JPH05211898A - 水試料中の水系微生物病原体およびヒト糞便汚染の指示微生物の検出方法とそのためのキット - Google Patents
水試料中の水系微生物病原体およびヒト糞便汚染の指示微生物の検出方法とそのためのキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 水試料中の水系微生物病原体およびヒト糞便
汚染の指示微生物の検出方法とそのためのキットの提
供。すなわち、ヒト感染を防いだりその原因を追跡した
りする目的のために、試験管内での酵素的増幅と特定の
遺伝子配列の検出によって、試料中の微生物、とりわけ
水の試料と海の試料を含む環境試料中の水系微生物病原
体と指示微生物、特に主として糞便に由来する細菌を検
出する方法に関する。 【構成】 水試料から病原体または指示生物の細胞を回
収し、細胞を溶解して滅成されていないＤＮＡを回収
し、ポリメラーゼ連鎖反応増幅によって病原体または指
示生物の細胞中に存在する標的遺伝子の標的遺伝子配列
を増幅し、増幅された標的遺伝子配列の存在を検出して
検査試料中に病原体または指示生物が存在するか否かを
決定することを特徴とする、水試料中の水系病原体と指
示生物を検出する方法とそのためのキット。
汚染の指示微生物の検出方法とそのためのキットの提
供。すなわち、ヒト感染を防いだりその原因を追跡した
りする目的のために、試験管内での酵素的増幅と特定の
遺伝子配列の検出によって、試料中の微生物、とりわけ
水の試料と海の試料を含む環境試料中の水系微生物病原
体と指示微生物、特に主として糞便に由来する細菌を検
出する方法に関する。 【構成】 水試料から病原体または指示生物の細胞を回
収し、細胞を溶解して滅成されていないＤＮＡを回収
し、ポリメラーゼ連鎖反応増幅によって病原体または指
示生物の細胞中に存在する標的遺伝子の標的遺伝子配列
を増幅し、増幅された標的遺伝子配列の存在を検出して
検査試料中に病原体または指示生物が存在するか否かを
決定することを特徴とする、水試料中の水系病原体と指
示生物を検出する方法とそのためのキット。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】水試料から病原体または指示生物の細胞を
回収し、細胞を溶解して減成されていないＤＮＡを回収
し、ポリメラーゼ連鎖反応増幅によって病原体または指
示生物の細胞中に存在する標的遺伝子の標的遺伝子配列
を増幅し、増幅された標的遺伝子配列の存在を検出して
検査試料中に病原体または指示生物が存在するか否かを
決定することを特徴とする、水試料中の水系病原体と指
示生物を検出する方法とそのためのキット。 【０００２】水試料中の水系微生物病原体およびヒト糞
便汚染の指示微生物の検出方法とそのためのキット 【０００３】本発明は、ヒト感染を防いだりその原因を
追跡したりする目的のために、試験管内での酵素的増幅
と特定の遺伝子配列の検出によって、試料中の微生物、
とりわけ水の試料と海の試料を含む環境試料中の水系微
生物病原体と指示微生物、特に主として糞便に由来する
細菌を検出する方法に関する。 【０００４】ほとんどの水系ヒト病原体は、糞便によっ
て汚染された水または食物の摂取によって感染とヒトの
病気を引き起こす。飲用や入浴やレクリエーションや貝
捕獲や食物の洗浄/ 調理に使われる水のヒト糞便による
汚染によって運ばれる原生動物とウイルスと細菌を含
む、様々なヒトの寄生虫と病原体がこのようにして運ば
れる。更に、汚染されたエアゾル剤によって運ばれて気
道を通って人体に入ることによって運ばれる水系病原体
も有る。在郷軍人病として知られているしばしば致命的
な呼吸器性肺炎感染であるｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ
の原因微生物であるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａはこのようにして運ばれる。エアコン冷却
塔、不十分に塩素化されている水泳プールや温泉、温水
ヒーター、呼吸器治療器具およびシャワーヘッドの中に
見いだされる温かい滞留した家庭水がＬｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ感染発生の原因であると確認されている。水精製の
必要性およびレクリエーションや飲用や貝捕獲のための
天然水（地下水と地表水）の安全性の十分さが、糞便細
菌とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａを検出するための標準微生物
学的検査によって日常的に調べられている。ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌｏｓｉｓの抑制は、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの蓄積場所が確認され得るように環境調査を必要と
する。その後に、この細菌性病原体を少なくするかまた
は取り除くために除染処置を実行してｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌｏｓｉｓの発生の危険性を低下させることができる。
更に、追加の発生を防ぐために、ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏ
ｓｉｓが発生した場合にはＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ
ａの源がすみやかに決定されなければならない。 【０００５】多くの糞便病原体は検査するのが難しいか
または水試料の採取と濃縮が不便な程低濃度で感染性な
ので、糞便微生物による水汚染は、しばしば、「糞便腸
内細菌」、特に大腸菌等の指示生物と呼ばれているより
堅くてより強いが必ずしも病原性ではない微生物を検査
することによって評価される。 【０００６】糞便細菌指示生物とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ
の両方についての最も普通の検査は、標準条件下での一
日から数日続けてかまたは普通培地中での培養の後に、
生育するコロニーを数えるかまたは正の液状培養物を確
認し、試料中の細菌数を決定するために最も可能性のあ
る数表を使用することを必要とする。追加の時間と費用
と特殊技能労働を必要とするけれども、これらの検査で
計数される生物の微生物学的正体を確かめるために様々
な代謝試験と生化学的検査と免疫化学的検査を用いても
よい。 【０００７】微生物汚染の培養試験は退屈で、時間がか
かり、不満足なことにはゆっくりで、ヒトの健康に重大
な影響を及ぼすかもしれない決定を遅らせるものであ
り、この試験は何日間という時間的規模でではなく何時
間という時間的規模でなされるべきである。 【０００８】送水設備の細菌学的安全性の日常的調査に
使われる実行可能な培養法にはいくつかの問題があり、
それらは、方法が退屈なこと、採取時と計数時との間に
細菌を生育できるように維持すること、水中の化学物質
によってストレスを受けるもの等の生育できるが培養不
可能な細菌が増殖しないこと、興味があるすべての生き
ている細胞を培養することができないこと、腸内細菌の
検出と確認のために必要な時間（日数）、大腸菌等の真
の糞便腸内細菌の検出に特異性が無いこと、直接顕微鏡
計数を使って生きている細胞を死細胞から識別すること
ができないこと、および血清学的方法を使った場合の抗
原の交差反応性に起因する生物の誤確認を含む。 【０００９】その様な培養試験は、大抵は、小数の特定
微生物の存在または非存在を十分な確実性をもって保証
するのに望ましいほど特異的でもなければ感度が良くも
ない。特定の病原体または指示生物と結び付けて考えれ
ている特定領域のＤＮＡと特異的にハイブリッド形成す
る遺伝子プローブは特異的検出の手段を提供するが、従
来の遺伝子プローブ法は、一般的に、環境調査の目的の
ために必要とされる感度の約１万分の１の感度である。 【００１０】最近、コリラート試験等のβーＤ−グルク
ロニダーゼ検出に基づく試験が腸内細菌検出の新しいア
プローチとして示唆されている。フルオロゲニックな基
質４ーメチルウンベリフェリルーβーグルクロニドまた
はカラリメトリックな基質ｐ−ニトロフェニルグルクロ
ニドの酵素的変換は大腸菌の存在を示すが、その様な酵
素活性の検出は依然として細菌の培養を必要とする。β
ーＤ−グルクロニダーゼを持たない大腸菌が高率に発生
するために、βーＤ−グルクロニダーゼ活性に基づいて
試験を行うと糞便腸内細菌の約３０％という著しい割合
を検出できないかもしれない事も最近報告されている。 【００１１】Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ検出の従来
法はプレート上生菌数測定と直接顕微鏡計数であり、後
者はいくつかの市販の蛍光抗体試薬を使って行われる。
水試料からのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ生菌細胞の培養が標
準的方法であるけれども、それは退屈であり時間がかか
る。加えて、標準生菌計数方法で使用される酸洗浄処理
と選択培地に感受性のＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ細
胞も有るので、培養法は生細胞の数を過小評価する場合
がある。また、生育できるが培養できないかもしれない
細胞も有る。免疫蛍光顕微鏡検査は生細胞を死細胞から
識別することができないし抗原交差反応性のために擬陽
性反応を示すＬｅｇｉｏｎｅｌｌａではない細胞も有る
ので、多クローン性抗体試薬を使ってのＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａの血清学的検出にも同様に限界が有る。 【００１２】制限酵素消化後のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの
染色体ＤＮＡから単離された放射標識された独特のＤＮ
Ａ遺伝子プローブフラグメントを使ったコロニーハイブ
リッド法によるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ検出が報告されて
いる。水冷却塔中に見いだされるような微生物数が高い
水では、コロニーハイブリッド法による検出感度レベル
は約１０4 ｍｌであろう。別の遺伝子プローブを使って
５×１０4 細胞の感度が達成された。ｒＲＮＡ検出に基
づく市販の遺伝子プローブ検出キットは、１０3 または
１０4 細胞の感度を持っている。 【００１３】従って、上記の問題が取り除かれているか
またはかなり低められている自然環境中の精製されてい
る水源または他の水源中の水系微生物病原体およびヒト
糞便汚染の指示微生物の検出のための方法とそのための
キットが入手可能であることが強く望まれている。本発
明の更なる目的は、非常に低濃度の病原体または指示微
生物を確実に検出するより大きい特異性と感度を持った
方法とキットを提供することである。本発明の更なる目
的は、その様な病原体と指示微生物を培養しないで検出
することを可能にする方法とそのためのキットを提供す
ることである。本発明の別の目的は、培養不可能な腸内
細菌を検出する方法とそのためのキットを提供すること
である。その様な病原体と指示微生物を何日間かではな
く何時間かで検出することを可能にする方法とそのため
のキットを提供することも本発明の目的である。本発明
の更なる目的は、指示生物の間接的検出に頼るというよ
りはむしろ水試料中の病原体を直接的に検出することを
可能にする方法とそのためのキットを提供することであ
る。 【００１４】本発明の追加の目的は、ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌｏｓｉｓの発生源を防ぐかまたは決定するためにＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ源を検出するための効果的で特異的で
感度の良い方法とそのためのキットを提供することであ
る。本発明の更なる追加の目的は、臨床的診断と環境調
査またはＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ源追跡の両方の
ためにＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを特異的に検出す
るための方法とそのためのキットを提供することであ
る。本発明の別の目的は、同じ水試料中のすべてのＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ種とすべてのＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈ
ｉｌａ血清型の両方を同時に検出することができる方法
とそのためのキットを提供することである。 【００１５】本発明の追加の目的は、微生物病原体また
は指示微生物部類に属する実質上すべての種と株を検出
するだろうが他の種または属の生物は検出しないだろう
方法とそのためのキットを提供することである。更なる
目的は、変異体間の識別を可能にすると同時に場合によ
って同じ標的種または属または他の定義された群の変異
体間の識別を避けるために、標的遺伝子内の高度に多型
の配列を用いる方法とそのためのキットを提供すること
である。 【００１６】本発明によると、特定のＤＮＡ標的遺伝子
配列が選ばれ、検査試料中に非常に低濃度、特に高非標
的バックグラウンドに比べて非常に低濃度に標的ＤＮＡ
配列が存在する場合にさえもそれらが検出され得るよう
に試験管内でそれらが増幅される。本発明では、標的ヌ
クレオチド配列が、増幅のために選ばれ、標的ヌクレオ
チド配列の濃度が各増幅またはサイクルにつき二倍ほど
も増すことができるかまたは各一連の１０増幅サイクル
につき１０２４倍ほども増すことができるように増幅さ
れる。 【００１７】本発明は、主として糞便に由来する水系微
生物と病原体と病原体の存在の可能性を示す細菌を検出
する方法を提供するものであり、該方法は、水、しばし
ば大容量の水から該微生物を回収し、微生物を溶解して
病原体または指示生物からほとんど減成していないＤＮ
Ａを放ち、標的遺伝子とその標的遺伝子からの標的ヌク
レオチド配列を選んで、標的ＤＮＡ配列の分離された標
的ストランドとハイブリッド形成するプライマーペアー
およびプライマーを延ばして標的ＤＮＡ配列の十分に二
重ストランド化されたレプリカを作るためのポリメラー
ゼを使って特定の標的ＤＮＡ配列を増幅し、増幅された
標的ＤＮＡ配列を検出して、増幅された標的ＤＮＡ配列
を検出することができたかできなかったかから元の検査
試料が標的ＤＮＡ配列を持った微生物を含有していたか
どうかを結論することから成る。 【００１８】本発明の方法で有用な特別の水系ヒト病原
体とヒト糞便汚染の指示微生物に対する特定の標的遺伝
子は下記のものを含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒおよび
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種に対するｌａｃＺ；Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｈｉｇｅ
ｌｌａ種に対するｌａｍＢ；Ｌｅｑｉｏｎｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに対するｍｉｐ；Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉに対する
ＵｉｄＡ；およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉと
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉに対するＵｉｄＣ。 【００１９】これらの標的遺伝子の各々からの特定のＤ
ＮＡヌクレオチド配列が、選ばれた各遺伝子配列に対す
るプライマーペアーを使った増幅の対象として選ばれ、
これらのプライマーは、選ばれた遺伝子配列の各々から
の選ばれた配列から成り下記に例示されている。 【００２０】標的ＤＮＡ配列の増幅は、以後単にＰＣＲ
と呼ぶポリメラーゼ連鎖反応として知られている方法に
従って、選ばれたプライマーペアーを使って行われる。
ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅は、１９８９年７月２７
日にＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに与えられた
Ｋ． Ｍｕｌｌｉｓの米国特許番号４６８３２０２に記
載されており、その開示は本明細書中に言及されてい
る。該特許中に記載されている通り、ＰＣＲ増幅プロセ
スは、各々が二つのストランドのうちの一つに対して相
補的な二つのオリゴヌクレオチドプライマーで核酸配列
の二つの別々の相補的ストランドを処理して相補的スト
ランドにプライマーをアニーリングした後にプライマー
を延ばして選ばれた標的核酸配列の十分に二重ストラン
ド化されたレプリカを作るためのポリメラーゼを使って
該プライマーの延長生成物を合成することによって約１
００ー１００ｂｐの長さの選ばれたかまたは標的となる
核酸配列を増幅した後に、延長生成物を分離（変成）し
てこの増幅連続を所望のサイクル数だけ繰り返し選ばれ
た核酸配列の濃度を増すことから成る。 【００２１】本発明の方法のＰＣＲ増幅段階では、反応
混合物は、（１）選ばれた標的配列へプライマーをアニ
ーリングさせるためかまたはストランド再結合のため
の、一般的に約３７゜Ｃから７０゜Ｃの低温と（２）プ
ライマーのポリメラーゼによる延長のための、一般的に
約７０゜Ｃから８０゜Ｃの中間温度と（３）ストランド
の変成または分離のための、一般的に約８０゜Ｃから１
００゜Ｃのより高い温度の間を繰り返して循環させられ
る。三つの温度範囲が述べられているけれども、これら
の温度範囲のうちの二つの間で増幅プロセスを十分に実
施することができることがしばしばである。二つまたは
三つの温度の各熱サイクルが増幅された標的ＤＮＡ配列
の濃度を２倍ほどにも増すことができるので、あらゆる
一連の１０増幅サイクルが濃度を１０２５倍ほども増す
ことができる。細菌Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ
（Ｔａｑ）から 生成されるものの等の温度安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼが使用される場合には、最初に加えられ
たポリメラーゼ酵素を増す必要なく二つまたは三つの温
度の間でポリメラーゼ反応を多回数、典型的には２０ー
４０回反復させることができる。 【００２２】成功した標的ＤＮＡ配列増幅を直接逆遺伝
子プローブハイブリッド形成によって検出するためのハ
イブリッド形成プローブとして標的遺伝子配列の各々か
らの特定のＤＮＡ配列を選んでもよい。例えば、ゲル電
気泳動や陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーや対
イオン逆相高速液体クロマトグラフィー等の主として大
きさに基づいてＤＮＡ分子を分離する方法等の、どんな
適当なＤＮＡ分子検出法によって成功した標的ＤＮＡ配
列増幅を成し遂げてもよい。 【００２３】本発明の方法とキットの様々な側面を下記
により詳細に説明する。本方法の最初の側面は、増幅段
階が起こる少量の検査試料よりも多次数大きい試料から
成っている場合があり非標的バックグラウンド細胞を標
的細胞よりも多次数高い濃度で含有しているかもしれな
い水試料、即ち数リットルの容量である可能性がある水
から得られる標的水系病原体または指示生物の実質上す
べての細胞を、約０.１から約１. ０ｍｌの次数の小検
査試料容量の水中に回収することから成る。次に、酵
素、低分子量阻害物質、または標的ＤＮＡ配列の酵素的
増幅を妨げるかもしれない他の成分等の妨害する可能性
がある物質を十分にも含まないように標的細胞から事実
上すべての減成されていない標的ＤＮＡ配列が回収され
るように、溶菌等によって事実上すべての標的細胞を処
理する。標的とされる系統サブセット内の事実上すべて
の生物の標的配列上の二つのプライマーの位置間の標的
ＤＮＡ配列のセグメントが効率的に特異的に増幅され標
的とされる群外からのものは何も増幅されないように標
的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うために、標的遺伝子からの
標的ＤＮＡ配列と一対のプライマー配列とＰＣＲ反応条
件が選ばれる。標的とされるＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅の
後に、十分に感度がよくて特異的な検出法によって増幅
された標的とされるＤＮＡを検出する。同位体を使った
検出方法を用いてもよいけれども、安全と便利さのため
に好適な同位体を使わない検出方法が用いられるのが好
ましい。標的とされる遺伝子配列の各々からの特定のＤ
ＮＡ配列のプローブを利用した好適なハイブリッド形成
プローブを使って検出が行われるのが好ましい。所望さ
れる場合には、増幅された標的ＤＮＡ配列の定量も実施
してもよい。 【００２４】水試料から実質上すべての標的細胞を回収
する操作は、標的生物をそれらの分離を容易にする物理
的状態で捕らえるかまたは凝集させる役目をする懸濁さ
せられているかまたは溶かされている添加物によって恐
らく助けられる例えば濾過と遠心分離を含むいくつかの
好適な方法のうちのどれによって行われてもよい。微生
物がもっとずっと大きい粒子に吸着されていないかまた
は凝集させられていない場合には、効率的な捕獲を確実
なものにするために濾紙穴の大きさは約０. ２から０.
５μｍ、好ましくは約０. ４５μｍよりも大きくないべ
きである。微生物がゲル中に回収されるかまたは粒子に
吸着されている場合には、濾過を促進するためにもっと
ずっと大きい濾紙穴の大きさが好ましい。本発明の好ま
しい細胞回収は、約１ｍｌ以下の小容量試料からの遠心
分離によって得られるかまたは小容量または典型的には
１００ｍｌの大容量の試料の場合には濾過によって得ら
れる。本発明の濾過による特に好ましい細胞回収は、１
１ー１３ｍｍの直径で０.２０ー０. ５０μｍの穴の大
きさのポリカーボネート製またはテフロン製の濾紙を通
過させることによって行われる。 【００２５】標的細胞から事実上すべての減成されてい
ない標的ＤＮＡ配列が回収されるように検査試料中の回
収された細胞を処理する操作は、多くの好適な方法のう
ちのどれによって行われてもよい。微生物溶解による標
的ＤＮＡ配列の回収は、両極端のｐＨ、有機溶媒、尿素
や塩酸グアニジン等のカオトロピック剤、硫酸ドデシル
ナトリウム（ＳＤＳ）やトリトンＸ−１００等の洗浄
剤、浸透ショック、リゾチーム消化、またはプロテアー
ゼ消化等に短時間さらすことによって達成されてもよ
い。例えば、有機溶媒抽出、酸沈澱、限外濾過、固体相
抽出、高速液体クロマトグラフィー、ＬｉＣｌ沈澱、プ
ロテアーゼ消化、ＲＮアーゼ消化またはポリエチレング
リコール沈澱などによって、妨害物質を取り除くことが
できる。固体相抽出または高速液体クロマトグラフィー
は、イオン交換、逆相、疎水的相互作用またはシリカゲ
ル吸着相互作用に基づかせることができる。本発明の標
的細胞からのＤＮＡの好ましい放出は、ＳＤＳーリゾチ
ーム処理とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに対しては特に凍結
（ー７０゜Ｃ）解凍（２５゜Ｃ）サイクルの交互実施を
使用することによって行われる。 【００２６】本発明の方法のＰＣＲ増幅段階を行うため
に、広範囲の遺伝子とさらにもっと広範囲の遺伝子サブ
配列を選ぶことができる。病原性またはヒト糞便（糞便
汚染の結果としてを除く害されていない自然環境ではな
い）中への出現についての知識に基づいて標的とされる
属、種、株および血清型がひとたび特定化されると、標
的生物中に存在し事実上すべての他の生物中に存在しな
い遺伝子と標的サブ配列を選ぶ。一遺伝子内のサブ配列
は多型性が大きく異なることがしばしばであり、これ
は、環境中の微生物調査を有利にするために使うことが
できる事実である。約１００ー１０００ｂｐで分離され
た非多型性サブ配列中に位置させることによってより大
きい標的セット内のすべての生物を効率的に増幅するよ
うな本発明の方法のＰＣＲ増幅段階のためのプライマー
を選んでもよく、標的ＤＮＡ配列の相補的ストランド上
の約１０ー３０のヌクレオチド配列に対して相補的であ
り増幅された領域内の配列と効率的にハイブリッド形成
して標的生物種、属または群に対する特異性を確実にす
るようにオリゴヌクレオチドプローブは構成されてい
る。 【００２７】本発明を実施するための特定の標的遺伝子
の例としては、例えば下記のものをあげることができ
る：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ種とＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種とＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ種を含むヒト糞便汚染の有用な指示微生物である全
腸内細菌を検出するためのｌａｃＺ；ヒト糞便汚染の有
用な指示微生物である腸内細菌種大腸菌と、ヒトの病気
を引き起こしヒト糞便汚染と関連して見いだされるＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ属とＳｈｉｇｅｌｌａ属の腸内病原性
細菌を検出するためのｌａｍＢ；すべてのＬｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａ種を検出するための５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝
子；腸内細菌種大腸菌および腸内病原体Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ ｓｏｎｎｅｉとＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅ
ｒｉを検出するためのＵｉｄＡ；および糞便腸内細菌指
示細菌種大腸菌と腸内病原体Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎ
ｎｅｉを検出するためのＵｉｄＣ。 【００２８】これらの遺伝子のヌクレオチド配列は前も
ってわかっており、この事がそれらの選択とＰＣＲでの
ＤＮＡ増幅のための標的としての使用を容易にするが、
本発明前には、これらの特定の遺伝子が限られた標的群
を検出するための基礎を提供する能力は知られていなか
ったしそれらがそうするための基礎を提供するであろう
ことも明かではなかった。我々の発明は下記の新しい新
奇な発見を含む：（１）ｌａｃＺ遺伝子は大腸菌（遺伝
子配列が過去に決定されていた細菌種）のみでなく腸内
細菌群（この配列を有することが知られていなかった）
を構成する他のグラム陰性ラクトース利用細菌のＰＣＲ
増幅と遺伝子プローブ検出を可能にする十分に保護され
た領域を含み、この保護された領域は非腸内グラム陰性
細菌中にもグラム陽性ラクトース利用細菌中にも見いだ
されないので、ｌａｃＺは「全」腸内細菌を検出するた
めの好適な標的である；（２）ｌａｍＢは大腸菌（遺伝
子配列が過去に決定されていた細菌種）のみだけでなく
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａやＳｈｉｇｅｌｌａ種（この配列
を持つことがわかっていなかった）のＰＣＲ増幅と遺伝
子プローブ検出を可能にする十分に保護された領域を含
み、この保護された領域は他のグラム陰性細菌やグラム
陽性細菌中には見いだされないので、ｌａｍＢは糞便指
示腸内細菌種大腸菌と糞便汚染環境中で最も関心のある
腸内病原体の検出に好適な標的である；（３）ＤＮＡを
暗号づける５ＳｒＲＮＡ配列はすべてのＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ種のＰＣＲ増幅と遺伝子プローブ検出を可能にす
る十分に保護された領域を含みこの保護された領域は他
の細菌種中には見いだされないので、５ＳｒＲＮＡを暗
号づけるＤＮＡの領域はすべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ
種の検出に好適な標的である；（４）Ｌ． ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａのｍｉｐ遺伝子はＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈ
ｉｌａのすべての血清型のＰＣＲ増幅と遺伝子プローブ
検出を可能にする十分に保護された領域を含みこの保護
された領域は他のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種または他の細
菌中には見いだされないので、ｍｉｐはＬ． ｐｅｎｕ
ｍｏｐｈｉｌａの検出に好適な標的である；そして
（５）ＵｉｄＡ遺伝子配列とＵｉｄＣ配列（ＵｉｄＡ遺
伝子の調節領域）のいずれも大腸菌といくつかのＳｈｉ
ｇｅｌｌａ種のＰＣＲ増幅と遺伝子プローブ検出を可能
にする領域を含み、この領域は他のグラム陰性細菌また
はグラム陽性細菌中には見いだされないので、ＵｉｄＡ
とＵｉｄＣは糞便指示腸内細菌種大腸菌といくつかのＳ
ｈｉｇｅｌｌａ種の検出に好適な標的である。 【００２９】本発明の方法で使用するのに特に好ましい
遺伝子サブ配列は下記のプライマー対によって限定され
る：ｌａｃＺに対する５’ーＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣ
ＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡまたは５’ーＣＡＣＣＡＴＧ
ＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴと５’ーＡＴＧＡ
ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣ；ｌａｍＢ
に対する５’ーＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡ
ＧＧＣＴＣＣと５’ーＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴ
ＴＡＴＣＡＣＧＣＡの対および５’ーＧＧＡＴＡＴＴＴ
ＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧと５’−ＡＣＴＴＧ
ＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣの対；ｍｉｐ
に対する５’ーＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧ
ＴＴＧと５’ーＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴ
ＴＣＡ；５ＳｒＲＮＡに対する５’ーＡＧＡＡＣＣＧＣ
ＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣと５’−ＴＡＧＧＡＣＣ
ＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡの対および５’ーＡＣＴＡ
ＴＡＧＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡと５’ーＧＣＧＡＴ
ＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴの対；ＵｉｄＡに対す
る５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧと
５’ーＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧの
対および５’−ＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴ
ＴＴと５’ーＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧ
Ｇの対および５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡ
ＧＣＡＧと５’ーＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧ
ＣＧＧの対；およびＵｉｄＣに対する５’ーＴＧＴＴＡ
ＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣと５’−ＡＡＡＡ
ＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴ これらのサブ配列のみからでなく、それらに含まれる配
列、それらとかなり、即ち１０ｂｐだけ重なりあう配
列、標的遺伝子内の配列、および標的遺伝子を包む配列
から効果的なプライマーを構成してもよい。 【００３０】実質上減成されていない標的ＤＮＡを約１
ｍｌの小容量の水または水性緩衝液中に回収して標的Ｄ
ＮＡ配列の相補的ストランド上の約１０ー３０のヌクレ
オチド配列に対して相補的な標的ＤＮＡ配列に適切なオ
リゴヌクレオチドプライマー対を選択した後に、プライ
マーが分離された（変成さされた）標的ＤＮＡストラン
ドとハイブリッド形成しポリメラーゼがプライマーを延
ばして標的配列の十分に二重ストランド化されたレプリ
カを作るような条件下で、標的ＤＮＡをｄＮＴＰ’ｓと
Ｍｇ+2とＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートす
る。温度やインキュベーション時間や溶媒や酵素選択や
試薬濃度や装置などのＰＣＲ増幅条件は、標的ＤＮＡ配
列の効率的で特異的な増幅がなされるように選ばれる。
様々な標的生物と様々な種類の検査試料や標的ＤＮＡ配
列と選ばれたプライマー対の間で各工程段階とパラメー
ターに対する効果的で随意の条件が著しく異なるだろう
事は、容易に理解されるだろう。十分によく調節された
温度とインキュベーション時間の熱サイクルを行うため
の溶媒選択、酵素の選択と濃度、プライマー濃度、ｄＮ
ＴＰ濃度および装置選択は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅の分野
の当業者によって一般的に理解される。臭化エチジウム
等の蛍光染料でＤＮＡを染色した後にアガロースまたは
ポリアクリルアミドゲル電気泳動等によって増幅された
ＤＮＡの量と質を調べて試行錯誤によって、本発明の特
定の標的配列のための正確な温度とインキュベーション
時間の選択を決定してもよい。選ばれたプライマーによ
って限定されると予想される大きさの標的ＤＮＡの電気
泳動バンドの収率を最大にし他のＤＮＡの増幅を最小限
にするかまたは好ましくは完全に防ぐ反応条件を選ぶ。 【００３１】本発明のＰＣＲでのＤＮＡ増幅を実施する
ために特に好ましい条件の例としては下記のものがあげ
られる：ｌａｃＺに対する９４゜Ｃで２分間の初期変
成、５０゜Ｃの再アニーリング温度で３０分間、７２゜
Ｃの延長温度で６０秒間、９４゜Ｃの変成温度で６０秒
間、１. ５ｍＭのマグネシウム濃度および活性ｔａｑポ
リメラーゼ；ｌａｍＢに対する９４゜Ｃで２分間の初期
変成、６０゜Ｃの再アニーリング温度で３０秒間、７２
゜Ｃの延長温度で３０秒間、９４゜Ｃの変成温度で６０
秒間、１. ５ｍＭのマグネシウム濃度および活性ｔａｑ
ポリメラーゼ；ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａＤＮＡ暗号づけ５
ＳｒＲＮＡに対する９４゜Ｃで３分間の初期変成、５０
゜Ｃの再アニーリング温度で６０秒間、７２゜Ｃの延長
温度で６０秒間、９４゜Ｃの変成温度で６０秒間、１.
