢盐模板DNA。
在如下条件下进行孵育反应：
20℃4分钟，95℃2分钟，50℃15分钟，55℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
核酸外切酶处理：
                          5U ExoIII/2U ExoI
ExoIII                    0.025μl
Exol                      0.1μl
T/E                       0.875
1μl的上述反应混合物加至合适的管。样品随后在37℃孵育14分钟，接着95℃2分钟且最后37℃1分钟
将0.5μl尿嘧啶DNA糖基化酶加至每个反应管并且在如下条件下孵育样品：50℃15分钟，95℃5分钟，50℃1分钟。
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液                   2.5μl(Promega)
水                              19.0μl
通用P1                          1.0μl
通用P2                          1.0μl
dNTPs                           1.2μl
Taq                             0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(40个循环)。
发夹反应-非环形的
图7显示了利用两个发夹的2个单臂的连接酶填充反应结果。
将5pg包含尿嘧啶的寡核苷酸(未甲基化的)用作靶。将1fmol的每种寡″臂″和0.05单位的Taq聚合酶一起用于反应中。Ampligase酶从1个单位稀释至0.03个单位。箭头标明PCR产物的校正大小。
具体的，将下列成分加至0.5μl的薄壁PCR管中：
10×Ampligase缓冲液       0.9μl
寡聚靶(5pg/μl)           1.0μl
发夹#1(1fmol/μl)         1.0μl
发夹#2(1fmol/μl)         1.0μl
Taq聚合酶                 0.1μl(稀释在Ampligase缓冲液中的0.5U/μl的原液)
dA/dC/dG/(1mM)            1.0μl(dA/dC/dG加至分开的管)
水                        4.0μl
在如下条件下孵育反应：
20℃4分钟，95℃5分钟，60℃25分钟，65℃5分钟(伴随0.05℃/秒的递增时间)，50℃1分钟。
此时加入1μlUDG以降解模板。
50℃15分钟，95℃5分钟，50℃1分钟。
用通用引物通过添加下列成分进行PCR：
10×PCR缓冲液       2.5μl(Promega)
水                  19.0μl
通用P1              1.0μl
通用P2              1.0μl
dNTPs               1.2μl
Taq                 0.3μl
95℃30s，48℃45s，72℃45s(28个循环)。
第一方面的实例
图8显示根据本发明第一方面的方法。实例#1和2#中，两个邻近的发夹序列随后利用DNA连接酶连接在一起。
第二方面的实例
图9显示根据本发明第二方面的方法。实例#3中，聚合酶将正确的碱基(G)带至该位点且随后连接酶将该碱基连接入DNA序列中以形成线性探针。实例#4中，聚合酶将正确的碱基(A)带至该位点且随后连接酶将该碱基连接入DNA序列以形成线性探针。
第三方面的实例
实例#5中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的三个发夹序列(图10)。发夹的一个臂此刻形成半-环形的探针，而其他两个发夹杂交至邻近于该半-环形探针的DNA的顶部或底部链。连接酶连接该碱基进入DNA序列中以形成完全线性化的探针。
实例#6中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的三个发夹序列(图10)。发夹的一个臂此刻形成半-环形的探针，而其他两个发夹杂交至邻近于该半-环形探针的DNA的顶部或底部链。连接酶连接该碱基进入DNA序列以形成完全线性化的探针。
第四方面的实例
实例#7中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的三个发夹序列(图11)。发夹的一个臂此刻形成半-环形的探针，而其他两个发夹杂交至邻近于该半-环形探针的DNA的顶部或底部链。聚合酶将正确的碱基(G)带至该位点且随后连接酶将该碱基连接入DNA序列中以形成完全线性化的探针。
实例#8中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的三个发夹序列(图11)。发夹的一个臂此刻形成半-环形的探针，而其他两个发夹杂交至邻近于该半-环形探针的DNA的顶部或底部链。聚合酶将正确的碱基(A)带至该位点且随后连接酶将该碱基连接入DNA序列中以形成完全线性化的探针。
