JP4714148B2

JP4714148B2 - 核酸検出アッセイ

Info

Publication number: JP4714148B2
Application number: JP2006525009A
Authority: JP
Inventors: ミラー，ダグラス，スペンサー; メルキ，ジョン，ロバート; ミクロス，ジョージ，エル．ガボール
Original assignee: ヒューマンジェネティックシグネチャーズピーティーワイリミテッド
Priority date: 2003-09-04
Filing date: 2004-09-03
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2024-09-03
Also published as: EP1668148A1; EP1668148B1; JP2007503819A; CA2537810A1; US7846693B2; CN1863927B; US20070178459A1; CA2537810C; DE602004018801D1; EP1668148A4; WO2005024053A1; CN1863927A; ATE419394T1

Description

【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、核酸検出アッセイおよび特に重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）クランプを用いた改善されたオリゴヌクレオチドアッセイに関する。本発明は、これらのアッセイを用いて、核酸内に５−メチルシトシン塩基を含む特異的な塩基配列を識別するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
現在、特異的な核酸分子の検出において多数の手順を利用可能である。これらの手順は、典型的には長さが短いオリゴヌクレオチド（２０塩基以下）から数キロ塩基（ｋｂ）の配列に及ぶことがある標的核酸と核酸プローブの間の配列依存性ハイブリダイゼーションに依存する。
【０００３】
核酸配列の集団内から特異的な配列を増幅するために最も広く用いられている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ディーフェンバッハＣ（ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈＣ）およびウェクスラーＧ（ＤｖｅｋｓｌｅｒＧ）編「ＰＣＲｐｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．」ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、プレインビュー、ニューヨーク州、ＮＹ）の方法である。この増幅方法では、一般に増幅されるべき領域のそれぞれの末端における相補鎖上の、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドを用いることによって、変性した一本鎖ＤＮＡ上でＤＮＡ合成がプライミングされる。変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鎖合成の連続サイクルは、プライマー間の配列を指数関数的に増幅することを可能にする。ＲＮＡ配列は、まず逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ複製物を生成することにより、増幅できる。増幅されたＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション、それに続く同定を可能にするタグ付きプライマーの使用（例えば、酵素連結アッセイを介する）、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション時にシグナルを生成する蛍光タグ付きプライマーの使用（例えば、ＢｅａｃｏｎおよびＴａｑＭａｎシステム）を含む種々の手段によって検出することができる。
【０００４】
ＰＣＲと同様、特異的配列の検出および増幅についても種々の技術が開発されている。その一例はリガーゼ連鎖反応である（バラニーＦ（ＢａｒａｎｙＦ）「ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｃｌｏｎｅｄｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｌｉｇａｓｅ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９−１９３頁（１９９１年））。
【０００５】
直接検出において、標的核酸は、最も一般的にはゲル電気泳動によって大きさに基づいて分離され、標的配列に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーションに先立って、固体支持体に移される（サザンおよびノーザンブロッティング）。プローブは、天然核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくは固定化核酸（ＬＮＡ）などの類似体であってもよい。プローブは（例えば^３２ｐで）直接標識してもよく間接的な検出手順を用いてもよい。間接的な手順は通常、ビオチンもしくはジゴキシゲニンなどの「タグ」のプローブ中への組込みに依存し、次いで酵素基質変換もしくは化学発光などの手段を介してプローブが検出される。
【０００６】
広く用いられている核酸の直接検出のためのもう一つの方法は「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションである。この方法では、捕捉プローブが固体支持体とカップリングされ、溶液中で標的核酸がその固定されたプローブとハイブリダイズする。結合しない標的核酸は洗い流され、標的配列にハイブリダイズする二次プローブを用いて結合核酸が検出される。上記概説のように、検出には直接的方法または間接的方法を用いることができる。「分岐ＤＮＡ」シグナル検出系は、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理を用いる一例である（ウルデアＭＳ（ＵｒｄｅａＭＳ）ら、「ＢｒａｎｃｈｅｄＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｕｌｔｉｍｅｒｓｆｏｒｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅ、ｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓｅｓ．」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐＳｅｒ．１９９１年；（２４）：１９７−２００頁）。
【０００７】
核酸配列の直接検出において核酸ハイブリダイゼーションを用いる急速な成長分野は、ＤＮＡマイクロアレイの分野である（ヤングＲＡ（ＹｏｕｎｇＲＡ）「ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｄｉｓｃｏｖｅｒｙｗｉｔｈＤＮＡａｒｒａｙｓ．」Ｃｅｌｌ１０２：９−１５頁（２０００年）；ワトソンＡ（ＷａｔｓｏｎＡ）「Ｎｅｗｔｏｏｌｓ．Ａｎｅｗｂｒｅｅｄｏｆｈｉｇｈｔｅｃｈｄｅｔｅｃｔｉｖｅｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：８５０−８５４頁（２０００年））。この方法では、オリゴヌクレオチドからｃＤＮＡクローンなどのより長い配列へと多岐にわたる個々の核酸種が固体支持体に格子パターン状に固定される。次いで、タグ付きの核酸または標識された核酸の集団がアレイとハイブリダイズし、アレイ内の各スポットとのハイブリダイゼーションレベルが定量される。最も一般的には、放射性標識または蛍光標識された核酸（例えばｃＤＮＡ）がハイブリダイゼーション用に用いられたが、他の検出系も利用された。
【０００８】
ゲノムタイピング分析におけるマイクロアレイの使用に付随する１つの問題は、個々の部位を分析する前に、通常何らかの方法で予備増幅しなければならないことである。ほとんどの方法は標的配列のＰＣＲ増幅に依存する。しかしながら、反応混合物中のプライマーセットの数がｎ個の標的配列に対するものである場合、プローブにおける任意の２ｎ^２＋ｎ通りの起こり得る対結合によって非特異的な増幅産物が生成される場合がある（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）およびニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）「Ｌｏｃｋｅｄｏｎｔａｒｇｅｔ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｆｕｔｕｒｅｇｅｎｅｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．」Ａｎｎ．Ｍｅｄ．１９９７年；（２９）：５８５−５９０頁）。この技術に対応するために、パッドロックプローブが開発されている。これらのプローブによれば、非特異的な反応によって線状分子が生成される一方で、特異的なハイブリダイゼーション事象により、エキソヌクレアーゼの使用を介して線状分子と区別できる二量体分子が生成される（ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）ら、「ＰａｄｌｏｃｋＰｒｏｂｅｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒｌｏｃａｌＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．」１９９４年；Ｓｃｉｅｎｃｅ９２６５０；２０８５−２０８８頁）。しかしながら、ゲノム変異の特異的検出では、典型的には個々の多型部位の検出のために４本のプローブが用いられ、全ゲノム走査においては極めて多数のプローブが生成されることになる。
【０００９】
もう一つの最近の技術である分子反転プローブ（ＭＩＰ）は、単一チューブ内で高レベルの多重化を実現することが実証されている。１０００本以上のプローブが単一チューブ内で多重化できることが報告されている（ハーデンボル（Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ）ら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：６７３−６７８頁）。しかしながら、パッドロックプローブとＭＩＰの方法の両方は、ほとんどの販売業者が入手できないほど非常に長い１１０ｂｐを超えるオリゴヌクレオチドの合成を必要とする。
