JP3170714B2 - クラミジア・トラコマチスを検出するための核酸プローブ - Google Patents
クラミジア・トラコマチスを検出するための核酸プローブInfo
- Publication number
- JP3170714B2 JP3170714B2 JP50880590A JP50880590A JP3170714B2 JP 3170714 B2 JP3170714 B2 JP 3170714B2 JP 50880590 A JP50880590 A JP 50880590A JP 50880590 A JP50880590 A JP 50880590A JP 3170714 B2 JP3170714 B2 JP 3170714B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- probe
- chlamydia trachomatis
- chlamydia
- probes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はクラミジア・トラコマチス（Chlamydia tra
chomatis）菌種に属する細菌を検出することに関するも
のであり、より詳細にはクラミジア・トラコマチスを特
異的に検出するための核酸プローブおよび組成物ならび
にそれらの使用法を提供するものである。
chomatis）菌種に属する細菌を検出することに関するも
のであり、より詳細にはクラミジア・トラコマチスを特
異的に検出するための核酸プローブおよび組成物ならび
にそれらの使用法を提供するものである。
発明の背景 ここで用いる“クラミジア・トラコマチス”という語
はBergey's Manual of Synthetic Bacteriology
（スニース（P.H.A.Sneath）編,1986,pp.729−736,ウィ
リアムズ・アンド・ウィルキンス）にそのように分類さ
れている細菌を意味する。クラミジア・トラコマチスは
クラミジア属の一員であり、これは他に１種の員子、す
なわちオーム病クラミジア（C.psittaci）を含むにすぎ
ない。クラミジア属は特異な一群の細胞内寄生体であ
る。クラミジア属は２形態を特色とする複雑な生活環を
もつ：ウイルスのように感染性であるが、代謝活性を示
さない基本小体（EB）、および代謝活性を示すが感染性
がなく、細菌のように二分裂により分裂する網状体（R
B）。RBは成熟して最終的にEBとなり、感染細胞により
放出される。この過程に約２日を要する。
はBergey's Manual of Synthetic Bacteriology
（スニース（P.H.A.Sneath）編,1986,pp.729−736,ウィ
リアムズ・アンド・ウィルキンス）にそのように分類さ
れている細菌を意味する。クラミジア・トラコマチスは
クラミジア属の一員であり、これは他に１種の員子、す
なわちオーム病クラミジア（C.psittaci）を含むにすぎ
ない。クラミジア属は特異な一群の細胞内寄生体であ
る。クラミジア属は２形態を特色とする複雑な生活環を
もつ：ウイルスのように感染性であるが、代謝活性を示
さない基本小体（EB）、および代謝活性を示すが感染性
がなく、細菌のように二分裂により分裂する網状体（R
B）。RBは成熟して最終的にEBとなり、感染細胞により
放出される。この過程に約２日を要する。
これらの菌は眼性疾患、呼吸器系疾患、および性的に
伝搬される疾患における役割のため、世界的に主要な保
健上の危険性をもたらす（ニコルスおよびマニレ（Nich
ols,R.L.,Manire,G.P.）：クラミジア、Microbiology,3
版、デイビス、ドゥルベッコ、アイゼンおよびギンスバ
ーグ（Davis,B.D.,Dulbecco,R.,Eisen,H.N.,Ginsburg,
H.S.）（編）、1980,776−784、ハーパー・アンド・ロ
ー）。クラミジア・トラコマチスは開発途上国における
ほぼ35000万症例に関与する（ドーソン（Dawson,C.
R.）、ヒト−クラミジア感染症に関する第５回国際シン
ポジウム会報、スウェーデン、ランド、1982年６月15−
19日、マーズ、ホルメス、オリル、パイオット、シャハ
テル（Mardh,P.A.,Holmes,K.K.,Oril,J.D.,Piot,P.,Sch
achter,J,）（編）、1982,71−81、エルスフィール・バ
イオメディカル・プレス、アムステルダム、ニューヨー
ク、オックスフォード）。トラコーマは予防しうる失明
の主因でもあるから、これは特に悲惨である（ジョーン
ズ（Jones,B.R.）,1975,Trans.Opthalmol.Soc.UK,95:16
−33）。この菌による感染は工業国における最も一般的
な性的伝搬による疾病であると今日では認識され（疾病
コントロールセンター、性的伝搬による疾病部門。クラ
ミジア・トラコマチス感染症。予防およびコントロール
のための対策ガイドライン。MMWR1985;34:53S−74S）、
米国内だけでも400万症例以上に関与する（ジャドソン
（Judson FN）1985,J.Reprod.Med.30:269−272）。直
接的および間接的経費は数十億ドルに達する。
伝搬される疾患における役割のため、世界的に主要な保
健上の危険性をもたらす（ニコルスおよびマニレ（Nich
ols,R.L.,Manire,G.P.）：クラミジア、Microbiology,3
版、デイビス、ドゥルベッコ、アイゼンおよびギンスバ
ーグ（Davis,B.D.,Dulbecco,R.,Eisen,H.N.,Ginsburg,
H.S.）（編）、1980,776−784、ハーパー・アンド・ロ
ー）。クラミジア・トラコマチスは開発途上国における
ほぼ35000万症例に関与する（ドーソン（Dawson,C.
R.）、ヒト−クラミジア感染症に関する第５回国際シン
ポジウム会報、スウェーデン、ランド、1982年６月15−
19日、マーズ、ホルメス、オリル、パイオット、シャハ
テル（Mardh,P.A.,Holmes,K.K.,Oril,J.D.,Piot,P.,Sch
achter,J,）（編）、1982,71−81、エルスフィール・バ
イオメディカル・プレス、アムステルダム、ニューヨー
ク、オックスフォード）。トラコーマは予防しうる失明
の主因でもあるから、これは特に悲惨である（ジョーン
ズ（Jones,B.R.）,1975,Trans.Opthalmol.Soc.UK,95:16
−33）。この菌による感染は工業国における最も一般的
な性的伝搬による疾病であると今日では認識され（疾病
コントロールセンター、性的伝搬による疾病部門。クラ
ミジア・トラコマチス感染症。予防およびコントロール
のための対策ガイドライン。MMWR1985;34:53S−74S）、
米国内だけでも400万症例以上に関与する（ジャドソン
（Judson FN）1985,J.Reprod.Med.30:269−272）。直
接的および間接的経費は数十億ドルに達する。
より重篤な合併症には子宮外妊娠および卵管性不妊症
がある（ワシントン（Washington）ら、1987,JAMA257:2
070−2072）。これら２種類のクラミジア・トラコマチ
ス感染症の発現はさらに他の２群を反映する：眼および
生殖器感染症の原因となるトラコーマ亜種（biovar）、
ならびに性病性リンパ肉芽腫（LGV）亜種。これら２亜
種はさらに15血清型（serotype）に小分割される:A,B,B
a,C（通常は胞性結膜炎を伴う）、Ｄ−Ｋ、およびL1
−L3。
がある（ワシントン（Washington）ら、1987,JAMA257:2
070−2072）。これら２種類のクラミジア・トラコマチ
ス感染症の発現はさらに他の２群を反映する：眼および
生殖器感染症の原因となるトラコーマ亜種（biovar）、
ならびに性病性リンパ肉芽腫（LGV）亜種。これら２亜
種はさらに15血清型（serotype）に小分割される:A,B,B
a,C（通常は胞性結膜炎を伴う）、Ｄ−Ｋ、およびL1
−L3。
これらの疾病の診断はしばしば時間および労力を要す
る。クラミジア・トラコマチスには細胞培養が“ゴール
ドスタンダード”であると考えられている。細胞培養は
時間がかかり冗長であり、多数の臨床分離物を組織培養
により増殖させるのは困難であるので、最近多数の迅速
な実験室的方法が用いられるようになった（バーンズ
（Barnes RC）,1989,Clin.Microbiol.Rev.2:119−13
6）。それらは大部分が抗体による試験法である。特定
の場合にはこれらの迅速アッセイ法は細胞培養より感度
または特異性が高いことが証明されたが、それらの有用
性はその迅速性にある。
る。クラミジア・トラコマチスには細胞培養が“ゴール
ドスタンダード”であると考えられている。細胞培養は
時間がかかり冗長であり、多数の臨床分離物を組織培養
により増殖させるのは困難であるので、最近多数の迅速
な実験室的方法が用いられるようになった（バーンズ
（Barnes RC）,1989,Clin.Microbiol.Rev.2:119−13