５ｍＭのマグネシウム濃度および活性ｔａｑポリメラー
ゼまたはａｍｐｌｉｔａｑ；ｍｉｐに対する９４゜Ｃで
３分間の初期変成、５０゜Ｃの再アニーリング温度で６
０秒間、７２゜Ｃの延長温度で６０秒間、９４゜Ｃの融
解温度で６０秒間、１. ５ｍＭのマグネシウム濃度およ
び活性ｔａｑポリメラーゼまたはａｍｐｌｉｔａｑ；お
よびＵｉｄＡとＵｉｄＣに対する９４゜Ｃで３分間の初
期変成、５０゜Ｃで１分間の再アニーリングと延長、９
４゜Ｃで６０秒間の変成、１. ５ｍＭのマグネシウム濃
度および活性ｔａｑポリメラーゼ。 【００３２】増幅された標的ＤＮＡはどんな好適な様々
な方法を使って検出することもできる。高速液体クロマ
トグラフィーによる増幅されたＰＣＲ標的ＤＮＡ生成物
と副生成物と未反応試薬の分離は、予想されるサイズ範
囲の増幅されたＤＮＡが存在するか否かに関する迅速な
定量的報告を提供することができる。高速液体クロマト
グラフィーカラムは、例えば、イオン交換分離または対
イオン逆相分離または粒度排他分離に基づくものであっ
てもよい。蛍光性ＤＮＡ結合性染料でのカラム後誘導後
の蛍光モニタリングと電気化学的検出もまた可能であり
一般的には分光光度法よりももっと感度がよい可能性が
あるけれども、カラム流出物は一般的には２５０ー２８
０ｎｍのスペクトル域での紫外線吸収によって最も簡単
に検出され定量される。増幅されたＰＣＲ標的ＤＮＡ生
成物と副生成物と未反応試薬をゲル電気泳動によって分
離した後に蛍光性染料または吸収性染料でＤＮＡを染色
することもまた、予想されるサイズ範囲の増幅されたＤ
ＮＡが存在するか否かについて報告する。しかしなが
ら、これらの分析シグナルは定量するのがより困難であ
る。 【００３３】標的遺伝子内の二つの選ばれたオリゴヌク
レオチドプライマー間に位置するＤＮＡサブ配列に対し
て配列相補的である単一ストランドオリゴヌクレオチド
プローブとのハイブリッド形成によるのが、ＰＣＲで増
幅されたＤＮＡ標的配列を検出する好ましいやり方であ
る。ＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列が変成させられ
ておりナイロンやニトロセルロース膜等の固体支持体上
に捕らえられている場合には、プローブを放射標識する
かまたは酵素分子に直接的または間接的に結合させても
よい。次に、ハイブリッド形成条件下で、膜に捕らえら
れたＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列生成物をプロー
ブと共にインキュベーションした後に、余分のプローブ
を洗い流してオートラジオグラフィー、放射線計数また
は放射性プローブを使って、またはプローブに結合させ
られた酵素をクロモゲニックなあるいはフルオロゲニッ
クな基質にさらすことによって検出を行うことができ
る。オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブが固
体支持体に結合させられている場合には、変成させられ
たＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列生成物をハイブリ
ッド形成条件下で固体支持体と共にインキュベートする
と該ＰＣＲ生成物が固定化される。アビジンや抗体等の
特定の結合分子が有るビオチンまたは何らかの他の化学
基をＰＣＲ生成物が含んでいる場合には、ストレプトア
ビジンに結合させられている西洋わさびペルオキシダー
ゼまたはアルカリホスファターゼ等の、特定の結合分子
に結合させられている酵素を使って固定化されている生
成物を検出することができる。 【００３４】本発明のＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配
列生成物を検出する好ましい方法は、放射性同位体で標
識された遺伝子プローブとビオチン化された遺伝子プロ
ーブでのハイブリッド形成を使用することによるもので
ある。本発明のＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列生成
物の特に好ましい検出は、ビオチン化ｄＵＴＰまたはビ
オチン化プライマーからのビオチンの取り込みと膜に固
定されているポリーＴ−テイル遺伝子プローブの使用に
よってＰＣＲ増幅時に増幅されたＤＮＡが標識されるこ
とを特徴とする逆ブロッティングハイブリッド形成を使
って行われる。 【００３５】本発明の標的ＤＮＡ遺伝子配列の検出に好
ましい遺伝子プローブ配列は下記のものを含む：ｌａｃ
Ｚに対する５’ーＴＧＡＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣ
ＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡ
ＴＴＴＣＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な配
列； ｌａｍＢに対する５’ーＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣ
ＴＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡ
ＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴＧまたはこの配列に対して
相補的な配列； ｍｉｐに対する５’ーＴＴＴＧＧＧＧ
ＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧ
ＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡまたはこの配列
に対して相補的な配列； Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ５Ｓ
ｒＲＮＡに対する５’ーＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡ
ＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡ
ＧＴまたはこの配列に対して相補的な配列および５’ー
ＢＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴ
ＣＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣ
（配列中Ｂはビオチン）またはこの配列に対して相補的
な配列；ＵｉｄＡに対する５’ーＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣ
ＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡ
ＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧまたはこの配列に対し
て相補的な配列および５’ーＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣ
ＡＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧ
ＣＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴまたはこの配列に対して相
補的な配列；そしてＵｉｄＣに対する５’ーＣＡＡＣＣ
ＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧＣＣ
ＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な
配列。 【００３６】本発明の更なる側面は、本発明のＰＣＲ増
幅と検出の方法を実施する際に使用するのに好適なキッ
トから成る。水系病原体または指示生物の増幅と検出を
容易にするように考案されたそのようなキットは、一般
的に、該病原体または指示生物の標的遺伝子内の標的と
されるＤＮＡ配列の相補的ストランド上の約１０ー３０
のヌクレオチド配列に対して相補的な二つのオリゴヌク
レオチドプライマーから成るプライマー対と、該標的Ｄ
ＮＡ配列を検出するためのプローブ配列と、場合によっ
ては該標的ＤＮＡ配列の制御ＤＮＡ鋳型とから成るだろ
う。検査キットは、標的ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅と検出
のための発表された指示と試薬を含むかもしれない。前
記のプライマー対とプローブ配列に加えて、検査キット
は、例えば溶菌剤やＰＣＲ増幅ポリメラーゼ等の標的Ｄ
ＮＡ配列のＰＣＲ増幅のための他の試薬と水試料採取の
ための濾過装置も含んでいるかもしれない。 【００３７】本発明の好ましい検査キットは、前記の好
ましいプライマー対とこれもまた上記に述べた相当する
好ましいプローブ配列、および場合によっては標的ＤＮ
Ａ配列の制御ＤＮＡ鋳型から成る。例えば、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ種とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種とＣｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ種とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種を検出す
るための検査キットは、ｌａｃＺ遺伝子中の配列を増幅
するためと該ｌａｃＺ遺伝子中の増幅された配列を検出
するためのプライマー対５’ーＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧ
ＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡまたは５’ーＣＡＣＣＡＴ
ＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴと５’ーＡＴＧ
ＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣおよび遺
伝子プローブ５’ーＴＧＡＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧ
ＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧ
ＡＴＴＴＣＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な配
列から成っていてもよい。大腸菌とＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ種とＳｈｉｇｅｌｌａ種の検出のための検査キット
は、ｌａｍＢ遺伝子中の配列の増幅のためと該ｌａｍＢ
遺伝子中の増幅された配列を検出するためのプライマー
対５’ーＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣ
ＴＣＣと５’ーＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＴ
ＣＡＣＧＣＡまたは５’ーＧＧＡＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴ
ＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧと５’−ＡＣＴＴＧＧＴＧＣＣ
ＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣおよび遺伝子プローブ
５’ーＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴ
ＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧ
ＴＴＧまたはこの配列に対して相補的な配列から成って
いてもよい。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種を検出するための
検査キットは、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの５Ｓリボゾーム
ＲＮＡ遺伝子中の配列を増幅するためと該Ｌｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａの５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子中の増幅された
配列を検出するためのプライマー対５’ーＡＧＡＡＣＣ
ＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣと５’ーＴＡＧＧＡ
ＣＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡおよび遺伝子プローブ
５’ーＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴまたはこの配列
に対して相補的な配列から成っていてもよい。Ｌｅｇｉ
ｏｎｅｌｌａ種の検出のための検査キットは、あるい
は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝
子中の配列を増幅するためと該Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの
５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子中の増幅された配列を検出
するためのプライマー対５’ーＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴ
ＴＴＧＧＡＡＣＣＡと５’ーＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣ
ＴＴＴＣＧＣＡＴおよびビオチン化された遺伝子プロー
ブ５’ーＢＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣ
ＡＴＴＴＣＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧ
ＣＴＴＣまたはこの配列に対して相補的な配列から成っ
ていてもよい。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐ
ｈｉｌａの検出のための検査キットは、ｍｉｐ遺伝子中
の配列の増幅のためと該ｍｉｐ遺伝子中の増幅された配
列を検出するためのプライマー対５’ーＧＣＴＡＣＡＧ
ＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＧと５’ーＧＴＴＴＴＧＴ
ＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡおよび遺伝子プローブ
５’ーＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴ
ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧ
ＣＡＡまたはこの配列に対して相補的な配列から成って
いてもよい。大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
とＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉの検出のため
の検査キットは、ＵｉｄＡ遺伝子中の配列を増幅するた
めと該ＵｉｄＡ遺伝子中の増幅された配列を検出するた
めのプライマー対５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡ
ＡＡＧＣＡＧと５’−ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴ
ＣＴＴＧＣＧおよび遺伝子プローブ５’ーＴＧＣＣＧＧ
ＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣ
ＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧまたはこの配
列に対して相補的な配列、またはプライマー対５’ーＴ
ＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴと５’ーＴＧ
ＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧおよび遺伝子プ
ローブ５’ーＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＧ
ＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴ
ＴＣＴＧＣＴまたはこの配列に対して相補的な配列、ま
たはプライマー対５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡ
ＡＡＧＣＡＧと５’ーＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣ
ＴＧＣＧＧおよび遺伝子プローブ５’ーＴＧＣＣＧＧＧ
ＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡ
ＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧと５’ーＡＡＡ
ＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣ
ＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴのうち
のいずれかから成っていてもよい。大腸菌とＳｈｉｇｅ
ｌｌａ ｓｏｎｎｅｉの検出のための検査キットは、Ｕ
ｉｄＣ遺伝子中の配列を増幅するためと該ＵｉｄＣ遺伝
子中の増幅された配列を検出するためのプライマー対
５’ーＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣ
と５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴ
Ｔおよび遺伝子プローブ５’ーＣＡＡＣＣＣＧＴＧＡＡ
ＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧ
ＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な配列から成っ
ていてもよい。これらの例示された検査キットの各々は
水試料採取用濾過装置や、活性ｔａｑポリメラーゼやａ
ｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ等のＰＣＲ増幅用ポリメラ
ーゼや、標的遺伝子配列の制御ＤＮＡ鋳型等の他の構成
要素または試薬もまた含んでいてもよい事は理解される
だろう。 【００３８】水系腸内細菌とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌
の回収とＰＣＲ増幅と検出のための下記の代表的な検査
とその結果によって本発明を説明する。 【００３９】糞便腸内細菌と腸内病原体 腸内細菌ＤＮＡの回収 細菌細胞からＤＮＡを回収するために二つの方法を用い
た。一つの方法では、一晩培養した１.５ｍｌの試料中
の細菌細胞から硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）処理
を使ってのアルカリ溶菌によって標的ＤＮＡを放出させ
る方法によって、培養物からゲノムＤＮＡを抽出した。
タンパク質と炭水化物を除去するためにプロテイナーゼ
Ｋ（セントルイスのシグマ）とＣＴＡＢ：ＮＡＣｌを使
い、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
抽出とフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４：２４：２）抽出を使ってＤＮＡを更に精製し
た後にイソプロパノールで沈澱させた。１２０００×ｇ
で１５分間遠心分離した後に、ペレット化したＤＮＡを
冷７０％アルコールで一回洗浄してから真空下で乾燥さ
せた。この方法を使って、各試料から約１００ー１５０
μｇの精製されたゲノムＤＮＡが回収された。 【００４０】細菌細胞から標的ＤＮＡを回収するもっと
簡単な直接溶菌法では、細菌細胞が加えられていた１０
０ｍｌの水試料から細胞を回収した。１００００×ｇで
１５分間の遠心分離によって細胞を採取した。細胞を
０.６ｍｌエッペンドルフ試験管に移し、１２０００×
ｇで５分間遠心分離した後に、１×ＰＣＲバッファーと
１ｍｌ当たり０. ０５ｍｇのプロテイナーゼＫと２０ｍ
Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）と１. ８μＭＳＤＳを
含有する２０μｌの溶菌液中に細胞ペレットを再懸濁さ
せ、試料を１５秒間ボルテックスして３７゜Ｃで１ー
１. ５時間インキュベートした後に、プロテイナーゼＫ
を不活化するためにそれらを８５ー９０゜Ｃで５分間加
熱した。その後に、更に１０μｌのＰＣＲバッファーと
ｄＮＴＰｓとＴａｑポリメラーゼとプライマーを加え
て、記載されている通りにＰＣＲ増幅を行った。 【００４１】ＰＣＲ増幅と標的とされるＤＮＡ腸内細菌
配列 ＤＮＡサーマルサイクラーと活性Ｔａｑポリメラーゼ
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒ
ｐ．）を使ってＰＣＲ増幅を行った。使用されたＰＣＲ
液は１×ＰＣＲ増幅緩衝液（１０×緩衝液は５０ｍＭ
ＫＣｌと１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ８.１３）
と１５ｍＭ ＭｇＣｌ2と０.１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを
含有する）とｄＮＴＰｓの各々が２００μＭとプライマ
ーの各々が０. ２ー１μＭと１ａｑ（１０-18 ｇ）−１
μｇの鋳型ＤＮＡと２. ５単位のＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼと０. １％ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）
含有二重蒸留水を含んでいた。鋳型標的ＤＮＡｓは最初
に９４゜Ｃで１ー３分間変成させた。その後、下記の条
件を使って総計２５ー４０のＰＣＲサイクルを行った：
９４゜Ｃで０. ５ー１分間の変成、４０゜Ｃまたは５０
゜Ｃまたは６０゜Ｃまたは７０゜Ｃで０. ５ー１分間の
プライマーアニーリング、７２゜Ｃで１ー２分間のＤＮ
Ａ延長。システックＤＮＡシンセサイザーを使ってオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成し、小試料については
オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（カリフォルニア
州のフォスター市のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を大試料についてはＣ−８ ３ミクロン逆相カラ
ム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）での逆相高速液体クロ
マトグラフィーを使って精製した。 【００４２】ＥＭＢＯ Ｊ． ２：５９３−５９７（１
９８３年）にＫａｌｎｉｎｓ等によって報告された配列
に基づいて、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子の８７６ｂｐ領域
を、２４ｍｅｒプライマーであるＺＬ−１６７５（５’
ーＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣ
Ｃ）とＺＲ−２５４８（５’ーＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴ
ＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴ）を使って増幅した。プラ
イマーＺＬ−１６７５を大腸菌のｌａｃＺ遺伝子の暗号
づけ配列内の１６７５ｂｐと１６９８ｂｐの間に位置さ
せ、ＺＲ−２５４８を２５２５ｂｐと２５４８ｂｐの間
に位置させた。ｌａｃＺのもっと短い３２６ｂｐ領域を
増幅するために、プライマーＺＬ−１６７５と共に第二
の２４ｍｅｒプライマーＺＲ−２０２５（５’ーＧＧＴ
ＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡ）を使用
した。プライマー配列ＺＲ−２５４８よりも大腸菌のｌ
ａｃＺ遺伝子のアミノ末端により近い領域である２００
１ｂｐと２０２５ｂｐの間にプライマーＺＲ−２０２５
を位置させた。 【００４３】Ｎａｔｕｒｅ ２８５：７８−８１（１９
８０年）にＢｅｄｏｕｅｌｌｅ等によって報告された配
列に基づいて、ｌａｍＢのｌａｍｂｄａ結合部位ペプチ
ドを暗号づける配列より下流の５５４ｂｐ配列を、二つ
の２４ｍｅｒプライマーを使って増幅した。プライマー
ＢＬ−４８９９（５’ーＧＧＡＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＣ
ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧ）を４８９９ｂｐと４９２２ｂｐ
の間に位置させ、プライマーＢＲ−５４５２（５’−Ａ
ＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣ）を
５４２９ｂｐと５４５２ｂｐの間に位置させた。大腸菌
のｌａｍＢ遺伝子の暗号づけ領域の３０９ｂｐセグメン
トを増幅するために、第二の組の２４ｍｅｒプライマー
もまた使用した。これらのプライマーは、４９１０ｂｐ
と４９３３ｂｐの間に位置させられたＢＬ−４９１０
（５’ーＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣ
ＴＣＣ）と５１９５ｂｐと５２１９ｂｐの間に位置させ
られたＢＲ−５２１９（５’ーＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡ
ＴＡＧＴＴＡＴＣＡＣＧＣＡ）と呼ばれた。 【００４４】いくつかの実施例では、ｌａｃＺについて
はプライマーＺＬ−１６７５とＺＲ−２５４８の混合物
をそしてｌａｍＢについてはＢＬ−４８９９とＢＲ−５
４５２の混合物を使って、ｌａｃＺの領域とｌａｍＢの
領域を同時に増幅した。これらの実施例では、５０ｎｇ
−１μｇの標的ゲノムＤＮＡと様々な相対的濃度のプラ
イマー（０. １２５ー１. ０μＭの各プライマー）が使
用された。 【００４５】ｌａｍＢとｌａｍＺの配列の位置番号は、
ＮＩＨ−ＢＩＯＮＥＴデータバンクで割り当てられてい
るものに基づく。 【００４６】ＰＮＡＳ，８３：８４４７−８４５１（１
９８６年）にＪｅｆｆｅｒｓｏｎ等によって報告された
配列に基づいて大腸菌のＵｉｄＡ遺伝子の１４７ｂｐ領
域が７５４ｂｐと７７３ｂｐの間および８８０ｂｐと９
００ｂｐの間にそれぞれ位置させられるプライマー７５
４Ｌ−１（５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧ
ＣＡＧ）と８７９Ｒ−１（５’−ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴ
ＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧ）を使って増幅され増幅された
ＵｉｄＡ遺伝子の検出のために８００ｂｐと８４９ｂｐ
の間に位置させられる遺伝子プローブＵｉｄＡ−１
（５’−ＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴ
ＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧ
ＴＧＧＧ）が使われた場合と、ＵｉｄＡ遺伝子の１６６
ｂｐ領域が１９３９ｂｐと１９５８ｂｐの間および２０
８５ｂｐと２１０４ｂｐの間にそれぞれ位置させられる
プライマー１９３９Ｌ−１（５’−ＴＡＴＧＧＡＡＴＴ
ＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴ）と２０８５Ｒ−１（５’ーＴ
ＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧ）を使って増
幅され増幅されたＵｉｄＡ遺伝子の検出のために１９９
８ｂｐと２０４７ｂｐの間に位置させられる遺伝子プロ
ーブＵｉｄＡ−２（５’−ＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡ
ＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣ
ＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴ）が使われた場合と、Ｕｉｄ
Ａ遺伝子の１３５０ｂｐ領域が前記のプライマー７４５
Ｌ−１と２０６５Ｒ−１を使って増幅され増幅されたＵ
ｉｄＡ遺伝子の検出のために前記の遺伝子プローブＵｉ
ｄＡ−１またはＵｉｄＡ−２が使われる場合と、Ｕｉｄ
Ａ遺伝子の制御領域でありＭＧＧ，１９９：１０１−１
０５（１９８５年）にＢａｌｎｃｏ等によって報告され
た配列に基づくＵｉｄＣ遺伝子の１５３ｂｐ領域が３０
１ｂｐと３２２ｂｐの間および４３２ｂｐと４５３ｂｐ
の間にそれぞれ位置させられるプライマー３０１Ｌ−１
（５’ーＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣ
Ｃ）と４３２Ｒ−１（５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧ
ＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴ）を使って増幅され増幅されたＵ
ｉｄＣ遺伝子の検出のために３２３ｂｐと３６２ｂｐの
間に位置させられる遺伝子プローブＵｉｄＣ−１（５’
−ＣＡＡＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧ
ＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴ）が使われる場合に
も、本発明に従って同様に糞便腸内細菌と腸内病原体が
うまく増幅され検出される。 【００４７】増幅された標的とされる腸内細菌ＤＮＡ配
列の検出 ゲル電気泳動と放射標識遺伝子プローブを使って、ＰＣ
Ｒで増幅された標的とされる腸内細菌ＤＮＡ配列を検出
した。０. ８ー１％水平アガロースゲルまたは５％垂直
ポリアクリルアミドゲルを使って、増幅された標的参照
ＤＮＡを分離した。アガロースゲル電気泳動はＴＡＥ緩
衝液（０. ０４Ｍトリスアセテートと０. ００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ, ｐＨ８. ０）中で行った。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動はＴＢＥ緩衝液（０. ８９Ｍトリスボレー
トと０. ０８９Ｍほう酸と０. ００２Ｍ ＥＤＴ, ｐＨ
８. ０）中で５. ７ー９. ０Ｖ／ｃｍで２ー４時間行っ
た。ゲルを、２×１０-4％臭化エチジウム液中で染色し
て、Ｐｈｏｔｏ／ＰｒｅｐＩ紫外線トランスイルミネー
ター（ウィスコンシン州のニューベルリンのＦｏｔｏｄ
ｙｎｅ Ｉｎｃ．）で可視化して、写真撮影した。 【００４８】サザン法の場合には、増幅された標的ＤＮ
Ａ配列を、０. ４Ｍ ＮａＯＨ液を使ってナイロン膜
（カリフォルニア州のコスタメサのＩＣＮ Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌｓまたはカリフォルニア州のリッチモンドの
ＢｉｏＲａｄ）上に移し、８０゜Ｃで１時間の焼成また
は紫外線照射によって膜上に固定した。ドットブロット
法の場合には、二重ストランド化された増幅された標的
ＤＮＡ配列を、０. １容量の３Ｍ ＮａＯＨと０. １Ｍ
Ｎａ2 ＥＤＴＡを含む変成液を加えることによって変
成させ、６０゜Ｃで１５分ー１時間インキュベートし、
１容量の冷２Ｍ酢酸アンモニウムで中和した後に、Ｂｉ
ｏＲａｄのドットブロットマニフォールドを使って４ー
５ｐｓｉの真空圧で試料をＺｅｔａプローブナイロン膜
（カリフォルニア州のリッチモンドのＢｉｏＲａｄ）上
にスポットした。 【００４９】５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１０ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ７. ０）と０.１８ｍ ＮａＣｌと
１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ）と０.５％ＳＤＳと５％デンハ
ーツ液と１ｍｌ当たり１００μｇのフェノール抽出され
た変成させられたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）または１ｍ
ｌ当たり５０μｇのＸ型パン酵母ｔＲＮＡ（シグマ）を
含有するハイブリッド形成液を使って、ＩＣＮナイロン
膜上に固定されている増幅されたＤＮＡをハイブリッド
形成させた。ハイブリッド形成処理は５５ー６０゜Ｃで
３ー１６時間行った。ブロットを、おだやかに撹拌しな
がら、室温の２×ＳＳＰＥ，０. ５％ＳＤＳ中で二回各
１０分間と５５゜Ｃの ０. １×ＳＳＰＥ，０. １％Ｓ
ＤＳ中で一回３ー５分間洗浄した。32Ｐ標識されたＤＮ
Ａを検出するために、ブロットをサランラップ（ペンシ
ルベニア州のピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ）で覆って、Ｘ線フィルム（ニューヨーク
州のロチェス ターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃ
ｏ．のコダックＸ−ＡＲフィルム）をそれらの上に置い
た。フィルムイクスポージャーはー７０゜Ｃで１ー４８
時間であった。 【００５０】増幅されたｌａｃＺの検出のために５０ｍ
ｅｒ遺伝子プローブＬＺ−１（５’ーＴＧＡＣＧＴＣＴ
ＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡ
ＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴ）を使い、増幅さ
れたｌａｍＢの検出のために５０ｍｅｒ遺伝子プローブ
ＬＢ−１（５’ーＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴ
ＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧ
ＧＣＴＧＧＴＴＧ）を使った。いずれの遺伝子プローブ
も、増幅された標的ＤＮＡ配列のそれぞれの領域内に位
置する標的配列とバイブリッド形成する。３０μｌ反応
液が５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、５ｍＭＤＴＴ（ミズーリ州のセントルイス
のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１ｍＭ ＫＣｌ、
１ー１０μＧオリゴヌクレオチド遺伝子プローブ、１２
０ｐモル［32Ｐ］ＡＴＰ（比活性＞３０００Ｃｉ／ｍモ
ル）（マサチューセッツ州のボストンのＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ．）、１ｍＭスペ
ルミジン（二ナトリウム塩）および２０単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）を含有していたことを特徴とする方法によって、遺
伝子プローブの５’ー端を［32Ｐ］ＡＴＰ（＞３０００
Ｃｉ／ｍモル）で放射標識した。反応混合物を３７゜Ｃ
で１時間インキュベートし、セファデックスＧ−５０カ
ラムとＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.