【００１０】
現在、前立腺癌におけるＧＳＴＰ１遺伝子プロモーター中に認められるようなＤＮＡにおけるメチル化変化を検出するための選択方法は、ＤＮＡの重亜硫酸塩修飾後における該配列のＰＣＲ増幅に依存する。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡでは、メチル化シトシンが反応を示さずにシトシンとして残存する一方でシトシンはウラシルに変換される（それ故にＰＣＲ中にチミンとして増幅される）（フロマーＭ（ＦｒｏｍｍｅｒＭ）、マクドナルドＬＥ（ＭｃＤｏｎａｌｄＬＥ）、ミラーＤＳ（ＭｉｌｌａｒＤＳ）、コリスＣＭ（ＣｏｌｌｉｓＣＭ）、ワットＦ（ＷａｔｔＦ）、グリッグＧＷ（ＧｒｉｇｇＧＷ）、モリーＰＬ（ＭｏｌｌｏｙＰＬ）およびポールＣＬ（ＰａｕｌＣＬ）「Ａｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｒｏｔｏｃｏｌｗｈｉｃｈｙｉｅｌｄｓａｐｏｓｉｔｉｖｅｄｉｓｐｌａｙｏｆ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＤＮＡｓｔｒａｎｄｓ．」ＰＮＡＳ８９：１８２７−１８３１頁（１９９２年）；クラークＳＪ（ＣｌａｒｋＳＪ）、ハリソンＪ（ＨａｒｒｉｓｏｎＪ）、ポールＣＬ（ＰａｕｌＣＬ）およびフロマーＭ（ＦｒｏｍｍｅｒＭ）「Ｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｍａｐｐｉｎｇｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅｓ．」ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：２９９０−２９９７頁（１９９４年））。したがって、重亜硫酸塩処理後、５−メチルシトシン塩基を含むＤＮＡは、対応する非メチル化ＤＮＡとは配列において異なることになる。対象ゲノム領域を非選択的に増幅するようにプライマーを選択することによりそのメチル化状態を判定するか、またはメチル化された特定のシトシンを含む配列を選択的に増幅するようにプライマーが設計される場合がある（ハーマンＪＧ（ＨｅｒｍａｎＪＧ）、グラフＪＲ（ＧｒａｆｆＪＲ）、ミョハネンＳ（ＭｙｏｈａｎｅｎＳ）、ネルキンＢＤ（ＮｅｌｋｉｎＢＤ）およびバイリンＳＢ（ＢａｙｌｉｎＳＢ）「Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ：ａｎｏｖｅｌＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＣｐＧｉｓｌａｎｄｓ．」ＰＮＡＳ９３：９８２１−９８２６頁（１９９６年））。
【００１１】
シトシンメチル化を検出するための代替方法として、部位特異的なＤＮＡメチル化により切断を遮断する制限酵素による消化や、それに続く対象領域に対するサザンブロッティングやハイブリダイゼーションプロービングが挙げられる。このアプローチは、有意な割合（一般に＞１０％）でＤＮＡが同部位でメチル化され、かつＤＮＡが約１〜５μｇで十分に存在することで検出が可能になる場合の環境に限られる。部位特異的なＤＮＡメチル化によって切断が遮断されるという制限酵素による消化の後に、制限酵素部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲ増幅が行われる。この方法は、ＤＮＡ量の利用を低減できるが、ＤＮＡメチル化以外の理由で完全酵素消化において何らかの不足が生じると偽陽性シグナルを招く可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、今回、感度のよい特異的なメチル化核酸の検出を行うためにオリゴヌクレオチドクランプを利用する方法を開発しており、当該方法は、非標的配列の非特異的増幅に関連する問題を大幅に低減し、個々の反応チューブ内で実施できる多重化レベルを上昇させるものである。これは、同技術を、メチル化パターンの全ゲノム分析にとって最適でロボット操作にも適用可能なものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の開示
第１態様では、本発明は、
（ａ）メチル化候補部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ）を含む修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
（ｂ）該修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列を含む第１クランプを提供する工程と；
（ｃ）該修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列を含む第２クランプを提供する工程と；
（ｄ）該第１クランプおよび該第２クランプが修飾核酸鋳型にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
（ｅ）該修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位をまたぐプローブを形成するためにハイブリダイズした第１クランプおよび第２クランプをライゲートする工程と；
（ｆ）該修飾核酸鋳型を消化する工程と；
（ｇ）該プローブを検出し、該修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程とを含む、ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法を提供する。
【００１４】
第２態様では、本発明は、
（ａ）修飾核酸鋳型を形成する条件下でシトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
（ｂ）該修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列を含む第１クランプを提供する工程と；
（ｃ）該修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列を含む第２クランプを提供する工程と；
（ｄ）該メチル化候補部位に相補的塩基が全く存在しないように該第１クランプおよび該第２クランプが該修飾核酸鋳型とハイブリダイズすることを可能にする工程と；
（ｅ）該第１クランプと該第２クランプの間に１つもしくは複数の塩基をもたらす工程と；
（ｆ）該修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位をまたぐプローブを形成するために該ハイブリダイズされたクランプをライゲートする工程と；
（ｇ）該修飾核酸鋳型を消化する工程と；
（ｈ）該プローブを検出し、該修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程とを含む、ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法を提供する。
【００１５】
第３態様では、本発明は
（ａ）メチル化候補部位を含むゲノム核酸の２本の相補鎖から修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
（ｂ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列と、該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列と、を含む第１クランプを提供する工程と；
（ｃ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第３捕捉配列を含む第２クランプを提供する工程と；
（ｄ）該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第４捕捉配列を含む第３クランプを提供する工程と；
（ｅ）該第１、第２および第３クランプが該修飾核酸鋳型にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
（ｆ）該ハイブリダイズされたクランプをライゲートすることで該修飾核酸鋳型の２本の鎖におけるメチル化候補部位をまたぐプローブを形成する工程と；
（ｇ）該修飾核酸鋳型を消化する工程と；
（ｈ）該プローブを検出して該修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程とを含む、ゲノム核酸上のメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法を提供する。
【００１６】
第４態様では、本発明は、
（ａ）メチル化候補部位を含む２本の核酸の相補鎖を含む修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
（ｂ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列と、該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列と、を含む第１クランプを提供する工程と；
（ｃ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第３捕捉配列を含む第２クランプを提供する工程と；
（ｄ）該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第４捕捉配列を含む第３クランプを提供する工程と；
（ｅ）該修飾核酸鋳型の少なくとも１本の相補鎖のメチル化候補部位に相補的塩基が全く存在しないように該第１、第２および第３クランプが該修飾核酸鋳型にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
（ｆ）該第１クランプと該第２クランプの間に少なくとも１つの塩基をもたらす工程と；
（ｇ）該ハイブリダイズされたクランプをライゲートすることで該修飾核酸鋳型の２本の鎖におけるメチル化候補部位をまたぐ線状プローブを形成する工程と；
（ｈ）該修飾核酸鋳型を消化する工程と；
（ｉ）該線状プローブを検出して該修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程とを含む、ゲノム核酸上のメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法を提供する。
【００１７】
第５態様では、本発明は、
（ａ）メチル化候補部位を含むゲノム核酸の２本の相補鎖から修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
