JPH08503606A

JPH08503606A - 検定法

Info

Publication number: JPH08503606A
Application number: JP6511088A
Authority: JP
Inventors: シャー，ジョツナ; キング，ウォルター; リュー，ジン; スミス，ジェームズ; サーペ，ユージン; ポポフ，ソンヤ
Original assignee: アモコ・コーポレーション
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1996-04-23
Also published as: WO1994010335A2; DE69327454D1; EP0625213A1; WO1994010335A3; DE69327454T2; US5629156A; EP0625213B1

Abstract

(57)【要約】サンドイッチ検定を実施するための新規の方法を開示した。該検定は、二重捕捉プローブを用い且つ捕捉プローブに対する検出プローブの非特異的結合の結果生じたノイズを消去する。

Description

【発明の詳細な説明】検定法発明の分野本発明は、試料中の標的分子を検出する方法およびキットに関する。特に、標的分子は臨床試料からの核酸フラグメントでありうる。本発明の実施態様は、標的核酸の迅速且つ敏感な検出法を提供する。背景臨床診断において標的核酸配列を検出する有用性は、十分に確立されている。様々な方法論は、標的生物の存在の徴候としての特定の標的核酸配列の検出に関して開発されてきた。これらには、標的核酸中の核酸配列に対してハイブリッド形成しうるまたは結合しうる１種類またはそれ以上の注文通りの核酸プローブに頼るハイブリッド形成検定がある。これまでに開発されたハイブリッド形成検定は、検定中に発生し、しかも捕捉された標的核酸によって生じたシグナルと競合する人為的シグナルまたはノイズの存在のために制限されたままである。例えば、標的核酸中の相互に排他的な核酸配列に対してハイブリッド形成しうる２種類の別個の核酸プローブを用いるサンドイッチハイブリッド形成検定が開発された。検出プローブである一方のプローブは、捕捉された標的の検出を可能にする検出可能な標識部分を有するように構築される。捕捉プローブである第二のプローブは、支持体並びに標的に対して結合できるように構築されて、試料精製および捕捉された標的の単離を容易にする。ハイブリッド形成または結合の条件下において、２種類のプローブは標的核酸とハイブリッド形成して、捕捉プローブ：標的：検出プローブの三重複合体を生成する。結合条件下での支持体の導入は、支持体による三重複合体の捕捉を引起こす。次に、検出プローブを単離し且つ測定して、試料中の標的の存在または量を決定することができる。しかしながら、このようなサンドイッチハイブリッド形成検定の感度は、試料中に標的が存在しないにもかかわらず検出プローブが検定支持体に対して直接的に結合するので制限されることが知られている。標的不存在における支持体に対する直接的な検出プローブの結合を非特異的結合と称する。更に、検定される試料は、標的として選択された配列に対して若干の類似点を有する、偽標的として知られた他の核酸配列を有することがある。検出プローブと高水準で結合したこれらの偽標的は、検定支持体に対して非特異的に結合し、そして更に、検出プローブに対して結合することがあり、それによって標的不存在下において検出プローブを支持体に対して結合させ且つノイズを発生する。更に、検出プローブと結合した偽標的は、捕捉プローブに対して若干のミスマッチを伴ってハイブリッド形成することがあり、このようにして検定支持体上に捕捉されることがある。標的と同様の核酸配列による支持体に対する検出プローブの結合を非特異的ハイブリッド形成と称する。非特異的結合および非特異的ハイブリッド形成は、三重複合体および標的の捕捉によって生じたシグナルと一緒に累積される検出可能なシグナルまたはノイズを発生する。非特異的結合および非特異的ハイブリッド形成によるノイズの問題は、検定において標的：検出プローブハイブリッド形成の迅速且つ完全な形成を促進するための過剰な検出プローブの存在によってしばしば悪化する。従来のサンドイッチハイブリッド形成検定は、約１０⁸標的の限界まで検出することができる。しかしながら、診断用検定は、従来の検定によって現在可能な１０⁸標的限界よりはるかに低い濃度で試料中に存在している標的の存在を検出することをしばしば要求する。研究者は、サンドイッチハイブリッド形成検定によるノイズを消去するかまたは少なくとも減少させることを試みてきた。以下、可逆的標的捕捉またはＲＴＣと称する一つの方法は、このようなバックグラウンドノイズを減少させるのに有効であった。可逆的標的捕捉は、一連の支持体からの三重複合体の捕捉および解放のサイクルを必要とする。最初に、検出のために標的核酸を暴露する従来の試料調製の後に、捕捉および検出プローブを試料媒質に対して加える。標的の存在下においておよび結合条件の賦課によって三重複合体が形成される。適当な支持体の導入により、三重複合体は支持体によって捕捉される。しかしながら、若干の量の検出プローブは支持体に対して非特異的に結合する。次に、支持体および結合した三重複合体を試料媒質から取出し、典型的に洗浄した後、第二試料媒質に導入する。次に、解放条件を賦課して、三重複合体を支持体から解放する。次に、元の支持体を第二試料媒質から取出し、それによって若干の非特異的に結合した検出プローブを検定から除去する。次に、第二支持体を第二試料媒質に導入し、結合条件を再度賦課し、そして複合体を含む三重標的を再度捕捉する。元の支持体に対して非特異的に結合した若干の検出プローブは、解放条件の賦課によって第二試料媒質中に解放されていて、したがって第二支持体に対する非特異的結合に利用可能でありうるので、追加の解放および捕捉サイクルは、検定の最大感度を達成するのに不可欠でありうる。典型的に、従来のサンドイッチハイブリッド形成検定形式においてノイズを検出可能限界未満に減少させるには、３サイクルの標的捕捉で十分である。検出プローブの非特異的結合の結果生じたノイズを減少させることを目的とした可逆的標的捕捉および他の方法は、欧州特許出願第８７３０９３０８．２号明細書（公開第０２６５２４４号）、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８１，３４５〜３５９（１９８９）およびＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８１，３６０〜３７０（１９８９）に詳細に記載されている。いずれも本明細書によって参考として包含される。可逆的標的捕捉を補足したサンドイッチハイブリッド形成検定は、感度レベルを約１０⁶標的まで拡大することができる。しかしながら、これらの技法の成功にもかかわらず、当業者は検定の感度を増大させる更に別の方法を追及し続けてきた。これらには、検定によって生じた標的またはシグナルを更に増幅させる増幅スキームの使用がある。例えば、欧州特許出願第８８３１２１３５．２号明細書（公開第０３２８８２９号）は、標的ポリペプチドを検出する前にそれを増幅させる改良された検定法を記載している。増幅は、ポリメラーゼ酵素を用いて酵素によって達成される。例えば、標的ＤＮＡおよび酵素コアＲＮＡポリメラーゼを用いて標的ＤＮＡに対するＲＮＡ相補体を生成することができる。次に、ＲＮＡ相補体を検出する。同様に、標的ＲＮＡを、検出の前にＱβレプリカーゼおよび逆転写酵素などの酵素によって複製することができる。これらの技法は可逆的標的捕捉と十分に適合し、そして検定感度を約１０⁶標的まで増大させるのに用いることができる。これらの技法は、本明細書中に参考として包含されている欧州特許出願第８８３１２１３５．２号明細書に更に十分に記載されている。或いは、検定感度は、検出プローブによって生じたシグナルまたは、更に詳しくは、検出プローブそれ自体を増幅させることによって増大させることができる。これは、検出プローブとして用いるのに中間変異型（ＭＤＶ−１）を採用することによって達成することができる。中間変異型様ＲＮＡは、Ｑβレプリカーゼの鋳型として役立つことができ、それによって複製することができる。したがって、検出プローブをＱβレプリカーゼによる増幅用に構築して、検定を更に向上させることができる。核酸サンドイッチハイブリッド形成検定において検定感度を約１０⁶標的まで増大させるのにＱβ−レプリカーゼ増幅を用いることは、本明細書中に参考として包含されているカーヒル（Ｃａｈｉｌｌ）ら、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１４８２（１９９１）に記載されている。これまでの進歩にもかかわらず、核酸サンドイッチハイブリッド形成検定の感度は、検定中に生じたバックグラウンドノイズによって制限されたままである。したがって、標的からのシグナルを検出する検定の能力によってのみ検定感度が制限され、検定中に生じたバックグラウンドノイズによって制限されない点まで検定感度を増加させることは有益であろう。したがって、本発明の目的は、増大した感度のサンドイッチハイブリッド形成検定を提供することである。本発明のもう一つの目的は、検定感度が標的によって生じたシグナルによって制限されるが検定中に生じたバックグラウンドノイズによって制限されないサンドイッチハイブリッド形成検定を提供することである。発明の概要ここで、可逆的標的捕捉検定法を若干修正した場合に有意の一層感度の高いサンドイッチハイブリッド形成検定が得られることを発見した。