６）, １ｍＭＮａ2 ＥＤＴＡ）を使って放射標識された
プローブを精製した。 【００５１】腸内細菌検出の特異性 ｌａｃＺ、ｌａｍＢ、ＵｉｄＡおよびＵｉｄＣ領域のＰ
ＣＲ増幅による腸内細菌検出の特異性を説明するため
に、下記の細菌株を使って検査を実施した：大腸菌ＡＴ
ＣＣ１１７７５、大腸菌ＡＴＣＣ１０７９８、大腸菌Ａ
ＴＣＣ１５２２４、大腸菌ＡＴＣＣ２５４０４、大腸菌
（ｌａｍＢ- ）ＡＴＣＣ２３５５６、大腸菌（ｌａｍＢ
- ）ＡＴＣＣ２３７３７、大腸菌（ｌａｍＢ- ）ＡＴＣ
Ｃ２３７３９、大腸菌（ｌａｍＢ- ）ＡＴＣＣ１２４３
５、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＡＴ
ＣＣ １３０４７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １９５８５、Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｆｕｅｎｄｉｉＡＴＣＣ ３３１２８、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ＡＴＣＣ１３
８８３、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉ ＡＴ
ＣＣ １２０２２、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
ＡＴＣＣ ２５９３１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ ｍｔ−２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓＡＴＣＣ １９４３５、およびＥｎｔｅｒｏ
ｔｕｂｅｓ（ロッシェ）を使って大腸菌だと同定されｍ
−Ｅｎｄｏ計数プレートから得られた３２の環境から分
離されたもの。大腸菌株を含むすべての腸内細菌を３５
゜Ｃで２×ＹＴ液状ブイヨン（１リットル当たり１０ｇ
のＢａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅと１０ｇの酵母抽出物
と５ｇのＮａＣｌ）とＴＹＥ寒天培地（２×ＹＴ＋ １
４ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天）中で培養し、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａを Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
単離寒天培地上で３０゜Ｃで培養し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓをリトマスミルク寒天培地（Ｄ
ｉｆｃｏ）上で３７゜Ｃで培養した。これらの細菌の培
養物からＤＮＡを１２ー１６時間抽出して、回収された
ＤＮＡの５０ｎｇ−１μｇをＰＣＲ方法実施時に様々な
アニーリング温度を使って先に述べられているＰＣＲ増
幅にかけた。増幅されたＤＮＡ配列を前記のサザン法と
ドットブロット法によって検出するために遺伝子プロー
ブを使った。放射標識されたプローブの比活性は６８０
００ー１６７０００ＤＰＭ／μｇＤＮＡであった。 【００５２】腸内細菌検出の感度 大腸菌のＰＣＲ増幅ー遺伝子プローブ検出の感度を説明
するために、大腸菌からのゲノムＤＮＡ（ミズーリ州の
セントルイスのシグマ）１μｇを連続希釈して１ａｇ−
１μｇの濃度範囲を確立した。大腸菌ＤＮＡが０ｇの対
照も含めた。試料を、その後に、ｌａｍＢの場合のプラ
イマーＢＬ４９１０とＢＲ５２１９またはｌａｃＺの場
合のプライマーＺＬ１６７５とＺＲ２５４８を使ったＰ
ＣＲ増幅にかけ、増幅されたＤＮＡを遺伝子プローブＬ
Ｂ−１とＬＺ−１を使ったドットブロット法によって分
析した。ハイブリッド形成反応のバックグラウンドシグ
ナルを決定するために負の対照として、１ミクログラム
のＰ． ｐｕｔｉｄａゲノムＤＮＡと１μｇのサケ精子
ＤＮＡもまた同じプライマーとＰＣＲ条件を使ったＰＣ
Ｒにかけた。ドットブロット分析のために、増幅された
試料の各々の１０分の１（１０μｌ）を使用した。 【００５３】更に、腸内細菌検出のためのｌａｍＢのＰ
ＣＲ増幅の感度を決定するために、２×ＹＴブイヨン中
で３７゜Ｃで一晩（１６時間）培養された大腸菌ＡＴＣ
Ｃ１１７７５の培養物を０. １Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７.
２）で連続希釈した液を使用した。脱塩素化のために
０. １％チオ硫酸ナトリウムで処理されたオートクレー
ブで殺菌された水道水を１００ｍｌ使って希釈を行っ
た。連続希釈液からの大腸菌細胞に加えて、非標的バッ
クグラウンド個体群として扱うためと試料からの細菌細
胞の採取を容易にするために、各希釈ブランクに約１×
１０9 個のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ細胞
を加えた。Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＳ−５遠心分離器中で１
２０００×ｇで１０分間遠心分離することによって細菌
細胞を採取し、ペレットを、小容量の無菌脱塩素化水道
水中に再懸濁させ、１. ５ｍｌ容のマイクロフュージ試
験管に移し、１２０００×ｇで５分間の遠心分離によっ
て再沈澱させた。細胞をＰＣＲ緩衝液中に懸濁させて、
ｌａｍＢについて上記に述べた通りにＰＣＲ増幅と遺伝
子プローブ検出を行った。各希釈液中の生大腸菌細胞の
数を測定するために、連続希釈液の一定容部分づつをｍ
−Ｅｎｄｏ寒天培地上にプレートした。３７゜Ｃでの２
４時間のインキュベーションの後に、典型的な腸内細菌
の外見を呈するコロニーを数えることによって、標的大
腸菌細胞のコロニー形成単位を測定した。アクリジンオ
レンジ直接計数方法を使って、直接的計数を行った。 【００５４】検査結果 ｌａｃＺのＰＣＲ増幅による腸内細菌検出の特異性 プライマーＺＬ−１６７５とＺＬ−２５４８および４０
゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使ったＰＣＲ増幅
は、腸内細菌と非腸内細菌の両方の標的ＤＮＡ配列につ
いてＤＮＡ配列の正の増幅を引き起こした。Ｃｉｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒのＤＮＡを鋳型として用いた場合には増幅
されたＤＮＡは大腸菌ＤＮＡが鋳型として用いられた場
合よりも大きかったが、この事は、これらの生物間での
標的ｌａｃＺ間の違いを示す。大腸菌と検査された他の
細菌種の間でプライマーアニーリング温度を上げること
に対する反応が異なることによってもまた、この違いは
示される。ＰＣＲの厳格さを増すためにプライマーアニ
ーリング温度を５０゜Ｃに上げると、例えばＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ等のすべての非腸内細菌の増幅が除
かれたが、例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏ
ｇｅｎｅｓやＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ等のいくつかの腸
内細菌の増幅もまた除かれた。５０゜Ｃのプライマーア
ニーリング使用すると、大腸菌とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｃｌｏａｃａｅおよび程度はより小さいがＫｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでｌａｃＺ増幅
が起こった。サザン法は、４０゜Ｃの厳格でないプライ
マーアニーリング温度が用いられた場合にでさえ、大腸
菌とＥｎｔ． ｃｌｏａｃａｅとＫ． ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅでのみの標的ｌａｃＺの増幅を示すＬＺ−１遺伝
子プローブでのハイブリッド形成を示した。６０゜Ｃと
７０゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使っても、大
腸菌とＥｎｔ． ｃｌｏａｃａｅのｌａｃＺの増幅とハ
イブリッド形成が起こった。３２の環境から分離された
ものを含む検査された大腸菌の全株が、正のＤＮＡ増幅
と、８７５ｂｐについて予言された位置でのｌａｃＺ用
遺伝子プローブでのハイブリッド形成を示した。Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａのＤＮＡもまた増幅されて検出された。 【００５５】プライマーＺＬ−１６７５とＺＬ−２５４
８での増幅は生菌数測定法による全腸内細菌計数に等し
い「全腸内細菌」検出の基盤とはならなかったので、プ
ライマーＺＬ−１６７５とＺＲ−２０２５および５０゜
Ｃのプライマーアニーリング温度を使って、アミノ末端
により近くて活性部位であるｌａｃＺのもっと短い領域
を増幅した。これらのプライマーを使って増幅された領
域は、「全腸内細菌」のＰＣＲと遺伝子プローブ検出の
基盤を提供するに十分なだけ保護されていた。しかしな
がら、増幅されたＤＮＡの大きさに関しては検査された
様々な腸内細菌種間で幾分の変動が有ったのであり、こ
の事は、遺伝子配列の異種性を示す。ｌａｃＺ増幅の使
用はＳｈｉｇｅｌｌａの検出を許したがＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａの検出は許さなかったので、この方法では直接検
出されない腸内病原体も有るであろう。Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａと同様に、非腸内細菌は増幅も検出もされなかっ
た。 ｌａｍＢのＰＣＲ増幅による腸内細菌検出の特異性 ｌａｃＺのＰＣＲ増幅と同様に、ｌａｍＢのＰＣＲ増幅
は、プライマーアニーリング温度が５０゜Ｃ以下であっ
た場合に、非腸内細菌ＤＮＡの増幅を含む余分の非特異
的ＤＮＡ増幅を引き起こした。しかしながら、プライマ
ーＢＬ−４８９９とＢＲ−５４５２および６０゜Ｃのプ
ライマーアニーリング温度を使用すると正のＤＮＡ増幅
を示す細菌の範囲が限られ、検査されたすべてのｌａｍ
Ｂ- 株を含む大腸菌とＳ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍと
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．のみが６０゜Ｃのプライマ
ーアニーリング温度が使われた時にｌａｍＢの増幅を示
し遺伝子プローブＬＢ−１でのハイブリッド形成によっ
て検出された。プライマーアニーリング温度を更に７０
゜Ｃまで上げると、Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増
幅が除かれたが、大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．
の増幅を依然として許した。 【００５６】第二組目のプライマーＢＬ−４９１０とＢ
Ｒ−５２１９および５０゜Ｃのプライマーアニーリング
温度を使った場合には、検査されたすべてのｌａｍＢ-
種を含む大腸菌とＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとＳｈｉ
ｇｅｌｌａ ｓｐｐ．のみが、遺伝子プローブＬＢ−１
でハイブリッド形成した標的３０９ｂｐ領域の増幅を示
した。６０゜Ｃのプライマーアニーリング温度が使用さ
れた場合にＳ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤＮＡはこ
れらのプライマーで増幅しなかったのに対して、環境か
らの３２分離物を含む大腸菌と Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓ
ｐｐ．は依然として標的ＤＮＡの増幅を示した。このよ
うに、ＰＣＲ増幅時にｌａｍＢ用のこれらのプライマー
と６０゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使用するこ
とは大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａの検出を許し、５０゜Ｃ
というもっと低いプライマーアニーリング温度を使用す
ることはこれらの腸内細菌に加えてＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａの検出を許した。非特異的増幅を最小限にするために
はプライマーアニーリング温度はＴｍに近いべきである
事を、これらの結果は示す。大腸菌に加えてＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅｌｌａがｌａｍＢ遺伝子の少な
くとも一部を有するかもしれない事もまたこれらの結果
は示唆する。従って、ここに証明されたように、ｌａｍ
ＢのＰＣＲ増幅は、糞便汚染の指示細菌種である大腸菌
並びに水系疾患発生を引き起こす主な腸内細菌病原体で
あるＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅｌｌａを調査す
る方法を提供する。従って、水のヒト糞便汚染と結び付
けて考えられる細菌である指示微生物と病原体の両方
が、ＰＣＲ増幅とｌａｍＢ用遺伝子プローブで検出可能
である。 【００５７】ＵｉｄＡとＵｉｄＣのＰＣＲ増幅による腸
内細菌検出の特異性 ５０゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使って、Ｕｉ
ｄＡ用プライマーとＵｉｄＣ用プライマーを使っての増
幅が達成された。 【００５８】プライマー対ＵｉｄＡ．７４５Ｌ−１とＵ
ｉｄＡ．８７９Ｒ−１を使っての増幅が、１４７ｂｐ生
成物を形成した。この生成物は、放射標識された遺伝子
プローブＵｉｄＡ−１を使って検出された。ｌａｍＢと
ｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸菌（検
査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉとＳ
ｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉのみがドットブロ
ット法分析とサザン法分析によって検出された正のシグ
ナルを生じた。プライマー対ＵｉｄＡ．１９３９Ｌ−１
とＵｉｄＡ．２０８５Ｒ−１を使っての増幅が、１６６
ｂｐ生成物を形成した。この生成物は、放射標識された
遺伝子プローブＵｉｄＡ−２を使って検出された。ｌａ
ｍＢとｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸
菌（検査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅ
ｉとＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉのみがドッ
トブロット法分析とサザン法分析によって検出された正
のシグナルを生じた。 【００５９】プライマー対ＵｉｄＡ．７４５Ｌ−１とＵ
ｉｄＡ．２０８５Ｒ−１を使っての増幅が、１３５０ｂ
ｐ生成物を形成した。この生成物は、放射標識された遺
伝子プローブＵｉｄＡ−２を使って検出された。ｌａｍ
ＢとｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸菌
（検査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
のみがドットブロット法分析とサザン法分析によって検
出された正のシグナルを生じた。 【００６０】プライマー対ＵｉｄＣ．３０１Ｌ−１とＵ
ｉｄＣ．４３２Ｒ−１を使っての増幅が、１５３ｂｐ生
成物を形成した。この生成物は、放射標識された遺伝子
プローブＵｉｄＣ−１を使って検出された。ｌａｍＢと
ｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸菌（検
査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉのみ
がドットブロット法分析とサザン法分析によって検出さ
れた正のシグナルを生じた。 【００６１】ｌａｃＺとｌａｍＢのＰＣＲ増幅による腸
内細菌検出の感度 調査の目的のために有用な標的腸内細菌に対する適切な
選択性に加えて、ＰＣＲー遺伝子プローブ法は、供給さ
れる飲用水の安全性を確実にするための十分な感度を提
供しなければならない。生菌培養法と同じぐらい申し分
ない１００ｍｌ当たり１個細胞の標的感度が望ましい。
検出感度はＰＣＲ条件によって左右されることがわかっ
た。すでに論じられたように標的細胞に対するＤＮＡ増
幅の選択性を高めるプライマーアニーリング温度上昇
は、検出感度を低めた。従って、７０゜Ｃのプライマー
アニーリング温度を使うことは、１００ｆｇより多いゲ
ノム大腸菌ＤＮＡ、即ち約１ａｇの標的ＤＮＡが存在し
た場合にはｌａｃＺの増幅と検出を許したが、もっと少
量のＤＮＡの場合にはｌａｃＺの増幅と検出を許さなか
った。これとは対照的に、４０゜Ｃのプライマーアニー
リング温度が使われた場合にはｌａｃＺのＰＣＲ増幅に
よって１ー１０ｆｇという少量の大腸菌ＤＮＡを検出す
ることができたのであり、ｌａｍＢ増幅を使って同じ検
出限界が確認された。１０ｆｇのゲノムＤＮＡの検出は
信頼できた。１ｆｇのゲノムＤＮＡでは、試料の約２２
％が、その濃度のゲノムＤＮＡでの標的遺伝子の予想さ
れるポアソン分布に厳密に相当する正のシグナルを生じ
た。１ｆｇ以下の大腸菌ＤＮＡ濃度は、正の増幅と遺伝
子プローブでのハイブリッド形成による正の検出を示さ
なかった。32Ｐ標識遺伝子プローブとカップリングさせ
られたｌａｃＺとｌａｍＢの増幅によって達成される検
出感度は、１ー１０ａｇの標的遺伝子、即ち単一ゲノム
コピー、単個細胞検出に相当する。 【００６２】遠心分離によって回収された細胞を使った
直接溶菌法もまた、ＰＣＲ増幅と遺伝子プ ローブ分析
による大腸菌の感度のよい検出を示した。１００ｍｌの
水当たり１ー５個というわずかの生細胞が検出された。
同様に、試料中のわずか１個の生細胞がｌａｍＢの増幅
を使って検出された。 【００６３】ＰＣＲと遺伝子プローブの使用は、水のヒ
ト糞便汚染の指示微生物としての腸内細菌を調査する方
法の基盤として必要な特異性と感度の両方を提供するこ
とが証明された。プライマーＺＬ−１６７５とＺＲ−２
０２５および５０゜Ｃのアニーリング温度を使ったｌａ
ｃＺのＰＣＲ増幅はほとんどの腸内細菌の検出を許し、
プライマーＢＬ−４９１０とＢＲ−５２１９および６０
゜Ｃのアニーリング温度を使ったｌａｍＢのＰＣＲ増幅
は低濃度の腸内指示生物、即ち大腸菌、および重要な腸
病原性病原体、即ちＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅ
ｌｌａ、の特異的な検出を可能にする。ｌａｃＺのＰＣ
Ｒ増幅もまた、水の細菌学的安全性を評価する迅速で信
頼のおける方法を可能にし、従来の生菌培養法にとって
代わる効果的な方法を提供する。標的とされるＤＮＡの
ＰＣＲ増幅もまた、指示生物の間接的検出に頼るという
よりもむしろ環境試料中の病原体を直接検出するための
十分な感度と特異性を可能にする。 【００６４】Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種 Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの増殖とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａＤ
ＮＡの回収 本研究で使用された細菌株を下記の表１に示す。更に、
新鮮な環境からの七つのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａ分離物が含まれた。これらの環境株
は、冷却塔から分離されたもので、システインを含まな
い培地上での増殖欠如等の表現型特徴およびＬ． ｐｎ
ｅｕｍｏｐｈｉｌａに特異的な単クローン性抗体試薬
（シアトルのＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）との正
の反応性等の血清学的反応に基づいて同定された。 【００６５】 表 １ 細菌株 属 種 亜種 株 血清群 源 1. Legionella pneumophila (Knovxille-1) 1 CDC 2. L. pneumophila (Togus-1) 2 CDC 3. L. pneumophila (Bloomington-2) 3 CDC 4. L. pneumophila (Los Angeles-1) 4 CDC 5. L. pneumophila fraseri (Los Angeles-1) 4 ATCC 33156 6. L. pneumophila (Dallas-1E) 5 CDC 7. L. pneumophila fraseri (Dallas-1E) 5 ATCC 33823 8. L. pneumophila (Chicago-2) 6 CDC 9. L. pneumophila (Chicago-8) 7 ATCC 33823 10. L. pneumophila pneumophila (Concord-3) 8 ATCC 35096 11. L. pneumophila pneumophila (IN-23-G1-CS) 9 ATCC 35289 12. L. pneumophila pneumophila (Leiden) 10 ATCC 43283 13. L. pneumophila pneumophila (797-PA-H) 11 ATCC 43130 14. L. pneumophila pneumophila (570-PA-H) 12 ATCC 43290 15. L. pneumophila pneumophila (82A3105) 13 ATCC 43736 16. L. pneumophila pneumophila (1169-MN-H) 14 ATCC 43703 17. L. pneumophila fraseri Lansing 3 ATCC 35251 18. L. pneumophila pascullei (V8W) 5 ATCC 33737 19. L. bozmanii CDC 20. L. erythra SF33P U of L 21. L. feelei CDC 22. L. longbeachae 1 CDC 23. L. longbeachae Tucker 1 2 ATCC 33484 24. L. jordanis CDC 25. L. dumoffii CDC 26. L. micdadei CDC 27. L. gormanii CDC 28. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 29. P. fluorescens CDC 93 CDC 30. P. fluorescens EB CDC 31. P. maltophilia CDC 32. P. alcaligenes ABB 50 CDC 33. Flavobacterium CDC 65 CDC 34. Salmonella typhimurium ATCC 19585 35. Shigella flexineri ATCC 12022 36. Escherichia coli ATCC 12435 【００６６】１リットル当たり１０ｇの酵母抽出物（デ
トロイトのＤｉｆｃｏ）と１０ｇのＡＣＥＳ（Ｎ−［２
−アセトアミド］ー２ーアミノエタンースルホン酸）と
から成り、ＫＯＨでｐＨ７. ０に調整され、加熱滅菌後
にＬ−システインと可溶性ピロリン酸鉄（セントルイス
のシグマ）の各々０. ２５ｇを補充された液体培地中で
すべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株とＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ株とＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を培養した。
２×ＹＴ液体ブイヨン（１リットル当たり１０ｇのＢａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅと１０ｇの酵母抽出物と５ｇ
のＮａＣｌ）とＴＹＥ寒天培地（２×ＹＴ＋１４ｇ／ｌ
バクト寒天）中で３５゜Ｃで腸内細菌を培養した。１２
０ｒｐｍで絶えず撹拌しながら３７゜Ｃで一晩培養した
後に、染色体ＤＮＡを単離した。ＳＤＳ処理でのアルカ
リ溶菌によって、１. ５ｍｌの一晩培養試料中の細菌細
胞からＤＮＡを放出させた。タンパク質と炭水化物を除
去するためにプロテイナーゼＫとＣＴＡＢ：ＮａＣｌを
使用し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：
１）抽出とその後にフェノール：クロロホルム：イソア
ミルアルコール（２４：２４：２）抽出を使ってＤＮＡ
を更に精製した。その後に、ＤＮＡを、イソプロパノー
ルを使って沈澱させ、１２０００×ｇで１５分間の遠心
分離によってペレット化させた。ＤＮＡペレットを、冷
７０％アルコールで一回洗浄し、真空下で乾燥させた。
同様に、すべての環境分離物からの全ゲノムＤＮＡを、
上述のＤＮＡ抽出処理の後に単離した。この方法を使っ
て、各細菌培養物から１００ー１５０μｇの精製ゲノム
ＤＮＡが回収された。 【００６７】標的とされるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ配列の
ＰＣＲ増幅 ＤＮＡサーマルサイクラーとＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｃｏｒｐ．）を使ってＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ液は
１×ＰＣＲ増幅緩衝液（１０×緩衝液は５０ｍＭ ＫＣ
ｌと１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８. １３）と１５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 と０. １％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含有す
る）、各々２００μＭのｄＮＴＰ、各々０.５μＭのプ
ライマー、１ｆｇ−１μｇの鋳型ＤＮＡ、２.５単位の
Ａｍｐｌｉｔａｑ、および０. １％ジエチルピロカルボ
ネート（ＤＥＰＣ）を含有していた。いくつかの検査で
は、ＰＣＲ反応での全マグネシウムイオンの濃度を０.