（ｂ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列と、該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列と、を含む第１クランプを提供する工程と；
（ｃ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第３捕捉配列と、該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第４捕捉配列と、を含む第２クランプを提供する工程と；
（ｄ）該第１クランプおよび該第２クランプが該修飾核酸鋳型の２本の鎖にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
（ｅ）該ハイブリダイズされたクランプをライゲートすることで該修飾核酸鋳型の２本の鎖におけるメチル化候補部位をまたぐ環状プローブを形成する工程と；
（ｆ）該修飾核酸鋳型を消化する工程と；
（ｇ）該環状プローブを検出して該修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程とを含む、ゲノム核酸上のメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法を提供する。
【００１８】
第６態様では、本発明は、
（ａ）メチル化候補部位を含むゲノム核酸の２本の相補鎖から修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
（ｂ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列と、該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列と、を含む第１クランプを提供する工程と；
（ｃ）該修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第３捕捉配列と、該修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第４捕捉配列と、を含む第２クランプを提供する工程と；
（ｄ）該修飾核酸鋳型の少なくとも１本の相補鎖のメチル化候補部位に相補的塩基が全く存在しないように該第１クランプおよび該第２クランプが該修飾核酸鋳型の２本の鎖にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
（ｅ）該第１クランプと該第２クランプの間に少なくとも１つの塩基をもたらす工程と；
（ｆ）該ハイブリダイズされたクランプをライゲートすることで該修飾核酸鋳型の２本の鎖におけるメチル化候補部位をまたぐ環状プローブを形成する工程と；
（ｇ）該修飾核酸鋳型を消化する工程と；
（ｈ）該環状プローブを検出して該修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程とを含む、ゲノム核酸上のメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法を提供する。
【００１９】
ゲノム核酸はＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。好ましくは、ゲノム核酸はＤＮＡである。
【００２０】
好ましくは、メチル化候補部位は、３’側にグアニン（Ｇ）が隣接したシトシン（Ｃ）であり、当該技術ではＣｐＧダブレットと称される。
【００２１】
修飾用の作用物質は、好ましくは重亜硫酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択される。より好ましくは、同剤は重亜硫酸ナトリウム、すなわち水の存在下でシトシンをウラシルに改変する試薬である。
【００２２】
重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応することで、脱アミノ化の影響を受けやすいスルホン化されたシトシン反応中間体が形成され、また水の存在下でウラシルサルファイトが生成される。必要に応じて、サルファイト基は弱アルカリ性の条件下で除去することができ、結果としてウラシルが形成される。ゆえに、すべてのシトシンがウラシルに変換されうることになる。しかしながら、任意のメチル化シトシンは、メチル化による保護に起因して修飾用の作用物質により変換されない。
【００２３】
１つの好ましい形態では、少なくとも第１、第２または第３クランプは、ライゲーション工程後のプローブの増幅を可能にするユニバーサルプライマーを含む。
【００２４】
別の好ましい形態では、少なくとも第１、第２または第３クランプは、プローブの捕捉を可能にする捕捉部位を含む。
【００２５】
別の好ましい形態では、少なくとも第１、第２または第３クランプは、切断可能部位を含む。好ましくは、同切断可能部位は、ヌクレアーゼ制限部位またはウラシル塩基である。
【００２６】
１つの好ましい形態では、第１または第２クランプの相補配列はメチル化候補部位をまたぐ。
【００２７】
別の好ましい形態では、第１、第２または第３クランプの相補配列は、メチル化候補部位をまたがない。
【００２８】
クランプは、好ましくは一本鎖ＤＮＡをライゲートできる適切な酵素の利用によってライゲートされる。適切なリガーゼの例として、アンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ様々なｃａｔ＃）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２０２）、ＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２０８）、ＤＮＡリガーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＮＡＤ）（ＮＥＢｃａｔ＃Ｍ０２０５）などが挙げられるがこれらに限定されない。また一方で、他のリガーゼも本発明に適すると考えられることが認識されるであろう。
【００２９】
第５および第６態様では、クランプは、好ましくは第１および第２捕捉配列の位置またはその近隣で、かつ第３および第４捕捉配列の位置またはその近隣でライゲートされる。
【００３０】
１つもしくは複数の塩基がクランプ間に存在する場合、好ましくはＤＮＡポリメラーゼが用いられる。適切なポリメラーゼの例として、ＴａｑポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｄｖａｎｔａｇｅのＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ、ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ、ＡｃｃｕｐｒｉｍｅＴａｑポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ大断片、Ｋｌｅｎｏｗｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＢポリメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは適切なＤＮＡポリメラーゼであれば任意である。また一方で、他のポリメラーゼも本発明に適すると考えられることが認識されるであろう。この形態では、好ましくは１種類のヌクレオチドの存在下で塩基挿入反応が実施され、各ヌクレオチドは別々に反応する。ゆえに、特定の塩基が挿入されると修飾ＤＮＡ鋳型上の相補的塩基が同定されることになる。
【００３１】
好ましくは、修飾ＤＮＡ鋳型は、ウラシルＮＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧまたはＵＮＧ）の使用によって消化される。処理されたＤＮＡ鋳型がウラシルを含むことから、ＵＤＧによる処理によって鋳型を除去することが可能である。しかしながら、実質的にプローブを消化することのない、他の任意の消化方法も本発明に適すると考えられることが認識されるであろう。核酸鋳型の除去に関する利点は、続いてプローブに施されるいずれの増幅も極めて少ないバックグラウンドを有し、そしてより正確な増幅とそれに続く検出を可能にすることである。さらに、核酸鋳型の除去によって非特異的に形成しうる人工産物の量が低下する。
【００３２】
プローブを検出し、修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための適切な方法として、第１および第２クランプの間の欠落した塩基（ｍｉｓｓｉｎｇｂａｓｅ）の組込みやプローブの特異的増幅が挙げられるがこれらに限定されない。所望の試料の後成的状態を判定するのに極めて多くの有望な検出系が存在する。検出系として以下のものが挙げられるがそれらに限定されない。
Ｉ．１０から６０，０００種類を超える各成分を選択可能と考えられるマイクロアレイ型デバイスに対する適切に標識された増幅核酸のハイブリダイゼーション。それらアレイは、ガラス、プラスチック、マイカ、ナイロン、ビーズ、磁気ビーズ、蛍光ビーズもしくは膜などの任意の適切な固体表面上において挿入核酸（ＩＮＡ、国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット参照）、ＰＮＡ、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドアレイのいずれかから構成されうる。
ＩＩ．サザンブロット型検出系
ＩＩＩ．特異的ゲノムもしくは多重ゲノムの増幅断片または分子ビーコン、スコルピオンなどの任意のバリエーションにおけるリアルタイムＰＣＲ定量
ＩＶ．蛍光ビーズ、酵素共役、放射性ビーズなどを用いる検出系
Ｖ．リガーゼ連鎖反応などの任意の他の増幅系
ＶＩ．鎖置換増幅(ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ;ＳＤＡ法）、ローリングサークル増幅（ＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＣＡ法）などの等温核酸増幅技術
【００３３】
本発明に先立ち、重亜硫酸塩処理、２つの「隣接する」クランプにおける特異的ハイブリダイゼーション、場合によってクランプ間への塩基挿入、その２つのクランプのライゲーション、それに続く鋳型核酸の除去を用いる場合のゲノム核酸における対象部位の検出は実現されていない。処理された核酸は、第１および第２クランプを配置するための足場または鋳型として機能し、次いで除去される。それに対し、ほとんどの先行技術におけるアッセイは、捕捉および核酸鋳型の保持を必要とする。
【００３４】
本発明の１つの利点は、用いられる方法において、ゲノム核酸の増幅が必ずしも必要とされない点である。
