RU2796820C1 - Способ детекции чумного микроба и набор реагентов для его осуществления - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Предложен набор реагентов для детекции чумного микроба. Набор включает иммуномагнитные частицы magF19 - конъюгаты моноклональных антител к поверхностным антигенам Y. pestis F19 с наномагнитными частицами размером 200 нм - для магнитоуправляемой сепарации бактерий вида Yersinia pestis в пробах, и набор олигонуклеотидных праймеров для определения бактерий вида Yersinia pestis методом петлевой изотермической амплификации, содержащий олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID 2; SEQ ID 3, SEQ ID 4; SEQ ID 5, SEQ ID 6. Предложен способ детекции чумного микроба, в котором на первом этапе проводят магнитоуправляемую сепарацию бактерий вида Yersinia pestis в пробах с использованием набора иммуномагнитных частиц magF19, на втором этапе определение бактерий вида Yersinia pestis проводят методом петлевой изотермической амплификации с помощью набора реагентов для детекции чумного микроба. Синтез и накопление фрагментов гена-мишени проводят при 63°С в течение максимум 40 мин. Определение целевого гена-мишени проводят с помощью окрашивания продуктов реакции амплификации интеркалирующим красителем SYT082. Заявленное изобретение позволяет в течение 1-2 часов с высокой специфичностью детектировать наличие возбудителя чумы - Yersinia pestis в пробах чистых культур в концентрациях от 10 до 1000 м.к. в мл в зависимости от штаммов. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для лабораторной диагностики чумы, как в практическом здравоохранении, так и для научных исследований в области микробиологии, эпидемиологии и патогенеза чумы.

Чума - природно-очаговая особо опасная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя. Этиологическим агентом чумы является - Yersinia pestis (семейство Enterobacteriaceae род Yersinia) - неподвижная мелкая (1-3х0,5-0,7 мкм) прямая или овоидная, грамотрицательная палочка, отличающаяся полиморфизмом (наряду с обычными палочками и короткими коккобациллами встречаются и более длинные клетки), факультативный анаэроб. Заболевание характеризуется интоксикацией, лихорадкой, поражением лимфатической системы, сепсисом и летальностью, уровень которой колеблется в значительных пределах от высокого (около 50%) до низкого, в зависимости от клинической формы, срока заболевания и качества лечения. Источники инфекции - больные животные и больной человек. Заболевания людей чумой регистрируются более чем в 25 странах мира. Ежегодно число заболевших чумой составляет около 2,5 тысячи человек, причём без тенденции к снижению. В природных очагах источником возбудителя инфекции служат грызуны и зайцеобразные разных видов. Естественная зараженность чумой зарегистрирована почти у 250 видов диких животных, от которых возбудитель получают городские грызуны - крысы и мыши. От зараженных животных чума передается при укусах блох. На территории России 11 природных очагов чумы, где чумной микроб циркулирует среди носителей: диких грызунов (сурков, сусликов, песчанок, полёвок и др.) и зайцеобразных (пищух) - постоянно передаваясь от больного зверька здоровому посредством переносчиков: в основном через укусы блох. Возбудитель чумы способен сохраняться в природе в течение многих десятков и сотен лет. Общая площадь природных очагов чумы в России составляет свыше 31 млн га. Наиболее обширные очаговые территории расположены в Европейской России, 10 % приходится на природные очаги Сибири. При этом в России ежегодно на территории природных очагов под риском заражения находится свыше 20 тыс. человек.

Yersinia pestis - один из наиболее патогенных для человека микроорганизмов, в течение длительного времени циркулирующий на территориях природных очагов на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды. Культуры Y. pestis ежегодно изолируют в природных очагах чумы, находящихся на территории Российской Федерации и сопредельных государств, также существует угроза применения этого патогена в качестве агента биотерроризма (Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов С.В., Мартынюк Р.А. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза. Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73, № 3. C. 195-204.).