新規の検定の感度は、検出された標的の結果として生じたシグナルによって制限されるが、バックグラウンドノイズによって制限されない。検出プローブ中のＲＮＡ様鋳型を増幅するのにＱβレプリカーゼを用いるようなシグナル増幅スキームを用いるハイブリッド形成検定に新規の検定法を導入することにより、検定感度を１０³倍まで増大させることが可能である。したがって、最大３桁まで感度を増加させることができる。サンドイッチハイブリッド形成検定におけるバックグラウンドノイズを減少させることを目的とした従来の研究は、検定において用いられた支持体に対する標識検定プローブの非特異的結合の結果として生じたノイズを減少させることに向けられてきた。可逆的標的捕捉のような技法はこのようなノイズを減少させるのに有効であるが、残留ノイズが検定に残る。ここで、この残留ノイズが完全に消去される点までそれを有意に減少させることができることを発見した。この残留ノイズは、２種類またはそれ以上の別個の捕捉プローブおよびＲＴＣ形式の変型を用いることによって消去することができることが分かった。新規の検定形式は、捕捉プローブに対する検出プローブの非特異的結合によるノイズを消去すると考えられる。従来の可逆的標的捕捉法は単一の捕捉プローブを用い且つ捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体を検定の間中保存した。したがって、捕捉プローブに対して非特異的に結合した検出プローブは、ＲＴＣの標的解放および再捕捉サイクルの間中維持され且つ検定の最後に存在して、捕捉された標的によって生じたシグナルと競合したノイズを発生する。標的解放および再捕捉中の検定において残存するこのノイズを周期性ノイズと称する。本明細書中に記載の方法は、周期性ノイズ、更には、支持体に対する検出プローブの非特異的結合によって生じたノイズを除去するのに有効である。実際に、該方法は、バックグラウンドノイズの全く無いサンドイッチハイブリッド形成検定を生じることができる。本発明は、２種類の二重捕捉検定を含む。クラスＩの方法は、試料と、第一捕捉プローブと、標的存在下において標的に対して結合する検出プローブとを接触させて第一捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体を生成し；該三重複合体の標的：検出プローブセグメントを第一捕捉プローブから分離し；標的に対して結合する第二捕捉プローブと試料を接触させて第二捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体を生成し；第二捕捉プローブに対して非特異的に結合した検出プローブの量を最小限にし；そして検出プローブの存在または不存在に関して第二の三重複合体を監視する工程を含む。クラスＩＩの方法は、試料と、第一プローブと、標的存在下において標的に対して結合する第二捕捉プローブとを接触させて標的複合体を生成し；試料中に存在する第二捕捉プローブの量を最小限にし；検出プローブと、標的存在下において標的に対して結合する新たな第一捕捉プローブと試料を接触させて、第二捕捉プローブ：標的：検出プローブの第二標的複合体を含み且つ第一捕捉プローブを結合した四重複合体を生成し；該第二標的複合体の第二捕捉プローブに対して結合した検出プローブの量を最小限にし；そして検出プローブの存在または不存在に関して第二標的複合体を監視する工程を含む。更に詳しくは、本発明のクラスＩの方法の好ましい実施態様は、標的に関して検定される試料媒質と、第一捕捉プローブと、標的存在下において標的に対して結合する検出プローブとを接触させて、第一捕捉プローブ：標的：検出プローブの第一三重複合体を生成し；試料と、第一支持体が第一捕捉プローブに対して結合している該第一支持体とを接触させることによって第一三重複合体を該支持体に対して結合し；第一支持体および第一三重複合体を試料媒質から実質的に分離し；第一支持体および第一三重複合体を第二媒質に導入し且つ第一三重複合体の標的：検出プローブセグメントを第一支持体および捕捉プローブから解放し；第一支持体および捕捉プローブを第二媒質から実質的に分離し；第二支持体および第二捕捉プローブを第二媒質に導入して、第二支持体に結合した第二捕捉プローブ：標的：検出プローブの第二三重複合体を生成し；第二支持体および第二三重複合体を第二媒質から実質的に分離し；第二支持体および第二三重複合体を第三媒質に導入し且つ第二三重複合体を第二支持体から解放し；第二支持体を第三媒質から実質的に分離し；そして第三媒質中の標的の存在を検出する工程を含む。標的捕捉および解放の追加のサイクルを必要に応じて実施して、支持体に対する検出プローブの非特異的結合によるノイズの減少を達成することができる。クラスＩＩの方法の好ましい実施態様は、検定される試料と、第一捕捉プローブおよび第二捕捉プローブが標的に対して結合している該第一および第二捕捉プローブとを接触させて標的複合体を生成し；試料と、第二捕捉プローブに対して結合する第二支持体とを接触させることによって該標的複合体を第二支持体に対して結合し；第二支持体および結合した標的複合体を試料から実質的に分離し；第二支持体および結合した標的複合体を第二媒質中に導入し且つ標的複合体を第二支持体から解放し；第二支持体を第二媒質から実質的に分離し；第一捕捉プローブに対して結合する第一支持体と第二媒質を接触させることによって標的複合体を結合し；第一支持体および結合した標的複合体を第二媒質から実質的に分離し；第一支持体および結合した標的複合体を第三媒質中に導入し且つ標的複合体の第二捕捉プローブ：標的セグメントを第一支持体および第一捕捉プローブから解放し；第一支持体および第一捕捉プローブを第三媒質から実質的に分離し；第三媒質と、検出プローブと、標的存在下において標的に結合する新たな第一捕捉プローブとを接触させて、第二捕捉プローブ：標的：検出プローブの第二標的複合体を含み且つ第一捕捉プローブを結合した四重複合体を生成し；第三媒質と、第一捕捉プローブと結合する新たな第一支持体とを接触させて四重複合体を結合し；第一支持体および結合した四重複合体を第三媒質から実質的に分離し；第一支持体および結合した四重複合体を第四媒質中に導入し且つ第二標的複合体を第一支持体および第一捕捉プローブから解放し；第一支持体および結合した第一捕捉プローブを第四媒質から実質的に分離し；第四媒質と、第二捕捉プローブに対して結合する第二支持体とを接触させ；第二支持体および結合した第二標的複合体を第四媒質から実質的に分離し；第二支持体および結合した第二標的複合体を第五媒質中に導入し且つ第二標的複合体を第二支持体から解放し；第二支持体を第五媒質から実質的に分離し；そして検出プローブの存在または不存在に関して第二標的複合体を監視する工程を含む。図面の簡単な説明図１は、本発明の二重捕捉クラスＩ方法論および標準的な可逆的標的捕捉方法論を用いて、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）からの標的に関する核酸ハイブリッド形成検定のシグナルおよびノイズ発生を実証する実験マトリックスによる結果を比較のために平行して示す。図２は、本発明の二重捕捉クラスＩ方法論の別個の実施態様を用いて、トラコーマクラミジアからの標的に関する核酸ハイブリッド形成検定のシグナルおよびノイズ発生を実証する実験マトリックスによる結果を、比較のために平行して示す。図３は、本発明の二重捕捉クラスＩＩ方法論および比較しうる可逆的標的捕捉方法論を用いて、トラコーマクラミジアからの標的に関する核酸ハイブリッド形成検定のシグナルおよびノイズ発生を実証する実験マトリックスによる結果を比較のために平行して示す。発明の詳細な説明ここで、サンドイッチ検定の感度を、例えば、欧州特許出願第８７３０９３０８２号明細書に記載された可逆的標的捕捉技術を用いる従来のサンドイッチ検定の変法である検定法を用いてかなり増大させることができることを発見した。ここで開示された方法は、別の状況では検定中に発生し、それによって検定の感度を制限するであろうバックグラウンドノイズを実質的に消去する。実際に、ここで開示された方法により、検定の感度は最大３桁まで拡大され且つノイズよりもむしろ真のシグナル応答によって感度が制限された検定が得られる。本発明の方法は、概して、サンドイッチ検定に適合しうる。それらは、特に、核酸標的に関するサンドイッチハイブリッド形成検定において好都合である。該方法は、更に、キット、自動化および機器化に従う。したがって、本明細書中において開示された方法により、従来の検定標的に関する迅速で好都合且つ感度の高いサンドイッチ検定が可能である。本明細書中において開示された検定法は、これまで認識されなかったサンドイッチ検定のノイズ成分に取組んでいるので、それらは好都合である。従来、検定法は、サンドイッチ検定で用いられた支持体に対するおよび実際の標的と多少類似した試料中の材料に対する検出プローブの非特異的結合の結果として生じたノイズを減少させるように開発されてきた。核酸ハイブリッド形成検定において、これらは、標的に対して若干の類似性を有する核酸配列でありうる。概して、本発明の検定法を二重捕捉クラスＩおよびクラスＩＩ検定と称する。単一の捕捉プローブを検定の間中用いる従来のサンドイッチ検定とは対照的に、二重捕捉検定は、検定において多数の捕捉プローブを用いる。