6）。それらは大部分が抗体による試験法である。特定
の場合にはこれらの迅速アッセイ法は細胞培養より感度
または特異性が高いことが証明されたが、それらの有用
性はその迅速性にある。
本発明の観点は、クラミジア属に特異的であり、試料
中に存在する可能性のある他の細菌または菌類と反応せ
ず、かつ多様なアッセイ系に使用しうる核酸プローブを
提供することである。
中に存在する可能性のある他の細菌または菌類と反応せ
ず、かつ多様なアッセイ系に使用しうる核酸プローブを
提供することである。
本発明の他の観点は、普通のアッセイ条件下でプロー
ブに到達しうる状態にされたターゲット領域にハイブリ
ダイズしうるプローブを提供することである。
ブに到達しうる状態にされたターゲット領域にハイブリ
ダイズしうるプローブを提供することである。
本発明のさらに他の観点は、日数を要する伝統的な培
養法に付随する多数の欠点を避けるアッセイ法を提供す
ることである。
養法に付随する多数の欠点を避けるアッセイ法を提供す
ることである。
コーン（Kohne）ら（Biophysical Journal,8:1104−
1118,1968）はrRNA配列に対するプローブの製法につい
て論じているが、クラミジア・トラコマチス特異性プロ
ーブの調製に必要な教示を行っていない。
1118,1968）はrRNA配列に対するプローブの製法につい
て論じているが、クラミジア・トラコマチス特異性プロ
ーブの調製に必要な教示を行っていない。
ペースおよびキャンベル（Pace,Campbell）（Journal
of Bactreriology,107:543−547,1971）は多数の細
菌種からのリボソームリボ核酸の相同性、およびこの相
同性を定量するためのハイブリダイゼーション法につい
て論じている。同様にソージン、ソージンおよびベーゼ
（Sogin,Sogin,Woese）（Journal of Molecular Evo
lution,1:173−184,1972）は異なるリボソームRNA分子
の一次構造解析を系統発生関係の評価に利用することの
理論的および実際的観点につき論じている。フォック
ス、ペヒマンおよびベーゼ（Fox,Pechman,Woese）（Int
ernational Journal of Systematic Bacteriology,
27:44−57,1977）は、原核細胞系統学の研究法としての
16SリボソームRNAの比較カタログ作成について論じてい
る。しかしこれらの参考文献はクラミジア・トラコマチ
スに関するコーンの教示の欠陥を解決し得ておらず、特
に臨床その他の試料中のクラミジア・トラコマチスを検
出するアッセイ法に有用なクラミジア・トラコマチス特
異性プローブを提供しない。
of Bactreriology,107:543−547,1971）は多数の細
菌種からのリボソームリボ核酸の相同性、およびこの相
同性を定量するためのハイブリダイゼーション法につい
て論じている。同様にソージン、ソージンおよびベーゼ
（Sogin,Sogin,Woese）（Journal of Molecular Evo
lution,1:173−184,1972）は異なるリボソームRNA分子
の一次構造解析を系統発生関係の評価に利用することの
理論的および実際的観点につき論じている。フォック
ス、ペヒマンおよびベーゼ（Fox,Pechman,Woese）（Int
ernational Journal of Systematic Bacteriology,
27:44−57,1977）は、原核細胞系統学の研究法としての
16SリボソームRNAの比較カタログ作成について論じてい
る。しかしこれらの参考文献はクラミジア・トラコマチ
スに関するコーンの教示の欠陥を解決し得ておらず、特
に臨床その他の試料中のクラミジア・トラコマチスを検
出するアッセイ法に有用なクラミジア・トラコマチス特
異性プローブを提供しない。
リボソームは遺伝情報を細胞蛋白質、すなわち生命の
主な構造要素および触媒要素に翻訳する既知の唯一の手
段として作用するので、すべての生物にとって極めて重
要である。この重要性の明らかな証拠は、すべての細胞
がリボソームを含むという所見である。
主な構造要素および触媒要素に翻訳する既知の唯一の手
段として作用するので、すべての生物にとって極めて重
要である。この重要性の明らかな証拠は、すべての細胞
がリボソームを含むという所見である。
リボソームは３種類の別個のRNA分子を含み、これら
は少なくとも大腸菌においては5S、16Sおよび23S rRNA
と呼ばれる。これらの名称は歴史的に、それらの沈降速
度で測定したRNA分子の大きさに関係する。しかし実際
には、リボソームRNA分子の大きさは生物間で若干異な
る。それにもかかわらず5S、16Sおよび23S rRNAがいず
れの細菌においても相同RNA分子に対する総称として慣
用され、ここでもこの慣例に従う。
は少なくとも大腸菌においては5S、16Sおよび23S rRNA
と呼ばれる。これらの名称は歴史的に、それらの沈降速
度で測定したRNA分子の大きさに関係する。しかし実際
には、リボソームRNA分子の大きさは生物間で若干異な
る。それにもかかわらず5S、16Sおよび23S rRNAがいず
れの細菌においても相同RNA分子に対する総称として慣
用され、ここでもこの慣例に従う。
ここで用いるプローブとは、特定の予め定められたス
トリンジェンシーにおいてターゲット核酸配列に特異的
に（すなわち優先的に、後記のハイブリダイゼーション
の項を参照されたい）ハイブリダイズしうる特異的ヌク
レオチド配列を設計または選択により含む、合成により
または生物学的に形成された核酸（DNAまたはRNA）を意
味する。プローブはそれらのハイブリダイゼーション特
性のほかに、個々のアッセイ条件下でのそれらの適正な
または最適な機能性を改良する特定の構成要素をも含み
うる。たとえばプローブを、検出リガンドを保有すべく
（たとえばフルオレセイン、32−Ｐ、ビオチンなど）、
または固体状支持体へのそれらの捕獲を容易にすべく
（たとえばポリデオキシアデノシン“テイル”）修飾し
うる。これらの修飾はプローブの基本的機能、すなわち
それがハイブリダイゼーションアッセイにおいてターゲ
ット生物と非ターゲット生物を有用な程度に区別する能
力を配慮したものである。
トリンジェンシーにおいてターゲット核酸配列に特異的
に（すなわち優先的に、後記のハイブリダイゼーション
の項を参照されたい）ハイブリダイズしうる特異的ヌク
レオチド配列を設計または選択により含む、合成により
または生物学的に形成された核酸（DNAまたはRNA）を意
味する。プローブはそれらのハイブリダイゼーション特
性のほかに、個々のアッセイ条件下でのそれらの適正な
または最適な機能性を改良する特定の構成要素をも含み
うる。たとえばプローブを、検出リガンドを保有すべく
（たとえばフルオレセイン、32−Ｐ、ビオチンなど）、
または固体状支持体へのそれらの捕獲を容易にすべく
（たとえばポリデオキシアデノシン“テイル”）修飾し
うる。これらの修飾はプローブの基本的機能、すなわち
それがハイブリダイゼーションアッセイにおいてターゲ
ット生物と非ターゲット生物を有用な程度に区別する能
力を配慮したものである。
ハイブリダイゼーションとは、予め定められた反応条
件下で２本の部分的または完全に相補的な核酸ストラン
ドが逆平行に合わさって、特異的かつ安定な水素結合を
もつ２本鎖核酸を形成する過程であると伝統的に理解さ
れている。
件下で２本の部分的または完全に相補的な核酸ストラン
ドが逆平行に合わさって、特異的かつ安定な水素結合を
もつ２本鎖核酸を形成する過程であると伝統的に理解さ
れている。
特定の１組のハイブリダイゼーション条件のストリン
ジェンシーは、プローブ−ターゲットデュプレックスの
長さおよび塩基組成により、ならびに２核酸間の対合誤
りの程度および形状により定まる。
ジェンシーは、プローブ−ターゲットデュプレックスの
長さおよび塩基組成により、ならびに２核酸間の対合誤
りの程度および形状により定まる。
ストリンジェンシーはハイブリダイゼーション溶液中
に存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性剤
の種類および濃度、および／またはハイブリダイゼーシ
ョンの温度などの反応パラメーターによっても支配され
る。一般に安定なハイブリッドを形成したい場合は、ハ
イブリダイゼーション条件がよりストリンジェントにな
るのに伴ってより長いプローブが好ましい。当然、ハイ
ブリダイゼーションが起こる条件のストリンジェンシー
（実施すべきアッセイの種類による）が、使用すべき好
ましいプローブの特定の特性を指示するであろう。これ
らの関係は十分に理解されており、当業者が容易に操作
しうる。
に存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性剤
の種類および濃度、および／またはハイブリダイゼーシ
ョンの温度などの反応パラメーターによっても支配され