【００３５】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される因子、整数もしくは工程、または因子群、整数群もしくは工程群を包含するが、任意の他の因子、整数もしくは工程、または因子群、整数群もしくは工程群を除外しないことを意味するように理解されるであろう。
【００３６】
本明細書に包含されている記録、作用、材料、デバイス、物品または同様のものに関するあらゆる考察は、専ら本発明に文脈を与えるためである。ありとあらゆるこれらの事柄が先行技術の基盤の一部を形成するか、または本発明の出現に先立ってオーストラリアに存在したものとして本発明に関する分野における周知の知識であったことを承認として理解されるべきではない。
【００３７】
本発明がより明瞭に理解されるために、好ましい形態が以下の図面や実施例に関連して記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明を実施するためのモード
材料および方法
クランプ
各クランプは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、固定核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキシル核酸（ＣＮＡ）、およびそれらの混合物やそれらのハイブリッドから選択されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、ならびにホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホアミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステル、およびボラノホスフェートなどの（それらに限定されない）それらのリン原子修飾でありうる。自然発生しないヌクレオチドとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡまたはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡの範囲内に含まれるヌクレオチドが挙げられるがそれらに限定されない。さらに、メチルイミノメチル、酢酸ホルム、チオホルムアセテートおよびアミドを含む連結基など（これらに限定されない）の非リン含有化合物が、ヌクレオチドへの連結用に用いられる場合がある。特に核酸および核酸類似体は１つもしくは複数の介入物である偽ヌクレオチドを含む場合がある。
【００３９】
好ましくは、クランプはＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
ゲノム核酸
ゲノム核酸は、植物、動物、そして細菌、真菌、酵母、およびウイルスなどの微生物から得られるＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。好ましくは核酸はＤＮＡであり、より好ましくは動物もしくはヒト由来のゲノムＤＮＡ、または動物もしくはヒト細胞における感染物質の核酸である。
【００４１】
ＤＮＡの重亜硫酸塩処理
核酸の重亜硫酸塩処理のために有効で典型的なプロトコルを下記に示す。プロトコルは、結果として処理対象の実質的にすべてのＤＮＡを保持する。この方法は、本明細書においてヒューマン・ジェネティック・シグネチャーズ（ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＳｉｇｎａｔｕｒｅｓ）（ＨＧＳ）法としても言及される。試料または試薬の容量もしくは量が検証できることは認識されるであろう。
【００４２】
重亜硫酸塩処理における好ましい方法は、参照として本明細書に援用される米国特許出願第１０／４２８３１０号明細書またはＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００５４９において認められうる。
【００４３】
所望される場合、適切な制限酵素で予備消化できる２μｇのＤＮＡに対して２μｌ（１／１０容量）の３ＭＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇ、作製直後）を添加して最終容量を２０μｌにした。重亜硫酸塩試薬が好ましく一本鎖分子と反応することから、この工程は二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖形態に変性させる。この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。室温を超える温度でのインキュベーションを行うことで変性効率を改善できる。
【００４４】
インキュベーション後、２０８μｌの２Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム（４１６ｍｌの１０ＮＮａＯＨを含む水２０ｍｌ中７．６ｇ；ＢＤＨＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ；作製直後）および１２μｌの１０ｍＭキノール（水５０ｍｌ中０．０５５ｇ、ＢＤＨＡｎａＩＲ＃１０３１２２Ｅ；作製直後）を連続添加した。キノールは還元剤であり、試薬の酸化を低減するのに役立つ。例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）をはじめとする適切な還元剤といった他の還元剤も使用できる。試料はミネラルオイル２００μｌと重層した。ミネラルオイルの重層は試薬の蒸発および酸化を防止するが必須ではない。次いで試料を５５℃で一晩インキュベートした。あるいは、試料は以下のようにサーマルサイクラー内でサイクリングできる。すなわち、ＰＣＲ装置内で工程１として５５℃／２時間、工程２として９５℃／２分でサイクリングするようにして約４時間または一晩インキュベートする。工程１は約３７℃から約９０℃の任意の温度で実施でき、５分から８時間で長さを変更できる。工程２は約７０℃から約９９℃の任意の温度で実施でき、約１秒から６０分もしくは６０分を超えるまで長さを変更できる。
【００４５】
メタ重亜硫酸ナトリウムで処理した後、オイルを除去し、そしてＤＮＡ濃度が低い場合、ｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌもしくはグリコーゲン２μｌを添加した。これらの添加剤は任意であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合には標的ＤＮＡとの共沈によって得られるＤＮＡの収率を改善するのに使用できる。一般に核酸量が＜０．５μｇの場合には、核酸のより効率的な沈殿のために担体として添加剤を使用することが望ましい。
【００４６】
以下のようにイソプロパノール洗浄処理を行った。すなわち水８００μｌを試料に添加して混合し、次いでイソプロパノール１ｍｌを添加した。水または緩衝液は、反応槽中で重亜硫酸塩の濃度を同塩が対象の標的核酸と共沈しようとしない濃度まで低下させる。本明細書において開示されるように、同塩濃度が所望の範囲未満に希釈される限り、希釈は一般に約１／４から１／１０００である。
【００４７】
試料を再び混合し、最低５分にわたり４℃で放置した。試料をマイクロチューブ内で１０〜１５分間回転させ、ペレットを７０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、各回ごとにボルテックスした。この洗浄処理によって核酸とともに沈殿した残留塩を残らず取り出す。
【００４８】
ペレットを乾燥可能にし、次いで５０μｌなどの適切な容量のＴ／Ｅ（１０ｍＭトリス／０．１ｍＭＥＤＴＡ）、ｐＨ７．０〜１２．５で再懸濁した。ｐＨ１０．５の緩衝液が特に有効であることが認められている。核酸を懸濁する必要に応じて、試料を３７℃から９５℃で１分間から９６時間インキュベートした。
【００４９】
ポリメラーゼおよびリガーゼの添加
ポリメラーゼは、正確な塩基すなわちＧ（メチル化に相補的）またはＡ（非メチル化に相補的）を付加することになる。
【００５０】
次いで、リガーゼはＧまたはＡの塩基をライゲートすることで環が形成されることになる。
【００５１】
次いで、重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡが同環の線状化も行うウラシルＮＤＮＡグリコシラーゼで分解される。
【００５２】
次いで１対の共通プライマーで線状ＤＮＡを増幅する。
【００５３】
次いで、クランププライマー内に存在する固有のＤＮＡ配列（Ｚｉｐコード）を用いてマイクロアレイプラットフォーム上でＤＮＡが検出される（ＮＢは、Ｚｉｐコードが重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡの相補鎖に対するハイブリダイゼーションによってではなく、単に複合体に対してアレイ上で空間的に向かうべき場所を伝えるだけのような従来の方法では検出されない）。
【００５４】
ＮＢプライマーの１と３は配列が同一であるが、異なるＺｉｐコード（青および黄色の棒）や、プライマー３がメチル化の欠失を検出する末端塩基Ａを有する一方でメチル化の存在を検出する末端塩基Ｇを有するプライマー１を含める場合を除く。これによって産物をマイクロアレイ上で間隔を置いて分離できる（図１５参照）。このことはＣまたはＴの存在が同じ反応槽内で同時に検出できることを意味する。それ故に、何千もの異なるゲノム座が１つの反応槽において対応でき、それら固有のＺｉｐコードに基づいて分離できる。
【００５５】
クランプは、ライゲートされて増幅されていると、次には各重亜硫酸塩クランププライマーセット内に含まれる内部Ｚｉｐコードによって予め定められたマイクロアレイデバイス上の特異的部位に導かれる（図１６）。
【００５６】
結果
クランプの特異性に対するエキソヌクレアーゼＩＩＩ濃度およびリガーゼ濃度の効果
メチル化ＤＮＡ配列を用いて実験を行った。図１は、クランプ反応の性能に関するリガーゼ酵素濃度およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ濃度の効果を示す。同図から明らかなように、エキソヌクレアーゼ酵素を過量に用いる場合（１０ユニット）、反応が効率的とはいえない。逆に用いる酵素が少なすぎる場合（２ユニット）、これは反応の特異性を低下させ、Ａ、ＴおよびＣトラックにおける非特異的増幅の発生をもたらす（図１Ａ参照）。（星で示される）一部のレーンを認める上部バンドは、環を２回複製するポリメラーゼの結果としての標的バンドの二量体である。
【００５７】
さらに反応あたり５Ｕから反応あたり１０Ｕまでのリガーゼ濃度の上昇によって本方法の特異性が再び低下する結果として、Ａ、ＴおよびＣトラックにおいて非特異的検出がなされた（図１ｂ参照）。太字は最適なエキソヌクレアーゼ濃度を示す。１ナノグラム（ｎｇ）のメチル化オリゴヌクレオチドを標的として用いた。反応において０．１ユニットのＳｔｏｆｆｅｌＤＮＡポリメラーゼとともに１０ｎｇの各クランプを用いた。アンプリガーゼ酵素を５および１０ユニットで用いた。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す。