８ｍＭ−４ｍＭ全Ｍｇ++の範囲にわたって変化させた
が、ＰＣＲ混合物中の他の成分はメーカーの標準である
１０×ＰＣＲ反応緩衝液の濃度に維持した。鋳型ＤＮＡ
を最初に９４゜Ｃで１ー３分間変成させた。その後、合
計２５ー３０のＰＣＲサイクルを行った。ＰＣＲサイク
ルでは、９４゜Ｃで１分間ＤＮＡを変成させ、５０゜Ｃ
で１分間プライマーをアニーリングして延長させた。い
くつかの検査では、６０゜Ｃと７０゜Ｃのプライマーア
ニーリング温度もまた使用した。オリゴヌクレオチドプ
ライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの
モデルＤＮＡシンセサイザーを使って合成し、小試料に
ついてはオリゴヌクレオチド精製カートリッジ（カリフ
ォルニア州のフォスター市のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を使ってまた大試料についてはＣ−８
３ミクロン逆相カラム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で
の逆相高速液体クロマトグラフィーを使って精製した。 【００６８】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，１３３５（１９８７年）にＭａｃＤｏｎｅｌｌ
とＣｏｌｗｅｌｌによって報告された配列に基づいて、
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの５Ｓ ｒＲＮＡ暗号づけ遺伝子
の１０４ｂｐ領域を、２０ｍｅｒプライマーＬ５ＳＬ９
（５’−ＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡ−
３’）とＬ５ＳＲ９３（５’−ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡ
ＣＴＴＴＣＧＣＡＴ−３’）を使って増幅した。プライ
マーＬ５ＳＬ９を５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の９ｂｐと２８
ｂｐの間に位置させ、プライマーＬ５ＳＲ９３を９３ｂ
ｐと１１２ｂｐの間に位置させた。Ｉｓｒａｅｌ Ｊ．
Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．２２：７０３−７０５（１９８６
年）にＥｎｇｌｅｂｅｒｇ等によって報告された配列に
基づいて、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａのマクロファ
ージ感染性増強（ｍｉｐ）遺伝子の暗号づけ領域の６５
０ｂｐ配列を、二つの２１ｍｅｒプライマーを使って増
幅した。プライマーＬｍｉｐＬ９２０（５’ーＧＣＴＡ
ＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＧ−３’）をｍｉｐ
遺伝子の９２０ｂｐと９４０ｂｐの間に位置させ、プラ
イマーＬｍｉｐＲ１５４８（５’ーＧＴＴＴＴＧＴＡＴ
ＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡ−３’）を１５４８ｂｐと１
５６９ｂｐの間に位置させた。 増幅された標的とされるＤＮＡ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
配列の検出 【００６９】ゲル電気泳動と放射標識遺伝子プローブを
使って、ＰＣＲ増幅されたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＤＮ
Ａ配列を検出した。０. ８ー１％水平アガロースゲルま
たは５％垂直ポリアクリルアミドゲルを使って、増幅さ
れた標的とされるＤＮＡ配列を分離した。アガロースゲ
ル電気泳動はＴＡＥ緩衝液（０. ０４Ｍトリスアセテー
トと０. ００１Ｍ ＥＤＴＡ, ｐＨ ８. ０）中で行っ
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＴＢＥ緩衝液
（０. ０８９Ｍトリスボレートと０.０８９Ｍほう酸と
０.００２Ｍ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.０）中で５.７ー９. ０
Ｖ／ｃｍで２ー４時間行った。ゲルを、２×１０-4％臭
化エチジウム液中で染色してからＰｈｏｔｏ／Ｐｒｅｐ
Ｉ紫外線トランスイルミネーター（ウィスコンシン州の
ニューベルリンのＦｏｔｏｄｙｎｅ Ｉｎｃ．）を使っ
て可視化した。 【００７０】サザン法の場合には、ＤＮＡを、０. ４Ｍ
ＮａＯＨ変成液を使ってナイロン膜（カリフォルニア
州のコスタメサのＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓまた
はカリフォルニア州のリッチモンドのＢｉｏＲａｄ）上
に移し、８０゜Ｃで１時間の焼成または紫外線照射によ
って膜上に固定した。ドットブロット法の場合には、二
重ストランド化された増幅されたＤＮＡを０. １容量の
３Ｍ ＮａＯＨと０.１Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウムを含
有する変成液を加えることによって変成させ、６０゜Ｃ
で１５分間インキュベートし、１容量の冷２Ｍ酢酸アン
モニウムで中和した後に、試料をＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｅｌｌスロットブロットマニフォ
ールドを使って４ー５ｐｓｉの真空圧でＺｅｔａプロー
ブナイロン膜（カリフォルニア州のリッチモンドのＢｉ
ｏＲａｄ）上にスポットした。 【００７１】５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１０ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ７. ０）と０.１８Ｍ ＮａＣｌと
１ｍＭ ＥＤＴＡ）、０. ５％ＳＤＳ、５％デンハーツ
液および１００μｇ／ｍｌのフェノールで抽出された変
成させられたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）または５０μｇ
ｍｌのＸ型パン酵母ｔＲＮＡ（シグマ）を含有する溶液
で、ＩＣＮナイロン膜上に固定された増幅されたＤＮＡ
をハイブリッド形成させた。Ｚｅｔａプローブ膜上に固
定されたＤＮＡについては、ハイブリッド形成のために
０. ５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７. ２）と１ｍＭ Ｎ
ａ2 ＥＤＴＡと７％ＳＤＳ液を使用した。いずれの種の
膜の場合にも、ハイブリッド形成は５５ー６０゜Ｃで１
５ー２０分間であった。ハイブリッド形成緩衝液を除去
した後に、膜を、２００ー３００ｎｇの変成させられた
放射標識遺伝子プローブを含有する新鮮なハイブリッド
形成液を使ってハイブリッド形成させ、おだやかに撹拌
しながら ５５ー６０゜Ｃで３ー１６時間インキュベー
トした。おだやかに撹拌しながら、室温の２×ＳＳＰＥ
と０. ５％ＳＤＳ中で１０分間ずつ二回と５５ー６０゜
Ｃの０. １×ＳＳＰＥと０. １％ＳＤＳ中で３ー５分間
一回、ブロットを洗浄した。32Ｐ標識ＤＮＡを検出する
ために、ブロットをサランラップ（ペンシルベニア州の
ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）で覆い、Ｘ線フィルム（ニューヨーク州のロチェス
ターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．のＫｏｄａ
ｋ Ｘ−ＡＲフィルム）をそれらの上に置いた。すべて
のフィルムのイクスポージャーをー７０゜Ｃで１ー４８
時間行った。 【００７２】使用される３０μｌ反応液が５０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７. ５）と１０ｍＭＭｇＣｌ2 と５Ｍｍ
ＤＴＴ（ミズーリ州のセントルイスのＳｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）と１ｍＭ ＫＣｌと１０μｇオリゴヌ
クレオチド遺伝子プローブと１２０ｐモル ［32Ｐ］Ａ
ＴＰ（比活性＞３０００Ｃｉ／ｍモル）と１ｍＭスペル
ミジン（二ナトリウム塩）と２０単位のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を
含有したことを特徴とする方法で、遺伝子プローブの
５’ー端を［32Ｐ］ＡＴＰ （＞３０００Ｃｉ／ｍモ
ル）（マサチューセッツ州のボストンのＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ．）で放射標識し
た。反応混合物を３７゜Ｃで１時間インキュベートし、
セファデックスＧ−５０カラムとＴＥ緩衝液［１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ７. ６）と１ｍＭＥＤＴＡ（二ナト
リウム塩）］を使ってかまたはセントリコン１０カラム
（マサチューセッツ州のＤａｎｖｅｒｓのＡｍｉｃｏｎ
Ｃｏｒｐ．）を使って放射標識されたプローブを精製
した。 【００７３】増幅された５Ｓ ＲＮＡ暗号づけ遺伝子の
検出のために、５０ｍｅｒ遺伝子プローブＬ５Ｓ−１
（５’−ＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣ
ＴＴＣ）を使った。 【００７４】増幅されたｍｉｐ遺伝子の検出のために、
５０ｍｅｒ遺伝子プローブＬｍｉｐ−１（５’−ＴＴＴ
ＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡ）を使
った。 【００７５】ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａとＬ． ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａの検出の特異性 ＰＣＲ増幅ー遺伝子プローブ法による全Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ検出の特異性を説明するために、表１に記載する
株の各々からの５０ｎｇのＤＮＡを単独、および増幅と
検出の特異性を更に詳しく調べるためと非標的ＤＮＡが
このＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ検出法を妨害するかどうかを
決定するために既知のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種からの５
０ｎｇのＤＮＡと組み合わせて検査した。 【００７６】同様に、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの
特異的検出のために、これらの細菌株の各々からの５０
ｎｇのＤＮＡを、プライマーＬｍｉｐＬ９２０とＬｍｉ
ｐＲ１５４８を使ったＰＣＲ増幅にかけた。更に、増幅
と検出の特異性を更に詳しく調べるためと非標的ＤＮＡ
がこのＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ検出法を妨害する
かどうかを決定するために、表１に記載するＬｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａの非Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種のすべて
からのＤＮＡの混合物５０ｎｇを単独および既知株の
Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａからのＤＮＡの混合物５
０ｎｇと組み合わせて検査した。 【００７７】ＤＮＡ増幅を観察するためにアガロースゲ
ル電気泳動を使った。標的遺伝子配列の増幅を確認する
ために、放射標識遺伝子プローブとサザン法分析を使っ
た。 【００７８】Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ検出の感度 Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａのＰＣＲ増幅ー遺伝子プ
ローブ検出の感度を説明するために、Ｌ． ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａからのゲノムＤＮＡ１μｇを連続希釈して
１ａｇ （１０-18 ｇ）−１μｇのゲノムＤＮＡ（約１
０-4ａｇ−１０2 ｐｇの標的ＤＮＡ）の濃度範囲を確立
した。ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＤＮＡを含まない負の対
照も含めた。その後に、試料を、プライマーＬｍｉｐＬ
９２０とＬｍｉｐＲ１５４８を使ったＰＣＲ増幅にかけ
て、遺伝子プローブＬｍｉｐ−１を使ったスロットブロ
ット法によって分析した。ハイブリッド形成反応のバッ
クグラウンドシグナルを決定するために、負の対照とし
て、１ミクログラムの大腸菌ゲノムＤＮＡと１μｇのサ
ケ精子ＤＮＡもまた同じプライマーとＰＣＲ条件を使っ
たＰＣＲ増幅にかけた。増幅された試料の各々の１０分
の１（１０μｌ）をスロットブロット分析のために使っ
た。 【００７９】検査結果 ５Ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅によるＬｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ検出の特異性 プライマーＬ５ＳＬ９とＬ５ＳＲ９３および５０゜Ｃの
プライマーアニーリング温度を使ったＰＣＲ増幅は、環
境からの七つのＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ分離物を含
む検査されたすべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種につい
て、正の増幅ＤＮＡバンドを生じた。Ｐ． ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ ＥＢとＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ
ＤＣ ９３とＰ． ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａについて
は、かすかなバンドもまた観察された。非特異的増幅を
除くためにプライマーアニーリング温度を６０゜Ｃに上
げた時にも、同じパターンが見られた。直接蛍光抗体
（ＤＦＡ）で染色される場合には、これらのＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ株はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに対する抗体と
交差反応をするが、この事は、それらが何らかの形でＬ
ｅｇｉｏｎｅｌｌａと関連している事を示唆する。しか
しながら、Ｌ５Ｓ−１プローブでのサザン法は、Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌｌａの増幅ＤＮＡとのみのハイブリッド形成
を示したのであり、これは、増幅された標的５Ｓ ＲＮ
Ａ配列の特異的検出を証明する。他のどの非Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａ増幅試料の場合にもバンドが観察されなかっ
たしハイブリッド形成が起こらなかったのであり、この
事は、プライマーＬ５ＳＬ９とＬ５ＳＲ９３を遺伝子プ
ローブＬ５Ｓ−１と一緒に用いることはＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ種に特異的な検出システムの基盤を提供する事を
示す。 【００８０】更に、ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＤＮＡも加
えられない限りは非Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種からのＤＮ
Ａの混合物を使ってＤＮＡ増幅は認められなかったので
あり、この事は、５ＳｒＲＮＡ暗号づけセグメントの増
幅はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種に特異的であった事と、非
標的ＤＮＡは標的遺伝子セグメントの検出を妨げない事
を示す。 【００８１】すべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株が、ＰＣ
Ｒ反応でのＭｇＣｌ2 の最終濃度１. ５Ｍ−４ｍＭで標
的遺伝子配列の増幅を示した。典型的には、１. ５ｍＭ
のＭｇＣｌ2 （最終濃度）で最適な増幅が起こった。 ｍｉｐのＰＣＲ増幅によるＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ
ａ検出の特異性 【００８２】プライマーＬｍｉｐＬ９２０とＬｍｉｐＲ
１５４８および５０゜Ｃｎｏプライマーアニーリング温
度を使ったＰＣＲ増幅は、検査されたすべてのＬ． ｐ
ｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ株について正の増幅ＤＮＡバンド
を生じた。非Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種、即ち検
査された他のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種と他の属は、ｍｉ
ｐ用プライマーを使ってのＤＮＡ増幅を示さなかった。
ｍｉｐ−１遺伝子プローブを使ってのサザン法ハイブリ
ッド形成は、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに特異的な
標的ｍｉｐ配列の増幅を示した。更に、混合物にＬ．
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａからのＤＮＡが添加されない限
りは、非Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ株からのＤＮＡ
の混合物を使ってｍｉｐ遺伝子のＤＮＡ増幅は検出され
なかった。 【００８３】Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｋｎｏｘ
ｖｉｌｌｅ−１（血清群１）とＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ−１（血清群４）の二株
は、それぞれ１.０ｍＭと１. ０ｍＭという他のＬｅｇ
ｉｏｎｅｌｌａ種より低い最終ＭｇＣｌ2 濃度で増幅を
示した。同じこれらの二株は、それぞれ３. ５ｍＭと
２. ５ｍＭのＭｇＣｌ2 というＰＣＲ増幅の最適マグネ
シウム濃度を有したが、これらの濃度はＬ. ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａの他の株についての１. ５ｍＭＭｇＣｌ2
という最適濃度よりも高かった。 【００８４】ＰＣＲ増幅によるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ検
出の感度 ｍｉｐ遺伝子増幅用プライマーを使って、Ｌ． ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａの１０ｆｇのゲノムＤＮＡの増幅がｍ
ｉｐ−１プローブでのハイブリッド形成によって首尾一
貫して検出された。これは約０. １ａｇの標的ＤＮＡに
相当し、単一Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｍｉｐ遺
伝子セグメントの検出を表す。Ｌ． ｂｏｚｍａｎｉｉ
とＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａからの１ｆｇのゲノム
ＤＮＡがプライマーＬ５ＳＬ９とＬ５ＳＲ９３を使って
増幅された場合には、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ中の５Ｓ
ｒＲＮＡのためのプローブで試料の約１８％が検出され
た。正の増幅結果のこのパターンは、その濃度のゲノム
ＤＮＡでの予想される標的遺伝子のポアソン分布に相当
する。 【００８５】本発明を使っての標的ＤＮＡ配列増幅の特
異性はＤＮＡセグメントを暗号づける５Ｓ ｒＲＮＡ基
づく試料中のすべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの検出と、
特に、ｍｉｐ遺伝子に基づくＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの検出を可能にする。証明された特異性は、この方
法がＬｅｇｉｏｎｅｌｌａとＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの臨床診断と環境調査の両方のための方法を提供す
る事を示す。ＰＣＲ−遺伝子プローブ法を使ってのＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ検出のレベルは、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａの単個細胞の検出と一致した。このように小
数のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａを特異的に検出する能力は、
ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓにかかった個人の臨床的診
断および病院や移動式送水設備や冷却塔やＬｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａの可能性ある他の源の安全性を確実にするため
と在郷軍人病の発生が起こる場合にＬ． ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａの源を確認するための水と臨床試料の環境調
査の両方のための方法論的基盤を確立する。多数のプラ
イマーを使って、同じ試料中のすべてのＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ種とすべてのＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ血清
型の両方を同時に検出することができる。 【００８６】上記の説明は本発明を単に例証するもので
あり本発明は特に例示されない非常に多くの具体例を有
することは、当業者にとっては明かだろう。
回収し、細胞を溶解して減成されていないＤＮＡを回収
し、ポリメラーゼ連鎖反応増幅によって病原体または指
示生物の細胞中に存在する標的遺伝子の標的遺伝子配列
を増幅し、増幅された標的遺伝子配列の存在を検出して
検査試料中に病原体または指示生物が存在するか否かを
決定することを特徴とする、水試料中の水系病原体と指
示生物を検出する方法とそのためのキット。 【０００２】水試料中の水系微生物病原体およびヒト糞
便汚染の指示微生物の検出方法とそのためのキット 【０００３】本発明は、ヒト感染を防いだりその原因を
追跡したりする目的のために、試験管内での酵素的増幅
と特定の遺伝子配列の検出によって、試料中の微生物、
とりわけ水の試料と海の試料を含む環境試料中の水系微
生物病原体と指示微生物、特に主として糞便に由来する
細菌を検出する方法に関する。 【０００４】ほとんどの水系ヒト病原体は、糞便によっ
て汚染された水または食物の摂取によって感染とヒトの
病気を引き起こす。飲用や入浴やレクリエーションや貝
捕獲や食物の洗浄/ 調理に使われる水のヒト糞便による
汚染によって運ばれる原生動物とウイルスと細菌を含
む、様々なヒトの寄生虫と病原体がこのようにして運ば
れる。更に、汚染されたエアゾル剤によって運ばれて気
道を通って人体に入ることによって運ばれる水系病原体
も有る。在郷軍人病として知られているしばしば致命的
な呼吸器性肺炎感染であるｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ
の原因微生物であるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａはこのようにして運ばれる。エアコン冷却
塔、不十分に塩素化されている水泳プールや温泉、温水
ヒーター、呼吸器治療器具およびシャワーヘッドの中に
見いだされる温かい滞留した家庭水がＬｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ感染発生の原因であると確認されている。水精製の
必要性およびレクリエーションや飲用や貝捕獲のための
天然水（地下水と地表水）の安全性の十分さが、糞便細
菌とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａを検出するための標準微生物
学的検査によって日常的に調べられている。ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌｏｓｉｓの抑制は、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの蓄積場所が確認され得るように環境調査を必要と
する。その後に、この細菌性病原体を少なくするかまた
は取り除くために除染処置を実行してｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌｏｓｉｓの発生の危険性を低下させることができる。
更に、追加の発生を防ぐために、ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏ
ｓｉｓが発生した場合にはＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ
ａの源がすみやかに決定されなければならない。 【０００５】多くの糞便病原体は検査するのが難しいか
または水試料の採取と濃縮が不便な程低濃度で感染性な
ので、糞便微生物による水汚染は、しばしば、「糞便腸
内細菌」、特に大腸菌等の指示生物と呼ばれているより
堅くてより強いが必ずしも病原性ではない微生物を検査
することによって評価される。 【０００６】糞便細菌指示生物とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ
の両方についての最も普通の検査は、標準条件下での一
日から数日続けてかまたは普通培地中での培養の後に、
生育するコロニーを数えるかまたは正の液状培養物を確
認し、試料中の細菌数を決定するために最も可能性のあ
る数表を使用することを必要とする。追加の時間と費用
と特殊技能労働を必要とするけれども、これらの検査で
計数される生物の微生物学的正体を確かめるために様々
な代謝試験と生化学的検査と免疫化学的検査を用いても
よい。 【０００７】微生物汚染の培養試験は退屈で、時間がか
かり、不満足なことにはゆっくりで、ヒトの健康に重大
な影響を及ぼすかもしれない決定を遅らせるものであ
り、この試験は何日間という時間的規模でではなく何時
間という時間的規模でなされるべきである。 【０００８】送水設備の細菌学的安全性の日常的調査に
使われる実行可能な培養法にはいくつかの問題があり、
それらは、方法が退屈なこと、採取時と計数時との間に
細菌を生育できるように維持すること、水中の化学物質
によってストレスを受けるもの等の生育できるが培養不
可能な細菌が増殖しないこと、興味があるすべての生き
ている細胞を培養することができないこと、腸内細菌の
検出と確認のために必要な時間（日数）、大腸菌等の真
の糞便腸内細菌の検出に特異性が無いこと、直接顕微鏡
計数を使って生きている細胞を死細胞から識別すること
ができないこと、および血清学的方法を使った場合の抗
原の交差反応性に起因する生物の誤確認を含む。 【０００９】その様な培養試験は、大抵は、小数の特定
微生物の存在または非存在を十分な確実性をもって保証
するのに望ましいほど特異的でもなければ感度が良くも
ない。特定の病原体または指示生物と結び付けて考えれ
ている特定領域のＤＮＡと特異的にハイブリッド形成す