更に、捕捉プローブは、検定において用いられる支持体および標的双方に対して結合しうることが不可欠であり、更に、本発明の特徴は、検定において用いるための捕捉プローブを、あるものは標的よりも検定支持体に対して強く結合し、したがって支持体に結合したままの状態で標的から分離することができ、そして他のものは支持体よりも標的に対して強く結合し、したがって標的に結合したままの状態で支持体から分離することができるように構築し且つ選択することである。例えば、二重捕捉クラスＩ検定において、捕捉プローブは、標的の同じかまたは異なる部分に対して結合することができるが、更に、第一捕捉プローブは、それが結合している支持体よりも標的から容易に分離され、そして第二捕捉プローブは標的よりも支持体から容易に分離されるように構築される。最初に、第一捕捉プローブおよび検出プローブを試料と接触させ、そして標的と結合させて第一の三重複合体を生成する。次に、第一捕捉プローブに対して結合している第一支持体を試料と接触させる。次に、標的および検出プローブを、第一捕捉プローブを介して支持体に捕捉させる。第一支持体および結合した第一三重複合体を試料媒質から実質的に分離し且つ第二媒質に導入する。次に、三重複合体の標的および検出プローブを解放し、そして引き続き第二媒質から除去される第一捕捉プローブおよび支持体から分離する。おそらく、支持体および第一捕捉プローブの除去は、支持体および捕捉プローブに対して非特異的に結合した検出プローブを除去し、それによってバックグラウンドノイズを検定から除去するであろう。次に、第二捕捉プローブを最初に第二試料媒質に導入することによって標的および検出プローブを捕捉して三重複合体を生成した後、第二支持体を導入する。その後、第二支持体および第二三重捕捉プローブ：標的：検出プローブ複合体を、処理のために第三媒質に移すことができる。次に、第二支持体を第二の三重複合体から分離し且つ第三媒質から分離することができる。次に、三重複合体を検出プローブの存在または不存在に関して監視する。標的が元の試料中に存在する場合、検出プローブが検出される。おそらく、第二支持体の第三媒質からの分離は、第二支持体に対して非特異的に結合した検出プローブを除去するであろう。第一および第二捕捉プローブを用いる捕捉および解放は、どちらかの順でも実施することができる。更に、捕捉プローブかまたは更にもう一つの捕捉プローブを用いる追加の捕捉および解放サイクルを必要に応じて実施して、バックグラウンドノイズを更に減少させることができる。実施例１で例証したように、第一捕捉プローブを用いる１サイクルおよび第二捕捉プローブを用いる２サイクルは、バックグラウンドノイズをほとんど全部消去する。同様に、二重捕捉クラスＩＩの方法もまた、別個の捕捉プローブを用いてバックグラウンドノイズを除去する。この方法において、それぞれの捕捉プローブは標的の別々の部分に対して結合する。更に、それぞれの捕捉プローブは、一方は標的よりも支持体に対して強く結合するが、もう一方は支持体よりも標的に対して強く結合するように構築される。更に、捕捉プローブおよび支持体は、それらの間の交差反応性が最小であるように選択される。第一捕捉プローブおよび第一支持体は、それぞれ第二支持体および第二捕捉プローブに対して最小の親和性を有するように選択される。クラスＩＩの方法において、両方のプローブを標的に対して結合して検定を開始する。捕捉プローブの一方を、検定の完了において標的捕捉および解放サイクルに用いる。したがって、検定からのどんなに過剰の捕捉プローブでも、すなわち、標的に対して非特異的に結合したいずれの捕捉プローブでも、検出プローブを検定に導入する前にその量を最小にする工程を行なう。例えば、第一および第二捕捉プローブを、標的と混合し且つそれに対して結合して標的複合体を生成する。標的に対して結合していない過剰の第一捕捉プローブは、第二捕捉プローブには特異的であるが第一捕捉プローブに対して親和性でない第二支持体によって標的複合体を捕捉することにより除去することができる。第二支持体およびおよび捕捉された標的複合体を試料媒質から分離し且つ更に処理するために第二媒質に移すことができる。第二捕捉プローブを、第二支持体よりも標的に対して強く結合するように構築する。このようにして次に、標的複合体を第二支持体から分離することができる。第二支持体は第二媒質から分離することができる。その後、標的複合体を、第一捕捉プローブに特異的な第一支持体によって捕捉することができる。この第一捕捉プローブは、標的に対するよりも第一支持体に対して強く結合するように構築される。したがって、第一支持体および捕捉された標的複合体を第二媒質から分離し且つ更に処理するために第三媒質中に導入することができる。次に、標的および第二捕捉プローブを第一支持体および第一捕捉プローブから解放することができる。次に、第一支持体および第一捕捉プローブを第三媒質から分離することができ、おそらくは、検定においてノイズを引起こすことがある第一支持体に対して非特異的に結合した過剰の第二捕捉プローブが除去されるであろう。次に、標的および第二捕捉プローブを、検出プローブの存在下において最初に第一捕捉プローブの新たな供給によって捕捉した後、第一支持体によって捕捉することができる。第一支持体と、第二捕捉プローブ：標的：検出プローブの第二標的複合体および結合した第一捕捉プローブを含む捕捉された四重複合体とを第三媒質から分離し且つ第四試料処理媒質に導入することができる。次に、第二標的複合体を第一支持体および第一捕捉プローブから解放することができる。これらを試料媒質から分離し、それによって、第一支持体および第一捕捉プローブに対して非特異的に結合した過剰の検出プローブを除去し且つ検定からバッククラウンドノイズを減少させることができる。次に、第二標的複合体の捕捉および解放の１サイクルまたはそれ以上を対応する第二支持体を用いて実施して、バッククラウンドノイズを更に減少させることができる。更に、第一捕捉プローブおよび第一支持体を用いる１サイクルまたはそれ以上の捕捉および解放サイクルを実施することもできる。追加の捕捉および解放サイクルはいずれの順で実施してもよい。最後に、元の試料中の標的の存在または不存在を示す検出プローブの存在または不存在に関して第二標的複合体を監視する。当業者は、支持体および標的に対するプローブの結合が適当な結合条件の賦課によって促進されることを理解するであろう。同様に、標的およびプローブの支持体からの解放は、解放条件の賦課によって促進されることができる。結合および解放条件、例えば試料溶液中の試料温度および塩濃度の調節は、当該技術分野において周知である。当業者は、更に、両方の二重捕捉検定形式における捕捉および解放工程の間に洗浄工程を挿入してバックグラウンドノイズを更に減少させることができることを理解するであろう。更に、当業者は、検定の便宜上、しばしば捕捉プローブを対応する支持体とは別個に加えて複合体形成を容易にすることを理解するであろう。しかしながら、捕捉プローブおよび支持体は、別の状況で検定の実施を中断することなく同時に加えることができる。本発明の二重捕捉法は、従来のサンドイッチ検定法と適合しうる。該方法は、広範囲の一連の支持体、例えば、フィルター、ディップスティックおよび分散性粒子と適合しうる。該方法は、従来のサンドイッチ検定標的、例えば、抗原および核酸配列、更にはプローブとしてのそれらの対応する抗体および核酸結合性パートナーと適合しうる。該方法は、従来の標識部分および検出スキームと適合しうる。二重捕捉法は、特に、核酸ハイブリッド形成検定に十分適合する。該方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的に関する検定に等しく十分適合する。核酸プローブおよび支持体は、二重捕捉に必要とされる結合特性を伴って容易に構築される。例えば、標的特異的核酸配列は、ビオチンなどのリガンド結合対の一方のメンバーによって誘導化することができる。ビオチンに対するストレプトアビジンなどのリガンド結合対のもう一方のメンバーによって誘導化された支持体と一緒に用いた場合、このようなプローブは標的よりも支持体に対して強く結合するように、標的および支持体双方に結合する。すなわち、プローブが粒子ではなく標的から分離されるように条件を賦課することができる。同様に、このようなプローブおよび支持体は、標的特異的核酸配列をデアザデオキシグアノシン残基によって誘導化し且つ対応する支持体をデオキシシチジン残基によって誘導化することにより製造することができる。当業者は、他のプローブ−支持体の組合せを不可欠の性質を伴って考案することができることを理解するであろう。支持体よりも標的に対して強く結合するプローブは周知であり、従来のサンドイッチハイブリッド形成検定において日常的に用いられている。例えば、標的特異的核酸配列は、デオキシアデニル酸塩残基ｄＡなどの特異的ヌクレオチド残基のホモポリマー末端によって誘導化することができる。デオキシチミジン残基ｄＴで誘導化された支持体と一緒に用いた場合、このようなｄＡ末端付きプローブは、支持体よりも標的に対して強く結合するように、標的およびｄＴ誘導化支持体双方に対して結合する。すなわち、プローブが標的ではなく支持体から分離されるように条件を賦課することができる。核酸ハイブリッド形成検定は、更に、試料媒質中で分散性である支持体と適合しうる。このような支持体は捕捉プローブおよび支持体間の迅速なハイブリッド形成を可能にし、したがって一層迅速な検定操作を可能にするので、それらは特に好都合である。このような支持体の例は、ポリスチレンビーズおよび磁性粒子である。しかしながら、当業者は、このような支持体全部を試料媒質から捕捉し且つ分離することは困難であることを理解するであろう。