【００５８】
詳細には、０．５μｌ薄壁ＰＣＲチューブに以下を添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液１．０μｌ
クランプ＃１（１０ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ＃２（１０ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
Ｓｔｏｆｆｅｌポリメラーゼ０．１μｌ
アンプリガーゼ１．０μｌまたは２μｌ
ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ／ｄＣ（１ｍＭ）１．０μｌ（ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ／ｄＣを別々のチューブに添加する）
水３．９μｌまたは２．９μｌ
【００５９】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃２分間、５０℃１５分間、５５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間
【００６０】
【表１】

【００６１】
上記反応混合物１μｌを適切なチューブに添加した。次いで試料を３７℃で１４分間、続いて９５℃で２分間、最後に３７℃で１分間インキュベートした。
【００６２】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒、４８℃４５秒、７２℃４５秒（２５サイクル）
【００６３】
メチル化ＤＮＡ、非メチル化ＤＮＡおよび５０％メチル化ＤＮＡ＋５０％非メチル化ＤＮＡの混合物の検出
図２から明らかなように、同系はメチル化配列を非メチル化配列から容易に識別でき、混合集団の存在も検出できる。
【００６４】
メチル化オリゴヌクレオチド、非メチル化オリゴ、またはメチル化オリゴと非メチル化オリゴの５０％／５０％混合物のいずれか１ｎｇを標的として用いた。反応において１ユニットのＳｔｏｆｆｅｌＤＮＡポリメラーゼとともに各クランプを１０ｎｇずつ用いた。アンプリガーゼ酵素を５ユニットで用いた。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す。
【００６５】
詳細には、以下を０．５μｌの薄壁ＰＣＲチューブに添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液１．０μｌ
クランプ＃１（１０ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ＃２（１０ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
Ｓｔｏｆｆｅｌポリメラーゼ０．１μｌ（１ユニット）
アンプリガーゼ１．０μｌ
ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ／ｄＣ（１ｍＭ）１．０μｌ（ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ／ｄＣを
別々のチューブに添加する）
水３．９μｌ
【００６６】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃２分間、５０℃１５分間、５５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間
【００６７】
エキソヌクレアーゼ処理：
５ＵＥｘｏＩＩＩ／２ＵＥｘｏ１
ＥｘｏＩＩＩ０．０２５μｌ
ＥｘｏＩ０．１μｌ
Ｔ／Ｅ０．８７５
【００６８】
上記反応混合物１μｌを適切なチューブに添加した。次いで試料を３７℃で１４分間、続いて９５℃で２分間、最後に３７℃で１分間インキュベートした。
【００６９】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒，４８℃４５秒，７２℃４５秒（２５サイクル）
【００７０】
クランプ反応に対するポリメラーゼ効果
メチル化ＤＮＡ配列を用いて行われた実験。
【００７１】
図３は、反応の実施に対する異なるポリメラーゼ酵素の効果を示す。標的の濃度がさらに上昇する際にすべての試験対象のポリメラーゼ酵素が陽性シグナルを発したことは注目すべきである。しかしながら、更なる最適化を伴うことなく低いＤＮＡ濃度で使用できた酵素はすべてではなかった。
【００７２】
これらの結果は、最大の感度をもたらす酵素がＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼであったことを示した。更なる実験では引き続き、これら２つの酵素を使用した。
【００７３】
反応において１ユニットのＤＮＡポリメラーゼとともに各クランプを１ｎｇずつ用いた。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す。
【００７４】
詳細には、以下を０．５μｌの薄壁ＰＣＲチューブに添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液１．０μｌ
クランプ＃１（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ＃２（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
ポリメラーゼ１Ｕ
アンプリガーゼ５Ｕ
ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ（１ｍＭ）１．０μｌ（ｄＧ／ｄＡ／ｄＴを
別々のチューブに添加する）
水３．９μｌ
【００７５】
先に示した適切な濃度で鋳型ＤＮＡを添加した。
【００７６】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃２分間、５０℃１５分間、５５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間
【００７７】
エキソヌクレアーゼ処理：
５ＵＥｘｏＩＩＩ／２ＵＥｘｏ１
ＥｘｏＩＩＩ０．０２５μｌ
ＥｘｏＩ０．１μｌ
Ｔ／Ｅ０．８７５
【００７８】
上記反応混合物１μｌを適切なチューブに添加した。次いで試料を３７℃で１４分間、続いて９５℃で２分間、最後に３７℃で１分間インキュベートした。
【００７９】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ０．５μｌを各反応チューブに添加し、そして試料を５０℃１５分間、９５℃５分間、５０℃１分間のようにインキュベートした。
【００８０】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒，４８℃４５秒，７２℃４５秒（２５サイクル）
【００８１】
ポリメラーゼ／リガーゼ濃度の効果
メチル化ＤＮＡを用いて実施された実験。
【００８２】
図４は、バンドがＧとＴトラックの両方に存在する場合に例えば５ユニットのリガーゼとポリメラーゼの両方に伴って認められたように、高濃度の両酵素が偽陽性シグナルを生成できることを示す。それに対し、２ユニットのリガーゼおよび１ユニットのポリメラーゼを用いると、バンドは正確なＧトラックにのみ存在する。したがって、酵素の組み合わせに関して注意深く滴定を行うことは、最も感度がよく特異的な酵素の組み合わせを作り出すのに不可欠である。以上のように、２Ｕのリガーゼおよび１ＵのＫｌｅｎｏｗにより、たとえ低いＤＮＡ濃度でも最も一貫性がある信頼性の高い増幅が得られる。
【００８３】
反応において各クランプを１ｎｇずつ用い、アンプリガーゼおよびポリメラーゼ酵素とともに上記のように用いた。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す。
【００８４】
詳細には、以下を０．５μｌの薄壁ＰＣＲチューブに添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液１．０μｌ
クランプ＃１（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ＃２（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
Ｋｌｅｎｏｗ上記
アンプリガーゼ上記
ｄＧ／ｄＴ（１ｍＭ）１．０μｌ（ｄＧ／ｄＴを別々のチューブに
添加する）
水３．９μｌ
【００８５】
先に示した適切な濃度で鋳型ＤＮＡを添加した。
【００８６】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃２分間、５０℃１５分間、５５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間
【００８７】
エキソヌクレアーゼ処理：
５ＵＥｘｏＩＩＩ／２ＵＥｘｏ１
ＥｘｏＩＩＩ０．０２５μｌ
ＥｘｏＩ０．１μｌ
Ｔ／Ｅ０．８７５
【００８８】
上記反応混合物１μｌを適切なチューブに添加した。次いで試料を３７℃で１４分間、続いて９５℃で２分間、最後に３７℃で１分間インキュベートした。
【００８９】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ０．５μｌを各反応チューブに添加し、そして試料を５０℃１５分間、９５℃５分間、５０℃１分間のようにインキュベートした。
【００９０】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒、４８℃４５秒、７２℃４５秒（２５サイクル）
【００９１】
メチル化ＤＮＡ配列に対して向けられたクランププライマーの使用におけるクランプ反応の感度
図５から明らかなように、アッセイは試験されたすべてのＤＮＡ濃度において極めて高い特異性および感度を有した。
【００９２】
反応において各クランプを１ｎｇずつ用い、アンプリガーゼ酵素とともに２．５および１ユニットで用いた。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す。
【００９３】
詳細には、以下を０．５μｌ薄壁ＰＣＲチューブに添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液１．０μｌ
クランプ＃１（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ＃２（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ＃３（１ｎｇ／μｌ）１．０μｌ