第五个方面的实例
实例#9中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的两个发夹序列。发夹的每个臂此刻形成半-环形的探针(图12)。连接酶连接碱基进入DNA序列中以形成完全环形的探针。
实例#10中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的两个发夹序列。发夹探针的每个臂此刻形成半-环形(图12)。连接酶连接碱基进入DNA序列中以形成完全环形的探针。
第六个方面的实例
实例#11中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA上的两个发夹序列。发夹的每个臂此刻形成半-环形的探针(图13)。聚合酶将正确的碱基(G)带至该位点且随后连接酶连接该两个半-环形的探针以形成完全环形的探针。
实例#12中，需要发生四个独立杂交事件以产生正确位于亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的两个发夹序列(图13)。发夹的每个臂此刻形成半-环形的探针。聚合酶将正确的碱基(A)带至该位点且随后连接酶连接该两个半-环形的探针以形成完全环形的探针。
图14显示了用尿嘧啶切割位点形成环形探针的发夹反应的图解实例。
阵列标记检测系统
亚硫酸氢盐发夹是用于基因组甲基化胞嘧啶碱基全面检测的新方法。不同于所有之前用于甲基化胞嘧啶检测的方法，该发夹方法不依赖于亚硫酸氢盐处理的核酸的扩增。该方法在可利用连接反应以检测CpG双联体内甲基化胞嘧啶存在或缺乏这点上是独特的(参见图15和16)。此意味着可对整个基因组分析单个的CpG位点。
连接和扩增发夹后，其能定位至通过每个亚硫酸氢盐发夹引物组内包含的内部Zip密码而预先设计的微阵列装置上的特定位置(图16)。图16显示了这种检测系统的一个实例。
该方法优于常规微阵列分析的一个主要优点为可以精确的方式控制杂交条件。Zip密码引物可经修整而使其均具有同样的解链温度并且具有类似的序列组成。这意味着每个探针的杂交动力学将非常类似，而在常规微阵列中杂交取决于基因组核酸的DNA序列并且不能以同样方式控制。
概要
相比现有技术本发明的亚硫酸氢盐发夹方法对基因组甲基化的全面检测具有许多独特的优点。一个主要优点为反应过程中产生的精确的特异性。常规的亚硫酸氢盐分析(Clark等.，1994)依赖于两轮嵌套式PCR以在亚硫酸氢盐转化的基因组中产生所需的特异性。此归因于亚硫酸氢盐处理后由于所有未甲基化的胞嘧啶已转变为U而使基因组基本上仅由三种碱基即A、G和T组成的事实。随后设计用于一条亚硫酸氢盐处理的DNA链的四个嵌套引物，且进行两轮PCR以得到所需的特异性和灵敏度。亚硫酸氢盐处理后，DNA的两条链不再互补。转化后两条链的靶向只能注明未经使用。本发明的亚硫酸氢盐发夹方法可靶向经修饰或转化的DNA的两条链(参见图1)，因此在反应进行前需要发生四个独立的杂交反应。此实际上产生了单轮的嵌套式PCR特异性，其降低PCR污染的可能性并且大大简化了过程。此外，非特异性的扩增尤其在靶DNA量较低时常常出现。此归因于PCR扩增反应的特性。然而，亚硫酸氢盐发夹方法通过双特异性系统的利用而克服了这一点。特异性的第一层通过聚合酶添加入正确的碱基而产生。即使聚合酶产生误差，第二轮的保真度通过连接酶的利用而实现，其意味着任何不正确的碱基将不会被正确连接并且反应将停止。
亚硫酸氢盐发夹方法的另一个特征为尿嘧啶位点掺入一个引物的一个臂。因此，当正确的杂交和连接出现时形成环。反应混合物随后可用尿嘧啶N糖基化酶(UNG)处理。该酶将裂解所有包含尿嘧啶的亚硫酸氢盐处理的DNA并且同时线性化该环。因此，此时随后扩增发生在靶分子纯的群体中大大提高了反应效率，不同于发生在大量非靶基因组DNA中的常规PCR。或者，独特的限制性酶切位点可加至一个发夹引物以使UNG消化后，该环仍然未经消化而亚硫酸氢盐处理的基因组DNA已被降解。该环状DNA随后可通过等温的滚环扩增(RCA)复制(Lizardi等.Mutation detection and single-molecule counting usingisothermal rolling-circle amplification.1998 Nat.Genetics(19)；225-232)。
此外，亚硫酸氢盐发夹方法允许相同的反应管中大量探针的倍增。因此，可同时在一个反应管中检查大量的基因组区域。此归因于发夹可包含通用PCR引物位点的事实，因此不同于需要设计针对每个目的位点的单独引物组的多重PCR，其仅需要两个引物来扩增目标环化的分子。
另外，该方法还消除了亚硫酸氢盐反应中常见的PCR偏差的问题。此为亚硫酸氢盐发夹并不依赖于跨越两个引物位点的基因组区域扩增的事实的结果。已表明亚硫酸氢盐处理的DNA某些序列的扩增可能导致低估实际的甲基化状态(Warneke等)。该现象为相比未甲基化的链，甲基化DNA链的不同序列组成引起未甲基化的链优于甲基化的链优先复制的结果。由于发夹仅依靠杂交反应，将不会出现PCR偏差。