る遺伝子プローブは特異的検出の手段を提供するが、従
来の遺伝子プローブ法は、一般的に、環境調査の目的の
ために必要とされる感度の約１万分の１の感度である。 【００１０】最近、コリラート試験等のβーＤ−グルク
ロニダーゼ検出に基づく試験が腸内細菌検出の新しいア
プローチとして示唆されている。フルオロゲニックな基
質４ーメチルウンベリフェリルーβーグルクロニドまた
はカラリメトリックな基質ｐ−ニトロフェニルグルクロ
ニドの酵素的変換は大腸菌の存在を示すが、その様な酵
素活性の検出は依然として細菌の培養を必要とする。β
ーＤ−グルクロニダーゼを持たない大腸菌が高率に発生
するために、βーＤ−グルクロニダーゼ活性に基づいて
試験を行うと糞便腸内細菌の約３０％という著しい割合
を検出できないかもしれない事も最近報告されている。 【００１１】Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ検出の従来
法はプレート上生菌数測定と直接顕微鏡計数であり、後
者はいくつかの市販の蛍光抗体試薬を使って行われる。
水試料からのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ生菌細胞の培養が標
準的方法であるけれども、それは退屈であり時間がかか
る。加えて、標準生菌計数方法で使用される酸洗浄処理
と選択培地に感受性のＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ細
胞も有るので、培養法は生細胞の数を過小評価する場合
がある。また、生育できるが培養できないかもしれない
細胞も有る。免疫蛍光顕微鏡検査は生細胞を死細胞から
識別することができないし抗原交差反応性のために擬陽
性反応を示すＬｅｇｉｏｎｅｌｌａではない細胞も有る
ので、多クローン性抗体試薬を使ってのＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａの血清学的検出にも同様に限界が有る。 【００１２】制限酵素消化後のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの
染色体ＤＮＡから単離された放射標識された独特のＤＮ
Ａ遺伝子プローブフラグメントを使ったコロニーハイブ
リッド法によるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ検出が報告されて
いる。水冷却塔中に見いだされるような微生物数が高い
水では、コロニーハイブリッド法による検出感度レベル
は約１０4 ｍｌであろう。別の遺伝子プローブを使って
５×１０4 細胞の感度が達成された。ｒＲＮＡ検出に基
づく市販の遺伝子プローブ検出キットは、１０3 または
１０4 細胞の感度を持っている。 【００１３】従って、上記の問題が取り除かれているか
またはかなり低められている自然環境中の精製されてい
る水源または他の水源中の水系微生物病原体およびヒト
糞便汚染の指示微生物の検出のための方法とそのための
キットが入手可能であることが強く望まれている。本発
明の更なる目的は、非常に低濃度の病原体または指示微
生物を確実に検出するより大きい特異性と感度を持った
方法とキットを提供することである。本発明の更なる目
的は、その様な病原体と指示微生物を培養しないで検出
することを可能にする方法とそのためのキットを提供す
ることである。本発明の別の目的は、培養不可能な腸内
細菌を検出する方法とそのためのキットを提供すること
である。その様な病原体と指示微生物を何日間かではな
く何時間かで検出することを可能にする方法とそのため
のキットを提供することも本発明の目的である。本発明
の更なる目的は、指示生物の間接的検出に頼るというよ
りはむしろ水試料中の病原体を直接的に検出することを
可能にする方法とそのためのキットを提供することであ
る。 【００１４】本発明の追加の目的は、ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌｏｓｉｓの発生源を防ぐかまたは決定するためにＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ源を検出するための効果的で特異的で
感度の良い方法とそのためのキットを提供することであ
る。本発明の更なる追加の目的は、臨床的診断と環境調
査またはＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ源追跡の両方の
ためにＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを特異的に検出す
るための方法とそのためのキットを提供することであ
る。本発明の別の目的は、同じ水試料中のすべてのＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ種とすべてのＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈ
ｉｌａ血清型の両方を同時に検出することができる方法
とそのためのキットを提供することである。 【００１５】本発明の追加の目的は、微生物病原体また
は指示微生物部類に属する実質上すべての種と株を検出
するだろうが他の種または属の生物は検出しないだろう
方法とそのためのキットを提供することである。更なる
目的は、変異体間の識別を可能にすると同時に場合によ
って同じ標的種または属または他の定義された群の変異
体間の識別を避けるために、標的遺伝子内の高度に多型
の配列を用いる方法とそのためのキットを提供すること
である。 【００１６】本発明によると、特定のＤＮＡ標的遺伝子
配列が選ばれ、検査試料中に非常に低濃度、特に高非標
的バックグラウンドに比べて非常に低濃度に標的ＤＮＡ
配列が存在する場合にさえもそれらが検出され得るよう
に試験管内でそれらが増幅される。本発明では、標的ヌ
クレオチド配列が、増幅のために選ばれ、標的ヌクレオ
チド配列の濃度が各増幅またはサイクルにつき二倍ほど
も増すことができるかまたは各一連の１０増幅サイクル
につき１０２４倍ほども増すことができるように増幅さ
れる。 【００１７】本発明は、主として糞便に由来する水系微
生物と病原体と病原体の存在の可能性を示す細菌を検出
する方法を提供するものであり、該方法は、水、しばし
ば大容量の水から該微生物を回収し、微生物を溶解して
病原体または指示生物からほとんど減成していないＤＮ
Ａを放ち、標的遺伝子とその標的遺伝子からの標的ヌク
レオチド配列を選んで、標的ＤＮＡ配列の分離された標
的ストランドとハイブリッド形成するプライマーペアー
およびプライマーを延ばして標的ＤＮＡ配列の十分に二
重ストランド化されたレプリカを作るためのポリメラー
ゼを使って特定の標的ＤＮＡ配列を増幅し、増幅された
標的ＤＮＡ配列を検出して、増幅された標的ＤＮＡ配列
を検出することができたかできなかったかから元の検査
試料が標的ＤＮＡ配列を持った微生物を含有していたか
どうかを結論することから成る。 【００１８】本発明の方法で有用な特別の水系ヒト病原
体とヒト糞便汚染の指示微生物に対する特定の標的遺伝
子は下記のものを含む：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒおよび
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種に対するｌａｃＺ；Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｈｉｇｅ
ｌｌａ種に対するｌａｍＢ；Ｌｅｑｉｏｎｅｌｌａ ｐ
ｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに対するｍｉｐ；Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉに対する
ＵｉｄＡ；およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉと
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉに対するＵｉｄＣ。 【００１９】これらの標的遺伝子の各々からの特定のＤ
ＮＡヌクレオチド配列が、選ばれた各遺伝子配列に対す
るプライマーペアーを使った増幅の対象として選ばれ、
これらのプライマーは、選ばれた遺伝子配列の各々から
の選ばれた配列から成り下記に例示されている。 【００２０】標的ＤＮＡ配列の増幅は、以後単にＰＣＲ
と呼ぶポリメラーゼ連鎖反応として知られている方法に
従って、選ばれたプライマーペアーを使って行われる。
ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅は、１９８９年７月２７
日にＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに与えられた
Ｋ． Ｍｕｌｌｉｓの米国特許番号４６８３２０２に記
載されており、その開示は本明細書中に言及されてい
る。該特許中に記載されている通り、ＰＣＲ増幅プロセ
スは、各々が二つのストランドのうちの一つに対して相
補的な二つのオリゴヌクレオチドプライマーで核酸配列
の二つの別々の相補的ストランドを処理して相補的スト
ランドにプライマーをアニーリングした後にプライマー
を延ばして選ばれた標的核酸配列の十分に二重ストラン
ド化されたレプリカを作るためのポリメラーゼを使って
該プライマーの延長生成物を合成することによって約１
００ー１００ｂｐの長さの選ばれたかまたは標的となる
核酸配列を増幅した後に、延長生成物を分離（変成）し
てこの増幅連続を所望のサイクル数だけ繰り返し選ばれ
た核酸配列の濃度を増すことから成る。 【００２１】本発明の方法のＰＣＲ増幅段階では、反応
混合物は、（１）選ばれた標的配列へプライマーをアニ
ーリングさせるためかまたはストランド再結合のため
の、一般的に約３７゜Ｃから７０゜Ｃの低温と（２）プ
ライマーのポリメラーゼによる延長のための、一般的に
約７０゜Ｃから８０゜Ｃの中間温度と（３）ストランド
の変成または分離のための、一般的に約８０゜Ｃから１
００゜Ｃのより高い温度の間を繰り返して循環させられ
る。三つの温度範囲が述べられているけれども、これら
の温度範囲のうちの二つの間で増幅プロセスを十分に実
施することができることがしばしばである。二つまたは
三つの温度の各熱サイクルが増幅された標的ＤＮＡ配列
の濃度を２倍ほどにも増すことができるので、あらゆる
一連の１０増幅サイクルが濃度を１０２５倍ほども増す
ことができる。細菌Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ
（Ｔａｑ）から 生成されるものの等の温度安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼが使用される場合には、最初に加えられ
たポリメラーゼ酵素を増す必要なく二つまたは三つの温
度の間でポリメラーゼ反応を多回数、典型的には２０ー
４０回反復させることができる。 【００２２】成功した標的ＤＮＡ配列増幅を直接逆遺伝
子プローブハイブリッド形成によって検出するためのハ
イブリッド形成プローブとして標的遺伝子配列の各々か
らの特定のＤＮＡ配列を選んでもよい。例えば、ゲル電
気泳動や陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーや対
イオン逆相高速液体クロマトグラフィー等の主として大
きさに基づいてＤＮＡ分子を分離する方法等の、どんな
適当なＤＮＡ分子検出法によって成功した標的ＤＮＡ配
列増幅を成し遂げてもよい。 【００２３】本発明の方法とキットの様々な側面を下記
により詳細に説明する。本方法の最初の側面は、増幅段
階が起こる少量の検査試料よりも多次数大きい試料から
成っている場合があり非標的バックグラウンド細胞を標
的細胞よりも多次数高い濃度で含有しているかもしれな
い水試料、即ち数リットルの容量である可能性がある水
から得られる標的水系病原体または指示生物の実質上す
べての細胞を、約０.１から約１. ０ｍｌの次数の小検
査試料容量の水中に回収することから成る。次に、酵
素、低分子量阻害物質、または標的ＤＮＡ配列の酵素的
増幅を妨げるかもしれない他の成分等の妨害する可能性
がある物質を十分にも含まないように標的細胞から事実
上すべての減成されていない標的ＤＮＡ配列が回収され
るように、溶菌等によって事実上すべての標的細胞を処
理する。標的とされる系統サブセット内の事実上すべて
の生物の標的配列上の二つのプライマーの位置間の標的
ＤＮＡ配列のセグメントが効率的に特異的に増幅され標
的とされる群外からのものは何も増幅されないように標
的ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うために、標的遺伝子からの
標的ＤＮＡ配列と一対のプライマー配列とＰＣＲ反応条
件が選ばれる。標的とされるＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅の
後に、十分に感度がよくて特異的な検出法によって増幅
された標的とされるＤＮＡを検出する。同位体を使った
検出方法を用いてもよいけれども、安全と便利さのため
に好適な同位体を使わない検出方法が用いられるのが好
ましい。標的とされる遺伝子配列の各々からの特定のＤ
ＮＡ配列のプローブを利用した好適なハイブリッド形成
プローブを使って検出が行われるのが好ましい。所望さ
れる場合には、増幅された標的ＤＮＡ配列の定量も実施
してもよい。 【００２４】水試料から実質上すべての標的細胞を回収
する操作は、標的生物をそれらの分離を容易にする物理
的状態で捕らえるかまたは凝集させる役目をする懸濁さ
せられているかまたは溶かされている添加物によって恐
らく助けられる例えば濾過と遠心分離を含むいくつかの
好適な方法のうちのどれによって行われてもよい。微生
物がもっとずっと大きい粒子に吸着されていないかまた
は凝集させられていない場合には、効率的な捕獲を確実
なものにするために濾紙穴の大きさは約０. ２から０.
５μｍ、好ましくは約０. ４５μｍよりも大きくないべ
きである。微生物がゲル中に回収されるかまたは粒子に
吸着されている場合には、濾過を促進するためにもっと
ずっと大きい濾紙穴の大きさが好ましい。本発明の好ま
しい細胞回収は、約１ｍｌ以下の小容量試料からの遠心
分離によって得られるかまたは小容量または典型的には
１００ｍｌの大容量の試料の場合には濾過によって得ら
れる。本発明の濾過による特に好ましい細胞回収は、１
１ー１３ｍｍの直径で０.２０ー０. ５０μｍの穴の大
きさのポリカーボネート製またはテフロン製の濾紙を通
過させることによって行われる。 【００２５】標的細胞から事実上すべての減成されてい
ない標的ＤＮＡ配列が回収されるように検査試料中の回
収された細胞を処理する操作は、多くの好適な方法のう
ちのどれによって行われてもよい。微生物溶解による標
的ＤＮＡ配列の回収は、両極端のｐＨ、有機溶媒、尿素
や塩酸グアニジン等のカオトロピック剤、硫酸ドデシル
ナトリウム（ＳＤＳ）やトリトンＸ−１００等の洗浄
剤、浸透ショック、リゾチーム消化、またはプロテアー
ゼ消化等に短時間さらすことによって達成されてもよ
い。例えば、有機溶媒抽出、酸沈澱、限外濾過、固体相
抽出、高速液体クロマトグラフィー、ＬｉＣｌ沈澱、プ
ロテアーゼ消化、ＲＮアーゼ消化またはポリエチレング
リコール沈澱などによって、妨害物質を取り除くことが
できる。固体相抽出または高速液体クロマトグラフィー
は、イオン交換、逆相、疎水的相互作用またはシリカゲ
ル吸着相互作用に基づかせることができる。本発明の標
的細胞からのＤＮＡの好ましい放出は、ＳＤＳーリゾチ
ーム処理とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに対しては特に凍結
（ー７０゜Ｃ）解凍（２５゜Ｃ）サイクルの交互実施を
使用することによって行われる。 【００２６】本発明の方法のＰＣＲ増幅段階を行うため
に、広範囲の遺伝子とさらにもっと広範囲の遺伝子サブ
配列を選ぶことができる。病原性またはヒト糞便（糞便
汚染の結果としてを除く害されていない自然環境ではな
い）中への出現についての知識に基づいて標的とされる
属、種、株および血清型がひとたび特定化されると、標
的生物中に存在し事実上すべての他の生物中に存在しな
い遺伝子と標的サブ配列を選ぶ。一遺伝子内のサブ配列
は多型性が大きく異なることがしばしばであり、これ
は、環境中の微生物調査を有利にするために使うことが
できる事実である。約１００ー１０００ｂｐで分離され
た非多型性サブ配列中に位置させることによってより大
きい標的セット内のすべての生物を効率的に増幅するよ
うな本発明の方法のＰＣＲ増幅段階のためのプライマー
を選んでもよく、標的ＤＮＡ配列の相補的ストランド上
の約１０ー３０のヌクレオチド配列に対して相補的であ
り増幅された領域内の配列と効率的にハイブリッド形成
して標的生物種、属または群に対する特異性を確実にす
るようにオリゴヌクレオチドプローブは構成されてい
る。 【００２７】本発明を実施するための特定の標的遺伝子
の例としては、例えば下記のものをあげることができ
る：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ種とＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種とＫｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ種を含むヒト糞便汚染の有用な指示微生物である全
腸内細菌を検出するためのｌａｃＺ；ヒト糞便汚染の有
用な指示微生物である腸内細菌種大腸菌と、ヒトの病気
を引き起こしヒト糞便汚染と関連して見いだされるＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ属とＳｈｉｇｅｌｌａ属の腸内病原性
細菌を検出するためのｌａｍＢ；すべてのＬｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａ種を検出するための５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝
子；腸内細菌種大腸菌および腸内病原体Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ ｓｏｎｎｅｉとＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅ
ｒｉを検出するためのＵｉｄＡ；および糞便腸内細菌指
示細菌種大腸菌と腸内病原体Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎ
ｎｅｉを検出するためのＵｉｄＣ。 【００２８】これらの遺伝子のヌクレオチド配列は前も
ってわかっており、この事がそれらの選択とＰＣＲでの
ＤＮＡ増幅のための標的としての使用を容易にするが、
本発明前には、これらの特定の遺伝子が限られた標的群
を検出するための基礎を提供する能力は知られていなか
ったしそれらがそうするための基礎を提供するであろう
ことも明かではなかった。我々の発明は下記の新しい新
奇な発見を含む：（１）ｌａｃＺ遺伝子は大腸菌（遺伝
子配列が過去に決定されていた細菌種）のみでなく腸内
細菌群（この配列を有することが知られていなかった）
を構成する他のグラム陰性ラクトース利用細菌のＰＣＲ
増幅と遺伝子プローブ検出を可能にする十分に保護され
た領域を含み、この保護された領域は非腸内グラム陰性
細菌中にもグラム陽性ラクトース利用細菌中にも見いだ
されないので、ｌａｃＺは「全」腸内細菌を検出するた
めの好適な標的である；（２）ｌａｍＢは大腸菌（遺伝
子配列が過去に決定されていた細菌種）のみだけでなく
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａやＳｈｉｇｅｌｌａ種（この配列
を持つことがわかっていなかった）のＰＣＲ増幅と遺伝
子プローブ検出を可能にする十分に保護された領域を含
み、この保護された領域は他のグラム陰性細菌やグラム
陽性細菌中には見いだされないので、ｌａｍＢは糞便指
示腸内細菌種大腸菌と糞便汚染環境中で最も関心のある
腸内病原体の検出に好適な標的である；（３）ＤＮＡを
暗号づける５ＳｒＲＮＡ配列はすべてのＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ種のＰＣＲ増幅と遺伝子プローブ検出を可能にす
る十分に保護された領域を含みこの保護された領域は他
の細菌種中には見いだされないので、５ＳｒＲＮＡを暗
号づけるＤＮＡの領域はすべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ
種の検出に好適な標的である；（４）Ｌ． ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａのｍｉｐ遺伝子はＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈ
ｉｌａのすべての血清型のＰＣＲ増幅と遺伝子プローブ
検出を可能にする十分に保護された領域を含みこの保護
された領域は他のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種または他の細
菌中には見いだされないので、ｍｉｐはＬ． ｐｅｎｕ
ｍｏｐｈｉｌａの検出に好適な標的である；そして
（５）ＵｉｄＡ遺伝子配列とＵｉｄＣ配列（ＵｉｄＡ遺
伝子の調節領域）のいずれも大腸菌といくつかのＳｈｉ
ｇｅｌｌａ種のＰＣＲ増幅と遺伝子プローブ検出を可能
にする領域を含み、この領域は他のグラム陰性細菌また
はグラム陽性細菌中には見いだされないので、ＵｉｄＡ
とＵｉｄＣは糞便指示腸内細菌種大腸菌といくつかのＳ
ｈｉｇｅｌｌａ種の検出に好適な標的である。 【００２９】本発明の方法で使用するのに特に好ましい
遺伝子サブ配列は下記のプライマー対によって限定され
る：ｌａｃＺに対する５’ーＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣ
ＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡまたは５’ーＣＡＣＣＡＴＧ
ＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴと５’ーＡＴＧＡ
ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣ；ｌａｍＢ
に対する５’ーＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡ
ＧＧＣＴＣＣと５’ーＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴ
ＴＡＴＣＡＣＧＣＡの対および５’ーＧＧＡＴＡＴＴＴ
ＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧと５’−ＡＣＴＴＧ
ＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣの対；ｍｉｐ
に対する５’ーＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧ
ＴＴＧと５’ーＧＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴ
ＴＣＡ；５ＳｒＲＮＡに対する５’ーＡＧＡＡＣＣＧＣ
ＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣと５’−ＴＡＧＧＡＣＣ
ＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡの対および５’ーＡＣＴＡ
ＴＡＧＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡと５’ーＧＣＧＡＴ
ＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴの対；ＵｉｄＡに対す
る５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧと
５’ーＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧの
対および５’−ＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴ
ＴＴと５’ーＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧ
Ｇの対および５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡ
ＧＣＡＧと５’ーＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧ
ＣＧＧの対；およびＵｉｄＣに対する５’ーＴＧＴＴＡ
ＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣと５’−ＡＡＡＡ
ＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴ これらのサブ配列のみからでなく、それらに含まれる配
列、それらとかなり、即ち１０ｂｐだけ重なりあう配
列、標的遺伝子内の配列、および標的遺伝子を包む配列
から効果的なプライマーを構成してもよい。 【００３０】実質上減成されていない標的ＤＮＡを約１
ｍｌの小容量の水または水性緩衝液中に回収して標的Ｄ
ＮＡ配列の相補的ストランド上の約１０ー３０のヌクレ
オチド配列に対して相補的な標的ＤＮＡ配列に適切なオ
リゴヌクレオチドプライマー対を選択した後に、プライ
マーが分離された（変成さされた）標的ＤＮＡストラン
ドとハイブリッド形成しポリメラーゼがプライマーを延
ばして標的配列の十分に二重ストランド化されたレプリ
カを作るような条件下で、標的ＤＮＡをｄＮＴＰ’ｓと
Ｍｇ+2とＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートす
る。温度やインキュベーション時間や溶媒や酵素選択や
試薬濃度や装置などのＰＣＲ増幅条件は、標的ＤＮＡ配
列の効率的で特異的な増幅がなされるように選ばれる。
様々な標的生物と様々な種類の検査試料や標的ＤＮＡ配
列と選ばれたプライマー対の間で各工程段階とパラメー
ターに対する効果的で随意の条件が著しく異なるだろう
事は、容易に理解されるだろう。十分によく調節された
温度とインキュベーション時間の熱サイクルを行うため
の溶媒選択、酵素の選択と濃度、プライマー濃度、ｄＮ
ＴＰ濃度および装置選択は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅の分野
の当業者によって一般的に理解される。臭化エチジウム
等の蛍光染料でＤＮＡを染色した後にアガロースまたは
ポリアクリルアミドゲル電気泳動等によって増幅された
ＤＮＡの量と質を調べて試行錯誤によって、本発明の特
定の標的配列のための正確な温度とインキュベーション
時間の選択を決定してもよい。選ばれたプライマーによ
って限定されると予想される大きさの標的ＤＮＡの電気
泳動バンドの収率を最大にし他のＤＮＡの増幅を最小限
にするかまたは好ましくは完全に防ぐ反応条件を選ぶ。 【００３１】本発明のＰＣＲでのＤＮＡ増幅を実施する
ために特に好ましい条件の例としては下記のものがあげ
られる：ｌａｃＺに対する９４゜Ｃで２分間の初期変
成、５０゜Ｃの再アニーリング温度で３０分間、７２゜
Ｃの延長温度で６０秒間、９４゜Ｃの変成温度で６０秒
間、１. ５ｍＭのマグネシウム濃度および活性ｔａｑポ
リメラーゼ；ｌａｍＢに対する９４゜Ｃで２分間の初期
変成、６０゜Ｃの再アニーリング温度で３０秒間、７２
゜Ｃの延長温度で３０秒間、９４゜Ｃの変成温度で６０
秒間、１. ５ｍＭのマグネシウム濃度および活性ｔａｑ
ポリメラーゼ；ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａＤＮＡ暗号づけ５
ＳｒＲＮＡに対する９４゜Ｃで３分間の初期変成、５０
゜Ｃの再アニーリング温度で６０秒間、７２゜Ｃの延長
温度で６０秒間、９４゜Ｃの変成温度で６０秒間、１.