アンプリガーゼ０．５または０．２μｌ
水４．５または４．８μｌ
【００９４】
鋳型ＤＮＡ１μｌを上記の適切な濃度で添加した。
【００９５】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃２分間、５０℃１５分間、５５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間
【００９６】
エキソヌクレアーゼ処理：
５ＵＥｘｏＩＩＩ／２ＵＥｘｏ１
ＥｘｏＩＩＩ０．０２５μｌ
ＥｘｏＩ０．１μｌ
Ｔ／Ｅ０．８７５
【００９７】
上記反応混合物１μｌを適切なチューブに添加した。次いで試料を３７℃で１４分間、続いて９５℃で２分間、最後に３７℃で１分間インキュベートした。
【００９８】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ０．５μｌを各反応チューブに添加し、そして試料を５０℃１５分間、９５℃５分間、５０℃１分間のようにインキュベートした。
【００９９】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒、４８℃４５秒、７２℃４５秒（２５サイクル）
【０１００】
（対応部位での非メチル化で既知の）ゲノムＤＮＡ上のクランプ
反応において２．５および１ユニットのアンプリガーゼ酵素とともに１０ｐｇまたは１ｐｇの各クランプを用いた。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す（図６）。
【０１０１】
詳細には、以下を０．５μｌ薄壁ＰＣＲチューブに添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液１．０μｌ
クランプ＃１１．０μｌ
クランプ＃２１．０μｌ
アンプリガーゼ０．５μｌ
ポリメラーゼ０．１μｌ
ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ／ｄＣ（１ｍＭ）１．０μｌ（ｄＧ／ｄＡ／ｄＴ／ｄＣを
別々のチューブに添加する）
水４．４μｌ
【０１０２】
重亜硫酸塩鋳型ＤＮＡ１μｌを添加した。
【０１０３】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃２分間、５０℃１５分間、５５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間
【０１０４】
エキソヌクレアーゼ処理：
５ＵＥｘｏＩＩＩ／２ＵＥｘｏ１
ＥｘｏＩＩＩ０．０２５μｌ
ＥｘｏＩ０．１μｌ
Ｔ／Ｅ０．８７５
【０１０５】
上記反応混合物１μｌを適切なチューブに添加した。次いで試料を３７℃で１４分間、続いて９５℃で２分間、最後に３７℃で１分間インキュベートした。
【０１０６】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ０．５μｌを各反応チューブに添加し、そして試料を５０℃１５分間、９５℃５分間、５０℃１分間のようにインキュベートした。
【０１０７】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒、４８℃４５秒、７２℃４５秒（４０サイクル）
【０１０８】
クランプ反応−非環状
図７は２つのクランプの２つの単一アームを用いたリガーゼ充填反応の結果を示す。
【０１０９】
オリゴヌクレオチド（非メチル化）を含むウラシル５ｐｇを標的として用いた。反応において０．０５ユニットのＴａｑポリメラーゼとともに各オリゴ「アーム」１ｆモルを用いた。１ユニットから０．０３ユニットのアンプリガーゼ酵素を希釈した。矢印はＰＣＲ産物の正確な大きさを示す。
【０１１０】
詳細には、以下を０．５μｌ薄壁ＰＣＲチューブに添加した。
１０×アンプリガーゼ緩衝液０．９μｌ
オリゴ標的（５ｐｇ／μｌ）１．０μｌ
クランプ１（１ｆモル／μｌ）１．０μｌ
クランプ２（１ｆモル／μｌ）１．０μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ０．１μｌ（アンプリガーゼ緩衝液中で
希釈された０．５Ｕ／μｌストックにおける）
ｄＡ／ｄＣ／ｄＧ（１ｍＭ）１．０μｌ（ｄＡ／ｄＣ／ｄＧを別々の
チューブに添加する）
水４．０μｌ
【０１１１】
反応物を以下のようにインキュベートした：
２０℃４分間、９５℃５分間、６０℃２５分間、６５℃５分間（０．０５℃／秒のランプ時間）、５０℃１分間。
【０１１２】
ＵＤＧ１μｌを添加して鋳型を分解した。
【０１１３】
５０℃１５分間、９５℃５分間、５０℃１分間。
【０１１４】
以下を添加することによってユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを実施した。
１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
水１９．０μｌ
ユニバーサルＰ１１．０μｌ
ユニバーサルＰ２１．０μｌ
ｄＮＴＰｓ１．２μｌ
Ｔａｑ０．３μｌ
９５℃３０秒、４８℃４５秒、７２℃４５秒（２８サイクル）
【０１１５】
第１態様例
図８は本発明の第１態様に従う方法を示す。次いで例＃１および＃２では、ＤＮＡリガーゼを用いて２つの隣接するクランプ配列を共にライゲートした。
【０１１６】
第２態様例
図９は、本発明の第２態様に従う方法を示す。例＃３では、ポリメラーゼ酵素は正確な塩基（Ｇ）をその部位にもたらし、次いでリガーゼ酵素は同塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションして線状プローブを形成することになる。例＃４では、ポリメラーゼ酵素は正確な塩基（Ａ）をその部位にもたらし、次いでリガーゼ酵素は同塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで線状プローブを形成することになる。
【０１１７】
第３態様例
例＃５では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する３つのクランプ配列をもたらすのに、４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される（図１０）。ここでクランプの１つのアームが半環状プローブを形成する一方、他の２つのクランプは、半環状プローブに隣接するＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖にハイブリダイズする。リガーゼ酵素は、塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで完全に線状化されたプローブを形成することになる。
【０１１８】
例＃６では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する３つのクランプ配列をもたらすのに、４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される（図１０）。ここでクランプの１つのアームが半環状プローブを形成する一方、他の２つのクランプは、半環状プローブに隣接するＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖にハイブリダイズする。リガーゼ酵素は、塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで完全に線状化されたプローブを形成することになる。
【０１１９】
第４態様例
例＃７では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する３つのクランプ配列をもたらすのに、４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される（図１１）。ここでクランプの１つのアームが半環状プローブを形成する一方、他の２つのクランプは、半環状プローブに隣接するＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖にハイブリダイズする。ポリメラーゼ酵素は正確な塩基（Ｇ）をその部位にもたらし、次いでリガーゼ酵素は、塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで完全に線状化されたプローブを形成することになる。
【０１２０】
例＃８では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する３つのクランプ配列をもたらすのに、４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される（図１１）。ここでクランプの１つのアームが半環状プローブを形成する一方、他の２つのクランプは、半環状プローブに隣接するＤＮＡのトップ鎖およびボトム鎖にハイブリダイズする。ポリメラーゼ酵素は正確な塩基（Ａ）をその部位にもたらし、次いでリガーゼ酵素は、塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで完全に線状化されたプローブを形成することになる。
【０１２１】
第５態様例
例＃９では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する２つのクランプ配列をもたらすのに４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される。ここでクランプの各アームは、半環状プローブを形成する（図１２）。リガーゼ酵素は、塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで完全に環状化されたプローブを形成することになる。
【０１２２】
例＃１０では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する２つのクランプ配列をもたらすのに４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される。ここでクランププローブの各アームは、半環状プローブを形成する（図１２）。リガーゼ酵素は、塩基をＤＮＡ配列内にライゲーションすることで完全に環状化されたプローブを形成することになる。
【０１２３】
第６態様例
例＃１１では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する２つのクランプ配列をもたらすのに４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される。ここでクランプの各アームは、半環状プローブを形成する（図１３）。ポリメラーゼ酵素は正確な塩基（Ｇ）をその部位にもたらし、次いでリガーゼ酵素は、２つの半環状プローブをライゲーションすることで完全に環状化されたプローブを形成することになる。