另外，亚硫酸氢盐处理的DNA中甲基化变化通过微阵列的检测依赖于两个独特的引物位点之间包含的所扩增DNA区域的序列特异性杂交。如之前所述，甲基化DNA序列的序列组成与未甲基化的序列非常不同。其产生未甲基化序列的杂交动力学与甲基化序列大大不同的结果。因此，实际上很难确定有助于未甲基化序列和甲基化序列同时与相同阵列结合的杂交条件。亚硫酸氢盐发夹方法可通过将Zip密码序列任选掺入随后引导该序列至阵列上给定位置的引物而克服该问题。该Zip密码序列并不设计成与亚硫酸氢盐处理的DNA的片段一致，而是人基因组中不存在的随机确定的DNA序列。该Zip密码序列可以是″改组的″以致每个Zip密码具有相同的解链温度和序列组成。因此，亚硫酸氢盐发夹中的杂交条件可进行修整以使每个探针的杂交动力学相一致。由此最终的读数将是样品甲基化状态的真实反映。
本领域技术人员明白，可在不背离概括描述的本发明精神和范围下对具体的实施方案中所示的本发明进行诸多改变和/或改进。因此，现有的实施方案无论怎样都认为是用于例证性的而非限制性的。

Claims (41)

1.用于确定基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
在形成包含潜在甲基化位点的修饰的核酸模板的条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
提供包含第一捕获序列的第一发夹，所述第一捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
提供包含第二捕获序列的第二发夹，所述第二捕获序列与修饰的核酸模板中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
允许第一发夹和第二发夹杂交至修饰的核酸模板；
连接杂交的第一和第二发夹以形成跨越修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的探针；
消化修饰的核酸模板以获得探针；以及
检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的处理步骤形成包括含有潜在甲基化位点的核酸的两条互补链的修饰的核酸模板；并且
第一发夹包含第一捕获序列和第二捕获序列，第一捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，而第二捕获序列与修饰的核酸模板的第二条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中第一发夹和第二发夹杂交至修饰的核酸模板使得在潜在的甲基化位点没有互补碱基并且在连接发夹形成跨越修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的探针之前将至少一个碱基插入第一发夹和第二发夹之间。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中潜在的甲基化位点为5′侧翼为鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中的修饰试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐和柠檬酸盐。
6.根据权利要求5所述的方法，其中的修饰试剂为亚硫酸氢钠。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的至少一个包含允许连接步骤后探针扩增的通用引物。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的至少一个包含允许探针捕获的捕获位点。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的至少一个包含可裂解的位点。
10.根据权利要求9所述的方法，其中可裂解的位点为核酸酶限制位点。
11.根据权利要求10所述的方法，其中可裂解的位点为尿嘧啶碱基。
12.根据权利要求1、2和4至11任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的互补序列跨越潜在的甲基化位点。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中发夹利用能连接单链核酸的合适的酶连接。
14.根据权利要求1、2和4至13任一项所述的方法，其中发夹连接于第一和第二捕获序列或其附近。
15.根据权利要求3至13任一项所述的方法，其中一个或多个碱基利用核酸聚合酶插入发夹之间。
16.根据权利要求15所述的方法，其中碱基插入反应在单核苷酸类型存在时进行并且每个单核苷酸类型分别反应使得特定碱基的插入指示修饰的核酸模板上互补碱基的同一性。
17.根据权利要求1至16任一项所述的方法，其中修饰的核酸模板通过酶消化。
18.根据权利要求17所述的方法，其中酶为Uracil N DNA糖基化酶。