それにもかかわらず、当業者は、検定に支障をきたすことなくこのような支持体の実質的に全部を分離することができるであろう。本発明の方法はキットとともに使用することができる。このようなキットは、用いられるクラスＩまたはクラスＩＩの方法に特異的な第一および第二捕捉プローブの供給を含む。更に、キットは検出プローブの供給を含む。全てのプローブは検出される標的に特異的である。更に、キットは、検定中の結合、解放および洗浄を容易にする適当な支持体および試薬の供給を含むことができる。実施例材料オリゴｄＴ₁₄およびｄＣ₁₄によって誘導化された常磁性粒子を実施例で用いるために以下のように調製した。サブミクロン酸化第二鉄粒子（アドバンスド・マグネティクス・インコーポレーテッド（ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ケンブリッジ、ＭＡ）を、モリセリー（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｒｙ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８１：３４５〜３４９（１９８９）によって記載された方法を用いてｄＴ₁₄またはｄＣ₁₄オリゴマーによって誘導化した。ビーズを、ビーズブロッキングバッファー（ＢｅａｄＢｌｏｃｋｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭトリス４．９％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ（Ｓｉｇｍａ）フラクション５、０．５％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）（シグマ）、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロノポル（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ）（イノレクス（Ｉｎｏｌｅｘ）、フィラデルフィア、ＰＡ）、０．０１％消泡剤［ダウ・コーニング（Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ）ＦＧ−１０］、ｐｈ７．８中において６５℃で４時間ブロックした。粒子の最終懸濁液は、結合能力が３００ピコモル（デオキシアデニル酸塩）ｄＡ₅₀／ｍｇである０．２５％（Ｗ／Ｖ）固体であった。使用直前に、粒子を緩衝液から分離し、そして新たなビーズブロッキングバッファー中並びにビーズブロッキングバッファーおよび４Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣ１）中０．０４５％にした。ストレプトアビジンによって誘導化された常磁性粒子は、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マディソン、ＷＩ）から入手した。トラコーマクラミジア由来の精製１６ＳｒＲＮＡを全実施例において標的として用いた。１６ＳｒＲＮＡは、従来の技法を用いて精製された。種々の核酸配列を、実施例で用いられるプローブ中に組込む。これらは、である。核酸配列３０１８、７８１および１６６０は、従来のβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学および従来の核酸合成機装置、例えば、３８０−Ｂシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスター・シティー、ＣＡ）を用いて製造された。該配列を捕捉および検出プローブとして用いるために以下のように修飾した。配列３０１８（配列番号１）を、最初に、第一アミンを含むように配列３０１８（配列番号１）の５′末端を修飾することによってビオチニル化してプローブＢ−３０１８を生成した。これは、アミノ−プロピル修飾シスチジンホスホルアミダイトを加えることによって達成された。リン酸塩およびヌクレオチド塩基の脱保護は、標準的な方法によって達成された。粗オリゴヌクレオチド混合物を逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した。アミノ修飾オリゴヌクレオチドを、フルオレポータービオチンラベリングキット（ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒＢｉｏｔｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）Ｆ−２６１０（モレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッド（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を用いてビオチンで標識した。配列７８１（配列番号２）および１６６０（配列番号３）は、各配列の３′末端を約１５０デオキシアデニル酸塩残基でテーリングして、プローブｄＡ−７８１およびｄＡ−１６６０を生成した。これは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ライフ・サイエンシズ・インコーポレーテッド（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）と一緒にインキュベーション後、ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：４１〜４７，１９７９の方法によって達成された。更に、配列３０１８（配列番号１）は、その配列の３′末端を約１５０デアザデオキシグアノシン残基（Ｃ７ｄＧ）でテーリングしてプローブＣ７ｄＧ−３０１８を生成した。これはネルソンらによって記載された方法を用いて達成された。配列Ｃ２９（配列番号４）を、更に修飾することなく全実施例において検出プローブとして用いた。ＲＮＡ配列Ｃ２９（配列番号４）は、従来の方法によって製造されたＣ２９（配列番号４）に対して相補的なＤＮＡ配列から製造された。相補的配列を転写酵素ベクター中にクローン化した。Ｃ２９を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼキット（プロメガ）を用いてクローン化ＤＮＡから転写した。実施例１〜３は、本発明の種々の実施態様、特徴および利点を例証するマトリックス実験を実証する。例えば、実施例１は、本発明のクラスＩ二重捕捉方法論と、標準的な可逆的標的捕捉方法論との平行した比較を提供する。該実施例は、比較のため、これらの検定方法論を用いる標的の検出およびこれらの検定中に生じたノイズの種々の成分を実証する。実施例１は、支持体に対する検出プローブおよび捕捉プローブに対する検出プローブの非特異的結合に起因する検定中に生じたノイズを実証する。実施例１この実施例は、トラコーマクラミジアの検出における本発明の二重捕捉クラスＩ方法論によるシグナルおよびノイズと、標準的な可逆的標的捕捉方法論によるそれらとを比較する。二重捕捉検定ではＢ−３０１８およびｄＡ−７８１捕捉プローブを用いた。ＲＴＣ検定ではｄＡ−７８１捕捉プローブのみを用いた。検定は以下のように行なった。５種類の溶液を調製した。溶液１は、４Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣ１）、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８および１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．４＊１０⁶精製標的分子、Ｂ−３０１８捕捉プローブ７０ｎｇＮＣ２９検出プローブ１．４＊１０¹²分子を含む７００マイクロリットルに調製した。溶液２は、４ＭＧｕＨＣ１、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．４＊１０⁶精製標的分子、ｄＡ−７８１捕捉プローブ７０ｎｇ、Ｃ２９検出プローブ１．４＊１０¹²分子を含む７００マイクロリットルに調製した。溶液３は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、Ｃ２９検出プローブ１．４＊１０¹²分子を含む７００マイクロリットルに調製した。溶液４は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、Ｂ−３０１８捕捉プローブ１６０ｎｇ、Ｃ２９検出プローブ３．２＊１０¹²分子を含む１６００マイクロリットルに調製した。溶液５は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、ｄＡ−７８１捕捉プローブ１６０ｎｇ、Ｃ２９検出プローブ３．２＊１０¹²分子を含む１６００マイクロリットルに調製した。１．５ｍｌポリプロピレン試験管（ミクロニクス（Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ）、フロー・ラボラトリーズ（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マクリーン、ＶＡ）用に８（Ａ−Ｈ）ｘ１２（１〜１２）９６ウェルラックを組立てた。溶液１〜５のアリコー卜５０マイクロリットルを以下のように試験管に加えた。溶液１の５０μｌ（１０⁵標的分子およびプローブ）を試験管Ａ−Ｂの１〜６に加えた。溶液２の５０μｌ（１０⁵標的分子およびプローブ）を試験管Ａ−Ｂの７〜１２に加えた。