Лабораторная диагностика чумы основана на применении комплекса методов: бактериоскопических, бактериологических, биологических и серологических тестов, а также молекулярных методов для идентификации характерных для Y. pestis последовательностей ДНК. Наиболее перспективными методами диагностики чумы являются молекулярно-биологические методы (в частности - ПЦР) ввиду высокой чувствительности, специфичности и оперативности исследования, а также возможности тестировать любой тип биологического материала и объекты окружающей среды. Молекулярные методы диагностики могут иногда заменять культуральную диагностику, даже когда бактерии не жизнеспособны или образцы исследуемого материала сильно загрязнены. Применяемые методы молекулярной диагностики высокоэффективны, однако требуют высокого уровня технической экспертизы и использования дорогостоящего оборудования для проведения реакций и визуализации результатов. В качестве альтернативного решения для упрощения и удешевления молекулярной диагностики чумы может рассматриваться метод петлевой изотермической амплификации ДНК (loop-mediated isothermal amplification - LAMP). Метод разработан Notomi и соавт. (Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12): E63), он не требует больших затрат времени и является более дешевой альтернативой для экспресс-диагностики различных инфекций. В 2009 г. опубликованы патентные сведения (Patents China. Method For Detecting Yersinia Pestis By Utilizing A Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). - 2010, China C12Q1/68GK101665832 SQ200910090037. - [Электронный ресурс]. URL: http://www.chnpat.com.) о применении петлевой изотермической амплификации для детекции чумного микроба. Предложенное изобретение существенно улучшает метод в сторону увеличения чувствительности и специфичности обнаружения Y. pestis. В патенте приводится описание использованных типов праймеров и экспериментальных примеров по подбору факторов оптимизации условий выполнения метода: выбор концентраций фермента, ионов Mg²⁺, дНТФ, бетаина и температуры проведения реакции. Таким образом, в настоящий момент разработка отечественных средств индикации и идентификации возбудителя чумы на основе изотермической амплификации (LAMP) очень актуальна.

Исследования молекулярно-генетической амплификационной технологии LAMP показали высокую специфичность и эффективность, которая достигается при изотермальных условиях реакции (Kaneko H., Kawana T., Fukushima E., Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007. 70(3):499-501; Bai Y., Rizzo M.R., Parise C., Maes S., Eisen R.J. A Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Yersinia pestis. Front Microbiol. 2022, 7;13:863142). В LAMP используется 4 праймера, которые гомологичны шести участкам гена-мишени. Дополнительно можно использовать 2 петлевых праймера, применение которых позволяет заметно сократить время реакции. Синтез продукта протекает при постоянной температуре с использованием фермента, который катализирует реакцию синтеза новых цепей со смещением старых. Амплификацию и детектирование гена можно осуществить за одну стадию путем инкубации смеси образцов, праймеров, ДНК-полимеразы с функцией вытеснения цепей и субстратов при постоянной температуре (около 65°С). Эффективность амплификации очень высока, в течение 15-60 минут ДНК амплифицируется 10⁹-10¹⁰ раз. Из-за высокой специфичности присутствие амплифицированного продукта однозначно указывает на присутствие гена-мишени.

Для обнаружения небольшого количества патогена в анализируемом образце концентрацию микроорганизмов следует увеличить до уровня предела обнаружения метода детекции. Однако, стадия накопления микроорганизмов может занимать продолжительное время (18-72 часа), увеличивая общее время анализа. Для улучшения чувствительности детекции патогена может использоваться иммуномагнитная сепарация. Магнитные частицы, связанные со специфическими антителами к антигенам на поверхности бактерий, селективно захватывают детектируемый микроорганизм и способствуют удалению мешающих анализу примесей из сложного образца.

Известно об использовании подобного метода для детекции Y. pestis (Feng N., Zhou Y., Fan Y., Bi Y., Yang R., Zhou Y., Wang X. Yersinia pestis detection by loop-mediated isothermal amplification combined with magnetic bead capture of DNA. Braz. J. Microbiol. 2018; 49(1):128-137). В качестве мишени использовали последовательность 3a на хромосоме. Для оценки специфичности праймеров проводили сравнение методов LAMP и ПЦР. Детекцию чумного микроба проводили в чистых культурах, а также контаминированных Y. pestis образцах легких, селезенки и печени. Результаты показали, что некоторые компоненты в тканях могут ингибировать и LAMP, и ПЦР. Использование магнитных частиц для иммуномагнитной сепарации значительно повысило чувствительность LAMP. Применение LAMP-анализа было возможно не только при анализе ДНК из чистых культур штаммов Y. pestis, но и при обнаружении патогена в суспензиях органов мышей. Однако информации о сочетании магнитоуправляемой сепарации с использованием конъюгатов моноклональных антител с наномагнитными частицами и изотермической амплификации нуклеиновых кислот для детекции Y. pestis и (или) диагностических LAMP-тестах в открытых источниках не обнаружено.