る。一般に安定なハイブリッドを形成したい場合は、ハ
イブリダイゼーション条件がよりストリンジェントにな
るのに伴ってより長いプローブが好ましい。当然、ハイ
ブリダイゼーションが起こる条件のストリンジェンシー
（実施すべきアッセイの種類による）が、使用すべき好
ましいプローブの特定の特性を指示するであろう。これ
らの関係は十分に理解されており、当業者が容易に操作
しうる。
一般にプローブの長さに応じて、ストリンジェント条
件は約0.9モル濃度の塩溶液中、約35−65℃を意味する
と当業者は解する。
件は約0.9モル濃度の塩溶液中、約35−65℃を意味する
と当業者は解する。
発明の要約 本発明の種々の原理および観点によれば、特定の条件
下でクラミジア・トラコマチスのリボソームRNA分子（r
RNA）またはrRNA遺伝子（rDNA）にハイブリダイズする
が、同じ条件下で試料中に存在する可能性のある他の関
連細菌のrRNAまたはrDNAにはハイブリダイズしない、DN
AまたはRNA配列からなる核酸プローブおよびプローブセ
ットが提供される。従って本発明のプローブは、臨床試
料中のクラミジア・トラコマチスを特異的に検出するた
めの価値ある核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法を
開発する基礎を与える。
下でクラミジア・トラコマチスのリボソームRNA分子（r
RNA）またはrRNA遺伝子（rDNA）にハイブリダイズする
が、同じ条件下で試料中に存在する可能性のある他の関
連細菌のrRNAまたはrDNAにはハイブリダイズしない、DN
AまたはRNA配列からなる核酸プローブおよびプローブセ
ットが提供される。従って本発明のプローブは、臨床試
料中のクラミジア・トラコマチスを特異的に検出するた
めの価値ある核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法を
開発する基礎を与える。
本発明者らの経験により、これらの核酸ハイブリダイ
ゼーションによるアッセイ法は被験試料中の細菌を検出
するための現在用いられている大部分の微生物学的方法
に関して性能の向上をもたらすことが見出された。これ
には一般に下記のものが含まれる： ａ）感度の向上；すなわち特定の試料中の上記少数細菌
を検出しうる； ｂ）安価な試薬の使用および労働の削減によりアッセイ
経費を著しく低減しうる； ｃ）生化学的に稀な菌株のターゲット細菌ですら正確に
同定される； ｄ）本発明の試験は試験前にターゲット細菌を試料から
単離する必要がないため、より速やかに結果が得られ
る。
ゼーションによるアッセイ法は被験試料中の細菌を検出
するための現在用いられている大部分の微生物学的方法
に関して性能の向上をもたらすことが見出された。これ
には一般に下記のものが含まれる： ａ）感度の向上；すなわち特定の試料中の上記少数細菌
を検出しうる； ｂ）安価な試薬の使用および労働の削減によりアッセイ
経費を著しく低減しうる； ｃ）生化学的に稀な菌株のターゲット細菌ですら正確に
同定される； ｄ）本発明の試験は試験前にターゲット細菌を試料から
単離する必要がないため、より速やかに結果が得られ
る。
本発明のプローブをrRNAに向けることにより得られる
他の利点には、検出されるrRNAが細胞質の重要な成分で
あるという事実が含まれる。細胞のリボソーム含量の推
定値は多様であるが、活発に増殖している大腸菌（E.Co
li）は細胞当たり50,000以上のリボソーム、従って各5
0,000コピーのrRNA（リボソーム中に1:1:1の化学量論的
量で存在する）を含むと思われる。クラミジア・トラコ
マチスの基本小体はこれよりはるかに少ないリボソーム
（数百）を含むことが知られている。それにもかかわら
ずこの数は、可能性のある他の大部分の細胞内ターゲッ
ト分子、たとえば遺伝子またはそのRNA転写体より多
い。これらは量がはるかに少ないためそれほど理想的で
ない。
他の利点には、検出されるrRNAが細胞質の重要な成分で
あるという事実が含まれる。細胞のリボソーム含量の推
定値は多様であるが、活発に増殖している大腸菌（E.Co
li）は細胞当たり50,000以上のリボソーム、従って各5
0,000コピーのrRNA（リボソーム中に1:1:1の化学量論的
量で存在する）を含むと思われる。クラミジア・トラコ
マチスの基本小体はこれよりはるかに少ないリボソーム
（数百）を含むことが知られている。それにもかかわら
ずこの数は、可能性のある他の大部分の細胞内ターゲッ
ト分子、たとえば遺伝子またはそのRNA転写体より多
い。これらは量がはるかに少ないためそれほど理想的で
ない。
他の予想外の利点は、rRNA（およびそれらを特定する
遺伝子）が同時に存在する生物間で横方向に伝達されな
いと思われる点である。従ってrRNAの一次構造は、たと
えば同時に存在する生物間で横方向に伝達される可能性
のあるプラスミド上遺伝子またはその産生物の場合のよ
うに遺伝子特異性ターゲットではなく、生物特異性分子
ターゲットとなる。
遺伝子）が同時に存在する生物間で横方向に伝達されな
いと思われる点である。従ってrRNAの一次構造は、たと
えば同時に存在する生物間で横方向に伝達される可能性
のあるプラスミド上遺伝子またはその産生物の場合のよ
うに遺伝子特異性ターゲットではなく、生物特異性分子
ターゲットとなる。
さらに本発明は、クラミジア・トラコマチスの被験菌
株すべてのターゲット領域にハイブリダイズしうるのに
十分なほどそれらクラミジア・トラコマチス菌株すべて
において類似する、クラミジア・トラコマチスrRNAター
ゲット配列に対するプローブを提供する。有利には、こ
れらの同じrRNAターゲット配列は大部分のクラミジア・
トラコマチスrRNAにおいて、プローブ791、860、861、8
79、1153、1203、1220、1318、1319、1320、1321、132
2、1323、1325および1479がクラミジア・トラコマチス
にハイブリダイズする条件下で大部分の非クラミジア・
トラコマチスrRNAにはハイブリダイズしないほど十分に
異なる。これらのプローブ特性はそれぞれ包括性および
排他性と定義される。
株すべてのターゲット領域にハイブリダイズしうるのに
十分なほどそれらクラミジア・トラコマチス菌株すべて
において類似する、クラミジア・トラコマチスrRNAター
ゲット配列に対するプローブを提供する。有利には、こ
れらの同じrRNAターゲット配列は大部分のクラミジア・
トラコマチスrRNAにおいて、プローブ791、860、861、8
79、1153、1203、1220、1318、1319、1320、1321、132
2、1323、1325および1479がクラミジア・トラコマチス
にハイブリダイズする条件下で大部分の非クラミジア・
トラコマチスrRNAにはハイブリダイズしないほど十分に
異なる。これらのプローブ特性はそれぞれ包括性および
排他性と定義される。
本発明の他のプローブ、すなわちプローブ783、882お
よび1324はクラミジア・トラコマチス菌株に対しては上
記プローブと同様に十分に包括性であり、さらにこれら
のプローブは他の数種類の細菌にもハイブリダイズす
る。プローブ782はオーム病クラミジアにハイブリダイ
ズし、クラミジア・トラコマチスにはハイブリダイズし
ない唯一のプローブである。
よび1324はクラミジア・トラコマチス菌株に対しては上
記プローブと同様に十分に包括性であり、さらにこれら
のプローブは他の数種類の細菌にもハイブリダイズす
る。プローブ782はオーム病クラミジアにハイブリダイ
ズし、クラミジア・トラコマチスにはハイブリダイズし
ない唯一のプローブである。
クラミジア・トラコマチスに対する著しい包括性およ
び排他性を備えた本発明のプローブが得られるという知
見は予知および予想不可能であった。
び排他性を備えた本発明のプローブが得られるという知
見は予知および予想不可能であった。
表の簡単な説明 表を参照することにより、本発明の原理および観点が
さらに理解されるであろう： 表１−クラミジア属ターゲットヌクレオチド配列上に整
列した、本発明の好ましい16S rRNA−ターゲット化プ
ローブのヌクレオチド配列を示す。大腸菌からの16S r
RNAの対応部分をも比較のため示す。RNA（ターゲット）
配列は５′から３′へ記載され、プローブ配列はDNAで
あり、３′から５′へ記載される。プローブはそれらの
包括性および排他性挙動の基礎となる変動の“コア”領
域と共に示される。
さらに理解されるであろう： 表１−クラミジア属ターゲットヌクレオチド配列上に整
列した、本発明の好ましい16S rRNA−ターゲット化プ
ローブのヌクレオチド配列を示す。大腸菌からの16S r
RNAの対応部分をも比較のため示す。RNA（ターゲット）
配列は５′から３′へ記載され、プローブ配列はDNAで
あり、３′から５′へ記載される。プローブはそれらの
包括性および排他性挙動の基礎となる変動の“コア”領
域と共に示される。
表２−クラミジア属ターゲットヌクレオチド配列上に整
列した、本発明の好ましい23S rRNA−ターゲット化プ