溶液３の５０μｌを試験管Ｃ１〜１２に加えた。溶液４の５０μｌを試験管Ｄ−Ｈの１〜６に加えた。溶液５の５０μｌを試験管Ｄ−Ｈの７〜１２に加えた。ラックの内容は以下のように図示することができる。ラックのセットアップ全試験管を３７℃で３０分間インキュベートして、該クラミジア属標的を捕捉プローブおよび検出プローブに対してハイブリッド形成させた。インキュベーション後、ビーズブロッキングバッファー［４％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ・フラクション５）、０．５％サルコシル、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％消泡剤］、ｐＨ８．０中０．０２３％ストレプトアビジン誘導化粒子の懸濁液３５０μｌを試験管Ａ−Ｈの１〜６それぞれに加えた。４ＭＧｕＨＣｌ含有ビーズブロッキングバッファー中０．０４５％ｄＴ₁₄誘導化粒子の懸濁液１００μｌを試験管Ａ〜Ｈの７〜１２それぞれに加えた。プラットホームボルテックス上で混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして三重捕捉プローブ：標的：検出プローブ複合体を捕捉した。粒子および捕捉された三重複合体を、本明細書中に参考として包含されているリー（Ｌｉ）らの米国特許第４，９８８，６１８号明細書に記載の磁性分離装置を用いて試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。次に、粒子を洗浄して、標的に結合していない検出プローブを除去した。ウォッシュバッファー［３００ｍＭＮａＣｌ、０．５％サルコシル、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、０．１％消泡剤］、ｐＨ８．１の２００マイクロリットルを各試験管に加えた。試験管を混合し且つ３７℃で２分間インキュベートした。粒子および捕捉された三重複合体を、上記に記載したように試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。同様の方法で粒子を２回以上洗浄した。次に、グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）バッファー［２．５ＭＧｕＳＣＮ）１００ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％サルコシルおよび０．５％ＢＳＡ］、ｐＨ７．８の１６０μｌを各試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートした。これによって、試験管Ａ〜Ｈの１〜６において三重複合体の標的：検出プローブセグメントは解放され、そして試験管Ａ〜Ｈの７〜１２において捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体が解放された。Ｂ−３０１８捕捉プローブは、試験管Ａ〜Ｈの１〜６においてストレプトアビジン粒子に結合したまま残る。５分後、上記に記載の磁性分離装置を用いて粒子を試験管の側面に集めた。上澄みを清浄な試験管に移した。次に、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ中５００ｎｇ／ｍｌのｄＡ−７８１捕捉プローブ４０μｌを試験管Ａ〜Ｈの１〜６の各上澄みに加えた。１０ｍＭトリスおよび１ｍＭＥＤＴＡの４０マイクロリットルを、試験管Ａ〜Ｈの７〜１２の各上澄みに加えた。試験管を３７℃で３０分間インキュベートして、試験管Ａ〜Ｈの１〜６においてｄＡ−７８１捕捉プローブを標的：検出プローブセグメントにハイブリッド形成させた。ビーズブロッキングバッファー中０．０５％ｄＴ₁₄粒子の３００マイクロリットルを全部の試験管に加えた。三重複合体をｄＴ₁₄ 粒子上に捕捉させた。粒子を上記に記載したように試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。次に、粒子を上記に記載のウォッシュバッファーで洗浄して、標的に結合していない検出プローブを除去した。上澄みを吸引除去した。次に、三重複合体を、上記に記載したようにリリースバッファー［２５ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．２％サルコシル、０．０５％ブロノポルおよび０．０５％ＢＳＡ］、ｐＨ８．１の１００μｌを加えることによって粒子から解放した。解放された三重複合体を含む上澄みを清浄な試験管に移した。次に、バッファーＡ［４％ＢＳＡ、４ＭＧｕＨＣｌ、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％サルコシルおよび０．１％消泡剤］、ｐＨ７．８中０．０４５％オリゴｄＴ₁₄粒子の懸濁液２００μｌを、解放された上澄みそれぞれに加えた。三重複合体を上記のように粒子上に捕捉させた。粒子を上記のように試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。次に、粒子をプレＡｍｐウォッシュバッファー［３００ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ］、ｐＨ８．０中で２回洗浄した。上澄みを吸引除去した。次に、プレＡｍｐリリースバッファー［５０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ）０．５％ＮＰ−４０］１５０μｌを各試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃でインキュベートした。これによって三重複合体を解放した。粒子を上記のように上澄みから分離した。標的の存在は、インターカレート染料ヨウ化プロピジウム存在下でＱβレプリカーゼによってＭＤＶ様Ｃ２９検出プローブを複製し且つ陽性反応を生じるのに必要な時間を測定することによって決定された。更に詳しくは、各試験管からの上澄み１００μｌを、２２０ｍＭトリスｐＨ７．８、４０ｍＭＭｇＣｌ₂、それそれ６００μＭのヌクレオチド三リン酸ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ヨウ化プロピジウム５０ｎｇおよび精製Ｑβレプリカーゼ（比活性２，０００単位／ｍｇ）１μｇの混合物１００μ ｌに加えた。Ｑβレプリカーゼは、本明細書中に参考として包含される米国特許第５，１４１，８５７号明細書に記載されたように得られた。試験管に蓋をし且つ測定するまで氷上で保持した。９６本の試験管を同時に処理した。各試験管を３７℃±０．２５℃で維持した。各試験管を５１０ｎｍで励起させ且つ６１０ｎｍで４０秒毎に４５分間読取った。発生蛍光の反応時間を数字によって分析した。反応時間は蛍光反応とベースライン（反応なし）の交点として得られた。交点は、蛍光反応に適合する３次元多項式を用いて決定された。ベースラインを平均した。反応時間は、試料中に存在する鋳型分子数の対数に反比例するため、標的の存在の定量化しうる測定値を表わす。カーヒルら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１４８２〜１４８５，１９９１。図１は、それぞれの方法の累積結果を示す。この図は、本発明の二重捕捉形式および標準ＲＴＣ形式を用いる検定によって生じた反応を示す。更に、図１は、標的存在下（真のシグナル）および標的不存在下（ノイズ）における検定によって生じた反応時間を示す。標的を含む二重捕捉法の１２本の試験管（Ａ〜Ｂの１〜６）の内の１０本が測定された。１０本全部が陽性反応を生じた。これらは、Ｔの上の縦列のスポットによって示される。標的を含む標準ＲＴＣ法の１２本の試験管（Ａ〜Ｂの７〜１２）の内の１１本が測定された。１１本全部が陽性反応を示した。捕捉プローブおよび検出プローブを含むが標的を省いた二重捕捉法の３０本の試験管（Ｄ〜Ｈの１〜６）の内の２３本が測定された。２３本の内の１本だけが陽性反応を生じた。これは、ＣＮの上の縦列のスポットによって示される。反応は、捕捉プローブに対するＣ２９検出プローブの非特異的結合の結果生じた周期性ノイズに起因する。捕捉プローブおよび検出プローブを含むが標的をを省いた標準ＲＴＣ法の３０本の試験管（Ｄ〜Ｈの７〜１２）の内の２８本が測定された。２８本全部が、周期性ノイズに起因する陽性反応を生じた。Ｃ２９検出プローブを含むが標的および捕捉プローブを除いた各検定法の６本の試験管（二重捕捉：Ｃ１〜６；ＲＴＣ：Ｃ７〜１２）の６本全部が測定された。ここでの反応は、検定において用いられた支持体に対する検出プローブの非特異的結合および／またはハイブリッド形成に起因すると考えられる。しかしながら、どの方法の試験管も陽性反応を生じたものはなかった。これは、ＮＳＨの上に縦列のスポットが存在しないことによって示される。図１で示された結果は、本発明の二重捕捉クラスＩ方法論が標準ＲＴＣ方法論よりも優れていることを実証する。図１が実証するように、両方の方法論で、標的存在下において生じたシグナルを検出することができる。同様に、両方の方法で、検定支持体に対する検出プローブの非特異的結合によって生じたバックグラウンドシグナル（ノイズ）を消去することができる。しかしながら、二重捕捉方法論は、周期性ノイズによって生じたバックグラウンドシグナルを消去するかまたは実質的に減少させるのに明らかに優れている。