Известен фермент для проведения петлевой изотермической амплификации - Bst-полимераза, выделенная из Bacillus stearothermophilus (Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase T., Notomi T., 2001. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a non-denatured template. Clin. Chem., 47: 1742-1743). Bst-полимераза активна при температуре до 66°С, но оптимальной для нее является температура 60°С. Успех изотермической амплификации зависит от активности ферментов по вытеснению цепи и от их способности проходить такие сложные области ДНК, как шпильки. Однако, в научных публикациях есть сообщения о появлении ложно-положительных сигналов при работе с Bst-полимеразой.

Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений об отечественных наборах, предназначенных для выявления Y. pestis методом петлевой изотермической амплификации с пробоподготовкой на иммуномагнитных частицах (ИМЧ) с конъюгированными моноклональными антителами к поверхностному антигену Y. pestis. Поэтому, существует необходимость создания такого диагностикума для быстрой, чувствительной и специфичной детекции ДНК чумного микроба.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка конъюгатов моноклональных антител с наномагнитными частицами для магнитоуправляемой сепарации чумного микроба, а также разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, специфичного и чувствительного способа выявлении бактерий вида Y. pestis в биологических образцах, основанного на петлевой изотермической амплификации фрагмента гена-мишени.

Технический результат достигается посредством концентрирования бактерий Y. pestis в анализируемом образце, проводимом с помощью иммуномагнитных частиц, конъюгированных с моноклональными антителами F19 к капсульному антигену Y. pestis..

Технический результат также достигается способом детекции чумного микроба, при котором используется набор оригинальных праймеров:

SEQ ID №:2 (прямой внешний праймер Yp-F3 Y. pestis);

SEQ ID №:3 (обратный внешний праймер Yp-B3 Y. pestis);

SEQ ID №:4 (прямой внутренний праймер Yp-FIP Y. pestis);

SEQ ID №:5 (обратный внутренний праймер Yp-BIP Y. pestis);

SEQ ID №:6 (петлевой праймер Yp-LВ Y. pestis)

и фермент SD-полимераза (Ignatov K.B., Barsova E.V., Fradkov A.F., Blagodatskich K.A., Kramarova T.V., Kramarov V.M. A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques. 2014; 57:81-7) в реакции петлевой изотермической амплификации в следующих условиях: предварительный прогрев смеси 92°C - 2 мин, амплификация 63°C - 40 мин, детекция продукта амплификации осуществляется по появлению флуоресцентного окрашивания пробы, содержащей интеркалирующий краситель SYTO 82. Регистрация флуоресценцентного сигнала осуществляется непосредственно после завершения реакции амплификации с помощью УФ света, источником которого может быть трансиллюминатор.

Технический результат также достигается благодаря использованию в качестве целевой мишени фрагмента хромосомного участка YPO0392, который присутствуют в геноме только у Y. pestis.

Обоснование разработки конъюгатов моноклональных антител с наномагнитными частицами для магнитоуправляемой сепарации.

Использование иммуномагнитных частиц для выделения и концентрирования чумного микроба может обеспечить повышение чувствительности и специфичности детекции на основе амплификации ДНК. Важным фактором в разработке системы магнитоуправляемой сепарации являет подбор соответствующих антител, связывающих бактериальные клетки. С помощью гибридомной технологии были получены мышиные моноклональные антитела к поверхностным антигенам Y. pestis - F19, которые специфично связываются с капсульным антигеном Y. pestis.

Обоснование выбора олигонуклеотидных праймеров и ДНК-мишени.