５ｍＭのマグネシウム濃度および活性ｔａｑポリメラー
ゼまたはａｍｐｌｉｔａｑ；ｍｉｐに対する９４゜Ｃで
３分間の初期変成、５０゜Ｃの再アニーリング温度で６
０秒間、７２゜Ｃの延長温度で６０秒間、９４゜Ｃの融
解温度で６０秒間、１. ５ｍＭのマグネシウム濃度およ
び活性ｔａｑポリメラーゼまたはａｍｐｌｉｔａｑ；お
よびＵｉｄＡとＵｉｄＣに対する９４゜Ｃで３分間の初
期変成、５０゜Ｃで１分間の再アニーリングと延長、９
４゜Ｃで６０秒間の変成、１. ５ｍＭのマグネシウム濃
度および活性ｔａｑポリメラーゼ。 【００３２】増幅された標的ＤＮＡはどんな好適な様々
な方法を使って検出することもできる。高速液体クロマ
トグラフィーによる増幅されたＰＣＲ標的ＤＮＡ生成物
と副生成物と未反応試薬の分離は、予想されるサイズ範
囲の増幅されたＤＮＡが存在するか否かに関する迅速な
定量的報告を提供することができる。高速液体クロマト
グラフィーカラムは、例えば、イオン交換分離または対
イオン逆相分離または粒度排他分離に基づくものであっ
てもよい。蛍光性ＤＮＡ結合性染料でのカラム後誘導後
の蛍光モニタリングと電気化学的検出もまた可能であり
一般的には分光光度法よりももっと感度がよい可能性が
あるけれども、カラム流出物は一般的には２５０ー２８
０ｎｍのスペクトル域での紫外線吸収によって最も簡単
に検出され定量される。増幅されたＰＣＲ標的ＤＮＡ生
成物と副生成物と未反応試薬をゲル電気泳動によって分
離した後に蛍光性染料または吸収性染料でＤＮＡを染色
することもまた、予想されるサイズ範囲の増幅されたＤ
ＮＡが存在するか否かについて報告する。しかしなが
ら、これらの分析シグナルは定量するのがより困難であ
る。 【００３３】標的遺伝子内の二つの選ばれたオリゴヌク
レオチドプライマー間に位置するＤＮＡサブ配列に対し
て配列相補的である単一ストランドオリゴヌクレオチド
プローブとのハイブリッド形成によるのが、ＰＣＲで増
幅されたＤＮＡ標的配列を検出する好ましいやり方であ
る。ＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列が変成させられ
ておりナイロンやニトロセルロース膜等の固体支持体上
に捕らえられている場合には、プローブを放射標識する
かまたは酵素分子に直接的または間接的に結合させても
よい。次に、ハイブリッド形成条件下で、膜に捕らえら
れたＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列生成物をプロー
ブと共にインキュベーションした後に、余分のプローブ
を洗い流してオートラジオグラフィー、放射線計数また
は放射性プローブを使って、またはプローブに結合させ
られた酵素をクロモゲニックなあるいはフルオロゲニッ
クな基質にさらすことによって検出を行うことができ
る。オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブが固
体支持体に結合させられている場合には、変成させられ
たＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列生成物をハイブリ
ッド形成条件下で固体支持体と共にインキュベートする
と該ＰＣＲ生成物が固定化される。アビジンや抗体等の
特定の結合分子が有るビオチンまたは何らかの他の化学
基をＰＣＲ生成物が含んでいる場合には、ストレプトア
ビジンに結合させられている西洋わさびペルオキシダー
ゼまたはアルカリホスファターゼ等の、特定の結合分子
に結合させられている酵素を使って固定化されている生
成物を検出することができる。 【００３４】本発明のＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配
列生成物を検出する好ましい方法は、放射性同位体で標
識された遺伝子プローブとビオチン化された遺伝子プロ
ーブでのハイブリッド形成を使用することによるもので
ある。本発明のＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ配列生成
物の特に好ましい検出は、ビオチン化ｄＵＴＰまたはビ
オチン化プライマーからのビオチンの取り込みと膜に固
定されているポリーＴ−テイル遺伝子プローブの使用に
よってＰＣＲ増幅時に増幅されたＤＮＡが標識されるこ
とを特徴とする逆ブロッティングハイブリッド形成を使
って行われる。 【００３５】本発明の標的ＤＮＡ遺伝子配列の検出に好
ましい遺伝子プローブ配列は下記のものを含む：ｌａｃ
Ｚに対する５’ーＴＧＡＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣ
ＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡ
ＴＴＴＣＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な配
列； ｌａｍＢに対する５’ーＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣ
ＴＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡ
ＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴＧまたはこの配列に対して
相補的な配列； ｍｉｐに対する５’ーＴＴＴＧＧＧＧ
ＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧ
ＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡまたはこの配列
に対して相補的な配列； Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ５Ｓ
ｒＲＮＡに対する５’ーＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡ
ＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡ
ＧＴまたはこの配列に対して相補的な配列および５’ー
ＢＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴ
ＣＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣ
（配列中Ｂはビオチン）またはこの配列に対して相補的
な配列；ＵｉｄＡに対する５’ーＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣ
ＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡ
ＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧまたはこの配列に対し
て相補的な配列および５’ーＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣ
ＡＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧ
ＣＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴまたはこの配列に対して相
補的な配列；そしてＵｉｄＣに対する５’ーＣＡＡＣＣ
ＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧＣＣ
ＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な
配列。 【００３６】本発明の更なる側面は、本発明のＰＣＲ増
幅と検出の方法を実施する際に使用するのに好適なキッ
トから成る。水系病原体または指示生物の増幅と検出を
容易にするように考案されたそのようなキットは、一般
的に、該病原体または指示生物の標的遺伝子内の標的と
されるＤＮＡ配列の相補的ストランド上の約１０ー３０
のヌクレオチド配列に対して相補的な二つのオリゴヌク
レオチドプライマーから成るプライマー対と、該標的Ｄ
ＮＡ配列を検出するためのプローブ配列と、場合によっ
ては該標的ＤＮＡ配列の制御ＤＮＡ鋳型とから成るだろ
う。検査キットは、標的ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅と検出
のための発表された指示と試薬を含むかもしれない。前
記のプライマー対とプローブ配列に加えて、検査キット
は、例えば溶菌剤やＰＣＲ増幅ポリメラーゼ等の標的Ｄ
ＮＡ配列のＰＣＲ増幅のための他の試薬と水試料採取の
ための濾過装置も含んでいるかもしれない。 【００３７】本発明の好ましい検査キットは、前記の好
ましいプライマー対とこれもまた上記に述べた相当する
好ましいプローブ配列、および場合によっては標的ＤＮ
Ａ配列の制御ＤＮＡ鋳型から成る。例えば、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ種とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種とＣｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ種とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種を検出す
るための検査キットは、ｌａｃＺ遺伝子中の配列を増幅
するためと該ｌａｃＺ遺伝子中の増幅された配列を検出
するためのプライマー対５’ーＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧ
ＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡまたは５’ーＣＡＣＣＡＴ
ＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴと５’ーＡＴＧ
ＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣおよび遺
伝子プローブ５’ーＴＧＡＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧ
ＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧ
ＡＴＴＴＣＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な配
列から成っていてもよい。大腸菌とＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ種とＳｈｉｇｅｌｌａ種の検出のための検査キット
は、ｌａｍＢ遺伝子中の配列の増幅のためと該ｌａｍＢ
遺伝子中の増幅された配列を検出するためのプライマー
対５’ーＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣ
ＴＣＣと５’ーＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＴ
ＣＡＣＧＣＡまたは５’ーＧＧＡＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴ
ＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧと５’−ＡＣＴＴＧＧＴＧＣＣ
ＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣおよび遺伝子プローブ
５’ーＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴ
ＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧ
ＴＴＧまたはこの配列に対して相補的な配列から成って
いてもよい。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種を検出するための
検査キットは、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの５Ｓリボゾーム
ＲＮＡ遺伝子中の配列を増幅するためと該Ｌｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａの５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子中の増幅された
配列を検出するためのプライマー対５’ーＡＧＡＡＣＣ
ＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣと５’ーＴＡＧＧＡ
ＣＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡおよび遺伝子プローブ
５’ーＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴまたはこの配列
に対して相補的な配列から成っていてもよい。Ｌｅｇｉ
ｏｎｅｌｌａ種の検出のための検査キットは、あるい
は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝
子中の配列を増幅するためと該Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの
５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子中の増幅された配列を検出
するためのプライマー対５’ーＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴ
ＴＴＧＧＡＡＣＣＡと５’ーＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣ
ＴＴＴＣＧＣＡＴおよびビオチン化された遺伝子プロー
ブ５’ーＢＣＴＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣ
ＡＴＴＴＣＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧ
ＣＴＴＣまたはこの配列に対して相補的な配列から成っ
ていてもよい。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐ
ｈｉｌａの検出のための検査キットは、ｍｉｐ遺伝子中
の配列の増幅のためと該ｍｉｐ遺伝子中の増幅された配
列を検出するためのプライマー対５’ーＧＣＴＡＣＡＧ
ＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＧと５’ーＧＴＴＴＴＧＴ
ＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡおよび遺伝子プローブ
５’ーＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴ
ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧ
ＣＡＡまたはこの配列に対して相補的な配列から成って
いてもよい。大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
とＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉの検出のため
の検査キットは、ＵｉｄＡ遺伝子中の配列を増幅するた
めと該ＵｉｄＡ遺伝子中の増幅された配列を検出するた
めのプライマー対５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡ
ＡＡＧＣＡＧと５’−ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴ
ＣＴＴＧＣＧおよび遺伝子プローブ５’ーＴＧＣＣＧＧ
ＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣ
ＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧまたはこの配
列に対して相補的な配列、またはプライマー対５’ーＴ
ＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴと５’ーＴＧ
ＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧおよび遺伝子プ
ローブ５’ーＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＧ
ＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴ
ＴＣＴＧＣＴまたはこの配列に対して相補的な配列、ま
たはプライマー対５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡ
ＡＡＧＣＡＧと５’ーＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣ
ＴＧＣＧＧおよび遺伝子プローブ５’ーＴＧＣＣＧＧＧ
ＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡ
ＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧと５’ーＡＡＡ
ＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣ
ＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴのうち
のいずれかから成っていてもよい。大腸菌とＳｈｉｇｅ
ｌｌａ ｓｏｎｎｅｉの検出のための検査キットは、Ｕ
ｉｄＣ遺伝子中の配列を増幅するためと該ＵｉｄＣ遺伝
子中の増幅された配列を検出するためのプライマー対
５’ーＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣ
と５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴ
Ｔおよび遺伝子プローブ５’ーＣＡＡＣＣＣＧＴＧＡＡ
ＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧ
ＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補的な配列から成っ
ていてもよい。これらの例示された検査キットの各々は
水試料採取用濾過装置や、活性ｔａｑポリメラーゼやａ
ｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ等のＰＣＲ増幅用ポリメラ
ーゼや、標的遺伝子配列の制御ＤＮＡ鋳型等の他の構成
要素または試薬もまた含んでいてもよい事は理解される
だろう。 【００３８】水系腸内細菌とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌
の回収とＰＣＲ増幅と検出のための下記の代表的な検査
とその結果によって本発明を説明する。 【００３９】糞便腸内細菌と腸内病原体 腸内細菌ＤＮＡの回収 細菌細胞からＤＮＡを回収するために二つの方法を用い
た。一つの方法では、一晩培養した１.５ｍｌの試料中
の細菌細胞から硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）処理
を使ってのアルカリ溶菌によって標的ＤＮＡを放出させ
る方法によって、培養物からゲノムＤＮＡを抽出した。
タンパク質と炭水化物を除去するためにプロテイナーゼ
Ｋ（セントルイスのシグマ）とＣＴＡＢ：ＮＡＣｌを使
い、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
抽出とフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４：２４：２）抽出を使ってＤＮＡを更に精製し
た後にイソプロパノールで沈澱させた。１２０００×ｇ
で１５分間遠心分離した後に、ペレット化したＤＮＡを
冷７０％アルコールで一回洗浄してから真空下で乾燥さ
せた。この方法を使って、各試料から約１００ー１５０
μｇの精製されたゲノムＤＮＡが回収された。 【００４０】細菌細胞から標的ＤＮＡを回収するもっと
簡単な直接溶菌法では、細菌細胞が加えられていた１０
０ｍｌの水試料から細胞を回収した。１００００×ｇで
１５分間の遠心分離によって細胞を採取した。細胞を
０.６ｍｌエッペンドルフ試験管に移し、１２０００×
ｇで５分間遠心分離した後に、１×ＰＣＲバッファーと
１ｍｌ当たり０. ０５ｍｇのプロテイナーゼＫと２０ｍ
Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）と１. ８μＭＳＤＳを
含有する２０μｌの溶菌液中に細胞ペレットを再懸濁さ
せ、試料を１５秒間ボルテックスして３７゜Ｃで１ー
１. ５時間インキュベートした後に、プロテイナーゼＫ
を不活化するためにそれらを８５ー９０゜Ｃで５分間加
熱した。その後に、更に１０μｌのＰＣＲバッファーと
ｄＮＴＰｓとＴａｑポリメラーゼとプライマーを加え
て、記載されている通りにＰＣＲ増幅を行った。 【００４１】ＰＣＲ増幅と標的とされるＤＮＡ腸内細菌
配列 ＤＮＡサーマルサイクラーと活性Ｔａｑポリメラーゼ
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒ
ｐ．）を使ってＰＣＲ増幅を行った。使用されたＰＣＲ
液は１×ＰＣＲ増幅緩衝液（１０×緩衝液は５０ｍＭ
ＫＣｌと１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ８.１３）
と１５ｍＭ ＭｇＣｌ2と０.１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを
含有する）とｄＮＴＰｓの各々が２００μＭとプライマ
ーの各々が０. ２ー１μＭと１ａｑ（１０-18 ｇ）−１
μｇの鋳型ＤＮＡと２. ５単位のＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼと０. １％ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）
含有二重蒸留水を含んでいた。鋳型標的ＤＮＡｓは最初
に９４゜Ｃで１ー３分間変成させた。その後、下記の条
件を使って総計２５ー４０のＰＣＲサイクルを行った：
９４゜Ｃで０. ５ー１分間の変成、４０゜Ｃまたは５０
゜Ｃまたは６０゜Ｃまたは７０゜Ｃで０. ５ー１分間の
プライマーアニーリング、７２゜Ｃで１ー２分間のＤＮ
Ａ延長。システックＤＮＡシンセサイザーを使ってオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成し、小試料については
オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（カリフォルニア
州のフォスター市のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を大試料についてはＣ−８ ３ミクロン逆相カラ
ム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）での逆相高速液体クロ
マトグラフィーを使って精製した。 【００４２】ＥＭＢＯ Ｊ． ２：５９３−５９７（１
９８３年）にＫａｌｎｉｎｓ等によって報告された配列
に基づいて、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子の８７６ｂｐ領域
を、２４ｍｅｒプライマーであるＺＬ−１６７５（５’
ーＡＴＧＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣ
Ｃ）とＺＲ−２５４８（５’ーＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴ
ＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴ）を使って増幅した。プラ
イマーＺＬ−１６７５を大腸菌のｌａｃＺ遺伝子の暗号
づけ配列内の１６７５ｂｐと１６９８ｂｐの間に位置さ
せ、ＺＲ−２５４８を２５２５ｂｐと２５４８ｂｐの間
に位置させた。ｌａｃＺのもっと短い３２６ｂｐ領域を
増幅するために、プライマーＺＬ−１６７５と共に第二
の２４ｍｅｒプライマーＺＲ−２０２５（５’ーＧＧＴ
ＴＴＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡ）を使用
した。プライマー配列ＺＲ−２５４８よりも大腸菌のｌ
ａｃＺ遺伝子のアミノ末端により近い領域である２００
１ｂｐと２０２５ｂｐの間にプライマーＺＲ−２０２５
を位置させた。 【００４３】Ｎａｔｕｒｅ ２８５：７８−８１（１９
８０年）にＢｅｄｏｕｅｌｌｅ等によって報告された配
列に基づいて、ｌａｍＢのｌａｍｂｄａ結合部位ペプチ
ドを暗号づける配列より下流の５５４ｂｐ配列を、二つ
の２４ｍｅｒプライマーを使って増幅した。プライマー
ＢＬ−４８９９（５’ーＧＧＡＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＣ
ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧ）を４８９９ｂｐと４９２２ｂｐ
の間に位置させ、プライマーＢＲ−５４５２（５’−Ａ
ＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣ）を
５４２９ｂｐと５４５２ｂｐの間に位置させた。大腸菌
のｌａｍＢ遺伝子の暗号づけ領域の３０９ｂｐセグメン
トを増幅するために、第二の組の２４ｍｅｒプライマー
もまた使用した。これらのプライマーは、４９１０ｂｐ
と４９３３ｂｐの間に位置させられたＢＬ−４９１０
（５’ーＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣ
ＴＣＣ）と５１９５ｂｐと５２１９ｂｐの間に位置させ
られたＢＲ−５２１９（５’ーＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡ
ＴＡＧＴＴＡＴＣＡＣＧＣＡ）と呼ばれた。 【００４４】いくつかの実施例では、ｌａｃＺについて
はプライマーＺＬ−１６７５とＺＲ−２５４８の混合物
をそしてｌａｍＢについてはＢＬ−４８９９とＢＲ−５
４５２の混合物を使って、ｌａｃＺの領域とｌａｍＢの
領域を同時に増幅した。これらの実施例では、５０ｎｇ
−１μｇの標的ゲノムＤＮＡと様々な相対的濃度のプラ
イマー（０. １２５ー１. ０μＭの各プライマー）が使
用された。 【００４５】ｌａｍＢとｌａｍＺの配列の位置番号は、
ＮＩＨ−ＢＩＯＮＥＴデータバンクで割り当てられてい
るものに基づく。 【００４６】ＰＮＡＳ，８３：８４４７−８４５１（１
９８６年）にＪｅｆｆｅｒｓｏｎ等によって報告された
配列に基づいて大腸菌のＵｉｄＡ遺伝子の１４７ｂｐ領
域が７５４ｂｐと７７３ｂｐの間および８８０ｂｐと９
００ｂｐの間にそれぞれ位置させられるプライマー７５
４Ｌ−１（５’ーＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧ
ＣＡＧ）と８７９Ｒ−１（５’−ＡＣＧＣＧＴＧＧＴＴ
ＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧ）を使って増幅され増幅された
ＵｉｄＡ遺伝子の検出のために８００ｂｐと８４９ｂｐ
の間に位置させられる遺伝子プローブＵｉｄＡ−１
（５’−ＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴ
ＡＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧ
ＴＧＧＧ）が使われた場合と、ＵｉｄＡ遺伝子の１６６
ｂｐ領域が１９３９ｂｐと１９５８ｂｐの間および２０
８５ｂｐと２１０４ｂｐの間にそれぞれ位置させられる
プライマー１９３９Ｌ−１（５’−ＴＡＴＧＧＡＡＴＴ
ＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴ）と２０８５Ｒ−１（５’ーＴ
ＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧ）を使って増
幅され増幅されたＵｉｄＡ遺伝子の検出のために１９９
８ｂｐと２０４７ｂｐの間に位置させられる遺伝子プロ
ーブＵｉｄＡ−２（５’−ＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡ
ＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣ
ＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴ）が使われた場合と、Ｕｉｄ
Ａ遺伝子の１３５０ｂｐ領域が前記のプライマー７４５
Ｌ−１と２０６５Ｒ−１を使って増幅され増幅されたＵ
ｉｄＡ遺伝子の検出のために前記の遺伝子プローブＵｉ
ｄＡ−１またはＵｉｄＡ−２が使われる場合と、Ｕｉｄ
Ａ遺伝子の制御領域でありＭＧＧ，１９９：１０１−１
０５（１９８５年）にＢａｌｎｃｏ等によって報告され
た配列に基づくＵｉｄＣ遺伝子の１５３ｂｐ領域が３０
１ｂｐと３２２ｂｐの間および４３２ｂｐと４５３ｂｐ
の間にそれぞれ位置させられるプライマー３０１Ｌ−１
（５’ーＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣ
Ｃ）と４３２Ｒ−１（５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧ
ＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴ）を使って増幅され増幅されたＵ
ｉｄＣ遺伝子の検出のために３２３ｂｐと３６２ｂｐの
間に位置させられる遺伝子プローブＵｉｄＣ−１（５’
−ＣＡＡＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧ
ＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴ）が使われる場合に
も、本発明に従って同様に糞便腸内細菌と腸内病原体が
うまく増幅され検出される。 【００４７】増幅された標的とされる腸内細菌ＤＮＡ配
列の検出 ゲル電気泳動と放射標識遺伝子プローブを使って、ＰＣ
Ｒで増幅された標的とされる腸内細菌ＤＮＡ配列を検出
した。０. ８ー１％水平アガロースゲルまたは５％垂直
ポリアクリルアミドゲルを使って、増幅された標的参照
ＤＮＡを分離した。アガロースゲル電気泳動はＴＡＥ緩
衝液（０. ０４Ｍトリスアセテートと０. ００１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ, ｐＨ８. ０）中で行った。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動はＴＢＥ緩衝液（０. ８９Ｍトリスボレー
トと０. ０８９Ｍほう酸と０. ００２Ｍ ＥＤＴ, ｐＨ
８. ０）中で５. ７ー９. ０Ｖ／ｃｍで２ー４時間行っ
た。ゲルを、２×１０-4％臭化エチジウム液中で染色し
て、Ｐｈｏｔｏ／ＰｒｅｐＩ紫外線トランスイルミネー
ター（ウィスコンシン州のニューベルリンのＦｏｔｏｄ
ｙｎｅ Ｉｎｃ．）で可視化して、写真撮影した。 【００４８】サザン法の場合には、増幅された標的ＤＮ
Ａ配列を、０. ４Ｍ ＮａＯＨ液を使ってナイロン膜
（カリフォルニア州のコスタメサのＩＣＮ Ｂｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌｓまたはカリフォルニア州のリッチモンドの
ＢｉｏＲａｄ）上に移し、８０゜Ｃで１時間の焼成また
は紫外線照射によって膜上に固定した。ドットブロット
法の場合には、二重ストランド化された増幅された標的
ＤＮＡ配列を、０. １容量の３Ｍ ＮａＯＨと０. １Ｍ
Ｎａ2 ＥＤＴＡを含む変成液を加えることによって変
成させ、６０゜Ｃで１５分ー１時間インキュベートし、
１容量の冷２Ｍ酢酸アンモニウムで中和した後に、Ｂｉ
ｏＲａｄのドットブロットマニフォールドを使って４ー
５ｐｓｉの真空圧で試料をＺｅｔａプローブナイロン膜
（カリフォルニア州のリッチモンドのＢｉｏＲａｄ）上
にスポットした。 【００４９】５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１０ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ７. ０）と０.１８ｍ ＮａＣｌと
１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ）と０.５％ＳＤＳと５％デンハ
ーツ液と１ｍｌ当たり１００μｇのフェノール抽出され
た変成させられたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）または１ｍ
ｌ当たり５０μｇのＸ型パン酵母ｔＲＮＡ（シグマ）を
含有するハイブリッド形成液を使って、ＩＣＮナイロン
膜上に固定されている増幅されたＤＮＡをハイブリッド
形成させた。ハイブリッド形成処理は５５ー６０゜Ｃで
３ー１６時間行った。ブロットを、おだやかに撹拌しな
がら、室温の２×ＳＳＰＥ，０. ５％ＳＤＳ中で二回各
１０分間と５５゜Ｃの ０. １×ＳＳＰＥ，０. １％Ｓ
ＤＳ中で一回３ー５分間洗浄した。32Ｐ標識されたＤＮ
Ａを検出するために、ブロットをサランラップ（ペンシ
ルベニア州のピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ）で覆って、Ｘ線フィルム（ニューヨーク
州のロチェス ターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃ
ｏ．のコダックＸ−ＡＲフィルム）をそれらの上に置い
た。フィルムイクスポージャーはー７０゜Ｃで１ー４８
時間であった。 【００５０】増幅されたｌａｃＺの検出のために５０ｍ
ｅｒ遺伝子プローブＬＺ−１（５’ーＴＧＡＣＧＴＣＴ
ＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＡ
ＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴ）を使い、増幅さ
れたｌａｍＢの検出のために５０ｍｅｒ遺伝子プローブ
ＬＢ−１（５’ーＴＧＣＧＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴ
ＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧ
ＧＣＴＧＧＴＴＧ）を使った。いずれの遺伝子プローブ
も、増幅された標的ＤＮＡ配列のそれぞれの領域内に位
置する標的配列とバイブリッド形成する。３０μｌ反応
液が５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、５ｍＭＤＴＴ（ミズーリ州のセントルイス
のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、１ｍＭ ＫＣｌ、
１ー１０μＧオリゴヌクレオチド遺伝子プローブ、１２
０ｐモル［32Ｐ］ＡＴＰ（比活性＞３０００Ｃｉ／ｍモ
ル）（マサチューセッツ州のボストンのＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ．）、１ｍＭスペ
ルミジン（二ナトリウム塩）および２０単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）を含有していたことを特徴とする方法によって、遺
伝子プローブの５’ー端を［32Ｐ］ＡＴＰ（＞３０００
Ｃｉ／ｍモル）で放射標識した。反応混合物を３７゜Ｃ
で１時間インキュベートし、セファデックスＧ−５０カ
ラムとＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.
６）, １ｍＭＮａ2 ＥＤＴＡ）を使って放射標識された
プローブを精製した。 【００５１】腸内細菌検出の特異性 ｌａｃＺ、ｌａｍＢ、ＵｉｄＡおよびＵｉｄＣ領域のＰ
ＣＲ増幅による腸内細菌検出の特異性を説明するため
に、下記の細菌株を使って検査を実施した：大腸菌ＡＴ
ＣＣ１１７７５、大腸菌ＡＴＣＣ１０７９８、大腸菌Ａ
ＴＣＣ１５２２４、大腸菌ＡＴＣＣ２５４０４、大腸菌
（ｌａｍＢ- ）ＡＴＣＣ２３５５６、大腸菌（ｌａｍＢ
- ）ＡＴＣＣ２３７３７、大腸菌（ｌａｍＢ- ）ＡＴＣ
Ｃ２３７３９、大腸菌（ｌａｍＢ- ）ＡＴＣＣ１２４３
５、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＡＴ
ＣＣ １３０４７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ １９５８５、Ｃｉｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｆｕｅｎｄｉｉＡＴＣＣ ３３１２８、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ＡＴＣＣ１３
８８３、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉ ＡＴ
ＣＣ １２０２２、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
ＡＴＣＣ ２５９３１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ ｍｔ−２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓＡＴＣＣ １９４３５、およびＥｎｔｅｒｏ
ｔｕｂｅｓ（ロッシェ）を使って大腸菌だと同定されｍ
−Ｅｎｄｏ計数プレートから得られた３２の環境から分
離されたもの。大腸菌株を含むすべての腸内細菌を３５
゜Ｃで２×ＹＴ液状ブイヨン（１リットル当たり１０ｇ
のＢａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅと１０ｇの酵母抽出物
と５ｇのＮａＣｌ）とＴＹＥ寒天培地（２×ＹＴ＋ １
４ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天）中で培養し、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａを Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
単離寒天培地上で３０゜Ｃで培養し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓをリトマスミルク寒天培地（Ｄ
ｉｆｃｏ）上で３７゜Ｃで培養した。これらの細菌の培
養物からＤＮＡを１２ー１６時間抽出して、回収された
ＤＮＡの５０ｎｇ−１μｇをＰＣＲ方法実施時に様々な
アニーリング温度を使って先に述べられているＰＣＲ増
幅にかけた。増幅されたＤＮＡ配列を前記のサザン法と
ドットブロット法によって検出するために遺伝子プロー
ブを使った。放射標識されたプローブの比活性は６８０
００ー１６７０００ＤＰＭ／μｇＤＮＡであった。 【００５２】腸内細菌検出の感度 大腸菌のＰＣＲ増幅ー遺伝子プローブ検出の感度を説明
するために、大腸菌からのゲノムＤＮＡ（ミズーリ州の
セントルイスのシグマ）１μｇを連続希釈して１ａｇ−
１μｇの濃度範囲を確立した。大腸菌ＤＮＡが０ｇの対
照も含めた。試料を、その後に、ｌａｍＢの場合のプラ
イマーＢＬ４９１０とＢＲ５２１９またはｌａｃＺの場
合のプライマーＺＬ１６７５とＺＲ２５４８を使ったＰ
ＣＲ増幅にかけ、増幅されたＤＮＡを遺伝子プローブＬ
Ｂ−１とＬＺ−１を使ったドットブロット法によって分
析した。ハイブリッド形成反応のバックグラウンドシグ
ナルを決定するために負の対照として、１ミクログラム
のＰ． ｐｕｔｉｄａゲノムＤＮＡと１μｇのサケ精子
ＤＮＡもまた同じプライマーとＰＣＲ条件を使ったＰＣ
Ｒにかけた。ドットブロット分析のために、増幅された
試料の各々の１０分の１（１０μｌ）を使用した。 【００５３】更に、腸内細菌検出のためのｌａｍＢのＰ
ＣＲ増幅の感度を決定するために、２×ＹＴブイヨン中
で３７゜Ｃで一晩（１６時間）培養された大腸菌ＡＴＣ
Ｃ１１７７５の培養物を０. １Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７.