【０１２４】
例＃１２では、重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡ上に正確に位置する２つのクランプ配列をもたらすのに４つの独立したハイブリダイゼーション事象の発生が要求される（図１３）。ここでクランプの各アームは、半環状プローブを形成する。ポリメラーゼ酵素は正確な塩基（Ａ）をその部位にもたらし、次いでリガーゼ酵素は、２つの半環状プローブをライゲーションすることで完全に環状化されたプローブを形成することになる。
【０１２５】
図１４は、ウラシル切断部位を有する環状プローブを形成するクランプ反応の略図を示す。
【０１２６】
アレイタグ検出系
重亜硫酸塩クランプは、メチル化シトシン塩基のゲノムワイド検出用の新しい方法である。メチル化シトシンの検出に対するすべての従来方法と異なり、クランプ法は重亜硫酸塩で処理された核酸の増幅に依存しない。同方法はライゲーション反応を用いることでＣｐＧダブレット内のメチル化シトシンの有無を判定できるという点で独特である（図１５および図１６を参照）。このことは各ＣｐＧ部位がゲノム全体を通して解析できることを意味する。
【０１２７】
クランプは、ライゲートされて増幅されていると、次には各重亜硫酸塩クランププライマーセット内に含まれる内部Ｚｉｐコードによって予め定められたマイクロアレイデバイス上の特異的な部位に方向づけできる。図１６は上記検出系の例を示す。
【０１２８】
従来のマイクロアレイ解析に比べてこのアプローチが有する主な利点の１つは、ハイブリダイゼーション条件が精密に制御できる点である。Ｚｉｐコードプライマーは、すべてが同一の融解温度を共有し、類似した配列内容を有するようにテーラーメイド可能である。このことは、ハイブリダイゼーション挙動が各プローブにおいて極めて類似することを意味する一方で、従来のマイクロアレイではハイブリダイゼーションがゲノム核酸のＤＮＡ配列に依存し同様には制御できない。
【０１２９】
要約
既存技術と比較し、メチル化状態のゲノムワイド検出を目的とした本発明に従う重亜硫酸塩クランプ法には多数の固有の利点がある。１つの主な利点は、反応中にもたらされる精巧な特異性である。従来の重亜硫酸塩分析（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４年）は、重亜硫酸塩で変換されたゲノムにおいて要求される特異性をもたらすのに２回の入れ子ＰＣＲに依存する。これは重亜硫酸塩処理後にすべての非メチル化シトシンがＵに変換されて以降、ゲノムが本質的に３つの塩基すなわちＡＧおよびＴのみから構成されるという事実に起因する。次いで、４つの入れ子プライマーが重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ鎖の１本に対して設計された上で２回のＰＣＲを実施することで、要求される特異性や感度がもたらされる。重亜硫酸塩処理後、ＤＮＡの二本鎖はもはや相補的ではない。これまで変換後の両鎖の標的化は利用されていない。本発明に従う重亜硫酸塩クランプ法は、修飾または変換されたＤＮＡの両鎖を標的とすることができることから（図１０から図１４を参照）、反応が進行する以前に４つの独立したハイブリダイゼーション反応の発生が要求される。このことは事実上、１回でＰＣＲ汚染の可能性を低減しかつ著しく手順を簡素化する入れ子ＰＣＲの特異性を提供する。さらに先行技術における非特異的増幅は、特に標的ＤＮＡ量が少ない場合に頻繁に起こる。このことはＰＣＲ増幅反応の性質に起因する。しかしながら、好ましい重亜硫酸塩クランプ法では、二重の特異性を有する系を用いることによってこれを克服する。特異性の第１層は、修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位をまたぐ２つのクランプ配列の間に相補的塩基が全くない場合に、ポリメラーゼが正確な塩基を充填することによってもたらされる。たとえポリメラーゼが誤りを起こしても、リガーゼ酵素の使用によって２回目で忠実性が得られる。これは任意の誤りのある塩基が正確にライゲートされないと反応が停止することになることを意味する。
【０１３０】
該修飾核酸鋳型の第１鎖および第２鎖におけるメチル化候補部位の領域に相補的な捕捉配列を有するクランプを用いて正確なハイブリダイゼーション構成が生じる場合、環状ＤＮＡ構造が形成される。ある場合にはこの環を線状に変換することは利点があり、１つもしくは複数のウラシルまたは代わりに制限部位を１つのプライマーの１つのアーム内に組み込むことによってこれが実施できる（ウラシルが付加される部位はウラシル部位と称される；図１４）。重亜硫酸塩クランプ法のもう一つの特徴は、１つのプライマーまたはクランプへの１つのアームへのウラシル部位の組込みでありうる。したがって、正確なハイブリダイゼーションやライゲーションが生じる際に環が形成される。次いで反応混合物は、ウラシルＮグリコシラーゼ（ＵＮＧ）で処理可能である。次いでこの酵素は、すべてのウラシルを含む重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡを分解すると同時に環を線状化することになる。ゆえに、非標的ゲノムＤＮＡの海の中で起こる従来のＰＣＲと異なり、この段階で反応効率を大幅に上昇させる純粋な標的分子集団において引き続き増幅が起こる。あるいは、クランププライマーの１つに固有の制限部位が付加できることで、ＵＮＧ消化後、環は未消化のままであるが重亜硫酸塩で処理されたゲノムＤＮＡは分解されている。次いで環状ＤＮＡは、等温におけるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を介して複製できる（リザーディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｃｏｕｎｔｉｎｇｕｓｉｎｇｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．」１９９８年Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９）；２２５−２３２頁）。
【０１３１】
さらに、重亜硫酸塩クランプ法は、同一反応チューブ内での多数のプローブの多重化を可能にする。したがって、１つの反応チューブ内で同時に多数のゲノム領域が対応できる。これは、クランプが共通のＰＣＲプライマー部位を含みうることから、個々のプライマーセットが対象の各遺伝子座に対して設計される必要がある場合の多重ＰＣＲと異なり、標的環状分子を増幅するのに必要なのは２つのプライマーにすぎないという事実に起因する。
【０１３２】
さらに、本方法は、重亜硫酸塩反応において頻発しうるＰＣＲバイアスの問題も除去する。これは重亜硫酸塩クランプが２つのプライマー部位をまたぐゲノム領域の増幅に左右されないという事実の結果である。重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡの特定配列の増幅によって真のメチル化状態が過小評価される可能性があることが判明している（ウォーニキー（Ｗａｒｎｅｋｅ）ら）。この現象は、メチル化ＤＮＡ鎖の非メチル化鎖との比較において異なる配列内容の結果であり、メチル化鎖よりも非メチル化鎖の優先的な複製をもたらす。クランプがハイブリダイゼーション反応にのみ依存することから、ＰＣＲバイアスは発生しないであろう。
【０１３３】
その上、マイクロアレイによる重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ内のメチル化変化の検出は、２つの固有のプライマー部位間に含まれる増幅ＤＮＡ領域における配列に特異的なハイブリダイゼーションに依存している。先に述べたように、メチル化ＤＮＡ配列の配列内容は非メチル化配列の場合とは極めて異なる。これは非メチル化配列のハイブリダイゼーション挙動がメチル化配列のそれと極めて異なるようになるという効果を発揮する。したがって、実際面では非メチル化配列およびメチル化配列の両方が同一アレイに対して同時になるようにアレイに対して結合する場合に好適となるハイブリダイゼーション条件を決定することは極めて困難である。重亜硫酸塩クランプ手順は、場合によってＺｉｐコード配列を後にアレイ上の規定の場所に同配列を導くプライマーに組込むことによってこの問題を克服できる。Ｚｉｐコード配列は、重亜硫酸塩で処理された１片のＤＮＡに対応するように設計されるのではなく、ヒトゲノム内に存在しない無作為に規定されたＤＮＡ配列である。このＺｉｐコード配列は、各Ｚｉｐコードが同一の融解温度や配列組成物を有するように「シャッフル」できる。それ故に、重亜硫酸塩クランプにおけるハイブリダイゼーション条件は、各プローブのハイブリダイゼーション挙動が同一になるようにテーラーメイド可能である。したがって、最終の読み出しが試料のメチル化状態を真に反映したものであろう。
【０１３４】
極めて多くのバリエーションおよび／または修飾は、幅広く記載された本発明の技術思想または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示される本発明に対して施される場合があることが当業者によって認識されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての態様において図示されるものや制限されないものとして考慮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】クランプの特異性に対するエキソヌクレアーゼＩＩＩ濃度およびリガーゼ濃度の効果を示す（第６態様）。
【図２】（第６態様に従う）メチル化、非メチル化および５０％メチル化ＤＮＡ＋５０％非メチル化ＤＮＡの混合物の検出を示す。
【図３】（第６態様に従う）クランプ反応に対するポリメラーゼの効果を示す。
【図４】（第６態様に従う）ポリメラーゼ／リガーゼ濃度の効果を示す。
【図５】メチル化ＤＮＡ配列に対して向けられたクランププライマーを用いる（第３態様に従う）クランプ反応の感度を示す。
【図６】（第６態様に従う）（対応部位でメチル化されないことで知られる）ゲノムＤＮＡに対するクランプ反応を示す。
【図７】（第２態様に従う）クランプ反応の結果を示す。
【図８】クランプのハイブリダイゼーションのターゲティングの例を示す。
【図９】クランプおよび塩基挿入のハイブリダイゼーションのターゲティングの例を示す。
【図１０】本発明の第３態様の例を示す。
【図１１】本発明の第４態様の例を示す。
【図１２】本発明の第５態様の例を示す。
【図１３】本発明の第６の態様の例を示す。
【図１４】本発明に従う重亜硫酸塩クランプ法の略図である。
【図１５】ライゲーションに依存する反応を示す。