Большинство вирулентных факторов Y. pestis кодируются последовательностями плазмиды размером 70 kb, которая присутствует у всех трех видов Yersinia и, следовательно, не является видоспецифичной. В геноме чумного микроба обнаружены хромосомные участки, характерные только для патогенных видов Y. pestis. Ген YPO0392, был идентифицирован с помощью сравнительной геномной гибридизации, как хромосомный участок, специфический для вида Y. pestis, и не был найден ни в одном из исследованных в работах штаммах Y. pseudotuberculosis или Y. enterocolitica (Zhou D., Han Y., Dai E., Pei D., Song Y., Zhai J., Du Z., Wang J., Guo Z., Yang R. Identification of signature genes for rapid and specific characterization of Yersinia pestis. Microbiol Immunol 2004a; 48:263-269). Генетический локус YPO0392 был выбран в качестве мишени для конструирования праймеров. Последовательность SEQ ID №1 (ген-мишень YPO0392) для подбора праймеров с целью детекции ДНК возбудителя чумы методом петлевой изотермической амплификации была получена из базы GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США).

В качестве положительного контроля в экспериментах использовали штамм Y. pestis EV НИИЭГ, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×10⁶ м.к./мл до 1×10⁰ м.к./мл. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей чумы Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Чувствительность реакции амплификации с праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штамма Y. pestis EV НИИЭГ после пробоподготовки на иммуномагнитных частицах.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл.3, фиг. 1-3) и примерами (1-5).

Таблица 1. Характеристика олигонуклеотидных праймеров для детекции возбудителя чумы.

Таблица 2. Оценка специфичности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5, SEQ ID №6.

Таблица 3. Оценка чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5, SEQ ID №6.

Фиг. 1. Последовательность SEQ ID №1 - нуклеотидная последовательность хромосомного участка YPO0392 из генома штамма Y. pestis CO92. Серыми прямоугольниками выделены участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности.

Фиг 2. Результаты амплификации ДНК штаммов возбудителя чумы с набором LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5, SEQ ID №6.

Обозначения: 1 - ДНК Y. pestis EV НИИЭГ; 2 - ДНК Y. pestis 5307-Гис; 3 - ДНК Y. pestis И-2422; 4 - ДНК Y. pestis И-3446; 5 - ДНК Y. pestis И-2359; 6 - ДНК Y. pestis И-1996; 7 - ДНК Y. pestis И-3449; 8 - ДНК Y. pestis И-1988; 9 - Y. pseudotuberculosis 35; 10 - Y. enterocolitica C-126; 11 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Фиг 3 Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5, SEQ ID №6. Использована ДНК из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.

Обозначения: 1 - ДНК из 1×10⁶ м.к. 2 - ДНК из 1×10⁵ м.к.; 3 - ДНК из 1×10⁴ м.к. 4 - ДНК из 1×10³ м.к. 5 - ДНК из 1×10² м.к.; 6 - ДНК из 1×10¹ м.к.; 7 - ДНК из 1 м.к.; 8 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика получения иммуномагнитных частиц с конъюгированными антителами для селективного захвата возбудителей чумы.

Для получения конъюгатов моноклональных антител с наномагнитными частицами использовали частицы размером 200 нм (Chemicell, Германия) с поверхностью, содержащей свободные аминогруппы. Моноклональные антитела к поверхностным антигенам Y. pestis F19, получали с помощью гибридомной технологии. Моноклональные антитела F19 способны связываться с капсульным антигеном Y. pestis с высокой специфичностью и аффинностью. Конъюгирование моноклональных антител с частицами проводили с помощью гетеробифункционального линкера. К преимуществу использования гетеробифункционального линкера следует отнести возможность ориентированного конъюгирования молекул на поверхности частиц. Большая плотность антител повышает извлекаемость детектируемого патогена, позволяя сократить время инкубирования суспензии иммуномагнитных частиц с исследуемым образцом.

Пример 2. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для детекции ДНК возбудителей чумы методом петлевой изотермической амплификации.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителя чумы, присутствующих в базе данных GenBank NCBI, для конструирования прямого и обратного внешних праймеров F3 и B3, прямого и обратного внутренних праймеров FIP и BIP, петлевого праймера LB был выбран участок генома Y. pestis размером 723 п.н., кодирующий предполагаемый белок. К участку гена SEQ ID №1 (фиг. 1) подобраны праймеры SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5, SEQ ID №6. Расчетная длина предполагаемого ампликона, фланкируемого праймерами SEQ ID №4; SEQ ID №5, составила 144 п.н. (табл.1). на Фиг 1 показаны участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности, которые выделены прямоугольниками серого цвета.