２）で連続希釈した液を使用した。脱塩素化のために
０. １％チオ硫酸ナトリウムで処理されたオートクレー
ブで殺菌された水道水を１００ｍｌ使って希釈を行っ
た。連続希釈液からの大腸菌細胞に加えて、非標的バッ
クグラウンド個体群として扱うためと試料からの細菌細
胞の採取を容易にするために、各希釈ブランクに約１×
１０9 個のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ細胞
を加えた。Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＳ−５遠心分離器中で１
２０００×ｇで１０分間遠心分離することによって細菌
細胞を採取し、ペレットを、小容量の無菌脱塩素化水道
水中に再懸濁させ、１. ５ｍｌ容のマイクロフュージ試
験管に移し、１２０００×ｇで５分間の遠心分離によっ
て再沈澱させた。細胞をＰＣＲ緩衝液中に懸濁させて、
ｌａｍＢについて上記に述べた通りにＰＣＲ増幅と遺伝
子プローブ検出を行った。各希釈液中の生大腸菌細胞の
数を測定するために、連続希釈液の一定容部分づつをｍ
−Ｅｎｄｏ寒天培地上にプレートした。３７゜Ｃでの２
４時間のインキュベーションの後に、典型的な腸内細菌
の外見を呈するコロニーを数えることによって、標的大
腸菌細胞のコロニー形成単位を測定した。アクリジンオ
レンジ直接計数方法を使って、直接的計数を行った。 【００５４】検査結果 ｌａｃＺのＰＣＲ増幅による腸内細菌検出の特異性 プライマーＺＬ−１６７５とＺＬ−２５４８および４０
゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使ったＰＣＲ増幅
は、腸内細菌と非腸内細菌の両方の標的ＤＮＡ配列につ
いてＤＮＡ配列の正の増幅を引き起こした。Ｃｉｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒのＤＮＡを鋳型として用いた場合には増幅
されたＤＮＡは大腸菌ＤＮＡが鋳型として用いられた場
合よりも大きかったが、この事は、これらの生物間での
標的ｌａｃＺ間の違いを示す。大腸菌と検査された他の
細菌種の間でプライマーアニーリング温度を上げること
に対する反応が異なることによってもまた、この違いは
示される。ＰＣＲの厳格さを増すためにプライマーアニ
ーリング温度を５０゜Ｃに上げると、例えばＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ等のすべての非腸内細菌の増幅が除
かれたが、例えばＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏ
ｇｅｎｅｓやＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ等のいくつかの腸
内細菌の増幅もまた除かれた。５０゜Ｃのプライマーア
ニーリング使用すると、大腸菌とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｃｌｏａｃａｅおよび程度はより小さいがＫｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでｌａｃＺ増幅
が起こった。サザン法は、４０゜Ｃの厳格でないプライ
マーアニーリング温度が用いられた場合にでさえ、大腸
菌とＥｎｔ． ｃｌｏａｃａｅとＫ． ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅでのみの標的ｌａｃＺの増幅を示すＬＺ−１遺伝
子プローブでのハイブリッド形成を示した。６０゜Ｃと
７０゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使っても、大
腸菌とＥｎｔ． ｃｌｏａｃａｅのｌａｃＺの増幅とハ
イブリッド形成が起こった。３２の環境から分離された
ものを含む検査された大腸菌の全株が、正のＤＮＡ増幅
と、８７５ｂｐについて予言された位置でのｌａｃＺ用
遺伝子プローブでのハイブリッド形成を示した。Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａのＤＮＡもまた増幅されて検出された。 【００５５】プライマーＺＬ−１６７５とＺＬ−２５４
８での増幅は生菌数測定法による全腸内細菌計数に等し
い「全腸内細菌」検出の基盤とはならなかったので、プ
ライマーＺＬ−１６７５とＺＲ−２０２５および５０゜
Ｃのプライマーアニーリング温度を使って、アミノ末端
により近くて活性部位であるｌａｃＺのもっと短い領域
を増幅した。これらのプライマーを使って増幅された領
域は、「全腸内細菌」のＰＣＲと遺伝子プローブ検出の
基盤を提供するに十分なだけ保護されていた。しかしな
がら、増幅されたＤＮＡの大きさに関しては検査された
様々な腸内細菌種間で幾分の変動が有ったのであり、こ
の事は、遺伝子配列の異種性を示す。ｌａｃＺ増幅の使
用はＳｈｉｇｅｌｌａの検出を許したがＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａの検出は許さなかったので、この方法では直接検
出されない腸内病原体も有るであろう。Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａと同様に、非腸内細菌は増幅も検出もされなかっ
た。 ｌａｍＢのＰＣＲ増幅による腸内細菌検出の特異性 ｌａｃＺのＰＣＲ増幅と同様に、ｌａｍＢのＰＣＲ増幅
は、プライマーアニーリング温度が５０゜Ｃ以下であっ
た場合に、非腸内細菌ＤＮＡの増幅を含む余分の非特異
的ＤＮＡ増幅を引き起こした。しかしながら、プライマ
ーＢＬ−４８９９とＢＲ−５４５２および６０゜Ｃのプ
ライマーアニーリング温度を使用すると正のＤＮＡ増幅
を示す細菌の範囲が限られ、検査されたすべてのｌａｍ
Ｂ- 株を含む大腸菌とＳ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍと
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．のみが６０゜Ｃのプライマ
ーアニーリング温度が使われた時にｌａｍＢの増幅を示
し遺伝子プローブＬＢ−１でのハイブリッド形成によっ
て検出された。プライマーアニーリング温度を更に７０
゜Ｃまで上げると、Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増
幅が除かれたが、大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．
の増幅を依然として許した。 【００５６】第二組目のプライマーＢＬ−４９１０とＢ
Ｒ−５２１９および５０゜Ｃのプライマーアニーリング
温度を使った場合には、検査されたすべてのｌａｍＢ-
種を含む大腸菌とＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとＳｈｉ
ｇｅｌｌａ ｓｐｐ．のみが、遺伝子プローブＬＢ−１
でハイブリッド形成した標的３０９ｂｐ領域の増幅を示
した。６０゜Ｃのプライマーアニーリング温度が使用さ
れた場合にＳ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤＮＡはこ
れらのプライマーで増幅しなかったのに対して、環境か
らの３２分離物を含む大腸菌と Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓ
ｐｐ．は依然として標的ＤＮＡの増幅を示した。このよ
うに、ＰＣＲ増幅時にｌａｍＢ用のこれらのプライマー
と６０゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使用するこ
とは大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａの検出を許し、５０゜Ｃ
というもっと低いプライマーアニーリング温度を使用す
ることはこれらの腸内細菌に加えてＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａの検出を許した。非特異的増幅を最小限にするために
はプライマーアニーリング温度はＴｍに近いべきである
事を、これらの結果は示す。大腸菌に加えてＳａｌｍｏ
ｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅｌｌａがｌａｍＢ遺伝子の少な
くとも一部を有するかもしれない事もまたこれらの結果
は示唆する。従って、ここに証明されたように、ｌａｍ
ＢのＰＣＲ増幅は、糞便汚染の指示細菌種である大腸菌
並びに水系疾患発生を引き起こす主な腸内細菌病原体で
あるＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅｌｌａを調査す
る方法を提供する。従って、水のヒト糞便汚染と結び付
けて考えられる細菌である指示微生物と病原体の両方
が、ＰＣＲ増幅とｌａｍＢ用遺伝子プローブで検出可能
である。 【００５７】ＵｉｄＡとＵｉｄＣのＰＣＲ増幅による腸
内細菌検出の特異性 ５０゜Ｃのプライマーアニーリング温度を使って、Ｕｉ
ｄＡ用プライマーとＵｉｄＣ用プライマーを使っての増
幅が達成された。 【００５８】プライマー対ＵｉｄＡ．７４５Ｌ−１とＵ
ｉｄＡ．８７９Ｒ−１を使っての増幅が、１４７ｂｐ生
成物を形成した。この生成物は、放射標識された遺伝子
プローブＵｉｄＡ−１を使って検出された。ｌａｍＢと
ｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸菌（検
査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉとＳ
ｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉのみがドットブロ
ット法分析とサザン法分析によって検出された正のシグ
ナルを生じた。プライマー対ＵｉｄＡ．１９３９Ｌ−１
とＵｉｄＡ．２０８５Ｒ−１を使っての増幅が、１６６
ｂｐ生成物を形成した。この生成物は、放射標識された
遺伝子プローブＵｉｄＡ−２を使って検出された。ｌａ
ｍＢとｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸
菌（検査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅ
ｉとＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｉｎｅｒｉのみがドッ
トブロット法分析とサザン法分析によって検出された正
のシグナルを生じた。 【００５９】プライマー対ＵｉｄＡ．７４５Ｌ−１とＵ
ｉｄＡ．２０８５Ｒ−１を使っての増幅が、１３５０ｂ
ｐ生成物を形成した。この生成物は、放射標識された遺
伝子プローブＵｉｄＡ−２を使って検出された。ｌａｍ
ＢとｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸菌
（検査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ
のみがドットブロット法分析とサザン法分析によって検
出された正のシグナルを生じた。 【００６０】プライマー対ＵｉｄＣ．３０１Ｌ−１とＵ
ｉｄＣ．４３２Ｒ−１を使っての増幅が、１５３ｂｐ生
成物を形成した。この生成物は、放射標識された遺伝子
プローブＵｉｄＣ−１を使って検出された。ｌａｍＢと
ｌａｃＺの場合と同じ株が検査された時に、大腸菌（検
査された全株）とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉのみ
がドットブロット法分析とサザン法分析によって検出さ
れた正のシグナルを生じた。 【００６１】ｌａｃＺとｌａｍＢのＰＣＲ増幅による腸
内細菌検出の感度 調査の目的のために有用な標的腸内細菌に対する適切な
選択性に加えて、ＰＣＲー遺伝子プローブ法は、供給さ
れる飲用水の安全性を確実にするための十分な感度を提
供しなければならない。生菌培養法と同じぐらい申し分
ない１００ｍｌ当たり１個細胞の標的感度が望ましい。
検出感度はＰＣＲ条件によって左右されることがわかっ
た。すでに論じられたように標的細胞に対するＤＮＡ増
幅の選択性を高めるプライマーアニーリング温度上昇
は、検出感度を低めた。従って、７０゜Ｃのプライマー
アニーリング温度を使うことは、１００ｆｇより多いゲ
ノム大腸菌ＤＮＡ、即ち約１ａｇの標的ＤＮＡが存在し
た場合にはｌａｃＺの増幅と検出を許したが、もっと少
量のＤＮＡの場合にはｌａｃＺの増幅と検出を許さなか
った。これとは対照的に、４０゜Ｃのプライマーアニー
リング温度が使われた場合にはｌａｃＺのＰＣＲ増幅に
よって１ー１０ｆｇという少量の大腸菌ＤＮＡを検出す
ることができたのであり、ｌａｍＢ増幅を使って同じ検
出限界が確認された。１０ｆｇのゲノムＤＮＡの検出は
信頼できた。１ｆｇのゲノムＤＮＡでは、試料の約２２
％が、その濃度のゲノムＤＮＡでの標的遺伝子の予想さ
れるポアソン分布に厳密に相当する正のシグナルを生じ
た。１ｆｇ以下の大腸菌ＤＮＡ濃度は、正の増幅と遺伝
子プローブでのハイブリッド形成による正の検出を示さ
なかった。32Ｐ標識遺伝子プローブとカップリングさせ
られたｌａｃＺとｌａｍＢの増幅によって達成される検
出感度は、１ー１０ａｇの標的遺伝子、即ち単一ゲノム
コピー、単個細胞検出に相当する。 【００６２】遠心分離によって回収された細胞を使った
直接溶菌法もまた、ＰＣＲ増幅と遺伝子プ ローブ分析
による大腸菌の感度のよい検出を示した。１００ｍｌの
水当たり１ー５個というわずかの生細胞が検出された。
同様に、試料中のわずか１個の生細胞がｌａｍＢの増幅
を使って検出された。 【００６３】ＰＣＲと遺伝子プローブの使用は、水のヒ
ト糞便汚染の指示微生物としての腸内細菌を調査する方
法の基盤として必要な特異性と感度の両方を提供するこ
とが証明された。プライマーＺＬ−１６７５とＺＲ−２
０２５および５０゜Ｃのアニーリング温度を使ったｌａ
ｃＺのＰＣＲ増幅はほとんどの腸内細菌の検出を許し、
プライマーＢＬ−４９１０とＢＲ−５２１９および６０
゜Ｃのアニーリング温度を使ったｌａｍＢのＰＣＲ増幅
は低濃度の腸内指示生物、即ち大腸菌、および重要な腸
病原性病原体、即ちＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅ
ｌｌａ、の特異的な検出を可能にする。ｌａｃＺのＰＣ
Ｒ増幅もまた、水の細菌学的安全性を評価する迅速で信
頼のおける方法を可能にし、従来の生菌培養法にとって
代わる効果的な方法を提供する。標的とされるＤＮＡの
ＰＣＲ増幅もまた、指示生物の間接的検出に頼るという
よりもむしろ環境試料中の病原体を直接検出するための
十分な感度と特異性を可能にする。 【００６４】Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種 Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの増殖とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａＤ
ＮＡの回収 本研究で使用された細菌株を下記の表１に示す。更に、
新鮮な環境からの七つのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａ分離物が含まれた。これらの環境株
は、冷却塔から分離されたもので、システインを含まな
い培地上での増殖欠如等の表現型特徴およびＬ． ｐｎ
ｅｕｍｏｐｈｉｌａに特異的な単クローン性抗体試薬
（シアトルのＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）との正
の反応性等の血清学的反応に基づいて同定された。 【００６５】 表 １ 細菌株 属 種 亜種 株 血清群 源 1. Legionella pneumophila (Knovxille-1) 1 CDC 2. L. pneumophila (Togus-1) 2 CDC 3. L. pneumophila (Bloomington-2) 3 CDC 4. L. pneumophila (Los Angeles-1) 4 CDC 5. L. pneumophila fraseri (Los Angeles-1) 4 ATCC 33156 6. L. pneumophila (Dallas-1E) 5 CDC 7. L. pneumophila fraseri (Dallas-1E) 5 ATCC 33823 8. L. pneumophila (Chicago-2) 6 CDC 9. L. pneumophila (Chicago-8) 7 ATCC 33823 10. L. pneumophila pneumophila (Concord-3) 8 ATCC 35096 11. L. pneumophila pneumophila (IN-23-G1-CS) 9 ATCC 35289 12. L. pneumophila pneumophila (Leiden) 10 ATCC 43283 13. L. pneumophila pneumophila (797-PA-H) 11 ATCC 43130 14. L. pneumophila pneumophila (570-PA-H) 12 ATCC 43290 15. L. pneumophila pneumophila (82A3105) 13 ATCC 43736 16. L. pneumophila pneumophila (1169-MN-H) 14 ATCC 43703 17. L. pneumophila fraseri Lansing 3 ATCC 35251 18. L. pneumophila pascullei (V8W) 5 ATCC 33737 19. L. bozmanii CDC 20. L. erythra SF33P U of L 21. L. feelei CDC 22. L. longbeachae 1 CDC 23. L. longbeachae Tucker 1 2 ATCC 33484 24. L. jordanis CDC 25. L. dumoffii CDC 26. L. micdadei CDC 27. L. gormanii CDC 28. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 29. P. fluorescens CDC 93 CDC 30. P. fluorescens EB CDC 31. P. maltophilia CDC 32. P. alcaligenes ABB 50 CDC 33. Flavobacterium CDC 65 CDC 34. Salmonella typhimurium ATCC 19585 35. Shigella flexineri ATCC 12022 36. Escherichia coli ATCC 12435 【００６６】１リットル当たり１０ｇの酵母抽出物（デ
トロイトのＤｉｆｃｏ）と１０ｇのＡＣＥＳ（Ｎ−［２
−アセトアミド］ー２ーアミノエタンースルホン酸）と
から成り、ＫＯＨでｐＨ７. ０に調整され、加熱滅菌後
にＬ−システインと可溶性ピロリン酸鉄（セントルイス
のシグマ）の各々０. ２５ｇを補充された液体培地中で
すべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株とＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ株とＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を培養した。
２×ＹＴ液体ブイヨン（１リットル当たり１０ｇのＢａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅと１０ｇの酵母抽出物と５ｇ
のＮａＣｌ）とＴＹＥ寒天培地（２×ＹＴ＋１４ｇ／ｌ
バクト寒天）中で３５゜Ｃで腸内細菌を培養した。１２
０ｒｐｍで絶えず撹拌しながら３７゜Ｃで一晩培養した
後に、染色体ＤＮＡを単離した。ＳＤＳ処理でのアルカ
リ溶菌によって、１. ５ｍｌの一晩培養試料中の細菌細
胞からＤＮＡを放出させた。タンパク質と炭水化物を除
去するためにプロテイナーゼＫとＣＴＡＢ：ＮａＣｌを
使用し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：
１）抽出とその後にフェノール：クロロホルム：イソア
ミルアルコール（２４：２４：２）抽出を使ってＤＮＡ
を更に精製した。その後に、ＤＮＡを、イソプロパノー
ルを使って沈澱させ、１２０００×ｇで１５分間の遠心
分離によってペレット化させた。ＤＮＡペレットを、冷
７０％アルコールで一回洗浄し、真空下で乾燥させた。
同様に、すべての環境分離物からの全ゲノムＤＮＡを、
上述のＤＮＡ抽出処理の後に単離した。この方法を使っ
て、各細菌培養物から１００ー１５０μｇの精製ゲノム
ＤＮＡが回収された。 【００６７】標的とされるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ配列の
ＰＣＲ増幅 ＤＮＡサーマルサイクラーとＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｃｏｒｐ．）を使ってＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ液は
１×ＰＣＲ増幅緩衝液（１０×緩衝液は５０ｍＭ ＫＣ
ｌと１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８. １３）と１５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 と０. １％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含有す
る）、各々２００μＭのｄＮＴＰ、各々０.５μＭのプ
ライマー、１ｆｇ−１μｇの鋳型ＤＮＡ、２.５単位の
Ａｍｐｌｉｔａｑ、および０. １％ジエチルピロカルボ
ネート（ＤＥＰＣ）を含有していた。いくつかの検査で
は、ＰＣＲ反応での全マグネシウムイオンの濃度を０.