図１は、ＲＴＣ法で観察されたこのような周期性ノイズが、１０⁵標的で生じたシグナルと競合することを実証する。従って、検定の感度は、周期性シグナルによって約１０⁵標的に制限される。対照的に、二重捕捉検定で生じた周期性ノイズはほとんど完全に消去され、しかも１０⁵標的で生じたシグナルと明らかに区別される。図１は、二重捕捉検定が標準ＲＴＣ法よりもはるかに感度が高いことを実証する。実施例２この実施例は、トラコーマクラミジアの検出における二重捕捉クラスＩ方法の別個の実施態様のシグナルおよび周期性ノイズを比較する。検定の一つのセットは、実施例１の場合と同様にＢ−３０１８およびｄＡ−７８１捕捉プローブを用いて行なった。検定の第二のセットは、Ｃ７ｄＧ−３０１８およびｄＡ−７８１捕捉プローブを用いて行なった。両方のセットでＣ２９検出プローブを用いた。検定は以下のように行なった。５種類の溶液を調製した。溶液１は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８および１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．４＊１０⁶精製標的分子、Ｂ−３０１８捕捉プローブ１４０ｎｇ、Ｃ２９検出プローブ２．８＊１０¹²分子を含む１４００μｌに調製した。溶液２は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．４＊１０⁶精製標的分子、Ｃ７ｄＧ−３０１８捕捉プローブ１４０ｎｇ、Ｃ２９検出プローブ２．８＊１０¹²分子を含む１４００μｌに調製した。溶液３は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、Ｃ２９検出プローブ２．８＊１０¹²分子を含む１４００μｌに調製した。溶液４は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、Ｂ−３０１８捕捉プローブ３２０ｎｇ、Ｃ２９検出プローブ６．４＊１０¹²分子を含む３２００μｌに調製した。溶液５は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、Ｃ７ｄＧ−３０１８捕捉プローブ３２０ｎｇＮＣ２９検出プローブ６．４＊１０¹²分子を含む３２００μｌに調製した。１．５ｍｌポリプロピレン試験管（ミクロニクス、フロー・ラボラトリーズ）用に８（Ａ〜Ｈ）ｘ１２（１〜１２）９６ウェルラックを組立てた。溶液１〜５のアリコート１００マイクロリットルを以下のように試験管に加えた。溶液１の１００μｌ（１０⁵標的分子およびプローブ）を試験管ＡおよびＢの１〜６に加えた。溶液２の１００μｌ（１０⁵標的分子およびプローブ）を試験管ＡおよびＢの７〜１２に加えた。溶液３の１００μｌを試験管Ｃ１〜１２に加えた。溶液４の１００μｌを試験管Ｄ〜Ｈの１〜６に加えた。溶液５の１００μｌを試験管Ｄ〜Ｈの７〜１２に加えた。すなわち、試験管Ａ〜Ｈの１〜６は、Ｂ−３０１８捕捉プローブを用いる二重捕捉法の態様を実証し；試験管Ａ〜Ｈの７〜１２は、Ｃ７ｄＧ−３０１８捕捉プローブを用いる態様を実証する。次に、全試験管を３７℃で３０分間インキュベートして、該クラミジア属標的を捕捉プローブおよび検出プローブに対してハイブリッド形成させた。インキュベーション後、ビーズブロッキングバッファー［４％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、シグマ・フラクション５）、０．５％サルコシル、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％消泡剤］、ｐＨ８．０中０．０２７％ストレプトアビジン誘導化粒子の懸濁液３００μｌを、試験管Ａ〜Ｈの１〜６それぞれに加えた。４ＭＧｕＨＣｌ含有ビーズブロッキングバッファー中０．０４５％ｄ（Ｃ）₁₄誘導化粒子の懸濁液２００μｌを試験管Ａ〜Ｈの７〜１２それぞれに加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして、三重捕捉プローブ：標的：検出プローブハイブリッドを捕捉した。次に、粒子を、米国特許第４，９８８，６１８号明細書に記載の磁性分離装置を用いて試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。次に、全部の試験管の粒子を洗浄して、標的に結合していない検出プローブを除去した。ローソルトウォッシュ／リリースバッファー［２５ｍＭＮａＣｌ、０．２％サルコシル、２５ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＢＳＡ）０．０５％ブロノポール］、ｐＨ８．１の２００マイクロリットルを各試験管に加えた。次に、試験管をプラットホームボルテックス上で３０秒間混合し且つ３７℃で２分間インキュベートした。粒子および捕捉されたハイブリッドを、上記に記載の磁性分離装置を用いて試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。同様の方法で粒子を２回以上洗浄した。次に、グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）バッファー［２．５ＭＧｕＳＣＮ）１００ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％サルコシルおよび０．５％ＢＳＡ］、ｐＨ７．８の１００μｌを各試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートした。この結果として三重複合体の標的：検出プローブセグメントが解放されたが、それはＢ−３０１８およびＣ７ｄＧ−３０１８５捕捉プローブが標的からではなく粒子から解離することによる。５分後、上記に記載の磁性分離装置を用いて粒子を試験管の側面に集めた。上澄みを清浄な試験管に移した。次に、１０ｍＭＥＤＴＡ中３００ｎｇ／ｍｌのｄＡ−７８１捕捉プローブ５０μｌを各上澄みに加えた。試験管を３７℃で３０分間インキュベートして、ｄＡ−７８１捕捉プローブを標的：検出プローブにハイブリッド形成させた。ビーズブロッキングバッファー中０．０５％ｄＴ₁₄粒子の２００マイクロリットルを全部の試験管に加えた。三重複合体をｄＴ₁₄粒子上に捕捉させた。次に、粒子を上記に記載したように試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。次に、粒子をハイソルトウォッシュバッファー［３００ｍＭＮａＣｌ、０．５％サルコシル、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ）０．５％ＢＳＡ、０．１％消泡剤］、ｐＨ８．１で洗浄して、標的に結合していない検出プローブを除去した。次に、三重複合体を、上記に記載のローソルトウォッシュ／リリースバッファー１００μｌ／試験管中に放出した。放出された上澄みを清浄な試験管に移した。次に、バッファーＡ［４％ＢＳＡ、４ＭＧｕＨＣｌ）１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ）０．５％サルコシルおよび０．１％消泡剤］、ｐＨ７．８中のｄＴ₁₄粒子懸濁液２００μｌを各試験管に加えた。三重複合体を上記のように粒子上に捕捉させた。粒子を上記のように試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。次に、粒子をハイソルトウォッシュバッファー中で２回洗浄した。次に、三重複合体をローソルトウォッシュ／リリースバッファー１００μｌ中に放出した。放出された上澄みを清浄な試験管に移した。次に、バッファーＡ中のｄＴ₁₄粒子懸濁液２００μｌをそれぞれの上澄みに加え、そして三重複合体を捕捉させた。粒子を前記のように試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。次に、粒子を前記のようにプレＡｍｐバッファー［３００μＭＫＣｌ）５０μＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ］、ｐＨ８．０中で２回洗浄した。最後に、三重複合体を、前記に記載のプレＡｍｐリリースバッファー［５０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％ＮＰ−４０］１５０μ ｌ中に放出した。粒子を前記のように上澄みから分離した。標的の存在は実施例１の場合と同様に決定された。図２は、標的の存在下において（Ｔ欄）および周期性ノイズによって（ＣＮ欄）生じた反応に関する各方法の累積結果を示す。標的、捕捉および検出プローブを含む各検定の１２本の試験管（試験管Ａ〜Ｂの１〜６はＢ−３０１８捕捉プローブを用い且つＡ〜Ｂの７〜１２はＣ７ｄＧ− ３０１８捕捉プローブを用いる）の１２本全部が測定された。全部の試験管が陽性反応を示した。捕捉および検出プローブを含むが標的を省いた試験管（Ｂ−３０１８捕捉プローブにはＤ〜Ｈの１〜６、Ｃ７ｄＧ−３０１８捕捉プローブにはＤ〜Ｈの７〜１２）全部が測定された。Ｂ−３０１８捕捉プローブを用いる３０本の試験管の内の７本だけが陽性反応を生じた。Ｃ７ｄＧ−３０１８捕捉プローブを用いる３０本の試験管の内の３本だけが陽性反応を生じた。これらの反応は周期性ノイズに起因する。図２の結果は、標的から生じたシグナルを周期性ノイズに起因するシグナルに相対して区別する能力においてそれらの検定が同様であることを実証する。