При выборе олигонуклеотидных праймеров использовали программу для расчета праймеров он-лайн Primer Explorer 5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). При подборе праймеров руководствовались требованиями к олигонуклеотидам, используемым в LAMP. Анализ формирования вторичных структур (димеров, шпилек) выбранными праймерами проводили с помощью компьютерной программы mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). Структуры всех олигонуклеотидов сравнивались с помощью информационного ресурса NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с последовательностями ДНК, размещенными в базе данных GenBank. При проведении этого анализа олигонуклеотиды с существенной гомологией с ДНК каких-либо других организмов исключали. Для определения специфичности праймеров моделировали ПЦР in silico в отношении секвенированных геномов микроорганизмов с помощью in silico PCR amplification (http://insilico.ehu.es/PCR/). Показана теоретическая пригодность праймеров для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Пример 3. Пробоподготовка на иммуномагнитных частицах (ИМЧ).

Суспензию иммуномагнитных частиц (10 мг/мл) тщательно ресуспендировали на вортексе. Вносили в каждую микропробирку с исследуемым образцом объемом 1 мл по 10 мкл суспензии частиц. Перемешивали содержимое пробирок, переворачивая микропробирки 5-6 раз, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 45 минут в роторной мешалке (Biosan, Латвия) со скоростью 4 оборота в минуту. В процессе инкубации каждые 10-15 минут образцы с ИМЧ перемешивали переворачиванием 5-6 раз. После инкубации микропробирки переносили в магнитный штатив. Через 3-4 минуты после полного осаждения частиц на стенке пробирки аккуратно отбирали супернатант. Микропробирки извлекали из магнитного штатива, смывали и ресуспендировали осажденные ИМЧ в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняли процедуру обеззараживания материала. Для этого в пробирки с тестируемыми микробными взвесями в объеме 100 мкл добавляли 11 мкл 0,1 % натрия мертиолята (разведение 1:1000) до конечной концентрации 0,01% (разведение 1:10000) и прогревали при температуре (56±1)°С в течение 30 мин. По истечении заданного времени в пробирки с бактериальными взвесями вносили по 450 мкл лизирующего раствора из комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-сорб» (ООО Интерлабсервис) и прогревали при температуре (65+1)°С в течение 15 мин. После этого пробы считали обеззараженными. Выделение ДНК осуществляли при помощи комплекта реагентов «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя, начиная с этапа внесения сорбента.

Пример 4. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для детекции возбудителя чумы методом петлевой изотермической амплификации.

Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1х SD-буфер (РусЭнзим, Россия), 40 ед. SD-полимеразы (РусЭнзим, Россия), 3,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ каждого дНТФ, 5 праймеров: 0,2 мкМ SEQ ID №2 (Yp-F3), 0,2 мкМ SEQ ID №3 (Yp-B3), 0,8 мкМ SEQ ID №4 (Yp-BIP), 0,8 мкМ SEQ ID №5 (Yp-FIP), 0,4 мкМ SEQ ID №6 (Yp-LB), 5 мкл матрицы. Реакцию проводили при температуре 63°С в течение 40 мин с предварительным прогревом при температуре 92°С в течение 2 мин на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология). Учет результатов петлевой изотермической амплификации проводили по наличию или отсутствию оранжевого свечения в проходящем УФ свете при длине волны 312 нм при температуре 60-63°С.

Результат амплификации каждого штамма Y. pestis считался положительным в случае наличия оранжевого окрашивания в проходящем УФ свете при длине волны 312 нм при температуре 60-63°С. Фиг 2 отображает результат амплификации ДНК штаммов возбудителя чумы с набором праймеров к последовательности SEQ ID №1.

Пример 5. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров к последовательности SEQ ID №1 для идентификации ДНК возбудителя чумы.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток Y. pestis после пробоподготовки с помощью иммуномагнитных частиц. Штаммы иерсиний выращивали в бульоне Хоттингера рН (7,2±0,1) в течение 18-24 ч при температуре 28±1°С. Затем производили посев бактериологической петли на чашки Петри с агаром Хоттингера, рН (7,2±0,1) и инкубировали 18-24 ч при температуре 28±1°С. Готовили бактериальные взвеси клеток в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-85 П), что соответствует 1×10⁹ м.к./мл для Y. pestis. Затем разводили в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида таким образом, чтобы концентрация возбудителей туляремии составляла от 1×10⁶ до 1×10⁰ м.к./мл. На первом этапе проводили пробоподготовку на иммуномагнитных частицах magF19, затем выделяли ДНК с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией по применению.