８ｍＭ−４ｍＭ全Ｍｇ++の範囲にわたって変化させた
が、ＰＣＲ混合物中の他の成分はメーカーの標準である
１０×ＰＣＲ反応緩衝液の濃度に維持した。鋳型ＤＮＡ
を最初に９４゜Ｃで１ー３分間変成させた。その後、合
計２５ー３０のＰＣＲサイクルを行った。ＰＣＲサイク
ルでは、９４゜Ｃで１分間ＤＮＡを変成させ、５０゜Ｃ
で１分間プライマーをアニーリングして延長させた。い
くつかの検査では、６０゜Ｃと７０゜Ｃのプライマーア
ニーリング温度もまた使用した。オリゴヌクレオチドプ
ライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの
モデルＤＮＡシンセサイザーを使って合成し、小試料に
ついてはオリゴヌクレオチド精製カートリッジ（カリフ
ォルニア州のフォスター市のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）を使ってまた大試料についてはＣ−８
３ミクロン逆相カラム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で
の逆相高速液体クロマトグラフィーを使って精製した。 【００６８】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，１３３５（１９８７年）にＭａｃＤｏｎｅｌｌ
とＣｏｌｗｅｌｌによって報告された配列に基づいて、
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの５Ｓ ｒＲＮＡ暗号づけ遺伝子
の１０４ｂｐ領域を、２０ｍｅｒプライマーＬ５ＳＬ９
（５’−ＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡ−
３’）とＬ５ＳＲ９３（５’−ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡ
ＣＴＴＴＣＧＣＡＴ−３’）を使って増幅した。プライ
マーＬ５ＳＬ９を５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の９ｂｐと２８
ｂｐの間に位置させ、プライマーＬ５ＳＲ９３を９３ｂ
ｐと１１２ｂｐの間に位置させた。Ｉｓｒａｅｌ Ｊ．
Ｍｅｄ． Ｓｃｉ．２２：７０３−７０５（１９８６
年）にＥｎｇｌｅｂｅｒｇ等によって報告された配列に
基づいて、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａのマクロファ
ージ感染性増強（ｍｉｐ）遺伝子の暗号づけ領域の６５
０ｂｐ配列を、二つの２１ｍｅｒプライマーを使って増
幅した。プライマーＬｍｉｐＬ９２０（５’ーＧＣＴＡ
ＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＧ−３’）をｍｉｐ
遺伝子の９２０ｂｐと９４０ｂｐの間に位置させ、プラ
イマーＬｍｉｐＲ１５４８（５’ーＧＴＴＴＴＧＴＡＴ
ＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡ−３’）を１５４８ｂｐと１
５６９ｂｐの間に位置させた。 増幅された標的とされるＤＮＡ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
配列の検出 【００６９】ゲル電気泳動と放射標識遺伝子プローブを
使って、ＰＣＲ増幅されたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＤＮ
Ａ配列を検出した。０. ８ー１％水平アガロースゲルま
たは５％垂直ポリアクリルアミドゲルを使って、増幅さ
れた標的とされるＤＮＡ配列を分離した。アガロースゲ
ル電気泳動はＴＡＥ緩衝液（０. ０４Ｍトリスアセテー
トと０. ００１Ｍ ＥＤＴＡ, ｐＨ ８. ０）中で行っ
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＴＢＥ緩衝液
（０. ０８９Ｍトリスボレートと０.０８９Ｍほう酸と
０.００２Ｍ ＥＤＴＡ,ｐＨ８.０）中で５.７ー９. ０
Ｖ／ｃｍで２ー４時間行った。ゲルを、２×１０-4％臭
化エチジウム液中で染色してからＰｈｏｔｏ／Ｐｒｅｐ
Ｉ紫外線トランスイルミネーター（ウィスコンシン州の
ニューベルリンのＦｏｔｏｄｙｎｅ Ｉｎｃ．）を使っ
て可視化した。 【００７０】サザン法の場合には、ＤＮＡを、０. ４Ｍ
ＮａＯＨ変成液を使ってナイロン膜（カリフォルニア
州のコスタメサのＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓまた
はカリフォルニア州のリッチモンドのＢｉｏＲａｄ）上
に移し、８０゜Ｃで１時間の焼成または紫外線照射によ
って膜上に固定した。ドットブロット法の場合には、二
重ストランド化された増幅されたＤＮＡを０. １容量の
３Ｍ ＮａＯＨと０.１Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウムを含
有する変成液を加えることによって変成させ、６０゜Ｃ
で１５分間インキュベートし、１容量の冷２Ｍ酢酸アン
モニウムで中和した後に、試料をＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｅｌｌスロットブロットマニフォ
ールドを使って４ー５ｐｓｉの真空圧でＺｅｔａプロー
ブナイロン膜（カリフォルニア州のリッチモンドのＢｉ
ｏＲａｄ）上にスポットした。 【００７１】５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは１０ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ７. ０）と０.１８Ｍ ＮａＣｌと
１ｍＭ ＥＤＴＡ）、０. ５％ＳＤＳ、５％デンハーツ
液および１００μｇ／ｍｌのフェノールで抽出された変
成させられたサケ精子ＤＮＡ（シグマ）または５０μｇ
ｍｌのＸ型パン酵母ｔＲＮＡ（シグマ）を含有する溶液
で、ＩＣＮナイロン膜上に固定された増幅されたＤＮＡ
をハイブリッド形成させた。Ｚｅｔａプローブ膜上に固
定されたＤＮＡについては、ハイブリッド形成のために
０. ５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７. ２）と１ｍＭ Ｎ
ａ2 ＥＤＴＡと７％ＳＤＳ液を使用した。いずれの種の
膜の場合にも、ハイブリッド形成は５５ー６０゜Ｃで１
５ー２０分間であった。ハイブリッド形成緩衝液を除去
した後に、膜を、２００ー３００ｎｇの変成させられた
放射標識遺伝子プローブを含有する新鮮なハイブリッド
形成液を使ってハイブリッド形成させ、おだやかに撹拌
しながら ５５ー６０゜Ｃで３ー１６時間インキュベー
トした。おだやかに撹拌しながら、室温の２×ＳＳＰＥ
と０. ５％ＳＤＳ中で１０分間ずつ二回と５５ー６０゜
Ｃの０. １×ＳＳＰＥと０. １％ＳＤＳ中で３ー５分間
一回、ブロットを洗浄した。32Ｐ標識ＤＮＡを検出する
ために、ブロットをサランラップ（ペンシルベニア州の
ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）で覆い、Ｘ線フィルム（ニューヨーク州のロチェス
ターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．のＫｏｄａ
ｋ Ｘ−ＡＲフィルム）をそれらの上に置いた。すべて
のフィルムのイクスポージャーをー７０゜Ｃで１ー４８
時間行った。 【００７２】使用される３０μｌ反応液が５０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７. ５）と１０ｍＭＭｇＣｌ2 と５Ｍｍ
ＤＴＴ（ミズーリ州のセントルイスのＳｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）と１ｍＭ ＫＣｌと１０μｇオリゴヌ
クレオチド遺伝子プローブと１２０ｐモル ［32Ｐ］Ａ
ＴＰ（比活性＞３０００Ｃｉ／ｍモル）と１ｍＭスペル
ミジン（二ナトリウム塩）と２０単位のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を
含有したことを特徴とする方法で、遺伝子プローブの
５’ー端を［32Ｐ］ＡＴＰ （＞３０００Ｃｉ／ｍモ
ル）（マサチューセッツ州のボストンのＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ．）で放射標識し
た。反応混合物を３７゜Ｃで１時間インキュベートし、
セファデックスＧ−５０カラムとＴＥ緩衝液［１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ７. ６）と１ｍＭＥＤＴＡ（二ナト
リウム塩）］を使ってかまたはセントリコン１０カラム
（マサチューセッツ州のＤａｎｖｅｒｓのＡｍｉｃｏｎ
Ｃｏｒｐ．）を使って放射標識されたプローブを精製
した。 【００７３】増幅された５Ｓ ＲＮＡ暗号づけ遺伝子の
検出のために、５０ｍｅｒ遺伝子プローブＬ５Ｓ−１
（５’−ＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＴ
ＴＴＣＣＧＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣ
ＴＴＣ）を使った。 【００７４】増幅されたｍｉｐ遺伝子の検出のために、
５０ｍｅｒ遺伝子プローブＬｍｉｐ−１（５’−ＴＴＴ
ＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡ）を使
った。 【００７５】ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａとＬ． ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａの検出の特異性 ＰＣＲ増幅ー遺伝子プローブ法による全Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ検出の特異性を説明するために、表１に記載する
株の各々からの５０ｎｇのＤＮＡを単独、および増幅と
検出の特異性を更に詳しく調べるためと非標的ＤＮＡが
このＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ検出法を妨害するかどうかを
決定するために既知のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種からの５
０ｎｇのＤＮＡと組み合わせて検査した。 【００７６】同様に、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの
特異的検出のために、これらの細菌株の各々からの５０
ｎｇのＤＮＡを、プライマーＬｍｉｐＬ９２０とＬｍｉ
ｐＲ１５４８を使ったＰＣＲ増幅にかけた。更に、増幅
と検出の特異性を更に詳しく調べるためと非標的ＤＮＡ
がこのＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ検出法を妨害する
かどうかを決定するために、表１に記載するＬｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａの非Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種のすべて
からのＤＮＡの混合物５０ｎｇを単独および既知株の
Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａからのＤＮＡの混合物５
０ｎｇと組み合わせて検査した。 【００７７】ＤＮＡ増幅を観察するためにアガロースゲ
ル電気泳動を使った。標的遺伝子配列の増幅を確認する
ために、放射標識遺伝子プローブとサザン法分析を使っ
た。 【００７８】Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ検出の感度 Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａのＰＣＲ増幅ー遺伝子プ
ローブ検出の感度を説明するために、Ｌ． ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａからのゲノムＤＮＡ１μｇを連続希釈して
１ａｇ （１０-18 ｇ）−１μｇのゲノムＤＮＡ（約１
０-4ａｇ−１０2 ｐｇの標的ＤＮＡ）の濃度範囲を確立
した。ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＤＮＡを含まない負の対
照も含めた。その後に、試料を、プライマーＬｍｉｐＬ
９２０とＬｍｉｐＲ１５４８を使ったＰＣＲ増幅にかけ
て、遺伝子プローブＬｍｉｐ−１を使ったスロットブロ
ット法によって分析した。ハイブリッド形成反応のバッ
クグラウンドシグナルを決定するために、負の対照とし
て、１ミクログラムの大腸菌ゲノムＤＮＡと１μｇのサ
ケ精子ＤＮＡもまた同じプライマーとＰＣＲ条件を使っ
たＰＣＲ増幅にかけた。増幅された試料の各々の１０分
の１（１０μｌ）をスロットブロット分析のために使っ
た。 【００７９】検査結果 ５Ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅によるＬｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ検出の特異性 プライマーＬ５ＳＬ９とＬ５ＳＲ９３および５０゜Ｃの
プライマーアニーリング温度を使ったＰＣＲ増幅は、環
境からの七つのＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ分離物を含
む検査されたすべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種につい
て、正の増幅ＤＮＡバンドを生じた。Ｐ． ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ ＥＢとＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ
ＤＣ ９３とＰ． ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａについて
は、かすかなバンドもまた観察された。非特異的増幅を
除くためにプライマーアニーリング温度を６０゜Ｃに上
げた時にも、同じパターンが見られた。直接蛍光抗体
（ＤＦＡ）で染色される場合には、これらのＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ株はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに対する抗体と
交差反応をするが、この事は、それらが何らかの形でＬ
ｅｇｉｏｎｅｌｌａと関連している事を示唆する。しか
しながら、Ｌ５Ｓ−１プローブでのサザン法は、Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌｌａの増幅ＤＮＡとのみのハイブリッド形成
を示したのであり、これは、増幅された標的５Ｓ ＲＮ
Ａ配列の特異的検出を証明する。他のどの非Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａ増幅試料の場合にもバンドが観察されなかっ
たしハイブリッド形成が起こらなかったのであり、この
事は、プライマーＬ５ＳＬ９とＬ５ＳＲ９３を遺伝子プ
ローブＬ５Ｓ−１と一緒に用いることはＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ種に特異的な検出システムの基盤を提供する事を
示す。 【００８０】更に、ＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのＤＮＡも加
えられない限りは非Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種からのＤＮ
Ａの混合物を使ってＤＮＡ増幅は認められなかったので
あり、この事は、５ＳｒＲＮＡ暗号づけセグメントの増
幅はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種に特異的であった事と、非
標的ＤＮＡは標的遺伝子セグメントの検出を妨げない事
を示す。 【００８１】すべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ株が、ＰＣ
Ｒ反応でのＭｇＣｌ2 の最終濃度１. ５Ｍ−４ｍＭで標
的遺伝子配列の増幅を示した。典型的には、１. ５ｍＭ
のＭｇＣｌ2 （最終濃度）で最適な増幅が起こった。 ｍｉｐのＰＣＲ増幅によるＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌ
ａ検出の特異性 【００８２】プライマーＬｍｉｐＬ９２０とＬｍｉｐＲ
１５４８および５０゜Ｃｎｏプライマーアニーリング温
度を使ったＰＣＲ増幅は、検査されたすべてのＬ． ｐ
ｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ株について正の増幅ＤＮＡバンド
を生じた。非Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種、即ち検
査された他のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種と他の属は、ｍｉ
ｐ用プライマーを使ってのＤＮＡ増幅を示さなかった。
ｍｉｐ−１遺伝子プローブを使ってのサザン法ハイブリ
ッド形成は、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに特異的な
標的ｍｉｐ配列の増幅を示した。更に、混合物にＬ．
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａからのＤＮＡが添加されない限
りは、非Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ株からのＤＮＡ
の混合物を使ってｍｉｐ遺伝子のＤＮＡ増幅は検出され
なかった。 【００８３】Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｋｎｏｘ
ｖｉｌｌｅ−１（血清群１）とＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ−１（血清群４）の二株
は、それぞれ１.０ｍＭと１. ０ｍＭという他のＬｅｇ
ｉｏｎｅｌｌａ種より低い最終ＭｇＣｌ2 濃度で増幅を
示した。同じこれらの二株は、それぞれ３. ５ｍＭと
２. ５ｍＭのＭｇＣｌ2 というＰＣＲ増幅の最適マグネ
シウム濃度を有したが、これらの濃度はＬ. ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａの他の株についての１. ５ｍＭＭｇＣｌ2
という最適濃度よりも高かった。 【００８４】ＰＣＲ増幅によるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ検
出の感度 ｍｉｐ遺伝子増幅用プライマーを使って、Ｌ． ｐｎｅ
ｕｍｏｐｈｉｌａの１０ｆｇのゲノムＤＮＡの増幅がｍ
ｉｐ−１プローブでのハイブリッド形成によって首尾一
貫して検出された。これは約０. １ａｇの標的ＤＮＡに
相当し、単一Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｍｉｐ遺
伝子セグメントの検出を表す。Ｌ． ｂｏｚｍａｎｉｉ
とＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａからの１ｆｇのゲノム
ＤＮＡがプライマーＬ５ＳＬ９とＬ５ＳＲ９３を使って
増幅された場合には、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ中の５Ｓ
ｒＲＮＡのためのプローブで試料の約１８％が検出され
た。正の増幅結果のこのパターンは、その濃度のゲノム
ＤＮＡでの予想される標的遺伝子のポアソン分布に相当
する。 【００８５】本発明を使っての標的ＤＮＡ配列増幅の特
異性はＤＮＡセグメントを暗号づける５Ｓ ｒＲＮＡ基
づく試料中のすべてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの検出と、
特に、ｍｉｐ遺伝子に基づくＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの検出を可能にする。証明された特異性は、この方
法がＬｅｇｉｏｎｅｌｌａとＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉ
ｌａの臨床診断と環境調査の両方のための方法を提供す
る事を示す。ＰＣＲ−遺伝子プローブ法を使ってのＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａ検出のレベルは、Ｌ． ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａの単個細胞の検出と一致した。このように小
数のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａを特異的に検出する能力は、
ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓにかかった個人の臨床的診
断および病院や移動式送水設備や冷却塔やＬｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａの可能性ある他の源の安全性を確実にするため
と在郷軍人病の発生が起こる場合にＬ． ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａの源を確認するための水と臨床試料の環境調
査の両方のための方法論的基盤を確立する。多数のプラ
イマーを使って、同じ試料中のすべてのＬｅｇｉｏｎｅ
ｌｌａ種とすべてのＬ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ血清
型の両方を同時に検出することができる。 【００８６】上記の説明は本発明を単に例証するもので
あり本発明は特に例示されない非常に多くの具体例を有
することは、当業者にとっては明かだろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:185）
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:22）
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:42）
(72)発明者 アスィム・ケー・ベイ
アメリカ合衆国 ケンタッキー 40217、
ルイスヴィル、デイヴィッド・フェアーレ
イ・コート 778、アパートメント・ナン
バー８
(72)発明者 ミーナ・エイチ・マブバニ
アメリカ合衆国 ケンタッキー 40217、
ルイスヴィル、デイヴィッド・フェアーレ
イ・コート 778、アパートメント・ナン
バー８
(72)発明者 リチャード・ミラー
アメリカ合衆国 インディアナ 47165、
ペキン、ヴォイレス・ロード 9451
(72)発明者 ロバート・ジェー・ステファン
アメリカ合衆国 ノース・ダコダ 58501、
ビスマック、ダヴル・リアン・ドライブ
402
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 （１）水試料中の実質上すべての水系病
原体と指示微生物を水試料から回収し、適当な大きさの
濃縮標的細胞検査試料になるように濃縮し、 （２）標的細胞を溶解して実質上減成されてない標的細
胞ＤＮＡを回収するために、濃縮検査試料を処理し、 （３）該標的細胞中に含まれている標的遺伝子を選び、
該標的遺伝子中の標的ＤＮＡヌクレオチド配列を選び、
標的ＤＮＡヌクレオチド配列の二つの分離されたストラ
ンドのうちの一つに対して各プライマーが相補的であり
それとハイブリッド形成しポリメーラーゼがプライマー
を延長して標的ＤＮＡヌクレオチド配列の十分に二重ス
トランド化されたレプリカを作るような、二つの選ばれ
たオリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼ
を使った増幅条件下で該標的ＤＮＡヌクレオチド配列を
インキュベートし、 （４）増幅された標的ＤＮＡを検出して選ばれた標的Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列を有する該水系病原体または指示
微生物が検査試料中に存在するか否かを決定することか
ら成る、水試料中に主として糞便に由来する細菌である
水系病原体と指示微生物が存在するかどうかを検出する
方法。 【請求項２】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種とＥｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ種とＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種とＫｌｅ
ｂｓｉｅｌｌａ種を検出するためにｌａｃＺ遺伝子によ
って暗号づけされる標的ＤＮＡヌクレオチド配列を増幅
するための、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 【請求項３】 大腸菌とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種とＳｈ
ｉｇｅｌｌａ種を検出するためにｌａｍＢ遺伝子で暗号
づけされる標的ＤＮＡヌクレオチド配列を増幅するため
の、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 【請求項４】 Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐ
ｈｉｌａを検出するためにｍｉｐ遺伝子で暗号づけされ
た標的ＤＮＡヌクレオチド配列を増幅するための、特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 【請求項５】 Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種を検出するため
に５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子で暗号づけされた標的Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列を増幅するための、特許請求の範
囲第１項に記載の方法。 【請求項６】 大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅ
ｉとＳｈｉｇｅｌｌａＦｌｅｘｉｎｅｒｉを検出するた
めにＵｉｄＡ遺伝子によって暗号づけられた標的ＤＮＡ
ヌクレオチド配列を増幅するための、特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 【請求項７】 大腸菌とＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅ
ｉを検出するためにＵｉｄＣ遺伝子によって暗号づけら
れた標的ＤＮＡヌクレオチド配列を増幅するための、特
許請求の範囲第１項に記載の方法。 【請求項８】 プライマー配列が５’−ＡＴＧＡＡＡＧ
ＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣと５’ーＣＡＣＣ
ＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴのすべてま
たはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約
８７６ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第２項に記
載の方法。 【請求項９】 プライマー配列が５’ーＧＧＴＴＴＡＴ
ＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡと５’−ＡＴＧＡ
ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣのすべてま
たはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約
３２６ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第２項に記
載の方法。増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＧＡＣＧＴ
ＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡ
ＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴまたはこの配
列に対して相補的な配列のすべてまたはかなりの部分か
ら成るプローブとのハイブリッド形成によって検出され
る、特許請求の範囲第２項に記載の方法。 【請求項１１】 プライマー配列が５’ーＧＧＡＴＡＴ
ＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧと５’−ＡＣＴ
ＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣのすべて
またはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが
約５５４ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第３項に
記載の方法。 【請求項１２】 プライマー配列が５’ーＣＴＧＡＴＣ
ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣと５’ーＣＡＡ
ＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＴＣＡＣＧＣＡのすべて
またはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが
約３０９ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第３項に
記載の方法。 【請求項１３】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＧＣ
ＧＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧ
ＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴＧまたは
この配列に対して相補的な配列のすべてまたはかなりの
部分から成るプローブとのハイブリッド形成によって検
出される、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 【請求項１４】 プライマー配列が５’ーＧＣＴＡＣＡ
ＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＧと５’ーＧＴＴＴＴＧ
ＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡのすべてまたはかな
りの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約６４９ｂ
ｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第４項に記載の方
法。 【請求項１５】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＴＴ
ＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡまたは
この配列に対して相補的な配列のすべてまたはかなりの
部分から成るプローブとのハイブリッド形成によって検
出される、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 【請求項１６】 プライマーが５’ーＡＧＡＡＣＣＧＣ
ＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣと５’−ＴＡＧＧＡＣＣ
ＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡのすべてまたはかなりの部
分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１１８ｂｐの大
きさを持つ、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 【請求項１７】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＣＴＣ
ＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＣ
ＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴまたはこの配列に対して相補
的な配列のすべてまたはかなりの部分から成るプローブ
とのハイブリッド形成によって検出される、特許請求の
範囲第５項に記載の方法。 【請求項１８】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＢＣＴ
ＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧ
ＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣ（Ｂ
はビオチン）またはこの配列に対して相補的な配列のす
べてまたはかなりの部分から成るプローブとのハイブリ
ッド形成によって検出される、特許請求の範囲第５項に
記載の方法。 【請求項１９】 プライマー配列が５’ーＡＡＡＡＣＧ
ＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧと５’−ＡＣＧＣＧＴＧ
ＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧのすべてまたはかなりの
部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１４７ｂｐの
大きさを持つ、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 【請求項２０】 プライマー配列が５’ーＴＡＴＧＧＡ
ＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴと５’ーＴＧＴＴＴＧＣ
ＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧのすべてまたはかなりの部
分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１６６ｂｐの大
きさを持つ、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 【請求項２１】 プライマー配列が５’ーＡＡＡＡＣＧ
ＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧと５’ーＴＧＴＴＴＧＣ
ＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧのすべてまたはかなりの部
分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１３５０ｂｐの
大きさを持つ、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 【請求項２２】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＧＣ
ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴ
ＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧまた
は５’ーＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＧＡＣ
ＣＦＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＴＣ
ＴＧＣＴまたはこれらの配列のうちの一つに対して相補
的な配列から成るプローブとのハイブリッド形成によっ
て検出される、特許請求の範囲第６項に記載の方法。 【請求項２３】 プライマー配列が５’ーＴＧＴＴＡＣ
ＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣと５’ーＡＡＡＡＣ
ＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴのすべてまたはかな
りの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１５３ｂ
ｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 【請求項２４】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＣＡＡ
ＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧ
ＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補
的な配列のすべてまたはかなりの部分から成るプローブ
とのハイブリッド形成によって検出される、特許請求の
範囲第７項に記載の方法。 【請求項２５】 主として糞便に由来する細菌である水
系病原体または指示微生物の遺伝子中の標的ＤＮＡ配列
の相補的ストランド上の約１０ー３０ヌクレオチド配列
に対して相補的な二つのオリゴヌクレオチドプライマー
から成るプライマー対、増幅された標的ＤＮＡ配列を検
出するためのプローブ配列、および場合によっては、該
標的ＤＮＡ配列の制御ＤＮＡ鋳型から成る、該水系病原
体と指示微生物の存在を検出する方法で使用されるキッ
ト。 【請求項２６】 ポリメラーゼ連鎖反応増幅による標的
ＤＮＡ配列の増幅のための指示と他の試薬もまた含む、
特許請求の範囲第２５項に記載のキット。 【請求項２７】 （ａ）公表された指示および（ｂ）標
的ＤＮＡ配列の該ＰＣＲ増幅と増幅された標的ＤＮＡ配
列の検出のための試薬から成る、主として糞便に由来す
る細菌である水系病原体または指示微生物を該病原体ま
たは指示微生物の遺伝子中の標的ＤＮＡ配列をポリメラ
ーゼ連鎖反応で増幅する方法によって検出するためのキ
ット。 【請求項２８】 （１）標的ＤＮＡ配列の相補的なスト
ランド上の約１０ー３０ヌクレオチド配列に対して相補
的な二つのオリゴヌクレオチドプライマーから成るプラ
イマー対と（２）該標的ＤＮＡ配列の検出のためのプロ
ーブ配列と、場合によっては、（３）該標的ＤＮＡ配列
の制御ＤＮＡ鋳型を含む、特許請求の範囲第２７項に記
載のキット。 【請求項２９】 ｌａｃＺ遺伝子中の配列の増幅のため
のプライマー対とｌａｃＺ遺伝子中の増幅された配列の
検出のためのプローブ配列を含む、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ種とＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種とＣｉｔｒｏｂａｃ
ｔｅｒ種とＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種を検出するための特
許請求の範囲第２５項に記載のキット。 【請求項３０】 ｌａｍＢ遺伝子中の配列を増幅するた
めのプライマー対とｌａｍＢ遺伝子中の増幅された配列
を検出するためのプローブ配列を含む、大腸菌とＳａｌ
ｍｏｎｅｌｌａとＳｈｉｇｅｌｌａを検出するための特
許請求の範囲第２５項に記載のキット。 【請求項３１】 ｍｉｐ遺伝子中の配列を増幅するため
のプライマー対とｍｉｐ遺伝子中の増幅された配列を検
出するためのプローブ配列を含む、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａを検出するための特許請求
の範囲第２５項に記載のキット。 【請求項３２】 ５ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子中の配列
を増幅するためのプライマー対と５ＳリボゾームＲＮＡ
遺伝子中の増幅された配列を検出するためのプローブ配
列を含む、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種を検出するための特
許請求の範囲第２５項に記載のキット。 【請求項３３】 ＵｉｄＡ遺伝子中の配列を増幅するた
めのプライマー対とＵｉｄＡ遺伝子中の増幅された配列
を検出するための検出用プローブ配列を含む、大腸菌と
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉとＳｈｉｇｅｌｌａ
ｆｌｅｘｉｎｅｒｉを検出するための特許請求の範囲第
２５項に記載のキット。 【請求項３４】 ＵｉｄＣ遺伝子中の配列を増幅するた
めのプライマー対とＵｉｄＣ遺伝子中の増幅された配列
を検出するためのプローブ配列を含む、大腸菌とＳｈｉ
ｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉを検出するための特許請求の
範囲第２５項に記載のキット。 【請求項３５】 プライマー配列が５’−ＡＴＧＡＡＡ
ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣと５’ーＣＡＣ
ＣＡＴＧＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴのすべて
またはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが
約８７６ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第２９項
に記載のキット。 【請求項３６】 プライマー配列が５’ーＧＧＴＴＴＡ
ＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡと５’ーＡＴＧ
ＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣのすべて
またはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが
約３２６ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第２９項
に記載のキット。 【請求項３７】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＧＡ
ＣＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＣＧＡＣＴ
ＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴまたは
この配列に対して相補的な配列から成るプローブとのハ
イブリッド形成によって検出される、特許請求の範囲第
２９項に記載のキット。 【請求項３８】 プライマー配列が５’ーＧＧＡＴＡＴ
ＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧと５’ーＡＣＴ
ＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣのすべて
またはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが
約５５４ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第３０項
に記載のキット。 【請求項３９】 プライマー配列が５’ーＣＴＧＡＴＣ
ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣと５’ーＣＡＡ
ＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＴＣＡＣＧＣＡのすべて
またはかなりの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが
約３０９ｂｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第３０項
に記載のキット。 【請求項４０】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＧＣ
ＧＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧ
ＣＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴＧまたは
この配列に対して相補的な配列のすべてまたはかなりの
部分から成るプローブとのハイブリッド形成によって検
出される、特許請求の範囲第３０項に記載のキット。 【請求項４１】 プライマー配列が５’ーＧＣＴＡＣＡ
ＧＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＧと５’ーＧＴＴＴＴＧ
ＴＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＡのすべてまたはかなり
の部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約６４９ｂｐ
の大きさを持つ、特許請求の範囲第３１項に記載のキッ
ト。 【請求項４２】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＴＴ
ＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＣ
ＡＴＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡまたは
この配列に対して相補的な配列のすべてまたはかなりの
部分から成るプローブとのハイブリッド形成によって検
出される、特許請求の範囲第３１項に記載のキット。 【請求項４３】 プライマー配列が５’ーＡＧＡＡＣＣ
ＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣと５’ーＴＡＧＧＡ
ＣＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡのすべてまたはかなり
の部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１１８ｂｐ
の大きさを持つ、特許請求の範囲第３２項に記載のキッ
ト。 【請求項４４】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＣＴＣ
ＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＣ
ＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴまたはこの配列に対して相補
的な配列のすべてまたはかなりの部分から成るプローブ
とのハイブリッド形成によって検出される、特許請求の
範囲第３２項に記載のキット。 【請求項４５】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＢＣＴ
ＣＧＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧ
ＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣ（Ｂ
はビオチン）またはこの配列に対して相補的な配列のす
べてまたはかなりの部分から成るプローブとのハイブリ
ッド形成によって検出される、特許請求の範囲第３２項
に記載のキット。 【請求項４６】 プライマー配列が５’ーＡＡＡＡＣＧ
ＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧと５’ーＡＣＧＣＧＴＧ
ＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＧのすべてまたはかなりの
部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１４７ｂｐの
大きさを持つ、特許請求の範囲第３３項に記載のキッ
ト。 【請求項４７】 プライマー配列が５’ーＴＡＴＧＧＡ
ＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＴＴと５’ーＴＧＴＴＴＧＣ
ＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧのすべてまたはかなりの部
分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１６６ｂｐの大
きさを持つ、特許請求の範囲第３３項に記載のキット。 【請求項４８】 プライマー配列が５’ーＡＡＡＡＣＧ
ＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧと５’ーＴＧＴＴＴＧＣ
ＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧのすべてまたはかなりの部
分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１３５０ｂｐの
大きさを持つ、特許請求の範囲第３３項に記載のキッ
ト。 【請求項４９】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＴＧＣ
ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＴＡＡＴＧＣＴ
ＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧまた
は５’ーＡＡＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＧＡＣ
ＣＦＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＴＴＴＴＣ
ＴＧＣＴまたはこれらの配列のうちの一つに対して相補
的な配列から成るプローブとのハイブリッド形成によっ
て検出される、特許請求の範囲第３３項に記載のキッ
ト。 【請求項５０】 プライマー配列が５’ーＴＧＴＴＡＣ
ＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＣと５’ーＡＡＡＡＣ
ＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴのすべてまたはかな
りの部分から成り、増幅された標的ＤＮＡが約１５３ｂ
ｐの大きさを持つ、特許請求の範囲第３４項に記載のキ
ット。 【請求項５１】 増幅された標的ＤＮＡが５’ーＣＡＡ
ＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧ
ＣＣＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴまたはこの配列に対して相補
的な配列のすべてまたはかなりの部分から成るプローブ
とのハイブリッド形成によって検出される、特許請求の
範囲第３４項に記載のキット。
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Family Applications (1)
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