19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中用检测系统检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态，所述检测系统可识别第一和第二发夹之间错误碱基的掺入或者检测探针的特异性扩增。
20.根据权利要求19所述的方法，其中的检测系统选自通过阵列杂交、Southern印迹类型检测、实时PCR定量、荧光珠、酶偶联物、放射性珠、连接酶链式反应和包括链置换扩增或滚环扩增的等温DNA扩增技术。
21.根据权利要求1至20任一项所述的方法，其中的基因组核酸为DNA。
22.用于确定基因组核酸上潜在甲基化位点的甲基化状态的方法，包括：
在形成包括含有潜在甲基化位点的核酸两条互补链的修饰的核酸模板条件下，用修饰胞嘧啶碱基但不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理基因组核酸；
提供包含第一捕获序列和第二捕获序列的第一发夹，第一捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补，而第二捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点一侧的侧翼区域互补；
提供包含第三捕获序列和第四捕获序列的第二发夹，第三捕获序列与修饰的核酸模板第一条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补，而第四捕获序列与修饰的核酸模板第二条链中潜在甲基化位点另一侧的侧翼区域互补；
允许第一和第二发夹杂交至修饰的核酸模板的两条互补链；
连接杂交的发夹以形成跨越修饰的核酸模板的互补链中潜在甲基化位点的环状探针；
消化修饰的核酸模板以获得环状探针；以及
检测该环状探针并确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态。
23.根据权利要求22所述的方法，其中第一发夹和第二发夹杂交至修饰的核酸模板的两条互补链使得在修饰的核酸模板至少一条互补链的潜在甲基化位点没有互补碱基，并且将至少一个碱基在连接发夹形成跨越修饰的核酸模板中潜在甲基化位点的探针之前插入第一发夹和第二发夹之间。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中潜在的甲基化位点为5′侧翼为鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)。
25.根据权利要求22至24任一项所述的方法，其中的修饰试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐和柠檬酸盐。
26.根据权利要求24所述的方法，其中的修饰试剂为亚硫酸氢钠。
27.根据权利要求22至26任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的至少一个包含允许连接步骤后探针扩增的通用引物。
28.根据权利要求22至27任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的至少一个包含允许探针捕获的捕获位点。
29.根据权利要求22至28任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的至少一个包含可裂解的位点。
30.根据权利要求29所述的方法，其中可裂解的位点为核酸酶限制位点。
31.根据权利要求29所述的方法，其中可裂解的位点为尿嘧啶碱基。
32.根据权利要求22和24至31任一项所述的方法，其中第一或第二发夹的互补序列跨越潜在的甲基化位点。
33.根据权利要求22至32任一项所述的方法，其中发夹利用能连接单链核酸的合适酶进行连接。
34.根据权利要求22和24至33任一项所述的方法，其中发夹连接于第一和第二捕获序列或其附近。
35.根据权利要求23至33任一项所述的方法，其中一个或多个碱基利用DNA聚合酶插入发夹之间。
36.根据权利要求35所述的方法，其中碱基插入反应在单核苷酸类型存在时进行并且每个单核苷酸类型分别反应使得特定碱基的插入指示修饰的核酸模板上互补碱基的同一性。
37.根据权利要求22至36任一项所述的方法，其中修饰的核酸模板通过酶消化。
38.根据权利要求37所述的方法，其中的酶为Uracil N DNA糖基化酶。
39.根据权利要求22至38任一项所述的方法，其中用检测系统检测探针并且确定修饰的基因组核酸中潜在甲基化位点的甲基化状态，所述检测系统可识别第一和第二发夹之间错误碱基的掺入或者检测探针的特异性扩增。
40.根据权利要求39所述的方法，其中的检测系统选自通过阵列杂交、Southern印迹类型检测、实时PCR定量、荧光珠、酶偶联物、放射性珠、连接酶链式反应和包括链置换扩增或滚环扩增的等温DNA扩增技术。
41.根据权利要求22至40任一项所述的方法，其中的基因组核酸为DNA。
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