Учитывая, что возбудитель чумы относится к агентам I группы патогенности, пробоподготовку и обеззараживание материала для проведения ПЦР осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».

Специфичность разработанных праймеров оценена на коллекции из 18 штаммов, из которых 8 штаммов Yersinia pestis и 12 штаммов гетерологичных микроорганизмов (2 штамма Y. pseudotuberculosis и по 1 штамму Y. enterocolitica, L. pneumophila, B. anthracis, B. cereus, F. tularensis, B. abortus, B. melitensis, B. suis, V. cholerae, E. coli). Оценка специфичности показала отсутствие продуктов амплификации с ДНК гетерологичных штаммов. Таблица 2 отображает результат оценки специфичности олигонуклеотидных праймеров.

Чувствительность праймеров оценивали с помощью проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штамма Y. pestis EV НИИЭГ с пробоподготовкой на иммуномагнитных частицах. Анализ результатов показал, что чувствительность разработанных праймеров составила 1×10³ м.к. в пробе. Таблица 3 и Фиг 3 отображают результат отображает результат определения чувствительности олигонуклеотидных праймеров.

Таким образом, в результате проведенной оценки установлено, что разработанные магнитные частицы с иммобилизованными антителами для сепарации чумного микроба и праймеры для детекции возбудителей чумы методом петлевой изотермической реакции могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя чумы и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя чумы в анализируемых пробах.

Специфичность анализа составляет 100%, чувствительность анализа - 1×10³ м.к. в пробе.

Claims (17)

1. Набор реагентов для детекции чумного микроба, включающий иммуномагнитные частицы magF19 - конъюгаты моноклональных антител к поверхностным антигенам Y. pestis F19 с наномагнитными частицами размером 200 нм - для магнитоуправляемой сепарации бактерий вида Yersinia pestis в пробах, и набор олигонуклеотидных праймеров для определения бактерий вида Yersinia pestis методом петлевой изотермической амплификации, содержащий олигонуклеотиды SEQ ID 2; SEQ ID 3, SEQ ID 4; SEQ ID 5, SEQ ID 6, приведенные в таблице,

комплементарные к гену-мишени YPO0392 бактерий вида Yersinia pestis, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1:

1 atggtgtcta cgtcattgaa atttggtggg aagataattg aggaactatc tcaaaaaata

61 ccttcatcac tctttgcttt gaatgaattg gtgaagaatt cgtatgacgc attctctcca

121 gatgttacca ttacagtaat tccatcagag ttaaagataa taatttccga ttacggaaac

181 ggtatgtcgg tagacgaaat tcattcttta tttcatatat caaaaagcac taaaaaatat

241 ggttgcgaag taagtcagaa tggaataaag agaattgttc aaggttcaaa aggactgggt

301 tttttatcag cctttaagtt tggtgataaa gttgaatgga aaacatgtca aaatggtata

361 tgtagtgttt tttctgtaaa aaaatcagat ttaatatata aagatgacgt ttctggaatt

421 aagattccta taacaacaga ttctagcaat aagaatggaa ctgagattag aatatttact

481 aatcaacaag atatggatga gttactatct gacttatccg atgaaaagat tgcgcggaaa

541 ttagcagcat caatgttgga tgaatccttt aatgttaaaa ttaagattga aaataaagat

601 aagataatat caacaagtaa attgaagtca tttctttttg agtgtgaaca gagtcaactt

661 ttttatgtga aatacaattt ttctaaagaa gagattgagt tttttcataa gggggataaa

721 taa

2. Способ детекции чумного микроба, характеризующийся тем, что на первом этапе проводят магнитоуправляемую сепарацию бактерий вида Yersinia pestis в пробах с использованием набора иммуномагнитных частиц magF19, на втором этапе определение бактерий вида Yersinia pestis проводят методом петлевой изотермической амплификации с помощью набора реагентов для детекции чумного микроба по п. 1, синтез и накопление фрагментов гена-мишени проводят при 63°С в течение максимум 40 мин, определение целевого гена-мишени проводят с помощью окрашивания продуктов реакции амплификации интеркалирующим красителем SYT082.

Images