実施例３この実施例は、本発明の二重捕捉クラスＩＩ方法論からのシグナルおよびノイズと、匹敵するＲＴＣ法からのそれらとを比較する。二重捕捉クラスＩＩ検定ではＢ−３０１８およびｄＡ−１６６０捕捉プローブを用いた。これらのプローブは、標的トラコーマクラミジア１６ＳｒＲＮＡの独特の配列に対してハイブリッド形成する。核酸配列１６６０（配列番号３）は、１６Ｓ真正細菌ｒＲＮＡに対して普遍的な配列である。ＲＴＣ検定ではｄＡ−１６６０捕捉プローブのみを用いた。検定は以下のように行なった。９種類の溶液を以下のように調製した。溶液１は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．１＊１０⁷精製標的分子、Ｂ−３０１８捕捉プローブ１１０ｎｇおよびｄＡ−１６６０捕捉プローブ１１０ｎｇを含む１１００μｌに調製した。溶液２は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．１＊１０⁷精製標的分子およびｄＡ−１６６０捕捉プローブ１１０ｎｇを含む１１００μｌに調製した。溶液３は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．１＊１０⁶精製標的分子、Ｂ−３０１８捕捉プローブ１１０ｎｇおよびｄＡ−１６６０捕捉プローブ１１０ｎｇを含む１１００μｌに調製した。溶液４は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、１．１＊１０⁶精製標的分子およびｄＡ−１６６０捕捉プローブ１１０ｎｇを含む１１００μｌに調製した。溶液５は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、Ｂ−３０１８捕捉プローブ１６０ｎｇおよびｄＡ−１６６０捕捉プローブ１６０ｎｇを含む１６００μｌに調製した。溶液６は、４ＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡ中に、ｄＡ−１６６０捕捉プローブ１６０ｎｇを含む１６００μｌに調製した。溶液７は、４ｍＭＧｕＨＣｌ、１２５ｍＭトリスｐＨ７．８、１６ｍＭＥＤＴＡを含む１１００μｌに調製した。溶液８は、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に、Ｂ−３０１８捕捉プローブ７５０ｎｇおよびＣ２９検出プローブ３．８＊１０¹²分子を含む２５００μｌに調製した。溶液９は、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８中に、ｄＡ−７８１捕捉プローブ７５０ｎｇおよびＣ２９検出プローブ３．８＊１０¹²分子を含む２５００μｌに調製した。１．５ｍｌポリプロピレン試験管用の８ｘ１２の９６ウェルラックの８（Ａ〜Ｈ）ｘ１０（１〜１０）ウェルを組立てた。溶液１〜７のアリコート１００マイクロリットルを以下のように試験管に加えた。溶液１の１００μｌ（１０⁵標的分子および捕捉プローブ）を試験管Ａ〜Ｂの１〜５に加えた。溶液２の１００μｌ（１０⁵標的分子および捕捉プローブ）を試験管Ａ〜Ｂの６〜１０に加えた。溶液３の１００μｌ（１０⁵標的分子および捕捉プローブ）を試験管Ｃ〜Ｄの１〜５に加えた。溶液４の１００μｌ（１０⁵標的分子および捕捉プローブ）を試験管Ｃ〜Ｄの６〜２０に加えた。溶液５の１００μｌを試験管Ｅ〜Ｇの１〜５に加えた。溶液６の１００μｌを試験管Ｅ〜Ｇの６〜１０に加えた。溶液７の１００μｌを試験管Ｈ１〜１０に加えた。全試験管を３７℃で３０分間インキュベートして、該クラミジア属標的を捕捉プローブに対してハイブリッド形成させた。インキュベーション後、４ＭＧｕＨＣｌ含有ビーズブロッキングバッファー、ｐＨ７．８中、０．０４５％ｄ（Ｔ）₁₄誘導化粒子懸濁液２００μｌを各試験管に加えた。プラットホームボルテックス上で混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして、捕捉プローブ：標的ハイブリッドを捕捉した。粒子を、前記の磁性分離装置を用いて試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。次に、粒子を洗浄して、標的に結合していない捕捉プローブを除去した。ハイソルトウォッシュバッファー［３００ｍＭＮａＣｌ、０．５％サルコシル、１００ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、０．１％消泡剤］、ｐＨ８．１の２００マイクロリットルを各試験管に加えた。試験管をプラットホームボルテックス上で混合し且つ３７℃で２分間インキュベートした。粒子および捕捉されたハイブリッドを、米国特許第４，９８８，６１８号明細書に記載の磁性分離装置を用いて試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。粒子およびハイブリッドを同様のハイソルトウォッシュバッファー中で再度洗浄した。次に、ローソルトウォッシュ／リリースバッファー［２５ｍＭＮａＣｌ、０．２％サルコシル、２５ｍＭトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）０．０５％ブロノポール］、ｐＨ８．１の１００マイクロリットルを全部の試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして、捕捉プローブハイブリッドを粒子から解放した。粒子を試験管の側面に集めた。上澄みを新規の試験管に移した。次に、１ＭＧｕＨＣｌを更に含むビーズブロッキングバッファー中０．０４％ストレプトアビジン誘導化常磁性粒子の懸濁液１００μｌを各試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして、標的捕捉プローブハイブリッドを再捕捉した。次に、粒子を試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。次に、粒子および捕捉されたハイブリッドをハイソルトウォッシュバッファーおよびローソルトウォッシュバッファーで各１回洗浄して、標的に結合していない捕捉プローブを除去した。次に、グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）バッファー［２．５ＭＧｕＳＣＮ）１００ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％サルコシルおよび０．５％ＢＳＡ］、ｐＨ７．８の１００μｌを全部の試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして、標的：ｄＡ−１６６０捕捉プローブハイブリッドを解放した。これらの条件下で、二重捕捉クラスＩＩ検定で用いられたＢ−３０１８捕捉プローブは、ストレプトアビジン粒子に結合したまま残る。次に、粒子を前記のように試験管の側面に集めた。上澄みを清浄な試験管に移した。次に、溶液８（Ｂ−３０１８捕捉プローブおよび検出プローブを含む）５０μ ｌを試験管Ａ〜Ｈの１〜５に加えた。同様に、溶液９（ｄＡ−７８１捕捉プローブおよび検出プローブを含む）５０μｌを試験管Ａ〜Ｈの６〜１０に加えた。試験管を３７℃で３０分間インキュベートして、三重捕捉プローブ：標的：検出プローブ複合体を生成させた。次に、ビーズブロッキングバッファー中０．０４％ストレプトアビジン誘導化粒子の懸濁液１５０μｌを試験管Ａ〜Ｈの１〜５それぞれに加えた。同様にビーズブロッキングバッファー中０．０５％ｄ（Ｔ）₁₄誘導化粒子の懸濁液３００μ ｌを試験管Ａ〜Ｈの６〜１０それぞれに加えた。試験管を３７℃で５分間インキュベートして、三重複合体を粒子に捕捉させた。粒子および捕捉された三重複合体を前記のように試験管の側面に集めた。上澄みを吸引除去した。次に、粒子を記載のハイソルトウォッシュバッファーで洗浄して、標的に結合していない検出プローブを除去した。次に、２．５ＭＧｕＳＣＮバッファー１００μｌを全部の試験管に加えた。混合後、試験管を３７℃で５分間インキュベートして、三重複合体を解放させた。更に詳しくは、試験管Ａ〜Ｈの１〜５において、三重ｄＡ−１６６０捕捉プローブ：標的：検出プローブ複合体は該バッファー中に放出されるが、Ｂ−３０１８捕捉プローブは粒子に結合したまま残る。試験管Ａ〜Ｈの６〜１０において、複合体は２種類の捕捉プローブ、標的および検出プローブを含む。粒子を試験管の側面に集め、そして上澄みを清浄な試験管に移した。次に、ビーズブロッキングバッファー中０．０４５％ｄＴ₁₄誘導化粒子の懸濁液２００μｌをそれぞれの上澄みに加えた。複合体を前記のように粒子上に捕捉させた。粒子を試験管の側面に集め、そして上澄みを吸引除去した。粒子をハイソルトウォッシュバッファー中で２回洗浄した。次に、三重複合体をローソルトウォッシュ／リリースバッファー１００μｌ中に放出した。上澄みの三重複合体を清浄な試験管に移した。次に、バッファーＡ中のｄＴ₁₄粒子懸濁液２００μｌをそれぞれの上澄みに加えた。複合体を前記のように粒子上に再捕捉させた。粒子を上澄みから分離し且つプレＡｍｐウォッシュバッファー［３００μＭＫＣｌ、５０μＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ］、ｐＨ８．０中で２回洗浄した。三重捕捉プローブ：標的：検出プローブ複合体を、前記のプレＡｍｐリリースバッファー［５０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％ＮＰ−４０］１５０μｌ中に放出した。