ローブのヌクレオチド配列を示す。大腸菌からの23S r
RNAの対応部分をも比較のため示す。RNA（ターゲット）
配列は５′から３′へ記載され、プローブ配列はDNAで
あり、３′から５′へ記載される。プローブはそれらの
包括性および排他性挙動の基礎となる変動の“コア”領
域と共に示される。
列した、本発明の好ましい23S rRNA−ターゲット化プ
ローブのヌクレオチド配列を示す。大腸菌からの23S r
RNAの対応部分をも比較のため示す。RNA（ターゲット）
配列は５′から３′へ記載され、プローブ配列はDNAで
あり、３′から５′へ記載される。プローブはそれらの
包括性および排他性挙動の基礎となる変動の“コア”領
域と共に示される。
表３−液相ハイブリダイゼーションアッセイにおける代
表的なクラミジア・トラコマチス血清変異体試料に対す
る好ましい16Sおよび23S rRNAプローブの包括性挙動を
例示する。
表的なクラミジア・トラコマチス血清変異体試料に対す
る好ましい16Sおよび23S rRNAプローブの包括性挙動を
例示する。
表４−ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ
における非クラミジア・トラコマチス細菌の代表的試料
に対する好ましい16Sおよび23S rRNAプローブの排他性
挙動を例示する。
における非クラミジア・トラコマチス細菌の代表的試料
に対する好ましい16Sおよび23S rRNAプローブの排他性
挙動を例示する。
発明および最良の形態の詳細な説明 プローブ開発計画 本発明のプローブの開発に際してとられた第１工程
は、クラミジア・トラコマチス特異性核酸プローブに対
するターゲット部位として作用すると思われる16Sおよ
び23S rRNAの領域を同定するものであった。実際には
被験試料中にいずれの非−クラミジア・トラコマチス菌
が存在するかを先験的に予測するのは困難である。
は、クラミジア・トラコマチス特異性核酸プローブに対
するターゲット部位として作用すると思われる16Sおよ
び23S rRNAの領域を同定するものであった。実際には
被験試料中にいずれの非−クラミジア・トラコマチス菌
が存在するかを先験的に予測するのは困難である。
その可能性のある非−クラミジア・トラコマチス細菌
は多数であるため、特定のプローブ配列についての排他
性を証明するのは予測不可能なばかりでなく、極めて困
難かつ労力を要するものである。最終的にプローブを用
いてスクリーンされるすべての被験試料中に存在すると
思われる非−クラミジア・トラコマチス細菌が何である
かを知る必要性を排除する、より厳密な判定基準が適用
された。
は多数であるため、特定のプローブ配列についての排他
性を証明するのは予測不可能なばかりでなく、極めて困
難かつ労力を要するものである。最終的にプローブを用
いてスクリーンされるすべての被験試料中に存在すると
思われる非−クラミジア・トラコマチス細菌が何である
かを知る必要性を排除する、より厳密な判定基準が適用
された。
これにはクラミジア・トラコマチス間、およびクラミ
ジア・トラコマチスと他の属の細菌との系統発生学的関
係についての知識を必要とした。
ジア・トラコマチスと他の属の細菌との系統発生学的関
係についての知識を必要とした。
詳細には、クラミジア・トラコマチスに対する代表的
な進化上の近縁体におけるrRNAの相同領域と十分に異な
る特定のターゲット領域がクラミジア・トラコマチスrR
NAに見出された場合、この配列を用いてハイブリダイゼ
ーションアッセイによりクラミジア・トラコマチスとそ
れらの近縁体を区別しうることを確認することにより排
他性基準が満たされるという、通用しているがこれまで
証明されていない仮説が適用された。系統発生の所見に
基づいて、実際の識別は必ずしもなされていないがより
離れた関係をもつ生物のrRNA配列は、特定領域の配列に
おいて上記の系統発生的にクラミジア・トラコマチス近
縁体のものとは恐らく異なるであろうと推定された。し
かしそれらの領域が存在するか否か、または存在したと
してもそれらの領域がrRNA内のどこに位置するかを先験
的に予測することは不可能であった。
な進化上の近縁体におけるrRNAの相同領域と十分に異な
る特定のターゲット領域がクラミジア・トラコマチスrR
NAに見出された場合、この配列を用いてハイブリダイゼ
ーションアッセイによりクラミジア・トラコマチスとそ
れらの近縁体を区別しうることを確認することにより排
他性基準が満たされるという、通用しているがこれまで
証明されていない仮説が適用された。系統発生の所見に
基づいて、実際の識別は必ずしもなされていないがより
離れた関係をもつ生物のrRNA配列は、特定領域の配列に
おいて上記の系統発生的にクラミジア・トラコマチス近
縁体のものとは恐らく異なるであろうと推定された。し
かしそれらの領域が存在するか否か、または存在したと
してもそれらの領域がrRNA内のどこに位置するかを先験
的に予測することは不可能であった。
核酸ハイブリダイゼーションプローブに対する有用な
ターゲット部位として作用する可能性のあるクラミジア
・トラコマチスrRNAの領域を同定する第１工程として、
クラミジア・トラコマチスからの16Sおよび23S rRNAの
全ヌクレオチド配列を調べた。
ターゲット部位として作用する可能性のあるクラミジア
・トラコマチスrRNAの領域を同定する第１工程として、
クラミジア・トラコマチスからの16Sおよび23S rRNAの
全ヌクレオチド配列を調べた。
ヌクレオチド配列は標準的実験室プロトコールによ
り、rRNAを特定する遺伝子のクローニング（マニアチス
（Maniatis）ら,1982,Molecular Cloning;A Laborato
ry Mannual,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリーズ，ニューヨーク,pp545）および配列決定（マク
サムおよびギルバート（Maxam,Gilbert）,1977,Proceed
ings of the National Academy of Science,USA
74:560−564:サンガー（Sanger）ら,1977,Proceeding
s of the National Academy of Science,USA 7
4:5463−5467）によって、および／または逆転写酵素を
用いてrRNA自身を直接配列決定することによって（レー
ン（Lane）ら,1985,Proceedings of the National
Academy of Science,USA82:6955−6959）決定され
た。
り、rRNAを特定する遺伝子のクローニング（マニアチス
（Maniatis）ら,1982,Molecular Cloning;A Laborato
ry Mannual,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリーズ，ニューヨーク,pp545）および配列決定（マク
サムおよびギルバート（Maxam,Gilbert）,1977,Proceed
ings of the National Academy of Science,USA
74:560−564:サンガー（Sanger）ら,1977,Proceeding
s of the National Academy of Science,USA 7
4:5463−5467）によって、および／または逆転写酵素を
用いてrRNA自身を直接配列決定することによって（レー
ン（Lane）ら,1985,Proceedings of the National
Academy of Science,USA82:6955−6959）決定され
た。
決定されたクラミジア・トラコマチスrRNAヌクレオチ
ド配列を得られた他のrRNAヌクレオチド配列、特にこの
研究の一部と判定されるオーム病クラミジアと比較し
た。
ド配列を得られた他のrRNAヌクレオチド配列、特にこの
研究の一部と判定されるオーム病クラミジアと比較し
た。
クラミジア・トラコマチスとその近縁のオーム病クラ
ミジアの配列の比較は特に有用であることが分かった。
数箇所の領域の配列が、クラミジア属のこれら２種にお
いて、およびクラミジア・トラコマチスと非−クラミジ
ア属細菌との間で異なると思われた。16Sおよび23S rR
NA配列間のこれらの領域の位置をそれぞれ表１および２
に示す。
ミジアの配列の比較は特に有用であることが分かった。
数箇所の領域の配列が、クラミジア属のこれら２種にお
いて、およびクラミジア・トラコマチスと非−クラミジ
ア属細菌との間で異なると思われた。16Sおよび23S rR
NA配列間のこれらの領域の位置をそれぞれ表１および２
に示す。
クラミジア・トラコマチス、オーム病クラミジアまた
は両者に優先的にハイブリダイズする、長さ28−36ヌク
レオチドのオリゴヌクレオチドプローブが設計された。
これらは下記により設計された:1）クラミジア・トラコ
マチスをオーム病クラミジアから、またはクラミジア属
を他の細菌から識別するのに有用なヌクレオチド配列の