【図１６】アレイタグ検出系を示す。

Claims

ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法であって、
メチル化候補部位を含むゲノム核酸の２本の相補鎖から修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
前記修飾核酸鋳型の第１鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列と、前記修飾核酸鋳型の第２鎖におけるメチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列と、を含む第１クランプを提供する工程と；
前記修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第３捕捉配列を含む第２クランプを提供する工程と；
前記第１クランプおよび前記第２クランプが前記修飾核酸鋳型にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
前記ハイブリダイズした第１および第２クランプをライゲートすることで前記修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位をまたぐプローブを形成する工程と；
前記修飾核酸鋳型を消化することで前記プローブを得る工程と；
前記プローブを検出して前記修飾ゲノム核酸におけるメチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程と、を含む、方法。
前記第１クランプおよび前記第２クランプは、前記クランプをライゲートすることで前記修飾核酸鋳型におけるメチル化候補部位をまたぐプローブを形成するのに先立って、前記第１クランプと前記第２クランプの間に少なくとも１つの塩基が挿入されるように前記修飾核酸鋳型にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
前記メチル化候補部位は、３’側にグアニン（Ｇ）が隣接したシトシン（Ｃ）である、請求項１または２に記載の方法。
前記修飾用の作用物質は、重亜硫酸塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記修飾用の作用物質は、重亜硫酸ナトリウムである、請求項４に記載の方法。
前記第１または第２クランプのうちの少なくとも１つは、前記ライゲーション工程後に前記プローブの増幅を可能にするユニバーサルプライマーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記第１または第２クランプのうちの少なくとも１つは、前記プローブの捕捉を可能にする捕捉部位を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１または第２クランプのうちの少なくとも１つは、切断可能部位を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記切断可能部位は、ヌクレアーゼ制限部位である、請求項８に記載の方法。
前記切断可能部位は、ウラシル塩基である、請求項９に記載の方法。
前記第１または第２クランプの相補配列は、ライゲートされる際に前記修飾核酸鋳型上のメチル化候補部位をまたぐ、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記クランプは、一本鎖核酸をライゲート可能な適切な酵素を用いてライゲートされる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記クランプは、前記第１および第２捕捉配列の位置またはその付近でライゲートされる、請求項１および３〜１２のいずれか１項に記載の方法。
核酸ポリメラーゼによって１つまたは複数の塩基が前記クランプの間に挿入される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
塩基挿入反応は、１種類のヌクレオチドの存在下で実施され、特定の塩基の挿入が前記修飾核酸鋳型上の相補的塩基を同定することになるように、各種類のヌクレオチドが別々に反応させられる、請求項１４に記載の方法。
前記修飾核酸鋳型は、酵素によって消化される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記酵素は、ウラシルＮＤＮＡグリコシラーゼである、請求項１６に記載の方法。
前記第１クランプと第２クランプとの間における欠落していた塩基の組み込みを認識可能な、または前記プローブの特異的な増幅を検出可能な検出系によって、前記プローブが検出され、且つ修飾された前記ゲノム核酸における前記メチル化候補部位のメチル化状態が判定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記検出系は、アレイによるハイブリダイゼーションと、サザンブロット型検出と、リアルタイムＰＣＲ定量と、蛍光ビーズと、酵素共役と、放射性ビーズと、リガーゼ連鎖反応と、鎖置換増幅もしくはローリングサークル増幅を含む等温ＤＮＡ増幅技術とからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記ゲノム核酸は、ＤＮＡである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
ゲノム核酸上のメチル化候補部位のメチル化状態を判定するための方法であって、
メチル化候補部位を含むゲノム核酸の２本の相補鎖から修飾核酸鋳型を形成する条件下で、シトシン塩基を修飾するが５−メチルシトシン塩基を修飾しない作用物質でゲノム核酸を処理する工程と；
前記修飾核酸鋳型の第１鎖における前記メチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第１捕捉配列と、前記修飾核酸鋳型の第２鎖における前記メチル化候補部位の一方側に隣接する領域に相補的な第２捕捉配列と、を含む第１クランプを供給する工程と；
前記修飾核酸鋳型の第１鎖における前記メチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第３捕捉配列と、前記修飾核酸鋳型の第２鎖における前記メチル化候補部位の他方側に隣接する領域に相補的な第４捕捉配列と、を含む第２クランプを供給する工程と；
前記第１クランプおよび前記第２クランプが前記修飾核酸鋳型の２本の相補鎖にハイブリダイズすることを可能にする工程と；
前記ハイブリダイズされたクランプをライゲートすることで前記修飾核酸鋳型の相補鎖の前記メチル化候補部位をまたぐ環状プローブを形成する工程と；
前記修飾核酸鋳型を消化することで前記環状プローブを得る工程と；
前記環状プローブを検出して前記修飾ゲノム核酸の前記メチル化候補部位のメチル化状態を判定する工程と、を含む、方法。
前記第１クランプおよび前記第２クランプは、前記クランプをライゲートすることで前記修飾核酸鋳型の前記メチル化候補部位をまたぐプローブを形成するのに先立って、前記第１クランプと前記第２クランプの間に少なくとも１つの塩基が挟まれるように、前記修飾核酸鋳型の２本の相補鎖にハイブリダイズする、請求項２１に記載の方法。
前記メチル化候補部位は、３’側にグアニン（Ｇ）が隣接したシトシン（Ｃ）である、請求項２１または２２に記載の方法。
前記修飾用の作用物質は、重亜硫酸塩である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記修飾用の作用物質は、重亜硫酸ナトリウムである、請求項２３に記載の方法。
前記第１クランプまたは第２クランプのうちの少なくとも１つは、前記ライゲーション工程後に前記プローブの増幅を可能にするユニバーサルプライマーを含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
前記第１または第２クランプのうちの少なくとも１つは、前記プローブの捕捉を可能にする捕捉部位を含む、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１または第２クランプのうちの少なくとも１つは、切断可能部位を含む、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
前記切断可能部位は、ヌクレアーゼ制限部位である、請求項２８に記載の方法。
前記切断可能部位は、ウラシル塩基である、請求項２８に記載の方法。
前記第１または第２クランプの相補配列は、ライゲートされる際に前記修飾核酸鋳型上のメチル化候補部位をまたぐ、請求項２１および２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
前記クランプは、一本鎖核酸をライゲート可能な適切な酵素を用いてライゲートされる、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
前記クランプは、第１および第２捕捉配列の位置またはその付近でライゲートされる、請求項２１および２３〜３２のいずれか１項に記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼによって、１つまたは複数の塩基が前記クランプ間に挿入される、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
塩基挿入反応は１種類のヌクレオチドの存在下で実施され、特定の塩基の挿入が前記修飾核酸鋳型上の相補的塩基を同定することになるように、各種類のヌクレオチドが別々に反応させられる、請求項３４に記載の方法。
前記修飾核酸鋳型は、酵素によって消化される、請求項２１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
前記酵素がウラシルＮＤＮＡグリコシラーゼである請求項３６に記載の方法。
前記プローブが検出され、かつ前記修飾ゲノム核酸における前記メチル化候補部位のメチル化状態が前記第１クランプと、第２クランプとの間の欠失塩基の組込みを認識できる、または前記プローブの特異的な増幅を検出できる検出系を用いて判定される請求項２１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
前記検出系は、アレイによるハイブリダイゼーションと、サザンブロット型検出と、リアルタイムＰＣＲ定量と、蛍光ビーズと、酵素共役と、放射性ビーズと、リガーゼ連鎖反応と、鎖置換増幅もしくはローリングサークル増幅を含む等温ＤＮＡ増幅技術とからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
前記ゲノム核酸は、ＤＮＡである、請求項２１〜３９のいずれか１項に記載の方法。