粒子を前記のように上澄みから分離した。標的の存在は、実施例１および２の場合と同様に決定された。図３は、１０⁶ 標的分子（Ａ〜Ｈの１〜１０）および１０⁵標的分子（Ｃ−Ｄの１〜１０）の標的の存在下において並びに周期性ノイズによって（Ｅ〜Ｇの１〜１０）生じた反応に関する各方法の累積結果を、それぞれＴ⁶、Ｔ⁵およびＣＮの欄に示す。標的（１０⁶および１０⁵標的）、捕捉および検出プローブに関する各二重捕捉クラスＩＩ検定の１０本の試験管の１０本全部が測定された。全部の試験管が陽性反応を示した。１０⁶標的、捕捉および検出プローブに関するＲＴＣ検定法の１０本の試験管全部が測定された。１０本全部が陽性反応を示した。１０⁵標的、捕捉および検出プローブに関するＲＴＣ法の１０本の試験管の内の９本が測定された。９本全部が陽性反応を示した。捕捉および検出プローブを含むが標的を除いた１５本の試験管の内の１４本が各検定法に関して測定された。二重捕捉クラスＩＩ方法を用いる１４本の試験管の内の１本だけが陽性反応を示した。対照的に、比較しうるＲＴＣ法を用いる１４本の試験管の１４本全部が陽性反応を示した。更に重要なことに、周期性ノイズに起因するこのシグナルは、１０⁵標的によって生じたシグナルに匹敵し且つそれと区別がつかない。従って、ここで例証したＲＴＣ法の感度は周期性ノイズによって制限される。しかしながら、二重捕捉クラスＩＩ方法の感度はそのように制限されないし、しかも１０⁵標的を容易に越える。【配列表】配列番号：１配列の長さ：２６塩基配列の型：塩基配列鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡプローブ配列の特徴：CHLAMYDIA TRACHOMATIS １６ＳｒＲＮＡに特異的なプローブ第１捕捉用記号：GTS OLIGO NUMBER 3018 配列：配列番号：２配列の長さ：３６塩基配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡプローブ配列の特徴：CHLAMYDIA TRACHOMATIS １６ＳｒＲＮＡに特異的なプローブ第２捕捉用記号：GTS OLIGO NUMBER 781 配列：配列番号：３配列の長さ：４５塩基配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡプローブ配列の特徴：主要な真正細菌１６ＳｒＲＮＡ用のバクテリアプローブクラスＩＩ検定用記号：GTS OLIGO NUMBER 1660 配列：配列番号：４配列の長さ：２８０塩基配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＲＮＡプローブ配列の特徴：CHLAMYDIA １６ＳｒＲＮＡ検出プローブＱ−ＢＥＴＡレプリカーゼによりインビトロ複製可能記号：GTS OLIGO NUMBER 1126,C29 RNA MOLECULE 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リュー，ジンアメリカ合衆国マサチューセッツ州02154, ウォルサム，ベッドフォード・ストリート 53 (72)発明者スミス，ジェームズアメリカ合衆国マサチューセッツ州01545, シュルースバリー，サウス・ストリート 237―１ (72)発明者サーペ，ユージンアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27103，ウィンストン―セーレム，ロックランド・アベニュー 865 (72)発明者ポポフ，ソンヤアメリカ合衆国マサチューセッツ州01778, ウェイランド，レイク・ロード 53

Claims

【特許請求の範囲】１．標的に関して試料を検定する方法であって、ａ．試料と、第一捕捉プローブと、標的存在下において標的に対して結合する検出プローブとを接触させて、第一捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体を生成し；ｂ．該三重複合体の標的：検出プローブセグメントを第一捕捉プローブから分離し；ｃ．試料と、標的存在下において標的に対して結合する第二捕捉プローブとを接触させて第二捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体を生成し；ｄ．第二捕捉プローブに対して非特異的に結合した検出プローブの量を最小限にし；そしてｅ．検出プローブの存在または不存在に関して第二三重複合体を監視する工程を含む上記方法。２．ａ．試料と、第一捕捉プローブに対して結合する第一支持体とを接触させ；ｂ．第一支持体および結合した第一三重複合体を試料から実質的に分離し；ｃ．第一支持体および結合した第一三重複合体を第二媒質に導入し且つ第一三重複合体の標的：検出プローブセグメントを第一支持体および第一捕捉プローブから解放し；ｄ．第一支持体および第一捕捉プローブを第二媒質から実質的に分離し；ｅ．標的存在下において標的に対して結合する第二捕捉プローブを第二媒質に導入して第二捕捉プローブ：標的：検出プローブ三重複合体を生成し；ｆ．第二媒質と、第二捕捉プローブに対して結合する第二支持体とを接触させ；ｇ．第二支持体および結合した第二三重複合体を第二媒質から実質的に分離し；ｈ．第二支持体および結合した第二三重複合体を第三媒質に導入し且つ第二三重複合体を第二支持体から解放し；そしてｉ．第二支持体を第三媒質から実質的に分離することを含む工程によって、三重複合体の標的：検出プローブセグメントを第一捕捉プローブから分離し且つ第二捕捉プローブに対して非特異的に結合した検出プローブの量を最小限にする請求項１に記載の方法。３．標的がポリヌクレオチドである請求項１に記載の方法。４．１種類またはそれ以上の分散性支持体を用いる請求項１に記載の方法。５．ａ．第三媒質と、第三支持体が第二捕捉プローブに対して結合している該第三支持体とを接触させ；ｂ．第三支持体および結合した第二三重複合体を第三媒質から実質的に分離し；ｃ．第三支持体および結合した第二三重複合体を第四媒質中に導入し且つ第二三重複合体を第三支持体から解放し；そしてｄ．第三支持体を第四媒質から実質的に分離することを含む工程の１サイクルまたはそれ以上を更に含む請求項２に記載の方法。６．標的がポリヌクレオチドである請求項５に記載の方法。７．支持体が試料媒質中において分散性である請求項５に記載の方法。８．標的捕捉および解放の２サイクルを更に含む請求項２に記載の方法。９．標的に関して試料を検定する方法であって、ａ．試料と、第一捕捉プローブと、標的存在下において標的に対して結合する第二捕捉プローブとを接触させて標的複合体を生成し；ｂ．試料中に存在する第二捕捉プローブの量を最小限にし；ｃ．試料と、検出プローブと、標的存在下において標的に対して結合する新たな第一捕捉プローブとを接触させて、第二捕捉プローブ：標的：検出プローブの第二標的複合体および結合した第一捕捉プローブを含む四重複合体を生成し；ｄ．第二標的複合体の第二捕捉プローブに対して結合した検出プローブの量を最小限にし；そしてｅ．検出プローブの存在または不存在に関して第二標的複合体を監視する工程を含む上記方法。１０．ａ．試料と、第二捕捉プローブに対して結合する第二支持体とを接触させ；ｂ．第二支持体および結合した標的複合体を試料から実質的に分離し；ｃ．第二支持体および結合した標的複合体を第二媒質中に導入し且つ標的複合体を第二支持体から解放し；ｄ．第二支持体を第二媒質から実質的に分離し；ｅ．標的複合体を含む第二媒質と、第一捕捉プローブに対して結合する第一支持体とを接触させ；ｆ．第一支持体および結合した標的複合体を第二媒質から実質的に分離し；ｇ．第一支持体および結合した標的複合体を第三媒質中に導入し且つ標的複合体の第二捕捉プローブ：標的セグメントを第一支持体および第一捕捉プローブから解放し；そしてｈ．第一支持体および第一捕捉プローブを第三媒質から実質的に分離することを含む工程によって、試料中に存在する第二捕捉プローブの量を最小限にする請求項９に記載の方法。１１．ａ．第三媒質と、第一捕捉プローブと結合する新たな第一支持体とを接触させ；ｂ．第一支持体および結合した四重複合体を第三媒質から実質的に分離し；ｃ．第一支持体および結合した四重複合体を第四媒質中に導入し且つ第二標的複合体を第一支持体および結合した第一捕捉プローブから解放し；そしてｄ．第一支持体および結合した第一捕捉プローブを第四媒質から実質的に分離することを含む工程によって、第二標的複合体の第二捕捉プローブに対して結合した検出プローブの量を最小限にする請求項１０に記載の方法。１２．ａ．第四媒質と、第二捕捉プローブに対して結合する第二支持体とを接触させ；ｂ．第二支持体および結合した第二標的複合体を第四媒質から実質的に分離しｃ．第二支持体および結合した第二標的複合体を第五媒質中に導入し且つ第二標的複合体を第二支持体から解放し；そしてｄ．第二支持体を第五媒質から実質的に分離することを含む工程の１サイクルまたはそれ以上を更に含む請求項１１に記載の方法。１３．１サイクルまたはそれ以上の追加の標的捕捉および解放サイクルを更に含む請求項１１に記載の方法。１４．支持体が試料媒質中において分散性である請求項１１に記載の方法。１５．標的がポリヌクレオチドである請求項９に記載の方法。１６．第一捕捉プローブの供給、別個の第二捕捉プローブの供給および検出プローブの供給を含む請求項１に記載の方法を実施するためのキット。１７．第一捕捉プローブの供給、第二捕捉プローブの供給および検出プローブの供給を含む請求項９に記載の方法を実施するためのキット。