相異を最大限に利用する（表１および２のコア変異の領
域内の大文字として示す）、ならびに２）ターゲットrR
NA内の局部的な、およびプローブ分子間の自己相補性の
影響を共に最小限に抑える。これらのパラメーターおよ
び先に述べた（背景）他のパラメーターを最適なものと
することにより、好ましい特異性およびハイブリダイゼ
ーション効率をもつプローブが得られる。
は両者に優先的にハイブリダイズする、長さ28−36ヌク
レオチドのオリゴヌクレオチドプローブが設計された。
これらは下記により設計された:1）クラミジア・トラコ
マチスをオーム病クラミジアから、またはクラミジア属
を他の細菌から識別するのに有用なヌクレオチド配列の
相異を最大限に利用する（表１および２のコア変異の領
域内の大文字として示す）、ならびに２）ターゲットrR
NA内の局部的な、およびプローブ分子間の自己相補性の
影響を共に最小限に抑える。これらのパラメーターおよ
び先に述べた（背景）他のパラメーターを最適なものと
することにより、好ましい特異性およびハイブリダイゼ
ーション効率をもつプローブが得られる。
表３は、液相ハイブリダイゼーションアッセイにおけ
る代表的なクラミジア・トラコマチスおよび非クラミジ
ア・トラコマチス細菌試料に対する好ましいプローブの
包括性挙動を例示する。
る代表的なクラミジア・トラコマチスおよび非クラミジ
ア・トラコマチス細菌試料に対する好ましいプローブの
包括性挙動を例示する。
表４は、ドットプロットハイブリダイゼーションアッ
セイにおける非クラミジア・トラコマチス細菌の代表的
試料に対する好ましいプローブの排他性挙動を例示す
る。
セイにおける非クラミジア・トラコマチス細菌の代表的
試料に対する好ましいプローブの排他性挙動を例示す
る。
プローブの物理的記載 以上のプローブ選択計画により、試料中のクラミジア
・トラコマチス細菌を同定するのに有用な多数のプロー
ブが得られた。プローブ781、782、783、860、861、87
9、882、1153および1203は16S rRNA配列から、プロー
ブ1318−1325およびプローブ1479は23S rRNA配列から
設計された。下記の好ましいオリゴヌクレオチドプロー
ブをここに開示する。
・トラコマチス細菌を同定するのに有用な多数のプロー
ブが得られた。プローブ781、782、783、860、861、87
9、882、1153および1203は16S rRNA配列から、プロー
ブ1318−1325およびプローブ1479は23S rRNA配列から
設計された。下記の好ましいオリゴヌクレオチドプロー
ブをここに開示する。
クラミジア・トラコマチスおよびオーム病クラミジア
の16Sおよび23S rRNAのプローブおよびターゲット配列
を表１および２に示す。対応する大腸菌16Sおよび23S
rRNAのヌクレオチド位置をも示す。大腸菌配列は全16S
および23S配列が得られた最初のものであるので、指定
された位置番号は目的のクラミジア属rRNA内の相同領域
を明確に同定するのに好都合な基準である。
の16Sおよび23S rRNAのプローブおよびターゲット配列
を表１および２に示す。対応する大腸菌16Sおよび23S
rRNAのヌクレオチド位置をも示す。大腸菌配列は全16S
および23S配列が得られた最初のものであるので、指定
された位置番号は目的のクラミジア属rRNA内の相同領域
を明確に同定するのに好都合な基準である。
表１および２に示す多数のターゲット領域に対し、ク
ラミジア・トラコマチス血清変異体LGVもしはＫ、また
はオーム病クラミジア、または３者すべての配列の相補
体にそれぞれ対応する２以上のプローブを設計した。整
列したプローブとターゲット配列を調べることにより、
各プローブの基礎となる（すなわちそれに対し相補的
な）個々の配列を表１および２に示す。たとえば表１か
ら分かるように、プローブ1203はクラミジア・トラコマ
チス血清変異体LGV配列に対しこのターゲット領域にお
いて相補的であり、関連プローブ1153はクラミジア・ト
ラコマチス血清変異体Ｋ配列に対し相補的である。しか
し一方または両方のプローブにより血清変異体間で若干
の交叉ハイブリダイゼーションが起こると予想される
（望ましい）。
ラミジア・トラコマチス血清変異体LGVもしはＫ、また
はオーム病クラミジア、または３者すべての配列の相補
体にそれぞれ対応する２以上のプローブを設計した。整
列したプローブとターゲット配列を調べることにより、
各プローブの基礎となる（すなわちそれに対し相補的
な）個々の配列を表１および２に示す。たとえば表１か
ら分かるように、プローブ1203はクラミジア・トラコマ
チス血清変異体LGV配列に対しこのターゲット領域にお
いて相補的であり、関連プローブ1153はクラミジア・ト
ラコマチス血清変異体Ｋ配列に対し相補的である。しか
し一方または両方のプローブにより血清変異体間で若干
の交叉ハイブリダイゼーションが起こると予想される
（望ましい）。
同様にプローブ781および782はそれぞれクラミジア・
トラコマチス（この領域においてはLGVはＫと等しい）
およびオーム病クラミジアの16S rRNAを基礎とする。
トラコマチス（この領域においてはLGVはＫと等しい）
およびオーム病クラミジアの16S rRNAを基礎とする。
上記プローブの特異的ハイブリダイゼーション挙動は
それらが用いられるアッセイ形式に著しく依存する。逆
にアッセイ形式は個々のプローブの最適設計性をある程
度支配するであろう。本発明のプローブの“本質”は先
に挙げたプローブ中の特異的ヌクレオチドストリングに
限定されると解すべきではない。たとえばこれら個々の
オリゴヌクレオチドの長さは下記ドットブロットアッセ
イ法（および他の特定の予想されるアッセイ法）に使用
するために最適なものとされた。当業者に周知のよう
に、プローブの最適長さは選ばれたハイブリダイゼーシ
ョン条件のストリンジェンシーの関数であり、従って本
発明のプローブの長さはそれに応じて変更しうる。同様
に２以上のプローブからなるセットを考慮すると、すべ
てのプローブは両者が用いられる個々の形式において適
応する様式で挙動することが望ましい。従って個々のプ
ローブの厳密な長さはある程度その特定の意図する用途
を反映する。
それらが用いられるアッセイ形式に著しく依存する。逆
にアッセイ形式は個々のプローブの最適設計性をある程
度支配するであろう。本発明のプローブの“本質”は先
に挙げたプローブ中の特異的ヌクレオチドストリングに
限定されると解すべきではない。たとえばこれら個々の
オリゴヌクレオチドの長さは下記ドットブロットアッセ
イ法（および他の特定の予想されるアッセイ法）に使用
するために最適なものとされた。当業者に周知のよう
に、プローブの最適長さは選ばれたハイブリダイゼーシ
ョン条件のストリンジェンシーの関数であり、従って本
発明のプローブの長さはそれに応じて変更しうる。同様
に２以上のプローブからなるセットを考慮すると、すべ
てのプローブは両者が用いられる個々の形式において適
応する様式で挙動することが望ましい。従って個々のプ
ローブの厳密な長さはある程度その特定の意図する用途
を反映する。
ここに記載するプローブの“本質”は上記ならびに表
１および２に示すクラミジア・トラコマチス特異性配列
（コア変異）の知見および利用にある。
１および２に示すクラミジア・トラコマチス特異性配列
（コア変異）の知見および利用にある。
プローブ挙動のハイブリダイゼーション分析 表１および２の配列データは、本発明のプローブが他
の細菌を排除してクラミジア・トラコマチス、オーム病
クラミジアまたは両者を特異的に検出する各種の有用な
ハイブリダイゼーション特性を示すことを示唆する。し
かし調べたクラミジア・トラコマチスおよびオーム病ク
ラミジアの配列は比較的わずかである。配列分析により
検査しなかった他のクラミジア・トラコマチス血清型中
に配列変異が存在する可能性がある。これらの変異は若
干または多数の未試験クラミジア・トラコマチス血清型
に対し可能性のあるプローブによるハイブリダイゼーシ
ョンを低下させまたは排除するかも知れない。
の細菌を排除してクラミジア・トラコマチス、オーム病
クラミジアまたは両者を特異的に検出する各種の有用な
ハイブリダイゼーション特性を示すことを示唆する。し
かし調べたクラミジア・トラコマチスおよびオーム病ク
ラミジアの配列は比較的わずかである。配列分析により
検査しなかった他のクラミジア・トラコマチス血清型中
に配列変異が存在する可能性がある。これらの変異は若
干または多数の未試験クラミジア・トラコマチス血清型
に対し可能性のあるプローブによるハイブリダイゼーシ
ョンを低下させまたは排除するかも知れない。
プローブの包括性挙動と同様に重要なものはそれらの
排他性挙動、すなわち非−クラミジア属細菌に対するそ
れらの反応性である。クラミジア属を含む可能性のある
被験試料において遭遇する非−クラミジア属菌株の数お
よび型は極めて多い。
排他性挙動、すなわち非−クラミジア属細菌に対するそ
れらの反応性である。クラミジア属を含む可能性のある
被験試料において遭遇する非−クラミジア属菌株の数お
よび型は極めて多い。
従って代表的なクラミジア・トラコマチスおよび非−
クラミジア・トラコマチス細菌に対するプローブの挙動
を、液相ハイブリダイゼーションおよびドットブロット
法によるハイブリダイゼーション分析により測定した。
クラミジア・トラコマチス細菌に対するプローブの挙動
を、液相ハイブリダイゼーションおよびドットブロット
法によるハイブリダイゼーション分析により測定した。
本発明の個々のプローブそれぞれにつきハイブリダイ
ゼーションデータを提示するが、個々のプローブの和で
あるハイブリダイゼーション挙動を示す有用な組み合わ
せプローブ（セット）もこれらのデータによって明らか
に予想しうることを留意すべきである。
ゼーションデータを提示するが、個々のプローブの和で
あるハイブリダイゼーション挙動を示す有用な組み合わ
せプローブ（セット）もこれらのデータによって明らか
に予想しうることを留意すべきである。
実施例1:液相ハイブリダイゼーションアッセイにおける
プローブハイブリダイゼーション挙動の包括性分析 本発明のプローブまたはそれらの誘導体は、種々のハ
イブリダイゼーション形式において極めて価値がある。
この形式の１つである二重プローブサンドイッチアッセ
イ形式（たとえば米国特許出願第277,579;169,646また
は233683号明細書に記載のホモポリマーキャプチャー二
重プローブ液相ハイブリダイゼーション形式）をこの例
において採用する。一般にこのような用途の場合、オリ
ゴヌクレオチドプローブはその３′末端において長さ約
20−200残基のデオキシアデノシン（dA）残基の範囲を
含むべく修飾されている。これはターゲットrRNAを被験
試料から、この目的のためにポリデオキシチミジン（d
T）で適宜誘導体化された固体支持体（たとえばビー
ズ、プラスチック表面、フィルターなど）上に“捕獲”
する（液相ハイブリダイゼーションにより）ために用い
られる。第２プローブは“検出”プローブとして用いら
れ、検出可能なリガンド（たとえば32−Ｐ、フルオレセ
イン、ビオチンなど）により誘導体化されている。原則
として検出プローブはオリゴヌクレオチドまたは比較的
長いDNAもしくはRNAプローブである。次いで被験試料中
のターゲット核酸の存在の検出は、検出リガンドが下記
の一連のハイブリダイゼーション相互作用により固体表
面上に捕獲されることにより示される： これは被験試料中にターゲット核酸が存在した場合に
のみ、起こる。
プローブハイブリダイゼーション挙動の包括性分析 本発明のプローブまたはそれらの誘導体は、種々のハ
イブリダイゼーション形式において極めて価値がある。
この形式の１つである二重プローブサンドイッチアッセ
イ形式（たとえば米国特許出願第277,579;169,646また
は233683号明細書に記載のホモポリマーキャプチャー二
重プローブ液相ハイブリダイゼーション形式）をこの例
において採用する。一般にこのような用途の場合、オリ
ゴヌクレオチドプローブはその３′末端において長さ約
20−200残基のデオキシアデノシン（dA）残基の範囲を
含むべく修飾されている。これはターゲットrRNAを被験
試料から、この目的のためにポリデオキシチミジン（d
T）で適宜誘導体化された固体支持体（たとえばビー
ズ、プラスチック表面、フィルターなど）上に“捕獲”
する（液相ハイブリダイゼーションにより）ために用い
られる。第２プローブは“検出”プローブとして用いら
れ、検出可能なリガンド（たとえば32−Ｐ、フルオレセ
イン、ビオチンなど）により誘導体化されている。原則
として検出プローブはオリゴヌクレオチドまたは比較的
長いDNAもしくはRNAプローブである。次いで被験試料中
のターゲット核酸の存在の検出は、検出リガンドが下記
の一連のハイブリダイゼーション相互作用により固体表
面上に捕獲されることにより示される： これは被験試料中にターゲット核酸が存在した場合に
のみ、起こる。
この例において各オリゴヌクレオチドはキャプチャー
プローブとして用いられる（このために約200−500dA残
基がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼによりそれらの３′末端に付加される）。16Sまた
は23S rRNAに特異的なＰ−32標識“リボプローブ”が
下記により調製され、“属の（generic）”検出プロー
ブとして用いられた。
プローブとして用いられる（このために約200−500dA残
基がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼによりそれらの３′末端に付加される）。16Sまた
は23S rRNAに特異的なＰ−32標識“リボプローブ”が
下記により調製され、“属の（generic）”検出プロー
ブとして用いられた。
両リボプローブは大腸菌（16S rRNA）またはオーム
病クラミジア（23S rRNA）遺伝子の一部を含むプラス
ミドベクターから転写により調製された。16Sリボプロ
ーブは長さ約56ヌクレオチドのアンチセンス転写体であ
り、大腸菌16S rRNA遺伝子のHind IIIサブフラグメン
トから形成される（大腸菌１−567位）。23Sリボプロー
ブは長さ約855ヌクレオチドのアンチセンス転写体であ
り、オーム病クラミジア23S rRNA遺伝子のPst I−EcoR
I部分から形成される（大腸菌１−855位）。転写反応
中に、Ｐ−32置換ヌクレオチドトリホスフェート前駆体
を用いて標準プロトコールに従って放射性Ｐ−32がリボ
プローブに取り込まれる。
病クラミジア（23S rRNA）遺伝子の一部を含むプラス
ミドベクターから転写により調製された。16Sリボプロ
ーブは長さ約56ヌクレオチドのアンチセンス転写体であ
り、大腸菌16S rRNA遺伝子のHind IIIサブフラグメン
トから形成される（大腸菌１−567位）。23Sリボプロー
ブは長さ約855ヌクレオチドのアンチセンス転写体であ
り、オーム病クラミジア23S rRNA遺伝子のPst I−EcoR
I部分から形成される（大腸菌１−855位）。転写反応
中に、Ｐ−32置換ヌクレオチドトリホスフェート前駆体
を用いて標準プロトコールに従って放射性Ｐ−32がリボ
プローブに取り込まれる。
次いで被験試料中のターゲット核酸の存在の検出は、
検出リガンド（Ｐ−32）が上記の一連のハイブリダイゼ
ーション相互作用により固体表面上に捕獲されることに
より示される オリゴヌクレオチドプローブの包括性挙動は前記液相
ハイブリダイゼーション形式の形態で試験された。
検出リガンド（Ｐ−32）が上記の一連のハイブリダイゼ
ーション相互作用により固体表面上に捕獲されることに
より示される オリゴヌクレオチドプローブの包括性挙動は前記液相
ハイブリダイゼーション形式の形態で試験された。
前記16Sおよび23Sリボプローブはそれぞれすべてのク
ラミジア属および非クラミジア属16Sおよび23S rRNAに
ハイブリダイズすると予想される。従ってこの例のアッ
セイにおいて陽性のハイブリダイゼーションシグナル
は、各実験に用いたオリゴヌクレオチドプローブのハイ
ブリダイゼーション挙動を示す。あるいはこれらのオリ
ゴヌクレオチドプローブは、クラミジア属菌株を放射性
リン中で増殖させることにより形成されるＰ−32標識ク
ラミジア16Sおよび23S rRNAを捕獲および検出するため
に用いうる。
ラミジア属および非クラミジア属16Sおよび23S rRNAに
ハイブリダイズすると予想される。従ってこの例のアッ
セイにおいて陽性のハイブリダイゼーションシグナル
は、各実験に用いたオリゴヌクレオチドプローブのハイ
ブリダイゼーション挙動を示す。あるいはこれらのオリ
ゴヌクレオチドプローブは、クラミジア属菌株を放射性
リン中で増殖させることにより形成されるＰ−32標識ク
ラミジア16Sおよび23S rRNAを捕獲および検出するため
に用いうる。
クラミジア・トラコマチスの15血清型を試験した。血
清変異体Ｋはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ATCC）から得た。残り（血清変異体Ａ−LGV）
はワシントン・リサーチ・ファウンデーションから得
た。
清変異体Ｋはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ATCC）から得た。残り（血清変異体Ａ−LGV）
はワシントン・リサーチ・ファウンデーションから得
た。
要約すると、指示されたクラミジア・トラコマチスの
血清変異体の基本小体（EB）を1.0mg/mlプロテイナーゼ
−Ｋ（ベーリンガー・マンハイム社）および1.6％サル
コシン（シグマ）の溶液中、65℃で15分間細胞溶解した
（最終容量0.07ml）。試料をインキュベーターから取り
出し、等容量の5.0M GuSCN（0.1Mトリス−HCl,pH7.0,1
0％硫酸デキストラン）−−ポリ−dAテイル付きキャプ
チャープローブおよびＰ−32標識付き検出プローブ（被
験オリゴヌクレオチドプローブそれぞれに適した16Sま
たは23Sリボプローブ）を濃度80ng/mlおよび30ng/ml
（比活性１×109cpm/ug）で含有−−を添加した。
血清変異体の基本小体（EB）を1.0mg/mlプロテイナーゼ
−Ｋ（ベーリンガー・マンハイム社）および1.6％サル
コシン（シグマ）の溶液中、65℃で15分間細胞溶解した
（最終容量0.07ml）。試料をインキュベーターから取り
出し、等容量の5.0M GuSCN（0.1Mトリス−HCl,pH7.0,1
0％硫酸デキストラン）−−ポリ−dAテイル付きキャプ
チャープローブおよびＰ−32標識付き検出プローブ（被
験オリゴヌクレオチドプローブそれぞれに適した16Sま
たは23Sリボプローブ）を濃度80ng/mlおよび30ng/ml
（比活性１×109cpm/ug）で含有−−を添加した。
ターゲット核酸へのプローブのハイブリダイゼーショ
ンを37℃で30分間進行させたのち、ターゲットコンプレ
ックス（dAキャプチャープローブ：ターゲット：検出プ
ローブ）をオリゴ−dT誘導体化した磁性ビーズに捕獲し
た。この捕獲は、0.0625％（w/v）磁性ビーズ、４％BS
A,10M EDTA,0.2％サルコシン,0.1Mトリス−HCl,pH8.0,
および0.05％ブロノポールを含有する混合物0.1mlをハ
イブリダイゼーション反応に添加し、混合物を37℃で５
分間インキュベートすることにより行われた。
ンを37℃で30分間進行させたのち、ターゲットコンプレ
ックス（dAキャプチャープローブ：ターゲット：検出プ
ローブ）をオリゴ−dT誘導体化した磁性ビーズに捕獲し
た。この捕獲は、0.0625％（w/v）磁性ビーズ、４％BS
A,10M EDTA,0.2％サルコシン,0.1Mトリス−HCl,pH8.0,
および0.05％ブロノポールを含有する混合物0.1mlをハ
イブリダイゼーション反応に添加し、混合物を37℃で５
分間インキュベートすることにより行われた。
プローブ／ターゲットコンプレックスをビーズに捕獲
させたのち、1.0M GuSCN、10mM EDTA、0.1Mトリス、p
H7.0、0.5％サルコシン、0.2％BSAおよび0.1％消泡剤を
含有する溶液0.2mlを反応試験管に添加し、試験管を磁
界内に置いた。ビーズ（プローブ／ターゲットコンプレ
ックスが付着したもの）を磁界により試験管の側面へ引
き付け、液相（ハイブリダイズしていないターゲットお
よびディテクター分子を含む）を試験管からアスピレー
ションにより除去した。
させたのち、1.0M GuSCN、10mM EDTA、0.1Mトリス、p
H7.0、0.5％サルコシン、0.2％BSAおよび0.1％消泡剤を
含有する溶液0.2mlを反応試験管に添加し、試験管を磁
界内に置いた。ビーズ（プローブ／ターゲットコンプレ
ックスが付着したもの）を磁界により試験管の側面へ引
き付け、液相（ハイブリダイズしていないターゲットお
よびディテクター分子を含む）を試験管からアスピレー
ションにより除去した。
試験管内に残留する捕獲されたターゲットコンプレッ
クスをこの方法でさらに２回洗浄した。
クスをこの方法でさらに２回洗浄した。
分離されたビーズを、最後に3.25M GuSCN、65mM ED
TA、0.1Mトリス−HCl、pH7.0、0.5％サルコシンおよび
0.5％BSAを含有する溶液0.1mlに懸濁し、37℃で５分間
インキュベートした。この処理によりビーズとdA−テイ
ル付きキャプチャープローブの間のdT:dA結合が“解
離”することによって、ターゲットコンプレックスがビ
ーズから遊離した。
TA、0.1Mトリス−HCl、pH7.0、0.5％サルコシンおよび
0.5％BSAを含有する溶液0.1mlに懸濁し、37℃で５分間
インキュベートした。この処理によりビーズとdA−テイ
ル付きキャプチャープローブの間のdT:dA結合が“解
離”することによって、ターゲットコンプレックスがビ
ーズから遊離した。
溶液を採取し、新たなアリコートのビーズ（0.1ml）
と混合し、ターゲットコンプレックスを上記により37℃
で５分間“再捕獲”した。前記洗浄操作も反復した。
と混合し、ターゲットコンプレックスを上記により37℃
で５分間“再捕獲”した。前記洗浄操作も反復した。
３回目の洗浄および分離ののちビーズを0.1mlの洗浄
用緩衝液に再懸濁し、ビーズをニトロセルロースメンブ
レン上に取し、Ｘ線フィルムに露光した。
用緩衝液に再懸濁し、ビーズをニトロセルロースメンブ
レン上に取し、Ｘ線フィルムに露光した。
各プローブのハイブリダイゼーションの程度は、露光
されたフィルムを視覚検査することにより判定された。
結果を表３に示す。＋＋＋＋はプローブとターゲットの
配列が完全に調和していることが配列分析により明らか
に判定された“対照”クラミジア・トラコマチス血清変
異体のものに等しいハイブリダイゼーションシグナルを
示す。＋＋＋、＋＋、＋および−はそれぞれ、極めて強
い、強い、弱い、および検出不可能なシグナルを表す。
されたフィルムを視覚検査することにより判定された。
結果を表３に示す。＋＋＋＋はプローブとターゲットの
配列が完全に調和していることが配列分析により明らか
に判定された“対照”クラミジア・トラコマチス血清変
異体のものに等しいハイブリダイゼーションシグナルを
示す。＋＋＋、＋＋、＋および−はそれぞれ、極めて強
い、強い、弱い、および検出不可能なシグナルを表す。
表３に示した約１×106の非クラミジア（陰性対照）
細菌へのプローブのハイブリダイゼーションも同様に採
点された。
細菌へのプローブのハイブリダイゼーションも同様に採
点された。
実施例2:プローブハイブリダイゼーション挙動のドット
ブロット分析 周知の方法によるドットブロット分析は下記による。
核酸または一群の核酸をフィルター、たとえばニトロセ
ルロース、ナイロンその他の誘導体化されたメンブレン
に固定化する。これらは特にこのために市販されてい
る。DNAまたはRNAはこれらのフィルターに容易に固定化
され、次いで各種条件下で（すなわちストリンジェンシ
ー）目的のヌクレオチド配列またはプローブとのハイブ
リダイゼーションにつき検査または試験される。ストリ
ンジェント条件下では、ターゲット配列に対する相補性
の高いヌクレオチド配列をもつプローブほど、相補性の
低いプローブより高い水準のハイブリダイゼーションを
示すであろう。
ブロット分析 周知の方法によるドットブロット分析は下記による。
核酸または一群の核酸をフィルター、たとえばニトロセ
ルロース、ナイロンその他の誘導体化されたメンブレン
に固定化する。これらは特にこのために市販されてい
る。DNAまたはRNAはこれらのフィルターに容易に固定化
され、次いで各種条件下で（すなわちストリンジェンシ
ー）目的のヌクレオチド配列またはプローブとのハイブ
リダイゼーションにつき検査または試験される。ストリ
ンジェント条件下では、ターゲット配列に対する相補性
の高いヌクレオチド配列をもつプローブほど、相補性の
低いプローブより高い水準のハイブリダイゼーションを
示すであろう。
表４に示す実験については、指示された各生物から得
られた0.1マイクログラムの精製RNA（レーン（Lane）
ら,1985,Proceedings of the National Academy o
f science,USA 82:6955−6959）をニトロセルロース
フィルターにスポットした。オリゴヌクレオチドプロー
ブは標準法により放射性Ｐ−32で末端標識された。
られた0.1マイクログラムの精製RNA（レーン（Lane）
ら,1985,Proceedings of the National Academy o
f science,USA 82:6955−6959）をニトロセルロース
フィルターにスポットした。オリゴヌクレオチドプロー
ブは標準法により放射性Ｐ−32で末端標識された。
ここに記載するオリゴヌクレオチドについては、60℃
で14−16時間の、rRNAターゲットへのハイブリダイゼー
ション（0.9M NaCl,0.12Mトリス−HCl,pH7.8,6mM EDT
A,0.1M KPO4,0.1％SDS,0.1％ピロホスフェート,0.002
％ファイコル,0.02％BSAおよび0.002％ポリビニルピロ
リジンを含有するハイブリダイゼーション溶液中で）、
次いで非結合プローブを除去するための60℃で３回、15
分間のハイブリダイゼーション後洗浄（0.03M NaCl,0.
004Mトリス−HCl,pH7.8,0.2mM EDTAおよび0.1％SDS
中）が表４に詳述する特異性水準を得るのに十分な程度
にストリンジェントであろう。
で14−16時間の、rRNAターゲットへのハイブリダイゼー
ション（0.9M NaCl,0.12Mトリス−HCl,pH7.8,6mM EDT
A,0.1M KPO4,0.1％SDS,0.1％ピロホスフェート,0.002
％ファイコル,0.02％BSAおよび0.002％ポリビニルピロ
リジンを含有するハイブリダイゼーション溶液中で）、
次いで非結合プローブを除去するための60℃で３回、15
分間のハイブリダイゼーション後洗浄（0.03M NaCl,0.
004Mトリス−HCl,pH7.8,0.2mM EDTAおよび0.1％SDS
中）が表４に詳述する特異性水準を得るのに十分な程度
にストリンジェントであろう。
前記のようにハイブリダイゼーションおよび洗浄した
のち、ハイブリダイゼーションフィルターをＸ線フィル
ムに露光し、既知量のターゲット物質（RNA）の対照ス
ポットに対してシグナル強度を視覚的に“採点した”
（実施例１）。
のち、ハイブリダイゼーションフィルターをＸ線フィル
ムに露光し、既知量のターゲット物質（RNA）の対照ス
ポットに対してシグナル強度を視覚的に“採点した”
（実施例１）。
rRNAの検出に関して本発明の説明を行ったが、ここに
記載するプローブおよびここに記載するプローブに対し
相補的なプローブはrRNAを特定する遺伝子（DNA）（す
なわち“rDNA"）の検出にも有用であることは容易に理
解され、従ってこれらのプローブはここに記載するプロ
ーブと均等物であり、本発明および請求の範囲の精神お
よび範囲に包含されると解すべきである。
記載するプローブおよびここに記載するプローブに対し
相補的なプローブはrRNAを特定する遺伝子（DNA）（す
なわち“rDNA"）の検出にも有用であることは容易に理
解され、従ってこれらのプローブはここに記載するプロ
ーブと均等物であり、本発明および請求の範囲の精神お
よび範囲に包含されると解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウィリアムス，シャーロット アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01532，ノースボロー，ウィンター・ス トリート 41 (72)発明者 マハン，ドナルド アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01519，グラフトン，ノース・ストリー ト 92 (72)発明者 レーン，デビッド・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01757，ミルフォード，オリオール・ド ライブ ９ (72)発明者 キング，ウォルター アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01754，メイナード，フレッチャー・ス トリート ３ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (6)
- 【請求項１】クラミジア・トラコマチスの23S rRNAの一
部又は全部と相補的または同一である核酸の配列、なら
びに所望により検出リガンドまたはキャプチャーリガン
ドからなる核酸プローブであって、前記クラミジア・ト
ラコマチスの23S rRNAは、以下の配列： この場合、前記核酸の配列は少なくとも、コア領域５′
−GAUAAGCAAAGACCCGGAGGUA−３′と完全に相補的または
同一のコア配列を含む； この場合、前記核酸の配列は少なくとも、コア領域５′
−GUAAUAGACUACCAUUGCAUGC−３′またはコア領域５′−
UAUGCAAAGCGACACCUGCC−３′と完全に相補的または同一
のコア配列を含む；あるいは この場合、前記核酸の配列は少なくとも、コア領域５′
−UAGCCUAAACCGAGCUGAUAAGGCUC−３′と完全に相補的ま
たは同一のコア配列を含む； を有する、前記核酸プローブ。 - 【請求項２】検出リガンドまたはキャプチャーリガンド
がフルオレセイン、32−Ｐ、ビオチンまたはポリ−デオ
キシアデノシンテイルである、請求項１の核酸プロー
ブ。 - 【請求項３】前記ヌクレオチドの配列が、以下の： と完全に相補的であるか、あるいは同一である、請求項
１の核酸プローブ。 - 【請求項４】検出リガンドまたはキャプチャーリガンド
がフルオレセイン、32−Ｐ、ビオチンまたはポリ−デオ
キシアデノシンテイルである、請求項３の核酸プロー
ブ。 - 【請求項５】試料中のクラミジア・トラコマチスの存在
を検出する方法であって、 （ａ）試料を請求項１の少なくとも１種類の核酸プロー
ブと接触させ； （ｂ）試料と核酸プローブにハイブリダイゼーション条
件を課し、プローブと、クラミジア・トラコマチスのrR
NAまたはrDNAが存在する場合にはそれとの間の核酸複合
体の形成を可能にし；そして （ｃ）前記核酸複合体を、試料中にクラミジア・トラコ
マチスが存在することを示す指標として検出する ことを含む、前記方法。 - 【請求項６】核酸プローブが請求項２、３および４のい
ずれか１項に記載のプローブである、請求項５の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35929389A | 1989-05-31 | 1989-05-31 | |
| US359,293 | 1989-05-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04500309A JPH04500309A (ja) | 1992-01-23 |
| JP3170714B2 true JP3170714B2 (ja) | 2001-05-28 |
Family
ID=23413201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50880590A Expired - Fee Related JP3170714B2 (ja) | 1989-05-31 | 1990-05-31 | クラミジア・トラコマチスを検出するための核酸プローブ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0732408A3 (ja) |
| JP (1) | JP3170714B2 (ja) |
| AT (1) | ATE140732T1 (ja) |
| AU (1) | AU5818890A (ja) |
| CA (1) | CA2031503A1 (ja) |
| DE (1) | DE69027910T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990015159A2 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5700636A (en) * | 1990-10-19 | 1997-12-23 | Becton Dickinson And Company | Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples |
| AU2844792A (en) * | 1991-12-11 | 1993-06-17 | Becton Dickinson & Company | Probes to chlamydia trachomatis |
| CA2124795A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Ray Sanchez-Pescador | Chlamydiae probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| EP0625213B1 (en) * | 1992-10-09 | 1999-12-29 | VYSIS, Inc. | Assay methods |
| JPH10500310A (ja) * | 1994-05-19 | 1998-01-13 | ダコ アクティーゼルスカブ | 淋菌及びトラコーマ クラミジアの検出のためのｐｎａ プローブ |
| US5514551A (en) * | 1994-10-14 | 1996-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| US5888733A (en) * | 1995-11-16 | 1999-03-30 | Dako A/S | In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples |
| US6558901B1 (en) | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
| IL124275A (en) | 1997-05-02 | 2002-03-10 | Bio Merieux Vitek Inc | A method to produce sequences of nucleic acids |
| FR2764293B1 (fr) * | 1997-06-05 | 2001-09-14 | Bio Merieux | Fragment nucleotidique de l'arn 23s de bacteries du genre chlamydia, utilisations comme sonde, amorce, et dans un reactif et un procede de detection |
| US6261769B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-07-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Intergenic spacer target sequence for detecting and distinguishing Chlamydial species or strains |
| US7807802B2 (en) | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
| JP5254012B2 (ja) | 2005-06-06 | 2013-08-07 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | テスト試料中のＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を決定するための、組成物、方法およびキット |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| JP2011062088A (ja) * | 2009-09-15 | 2011-03-31 | Ihi Corp | レジオネラ菌検出方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE163680T1 (de) * | 1986-11-24 | 1998-03-15 | Gen Probe Inc | Nukleinsäuresonden zum nachweis und/oder zur quantifizierung von nicht-viralen organismen |
| ATE107654T1 (de) * | 1987-03-02 | 1994-07-15 | Gen Probe Inc | Polykationische träger zur reinigung, trennung und hybridisierung von nukleinsäure. |
| EP0305145A3 (en) * | 1987-08-24 | 1990-05-02 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Methods and probes for detecting nucleic acids |
| DE3854029T2 (de) * | 1987-09-21 | 1995-10-26 | Gen Probe Inc | Homogener Abschirmungstest. |
| DE68929112T2 (de) * | 1988-03-18 | 2000-09-28 | Vysis Inc | Nachweis von Yersinia Intermedia |
-
1990
- 1990-05-31 EP EP95203160A patent/EP0732408A3/en not_active Withdrawn
- 1990-05-31 AT AT90909245T patent/ATE140732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-31 EP EP90909245A patent/EP0428693B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-31 JP JP50880590A patent/JP3170714B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-31 CA CA002031503A patent/CA2031503A1/en not_active Abandoned
- 1990-05-31 WO PCT/US1990/002989 patent/WO1990015159A2/en active IP Right Grant
- 1990-05-31 DE DE69027910T patent/DE69027910T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-31 AU AU58188/90A patent/AU5818890A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1990015159A2 (en) | 1990-12-13 |
| CA2031503A1 (en) | 1990-12-01 |
| EP0428693B1 (en) | 1996-07-24 |
| WO1990015159A3 (en) | 1991-06-27 |
| DE69027910T2 (de) | 1997-02-20 |
| EP0732408A3 (en) | 2004-01-14 |
| EP0732408A2 (en) | 1996-09-18 |
| DE69027910D1 (de) | 1996-08-29 |
| AU5818890A (en) | 1991-01-07 |
| EP0428693A1 (en) | 1991-05-29 |
| ATE140732T1 (de) | 1996-08-15 |
| JPH04500309A (ja) | 1992-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3833703B2 (ja) | ハイブリダイゼーションアッセイを用いて同時に行う真正細菌分類群の検出、単離および区別 | |
| JP3170714B2 (ja) | クラミジア・トラコマチスを検出するための核酸プローブ | |
| Mangiapan et al. | Sequence capture-PCR improves detection of mycobacterial DNA in clinical specimens | |
| US5705339A (en) | Methods for the detection of the bacterial agents causing spoilage of beer | |
| Stender et al. | Direct detection and identification of Mycobacterium tuberculosis in smear-positive sputum samples by fluorescence in situ hybridization (FISH) using peptide nucleic acid (PNA) probes | |
| JP2795503B2 (ja) | サルモネラ菌の検出 | |
| JPH08266299A (ja) | 核酸プローブ | |
| JPH08510386A (ja) | ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定 | |
| JP2001103986A (ja) | 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 | |
| CA2553286C (en) | Method for detecting pathogenic mycobacteria in clinical specimens | |
| US5552279A (en) | Nucleic acid probes for the detection of mycoplasma pneumoniae and mycoplasma genitalium | |
| US5843667A (en) | Nucleic acid probes for the detection for genital mycoplasmas | |
| JPH08510920A (ja) | Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを検出するための核酸プローブ | |
| US6210876B1 (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting Chlamydia pneumoniae | |
| JPH0817720B2 (ja) | ナイセリア・ゴノロエエの特異的検出法 | |
| JP2010515451A (ja) | 大腸菌検出用ｄｎａチップ | |
| WO1997044488A2 (en) | Compositions and methods for the detection of mycobacterium kansasii | |
| CA2075186A1 (en) | Hybridization probes for the detection of branhamella catarrhalis strains | |
| Rossau et al. | DNA probes for Bordetella species and a colorimetric reverse hybridization assay for the detection of Bordetella pertussis | |
| JP3360736B2 (ja) | ミコバクテリア属微生物を特異的に認識するプローブ及びミコバクテリア属微生物の検出方法 | |
| Manceau et al. | Assessment of subtractive hybridization to select species and subspecies specific DNA fragments for the identification of Xylophilus ampelinus by polymerase chain reaction (PCR) | |
| RU2338789C2 (ru) | Способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах | |
| RU2796820C1 (ru) | Способ детекции чумного микроба и набор реагентов для его осуществления | |
| CN115427567A (zh) | 判断属于脓肿分枝杆菌复合群的抗酸菌的erm(41)基因的单碱基突变的方法、该方法所使用的引物组及探针 | |
| Liu et al. | Genotypic identification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |