JP2006512928A

JP2006512928A - 炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）核酸を検出するためのアッセイおよび組成物

Info

Publication number: JP2006512928A
Application number: JP2005515708A
Authority: JP
Inventors: ノーマン，シルヴィア・エイ; ブンゴ，ジェニファー・ジェイ; ホーガン，ジェームズ・ジェイ; ウェイスバーグ，ウィリアム・ジー
Original assignee: ジェン−プローブ・インコーポレーテッド
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2006-04-20
Also published as: CA2506151C; US20120171669A1; EP1572977B1; AU2003303307A1; EP1572977A2; ATE459727T1; EP1572977A4; DE60331587D1; AU2003303307B2; WO2004070001A3; CA2506151A1; US20080176221A1; US7494774B2; WO2004070001A2; US8293885B2

Abstract

本発明は、核酸ハイブリダイゼーション反応において、ｐＸＯ１プラスミドおよびｐＸＯ２プラスミドに含有される遺伝物質に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いる、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）を検出する組成物および方法を含む。該方法の態様は、試料に存在する他の細菌種から炭疽菌を区別するか、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）配列がまったく検出されなかった際でも、アッセイが適切に行われたことの指標を提供する、他の遺伝子配列に特異的なさらなるプローブを含むことも可能である。

Description

発明の分野
本発明は、炭疽の原因病原体である炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）の検出に関し、そしてより具体的には、他のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から、炭疽菌を区別する、プラスミドが所持する核酸配列を検出するための組成物および方法に関する。

発明の背景
炭疽菌は、炭疽の原因病原体である芽胞形成細菌であり、炭疽はしばしば肺または結合組織を攻撃する疾患である。皮膚炭疽がこの疾患の最も一般的な型であり、炭疽菌芽胞が損傷を受けた皮膚または膜に感染し、そして発芽し栄養細胞になって炭疽毒を産生した後、皮膚炭疽が皮膚発赤、炎症性の腫れ物または潰瘍を引き起こす。菌血症が発展すると、高熱および死につながりうる。吸入型は、芽胞を吸い込んだ後に生じ、これが肺マクロファージに感染し、そしてリンパ節において発芽して、浮腫、出血、リンパ節壊死および胸水を引き起こす。吸入炭疽は、通常、感染１週間以内で致死であり、敗血症および髄膜炎を導きうる。口腔咽頭炭疽および胃腸炭疽は、疾患の最も一般的でない型であり、通常、十分に調理されていない汚染肉を摂取した結果生じる。一般的でなく、そして非特異的な症状（のどの痛み、発熱、吐き気、嘔吐）で始まるが、これらの炭疽の型は、約５０％の死亡率を有する。炭疽は、通常、草食動物を攻撃するが、汚染した動物の体毛、羊毛、皮膚、肉、または廃棄物に接触したヒトは、該疾患に接触しうる。炭疽菌芽胞の意図的な放出によって引き起こされるヒト感染は、皮膚炭疽および／または吸入炭疽を生じ、生物戦争またはバイオテロリズムの１つの型である。感染したヒトは、抗生物質、例えばペニシリンを用いることによって、炭疽に関して治療することも可能である。この疾患の致死率が高く、そして感染した個人または汚染物質に曝露されうる他者にリスクが生じるため、炭疽菌の存在を正確に検出し、そして感染を診断することは重要である。

炭疽菌は、バチルス属の他の種に関連し、バチルス属種はすべて、グラム陽性桿菌である、内生胞子形成細菌である。炭疽菌は、一般的に存在する非炭疽種、例えばセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、セレウス菌変種ミコイデス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓｖａｒｍｙｃｏｉｄｅｓ）、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に緊密に関連する。セレウス菌、セレウス菌変種ミコイデス、炭疽菌、およびＢ．チューリンゲンシスに緊密な遺伝的関係があるため、これらの種はしばしば、セレウス菌複合体のメンバーとして分類されるか、または１つの種と見なされることさえある（Ｋａｎｅｋｏら，１９７８，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２２：６３９−４１；Ｈｅｌｇａｓｏｎら，２０００，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：２６２７−３０）。例えば、この関係は、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列（１，５５４ｎｔ）に示され、ここで、炭疽菌、セレウス菌、およびＢ．チューリンゲンシス株の遺伝子間には１〜４ｎｔの相違があるが、炭疽菌配列は、試験した８６株で非常に保存されており、そしてＢ．チューリンゲンシス配列は、試験した１１株で非常に保存されていた（Ｓａｃｃｈｉら，２００２，ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８（１０）：１１１７−２３）。

炭疽菌の毒性株は、２つのプラスミド、ｐＸＯ１およびｐＸＯ２上に毒性遺伝子を所持する（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０６５４０４およびＡＦ１８８９３５）。プラスミドｐＸＯ１上の遺伝子は、炭疽菌感染の毒性に寄与するタンパク質：防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）、および致死因子（ＬＦ）をコードする。ＰＡは、ＥＦまたはＬＦいずれかと組み合わせた際、毒性に必要な膜結合タンパク質である。遺伝子ｐａｇはＰＡをコードし、遺伝子ｃｙａはＥＦをコードし、そして遺伝子ｌｅｆはＬＦをコードする（Ｐｒｉｃｅら，１９９９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１（８）：２３５８−２３６２）。プラスミドｐＸＯ２上の遺伝子は、ｃａｐＢ、ｃａｐＣ、およびｃａｐＡと称され、炭疽菌の抗食作用カプセルの要素をコードする。炭疽菌の既知の株は、これらのプラスミドの両方、または一方をコードするか、またはどちらもコードしない。一般的に、これらのプラスミドの一方または両方を失った株は、無毒性と見なされる。毒性株は、エイムズ（ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋）株のように、両方のプラスミドを含有する。ｐＸＯ２プラスミドを失った無毒性株は、Δスターン（ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２−）株であり、この芽胞は、世界中で動物に対する生ワクチンとして用いられている（Ｈａｍｂｌｅｔｏｎｅら，１９８４，Ｖａｃｃｉｎｅ２：１２５−３２）。ｐＸＯ１プラスミドを失った無毒性株は、Δエイムズ（ｐＸＯ１−／ｐＸＯ２＋）株である。どちらのプラスミドも失った株、例えばＶＮＲ１−Δ１株が知られる。

炭疽菌の臨床的同定は、標本または培養細菌から作製されるグラム染色スメアの顕微鏡検査、血液寒天上での非溶血または弱い溶血増殖の検出、寒天培地上で３６時間より長く増殖させたコロニーの顆粒状またはすりガラス風の外見の観察、あるいは毒性莢膜型と関連するムコイドコロニーの観察などの方法に頼る（Ｌｏｇａｎら：ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第７版，Ｍｕｒｒａｙら監修，１９９９，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ワシントンＤ．Ｃ．）中，ｐｐ．３５７−６９）。顕微鏡検査下で、炭疽菌細胞は、大きな桿体であり、通常、鎖状であり、そして莢膜に覆われており、一般的に、セレウス菌およびＢ．チューリンゲンシスの運動性株と比較して非運動性である。炭疽菌桿体は、楕円の中心または端付近に芽胞を含有する可能性もまたしない可能性もあり、この芽胞は、該細菌が、大気に見られるような低ＣＯ_２レベルに曝露された際に形成される。炭疽菌の臨床試験には、試料から作成される実験室培養物を調製し、そして調べること、例えばブロスおよび血液培養物に接種し、そして５％ヒツジ血液寒天、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天、およびフェニルエチルアルコール寒天などの実験室培地上にストリークすることが含まれる。培養を少なくとも３日間インキュベーションし、そして早ければ接種８時間後から毎日観察して、細菌またはコロニーの増殖特性を決定する。溶血中、グラム染色形態、または運動性結果を用いて、炭疽菌の存在を除外することも可能であり、試験試料に存在する生物として炭疽菌を除外するには、２つの試験結果の組み合わせが推奨される。セレウス菌複合群の他のメンバーは、外見および特性において、炭疽菌を模倣する可能性もあるため、試験結果の解釈は難しく、そして培養物からの炭疽菌の明確な同定は困難である。炭疽菌同定のためのさらなるアッセイは、抗体を用い、そしてα−グルコシダーゼ活性を検出することによって、莢膜に覆われた生物を検出することに頼ってきた。実験室でのコロニーの増殖期間は比較的長いため、これらの試験は、通常、炭疽菌の存在を除外するか、またはバチルス属種を陽性に同定するのに、少なくとも３日間を必要とする。さらに、これらの試験を実行する臨床実験室は、バイオセイフティレベル２（ＢＳＬ−２）以上で手技が行われるのが許可される設備を必要とする。臨床実験室が炭疽菌の存在を除外するか、またはバチルス属種を明確に同定することが不能であれば、さらなる試験のため、試料は別の実験室に送られる。

これらの臨床試験に加えて、他の方法を用いて、炭疽菌を含むバチルス属種を検出し、そして同定することも可能である（Ｈａｒｒｅｌｌら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：１８４７−１８５０；Ｋｅｉｍら，１９９９，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８７（２）：２１５−７；Ｊａｃｋｓｏｎら，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３（４）：１４００−５；Ｓｉｒａｒｄら，２０００，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９０（４−５）：３１３−６）；Ｍｏｃｋら，２００１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ５５：６４７−７１）。例えば、炭疽菌は、炭疽菌を同定する細菌核酸配列を増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく試験を用いることによって、検出されてきている（Ｍａｋｉｎｏら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（３）：５４７−５１；Ｒａｍｉｓｓｅら，１９９６，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４５（１）：９−１６；Ｍａｋｉｎｏら，２００１，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（３）：２３７−４０；Ｋｅｉｍら，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（３）：８１８−２４；Ｐａｔｒａら，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６（１１）：３４１２−１４；Ｄａｆｆｏｎｃｈｉｏら，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（３）：１２９８−３０３；Ｌｅｅら，１９９９，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８７（２）：２１８−２３；Ｆａｓａｎｅｌｌａら，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ１９（３０）：４２１４−１８；Ｅｎｓｅｒｉｎｋ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４（５５４５）：１２６６−７）。炭疽菌を検出する別の方法は、染色体ＤＮＡから単離された炭疽菌特異的多型サイン配列に頼る（Ｒａｓｔｏｇｉら、米国特許第６，４４８，０１６Ｂ１号）。１つのアッセイは、ｇｙｒＢ遺伝子の種特異的断片を増幅し、そして検出して、セレウス菌、Ｂ．チューリンゲンシス、および炭疽菌間を区別することに頼る（Ｙａｍａｄａら、米国特許第６，０８７，１０４号）。

炭疽感染が臨床的に重要であり、そして炭疽菌を伴いうるバイオテロリズム脅威または事象にはさらに精神的および経済的衝撃があるため、環境試料および臨床試料に存在しうる炭疽菌を検出し、そして同定する有効な方法に対する必要性が存在し続けている（ＬａｎｅおよびＦａｕｃｉ，２００１，ＪＡＭＡ２８６：２５９６−７；Ｅｎｓｅｒｉｎｋ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４（５５４５）：１２６６−７）。無毒性炭疽菌または他の類似のバチルス属種から炭疽菌の毒性型を同定しそして区別する必要性が特にある。米国における試料の最初の試験は、バチルス属種を同定するために装備されず、またはトレーニングされていない（米国疾病対策予防センター（「ＣＤＣ」）、米国ジョージア州アトランタに分類される、バイオテロリズム実験室応答ネットワーク（「ＬＲＮ」）の）レベルＡ臨床実験室で行われる可能性もあり、そして次いで、炭疽菌を含有すると疑われる試料が、さらなる試験のため、他の実験室（例えばＬＲＮレベルＢまたはＣ）に照会される。バチルス属種の同定が遅れるか、または同定のため、より高いレベルの実験室に不必要に照会することを避けるため、レベルＡ実験室が、試験試料から炭疽菌の存在を少なくとも除外し、そしてより好ましくは、試料中の炭疽菌の存在を同定することを迅速に可能にする必要性が存在し続けている。

発明の概要
本発明の１つの側面は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３４、標的配列いずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物の炭疽菌標的配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする、約２０〜４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。こうしたオリゴヌクレオチドの態様には、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４、ｐａｇＡ標的配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドが含まれる。これらのｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの例には、配列番号２１に特異的にハイブリダイズする、配列番号１または配列番号２のオリゴヌクレオチド、配列番号２２に特異的にハイブリダイズする、配列番号３または配列番号４のオリゴヌクレオチド、配列番号２３に特異的にハイブリダイズする、配列番号５または配列番号６のオリゴヌクレオチド、および配列番号２４に特異的にハイブリダイズする、配列番号７または配列番号８のオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の他の態様には、配列番号２５または配列番号２６、ｃａｐＢ標的配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有されるｃａｐＢ標的配列に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドが含まれる。配列番号２５に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの例は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のオリゴヌクレオチドである。配列番号２６に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの例は、配列番号１３または配列番号１４のオリゴヌクレオチドである。本発明のさらなる態様は、配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物の標的配列に含有されるバチルス属種の１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、約１８〜４０塩基のオリゴヌクレオチドである。こうしたオリゴヌクレオチドの例には、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９のものが含まれる。本発明の別の態様は、配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物の標的配列に含有されるバチルス属種の２３ＳｒＲＮＡまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、約２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドである。こうしたオリゴヌクレオチドの例には、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号３６のものが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドのいずれも、ＤＮＡ主鎖もしくはＲＮＡ主鎖、または混合ＤＮＡおよびＲＮＡ主鎖を有するか、あるいは塩基を連結する少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含有することも可能である。これらのオリゴヌクレオチドのいずれも、オリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結されたシグナル産生標識を含むことも可能である。好ましい標識は、化学発光化合物である。

本発明の別の側面は、試料中の炭疽菌核酸を検出する方法であって、炭疽菌核酸を含有する試料を提供し、ｐＸＯ１プラスミドに含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびｐＸＯ２プラスミドに含有されるｃａｐＢ標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを提供し、少なくとも１つのプローブをｐａｇＡ標的配列に、または少なくとも１つのプローブをｃａｐＢ標的配列に、あるいは少なくとも１つのプローブをｐａｇＡ標的配列にそして少なくとも１つのプローブをｃａｐＢ標的配列に、特異的にハイブリダイズさせ、そしてｐａｇＡ標的配列またはｃａｐＢ標的配列にハイブリダイズした少なくとも１つのプローブの存在を検出して、試料中の炭疽菌の存在を示す工程を含む、前記方法である。該方法の態様において、ｐａｇＡ標的配列は、配列番号３３、またはその相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有され、そしてｃａｐＢ標的配列は、配列番号３４、またはその相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有される。該方法のいくつかの態様において、ｐａｇＡ標的配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有され、そしてｃａｐＢ標的配列が、配列番号２５または配列番号２６、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有される。いくつかの態様において、ハイブリダイズ工程は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のオリゴヌクレオチドである、ｐａｇＡ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブ、あるいは配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４のオリゴヌクレオチドである、ｃａｐＢ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブを含む。該方法のいくつかの態様は、セレウス菌複合種のなかで保存されている１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいは１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを提供し、少なくとも１つのプローブを、セレウス菌複合種のなかで保存されている１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいは１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズさせ、そしてセレウス菌複合種のなかで保存されている１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいは１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのプローブの存在を検出し、それによって、試料中のセレウス菌複合生物の存在を示す工程をさらに含む。好ましい態様において、１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物に含有される配列に特異的にハイブリダイズする、１８〜４０塩基のオリゴヌクレオチドである。こうしたオリゴヌクレオチドには、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の配列を有するものが含まれる。該方法の別の態様は、配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする、２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドである、２３ＳｒＲＮＡまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを用いる。こうしたオリゴヌクレオチドには、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号３６のものが含まれる。該方法の別の態様において、提供工程は、真性細菌種に存在する遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするプローブを含み、ハイブリダイズ工程は、プローブを、真性細菌種に存在する遺伝子配列に特異的にハイブリダイズさせることを含み、そして検出工程は、真性細菌種に存在する遺伝子配列にハイブリダイズしたプローブを検出し、それによって、バチルス属配列がアッセイ中でまったく検出されなかった際も、方法工程が適切に行われたことを示すことを含む。好ましい態様において、プローブは配列番号４０の配列を有し、そしてｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードするＤＮＡにハイブリダイズしたこのプローブが検出されることは、試料中に真性細菌が存在することを示す。本発明のさらなる態様は、該方法を実施するためのキットであって、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物のｐａｇＡ標的配列に含有される配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、および配列番号２５または配列番号２６、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物のｃａｐＢ標的配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含む、前記キットを含む。キットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のオリゴヌクレオチドである、ｐａｇＡ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブ、および配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４のオリゴヌクレオチドである、ｃａｐＢ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブを含むことも可能である。

以下の詳細な説明は、本発明の多様な態様を例示し、こうした例示は、本発明の原理を説明するよう働く。

詳細な説明
本発明は、炭疽菌核酸を含有する試料を提供し、炭疽菌のｐＸＯ１プラスミドおよびｐＸＯ２プラスミドに含有される遺伝子配列に特異的にそして独立に結合する少なくとも２つの検出プローブにハイブリダイズさせ、そしてｐＸＯ１遺伝物質に結合したプローブおよび／またはｐＸＯ２遺伝物質に結合したプローブの存在を検出して、試料中の炭疽菌の存在を示すことによって、試料中の炭疽菌核酸を検出する方法を提供する。該方法は、ｉｎｖｉｔｒｏで、生物学的試料中の生物を増殖させ、そして試料中の生物を溶解して炭疽菌核酸を放出させることを含むことも可能である。該方法はまた、バチルス属１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡに特異的なｒＲＮＡ配列に、少なくとも１つの標識プローブを結合させる工程を含むことも可能であり、ここで、プローブに結合される配列は、セレウス菌複合種（すなわち炭疽菌、Ｂ．チューリンゲンシス、およびセレウス菌）のなかで保存されており、そしてｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに結合したプローブの存在を検出して、試料中のセレウス菌複合生物の存在を示す工程を含むこともまた可能である。例えば、該方法は、炭疽菌、Ｂ．チューリンゲンシスおよびセレウス菌の間で完全に保存されているが、炭疽菌およびＢ．ミコイデス間では完全には保存されていないバチルス属１６ＳｒＲＮＡ配列に特異的な、少なくとも１つの標識プローブを結合させる工程を含むことも可能であり、すなわち結合配列は、炭疽菌およびＢ．ミコイデス間の少なくとも１つのヌクレオチド相違を含有する。１６ＳｒＲＮＡ配列に結合したプローブの存在が検出されることは、試料中に炭疽菌またはセレウス菌複合種の別の種が存在することを示す。また、例えば、該方法は、少なくとも１つの検出プローブ、および場合によって検出プローブとともに１以上のヘルパーオリゴマーを用いて、２３ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズさせ、そして該配列の存在を検出して、炭疽菌および／または緊密に関連するバチルス属種の存在を示すことも可能である。該方法の別の態様は、真性細菌ｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的に結合するプローブをハイブリダイズさせて、アッセイにおいて、別のプローブを用いて、バチルス属または炭疽菌の配列が検出されなかった場合であっても、アッセイ工程が適切に行われたことを示すシグナルを産生する。こうした工程は、アッセイの内部対照として働いた。

本発明は、プラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２に含有される炭疽菌遺伝子配列に、すなわち配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号２６の配列内に含有される標的配列に、特異的に結合するオリゴヌクレオチドの核酸配列を含む。標的配列に結合するオリゴヌクレオチドは、２０〜４０ヌクレオチドの範囲の長さ、好ましくは２５〜３５ヌクレオチドの範囲の長さであることも可能である。こうしたオリゴヌクレオチドの態様は、配列番号１〜配列番号１４の配列を有するものを含む。本発明の方法を実施するのに有用な他のオリゴヌクレオチドには、配列番号１５〜配列番号２０のオリゴヌクレオチドを含む、配列番号３１の標的配列に特異的にハイブリダイズするバチルス属種の１６ＳｒＲＮＡ配列に特異的なもの、および配列番号２７〜配列番号３０のオリゴマーを含む、配列番号３２の標的配列に特異的にハイブリダイズするバチルス属種の２３ＳｒＲＮＡ配列に特異的なものが含まれる。バチルス属ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのさらなる態様が、配列番号３６および配列番号３７に例示される。本発明のオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡ主鎖もしくはＲＮＡ主鎖、または混合ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を有するか、あるいは塩基を連結する少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含有するものが含まれる。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結されたシグナル産生標識を含むことも可能である。

本発明は、炭疽菌のｐＸＯ１プラスミドおよびｐＸＯ２プラスミドの選択された配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、ｐＸＯ１プラスミドおよびｐＸＯ２プラスミドの配列に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを検出することによって、試料中の炭疽菌の存在を検出する方法を含む。態様は、プラスミドｐＸＯ１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２２５８９）のｐａｇＡ遺伝子およびプラスミドｐＸＯ２（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１８８９３５）のｃａｐＢ遺伝子に含有される配列を特異的に検出する。いくつかの態様は、配列番号２１〜配列番号２４の配列に含有されるｐＸＯ１プラスミドの配列に特異的に結合するオリゴマーであり、一方、他の態様は、配列番号２５および配列番号２６の配列に含有されるｐＸＯ２プラスミドの配列に特異的に結合するオリゴマーである。

本発明の説明を理解するのを補助するため、本明細書に用いる用語のいくつかの定義を提供する。別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての科学的用語および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味、例えば、ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク）、ＴｈｅＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，１９９１，ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ，ニューヨーク州ニューヨーク）、およびＤｏｒｌａｎｄ’ｓＩｌｌｕｓｔｒａｔｅｄＭｅｄｉｃａｌＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第２７版（Ｗ．Ａ．Ｄｏｒｌａｎｄ，１９８８，Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏ．，ペンシルバニア州フィラデルフィア）に提供される意味を有する。

「相補」核酸（または「相補性」）は、官能基の配向のため、一般的には水素結合を介して、相対する鎖の別の核酸配列にハイブリダイズするであろう、核酸の一方の鎖の核酸配列を指す。ＤＮＡ中の標準的塩基対形成は、一方の鎖のアデニン（Ａ）が相対する鎖のチミン（Ｔ）に結合し、そしてシトシン（Ｃ）が相対する鎖のグアニン（Ｇ）に結合することを意味する。ＲＮＡでは、ウラシル（Ｕ）がＴと交換されて、相対する鎖のＡに結合することを除いて、同じ結合関係が生じる。「実質的な相補性」または「実質的に相補的な」は、一方の鎖の核酸配列が、相対する鎖の核酸配列に１００％の相補性ではないが、相補塩基間に十分な水素結合が形成されて、適切な条件（例えば塩溶液濃度および温度）で、２つの鎖が安定な複合体を形成するのを許すことを意味する。「十分な相補性」または「十分に相補的」は、用いるハイブリダイゼーション条件下で、相補塩基間の水素結合によって、連続する核酸配列が、別の連続する核酸配列にハイブリダイズすることを意味する。相補配列は、標準的塩基対形成（例えばＧ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）を用いることによって、配列の各位で相補的であることも可能であるし、または標準的水素結合を用いて相補的ではない（イノシン、または無塩基性残基を含む別の類似体への結合によるなど）１以上の残基を有することも可能であるが、相補配列全体は、適切なハイブリダイゼーション条件において、別の配列と特異的にハイブリダイズ可能である。適切なハイブリダイゼーション条件が周知であり、そして該条件は、配列組成に基づいて容易に予測することも可能であり、または日常的な試験を用いることによって、実験的に決定することも可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，１９８９（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー），ｐｐ．１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、１１．１２−１１．１３および１１．４７−１１．５７を参照されたい）。核酸オリゴマーは、相補性を破壊することなく、さらなる部分（例えば、核酸に直接付着するか、またはリンカー部分を介して間接的に付着する標識）を含有することも可能である。

「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの一本鎖核酸が、第二の一本鎖核酸中の相補配列または実質的な相補配列に結合して、安定なハイブリダイゼーション複合体（または単に「複合体」）を産生する反応に用いる、累積環境を指す。こうした環境には、例えば、一本鎖核酸を含有する水性溶液または有機性溶液（例えば塩、キレート剤、非競合阻害剤核酸、ｐＨ）の構成要素の化合物および濃度が含まれ、そしてこうした環境は、他の要因、例えばハイブリダイゼーションが起こることを許された時間の長さ、反応チャンバーの形状、および混合または攪拌の使用によって影響を受ける可能性もある（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ｐｐ．１．９０−１．９１、９．４７−９．５１、１１．４７−１１．５７を参照されたい）。

「標識」は検出可能であるか、または例えば、検出可能産物を産生する反応に関与することによって、検出可能なシグナルを導くことも可能な分子部分を指す。標識は、例えば、発光（蛍光、生物発光、または化学発光など）部分、放射性同位体、ビオチン、アビジン、酵素または酵素基質、反応性基、または発色団（色素または検出可能な色を与える粒子など）であることも可能である。

「標識プローブ」は、検出可能部分、例えば蛍光または発光部分、放射性同位体、ビオチン、アビジン、酵素または触媒基、酵素基質、発色団または反応性基と直接または間接的に会合した、核酸配列、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーである。こうした標識プローブの産生および／または使用の例が、周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第１０章；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，３３３号；およびＢｅｃｋｅｒら、欧州特許出願第０７４７７０６号）。

「ヘルパーオリゴマー」または「ヘルパープローブ」は、標識プローブが結合するのと異なる領域で、標的核酸に結合する核酸オリゴマーであって、標的配列への標識プローブオリゴマーのハイブリダイゼーション効率を増加させるのに用いる前記核酸オリゴマーを指す（Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，０３０，５５７号）。ヘルパーオリゴマーは、一般的に、予測される二次構造または三次構造を含有する標的核酸内の配列に結合するように設計され、そして標的配列へのオリゴヌクレオチドプローブの結合速度を加速する目的で、プローブオリゴマーの標的配列の近くに位置する。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標識プローブと組み合わせて用いる場合、標識されていないが、標識プローブの結合を促進し、そしてしたがって、ハイブリダイゼーションから生じる検出可能シグナルを間接的に増進する。１以上のヘルパーオリゴマーをハイブリダイゼーション反応に含んで、標的配列への標識プローブの結合効率を増加させることも可能であるが、ヘルパーオリゴマーは、アッセイの、場合による構成要素である。

「核酸」は、長さ少なくとも２、そして好ましくは１０ヌクレオチド（ｎｔ）以上のポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡまたはその類似体）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡまたはその類似体）を指す。用語「核酸」には、一本鎖（ｓｓ）、二本鎖（ｄｓ）、または三本鎖いずれでもよいポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー、並びにポリマーＤＮＡおよびＲＮＡ分子が含まれる。本明細書に開示する核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡいずれであることも可能であり、そして塩基配列は、二者択一の主鎖（すなわちＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む対応する配列、または２’−メトキシ基または他の核酸類似体、たとえばペプチド連結を含む主鎖を含む。

「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、ホスホジエステル連結の主鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡ中）、修飾連結、または相補的標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない非ヌクレオチド部分を介して連結される、少なくとも２つのヌクレオチドで構成される、核酸配列を指す。修飾連結には、標準的ホスホジエステル連結が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、またはポリアミド連結などの異なる連結と交換されるもの（例えばペプチド核酸または「ＰＮＡ」中）が含まれる。窒素塩基類似体がオリゴヌクレオチドの構成要素であることも可能であり、そしてヌクレオチド・サブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、またはＯＭｅなどのその修飾誘導体であることも可能である。オリゴマーは、一般的に、通常、長さ約１００ヌクレオチドまでの、８以上の連結ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドおよび類似体配列を合成する方法が当該技術分野に周知である（例えば、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ監修（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４），Ｋｕｉｊｐｅｒｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１８（１７）：５１９７（１９９４），Ｄｕｃｈｏｌｍ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５７６７（１９９４）、米国特許第５，１４３，８５４号（Ｐｉｒｒｕｎｇら）、および米国特許第６，１５６，５０１号（ＭｃＧａｌｌら）を参照されたい）。オリゴマープローブは、場合によって、核酸に直接または間接的にコンジュゲート化される検出可能標識を有することも可能である。当業者が標識を核酸プローブに取り込むことを可能にする、日常的なプロトコルが利用可能である。ハイブリダイゼーション中で使用するため、一般的にプローブは、標的配列と、効率的な相補的塩基対形成を可能にするように、一本鎖にされる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｐｐ．１１．１−１１．６１）。

「標的」または「標的配列」は、相補的塩基対形成を用いることによってプローブ配列が結合する核酸配列を指す。１以上のプローブ配列の標的配列は、より大きい標的配列、例えば完全遺伝子配列のサブセットであることも可能である。例えば、「プローブＡ」は、相補的な「標的配列Ａ」を有し、そして「プローブＢ」は、相補的な「標的配列Ｂ」を有し、そして「標的配列Ａ」および「標的配列Ｂ」両方を含んでなる、より大きい「標的配列Ｃ」は、さらなる標的配列を含んでなることも可能である。別の例において、「プローブＡ」および「プローブＢ」は、「遺伝子Ｘ標的配列」の異なるサブセットに相補的な配列を有する。別の例において、多数のプローブが、異なるが重複する配列を有し、そしてこれらの多数のプローブは、多数の重複するプローブ配列の累積する連続配列に相補的な標的配列に結合する。

「Ｔ_ｍ」は、２つの核酸鎖間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が、５０％変性する融解温度を指す。２つの核酸鎖のＴ_ｍ未満の温度では、安定なハイブリダイゼーション複合体の形成が支持され、一方、Ｔ_ｍより高い温度では、複合体形成が支持されない。Ｔ_ｍは、日常的な方法を用いることによって実験的に決定するか、または既知の数学式を用いることによって概算することも可能である。例えば、水性１ＭＮａＣｌ溶液中、既知のＧ＋Ｃ含量を有する核酸のＴ_ｍの単純な概算値を、等式Ｔ_ｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いることによって計算するが、核酸の構造的特性を考慮に入れた他の計算もまた、当該技術分野に周知である（例えば、Ｔ_ｍ＝０．４０１（長さｎｔ）＋０．５７６（％Ｇ＋Ｃ）＋２４．８５２）。

特異的ハイブリダイゼーションによって、意図される標的配列を検出するオリゴヌクレオチドプローブの選択は、いくつかの考慮事項に頼り、これらには、プローブの長さおよびヌクレオチド塩基組成、並びにプローブ−標的ハイブリダイゼーション複合体の熱安定性（Ｔ_ｍ）が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｐｐ．１１．４５−１１．５７を参照されたい）。より長いプローブは、一般的に、より高い安定性を有するが、より短いプローブの場合は、ミスマッチ識別が増加するため、すなわち短いプローブおよびその標的間に塩基ミスマッチが発生すると、より長いプローブを用いた場合のミスマッチよりも、二重鎖に対する不安定化効果がより大きいため、より短いプローブは、しばしば、より高い特異性を有する。一般的に、プローブオリゴマーは、約１８〜５０ヌクレオチドのサイズ範囲、好ましくは２５〜３５ヌクレオチドの範囲である。プローブ−標的二重鎖のＴ_ｍに加えて、プローブオリゴマーまたはその標的の内部構造もまた、ハイブリダイゼーション効率に影響を及ぼしうる。例えば、自己相補配列は、分子内ヘアピンターンまたは分子間マルチハイブリッド複合体などの、プローブおよび標的間のハイブリダイゼーションに干渉しうる、より高次の構造を形成する可能性もある。したがって、プローブおよび標的配列を選択する際は、潜在的な自己相補配列を回避する。プローブまたは標的は、直接または間接的に、フィルター、膜、ビーズ、スライドまたはチップなどの固体支持体に付着させることも可能であるが、溶液相ハイブリダイゼーションは、固相ハイブリダイゼーションに比較して、より効率的な動力学を提供する。

「から本質的になる」によって、本発明の基本的でそして新規の特性を実質的に変化させないさらなる構成要素（単数または複数）、組成物（単数または複数）、または方法工程（単数または複数）が含まれていることも可能であることを意味する。こうした特性には、プラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２上の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも２つの核酸プローブ、例えば、プラスミドｐＸＯ１のｐａｇＡ配列に特異的な少なくとも１つのプローブおよびプラスミドｐＸＯ２のｃａｐＢ配列に特異的な少なくとも１つのプローブを用いることによる、プラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２両方を所持する炭疽菌株の検出が含まれる。プラスミドｐＸＯ１のｐａｇＡ遺伝子およびプラスミドｐＸＯ２のｃａｐＢ遺伝子に特異的に結合し、そしてこれら遺伝子を検出する、開示されるオリゴヌクレオチドプローブに比較して、プローブ配列長を増加させるかまたは減少させることも可能な、特異的プローブ配列への変化が、変化したプローブ配列が特異的プローブ配列の意図する標的配列にハイブリダイズすることを可能にし、そして本明細書記載の条件を用いて、無毒性炭疽菌株から毒性炭疽菌株を区別することを可能にするならば、変化は実質的とは見なされない。プラスミドｐＸＯ１のｐａｇＡ遺伝子およびプラスミドｐＸＯ２のｃａｐＢ遺伝子に特異的にハイブリダイズする、少なくとも２つの核酸プローブを用いることによって、炭疽菌株を検出するための開示する方法に比較して、試薬（例えば核酸または他の構成要素）を添加するかまたは置換するか、あるいはアッセイに工程を付加することを含むことも可能な、方法に対する変化が、本明細書に開示する条件下の、それぞれの標的配列との少なくとも２つのプローブの特異的ハイブリダイゼーションまたはそれぞれの標的配列に結合したプローブの検出に干渉しないならば、変化は実質的とは見なされない。本発明の基本的でそして新規の特性に実質的な影響を有するいかなる構成要素（単数または複数）、組成物（単数または複数）、または方法工程（単数または複数）も、この用語には属さないであろう。

別に言及しない限り、本明細書で使用するかまたは意図する技術は、一般の当業者に周知の標準的方法論である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版），Ｖｏｌ．１−３，１９８９（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい）。

炭疽菌遺伝子配列を検出するための核酸配列
本発明は、プラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２に、そして場合によって１６Ｓおよび／または２３ＳｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする遺伝子に含有される炭疽菌遺伝物質に特異的に結合するオリゴヌクレオチドの核酸配列を含む。一般的に、オリゴヌクレオチドは、５９℃〜７５℃の範囲のＴ_ｍ、２０〜５０ヌクレオチドの範囲の長さ、そして４０〜６４％の範囲のＧ＋Ｃパーセンテージを持つ、最小限の自己アニーリング二次構造を示す配列を選択するように設計された。

プラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２中の標的配列は、ｐＸＯ１のｐａｇＡ配列およびｐＸＯ２のｃａｐＢ配列内に含有される。より具体的には、標的配列は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４のｐａｇＡ配列、並びに配列番号２５および配列番号２６のｃａｐＢ配列に含有される。これらの標的配列に結合するオリゴヌクレオチドの態様は、長さ約２０〜４０ヌクレオチドの範囲、好ましくは約２５〜３５ヌクレオチドの範囲にあることも可能である。こうしたオリゴヌクレオチドの態様には、ｐａｇＡ標的配列に関しては、配列番号１〜配列番号８、そしてｃａｐＢ標的配列に関しては、配列番号９〜配列番号１４の配列を有するものが含まれる。オリゴヌクレオチドの態様には、ＤＮＡ主鎖もしくはＲＮＡ主鎖、混合ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、または少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ連結基を有するものが含まれる。オリゴヌクレオチドのいくつかの態様には、オリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結されることも可能なシグナル産生標識が含まれる。

他のバチルスまたは非バチルス属生物から区別可能な、セレウス菌複合群の生物を検出するこれらの方法では、炭疽菌のｐＸＯ１およびｐＸＯ２プラスミドの遺伝子配列を検出する核酸配列および方法に加えて、セレウス菌複合体のバチルス属種の１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列を検出するプローブが有用である。ｐＸＯ１および／またはｐＸＯ２プラスミドの遺伝物質の検出を、セレウス菌複合群の１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡあるいはｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出と組み合わせた際、組み合わせた情報は、毒性炭疽菌株を無毒性株またはセレウス菌複合体の他の種から区別するのに有用である。例えば、試料が、セレウス菌複合体のｒＲＮＡ配列またはｒＲＮＡをコードする遺伝子に関して陽性検出シグナルを提供するが、ｐＸＯ１およびｐＸＯ２標的配列両方に関して陰性シグナルを提供する場合、試料は病原性炭疽菌を含有しないが、セレウス菌複合体の別の種または非病原性炭疽菌株（すなわち両方のプラスミドを欠くもの、ｐＸＯ１−／ｐＸＯ２−）を含有すると合理的に結論付け可能である。試料が、セレウス菌複合体のｒＲＮＡ配列またはｒＲＮＡをコードする遺伝子に関して陽性検出シグナルを提供し、そしてｐＸＯ１およびｐＸＯ２プラスミド標的配列の１つに関して陽性シグナルを提供する場合、試料は１つのプラスミドを欠く炭疽菌（ｐＸＯ１−／ｐＸＯ２＋またはｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２−、どちらの陽性シグナルが検出されるかに応じる）を含有すると合理的に結論付け可能である。同様に、試料がセレウス菌複合体のｒＲＮＡ配列またはｒＲＮＡをコードする遺伝子に関して陽性検出シグナルを提供し、そしてｐＸＯ１およびｐＸＯ２プラスミド標的配列両方に関して陽性シグナルを提供する場合、試料は、野生型炭疽菌株におけるように、両方のプラスミドを含有する炭疽菌株（ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋）を含有すると合理的に結論付け可能である。大部分の場合、試料中の炭疽菌の存在を検出するのに有用な情報は、１つまたは両方のプラスミドに対するプローブからの陽性シグナルの検出（すなわちｐＸＯ１−／ｐＸＯ２＋またはｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２−またはｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋株）であろうし、そしてセレウス菌複合体の１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡあるいはｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出に関する陽性結果は、試料中の炭疽菌の存在に関する確認情報を提供するであろう。

炭疽菌のｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを設計するため、炭疽菌を含む多様なバチルス属種由来の、１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ両方をコードする遺伝子およびｒＲＮＡをコードする既知の遺伝子配列を比較して、そしてＢ．チューリンゲンシスおよびセレウス菌のものを除いて、炭疽菌配列が、緊密に関連するバチルス属種の同じ領域の配列から有意な相違を示す領域に相補的なオリゴヌクレオチドを選択した。例えば、炭疽菌の２３ＳｒＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドプローブ配列の選択には、炭疽菌の既知の２３ＳｒＲＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ２６７７３４）を、Ｂ．チューリンゲンシス、セレウス菌、Ｂ．ミコイデス、巨大菌、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびＢ．グロビスポラス（Ｂ．ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）の並列させた既知の２３ＳｒＲＮＡ配列に比較した。他の種と比較して、炭疽菌（およびＢ．チューリンゲンシスおよびセレウス菌）との間で最高量の相違を示した領域を、潜在的な標的として選択した。その後、上述の基準を用いて、特異的プローブオリゴマーを設計した（例えば予測される二次構造の限定、適切なＧＣ含量およびＴ_ｍ）。炭疽菌配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ１７６３２１）を、Ｂ．チューリンゲンシス、セレウス菌、Ｂ．ミコイデス、巨大菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．グロビスポラス、およびＢ．ステアロサーモフィルスの並列させた既知の配列に比較することによって、炭疽菌１６ＳｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする遺伝子に特異的なプローブを設計するため、同様の工程を行った。ヘルパーオリゴヌクレオチドとして働くことも可能なオリゴマーを設計し、そして設計したプローブの標的配列の近くに位置する領域を標的とし、特に、高次構造を含有すると予測される領域に向けた（先にＨｏｇａｎら、米国特許第５，０３０，５５７号に記載されるとおり）。以下の実施例で用いるように、ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標識プローブおよびその標的配列間のハイブリダイゼーションの動力学を増進し、そして／または標識プローブおよびその標的配列間のハイブリダイゼーションの度合いを増加させるように設計したが、とはいえ、こうして設計したヘルパーオリゴマーは、実施例に例示される態様に関して記載される特定の条件下で、最適に機能しなかった可能性もある。

バチルス属種の１６ＳｒＲＮＡ配列の検出に有用なオリゴヌクレオチドには、配列番号３１またはその相補鎖配列またはＲＮＡ均等物の標的配列に特異的にハイブリダイズするものが含まれる。こうしたオリゴヌクレオチドの態様には、配列番号１５〜配列番号２０のもの、およびその相補的またはＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。いくつかの態様において、これらのオリゴヌクレオチドの２以上の組み合わせは、１以上のオリゴマーが標識プローブであり、そして１以上のオリゴヌクレオチドが非標識であり、そして標識プローブとその標的配列のハイブリダイゼーションの効率を増加させるヘルパーオリゴヌクレオチドとして働く場合、１６ＳｒＲＮＡ標的配列の検出を促進する。ヘルパーオリゴマーの態様には、配列番号１７および配列番号１８のものまたはその相補配列またはＲＮＡ配列が含まれる。

バチルス属種の２３ＳｒＲＮＡ配列の検出に有用なオリゴヌクレオチドには、配列番号３２またはその相補鎖配列またはＲＮＡ均等物の標的配列に特異的にハイブリダイズするものが含まれる。態様には、配列番号２７〜配列番号３０、配列番号３５および配列番号３６のオリゴマーおよびその相補配列またはＲＮＡ配列が含まれる。いくつかの態様において、これらのオリゴヌクレオチドの２以上の組み合わせは、１以上のオリゴマーが非標識ヘルパーオリゴマーである場合、２３ＳｒＲＮＡ標的配列の検出を促進する。こうしたヘルパーオリゴマーの態様には、配列番号２７および配列番号２９のものまたはその相補配列またはＲＮＡ配列が含まれる。適切なハイブリダイゼーション条件が達成されたことを独立に確認するアッセイには、さらなるオリゴマーが含まれることも可能である。こうしたさらなるオリゴマーには、先に記載されるような、真性細菌配列にハイブリダイズするものが含まれる（Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，６７９，５２０号）。真性細菌プローブおよびヘルパーオリゴマーの態様は、配列番号４０〜４３のものである。

炭疽菌核酸を検出する方法
本発明の検出法で使用するため、炭疽菌生物（生存可能芽胞、生存細菌、またはその混合物を含む）を含有しうる試料を提供する。試料は、生物学的標本または環境試料を含むいかなる供給源由来であることも可能であるし、そして炭疽菌生物に加えて、他の生物学的（生存または生存不能）物質または不活性物質を含有することも可能である。例えば、生物学的試料または生物学的標本には、炭疽菌生物を含有しうる、生存または死亡生物由来のいかなる組織も含まれる。こうした試料には、例えば、ヒトまたは動物起源の出血液、末梢血、骨髄、血漿、皮膚損傷由来のものを含む生検試料、リンパ節、口腔咽頭組織、呼吸組織または滲出物または洗浄液、胃腸組織、神経系組織（例えば脳組織、髄膜、脳脊髄液）、尿、糞便、精液、または他の体液または組織が含まれる。表面および／または作業員が生きた細胞または芽胞で汚染されないように、炭疽菌を含有しうる試料の扱いには注意を払わなければならない。一般的に、試料を適切な微生物培地内にまたは培地上に接種し、そして周知の微生物学的技術を用いてインキュベーションして、バチルス属生物を増殖させる（例えば血液寒天プレート上にストリークして、そして１８〜２４時間増殖させる）。培養物を用いて、試料中に存在する生物に関する表現型情報を提供することも可能である（例えばコロニー形態、溶血活性）。次いで、炭疽菌核酸、特にｐＸＯ１およびｐＸＯ２プラスミドに所持される配列の存在に関して試験するため、培養した試料を用いて、生物の溶解物を作成して核酸を放出させる。

典型的には、培養した試料（例えば寒天プレートからの１以上のコロニーまたは約２〜４μｌの液体培養物）から生物学的物質を採取し、そして多様な周知の方法のいずれかを用いて、溶解して核酸を放出させる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋらｐｐ．１．２２−１．３９，ＧｒａｖｅｓＬ．Ｍ．ら，“ＵｎｉｖｅｒｓａｌＢａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｄｕｒｅ”，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら監修），１９９３，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ワシントンＤＣ）中，ｐｐ．６１７−６２２，Ｍｕｒｐｈｙら、米国特許第５，３７４，５２２号、およびＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３８６，０２４号を参照されたい）。培養した試料は、感染性生物を含有しうるため、好ましくは試料を処理して生存生物を殺し、そして芽胞を不活性化して、そして溶解させる。１つの方法は、約２〜４ループ分の細菌（約２〜４μｌ）を寒天プレートから採取し、界面活性剤を含有する溶解緩衝液（例えば約０．３５〜０．７ｍｌの０．１％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２０ｍＭコハク酸リチウム、ｐＨ５．５、１ｍＭＥＤＴＡ）と混合し、混合物を９０〜１０５℃に１５分間加熱し、そして混合物を１５分間、超音波処理した（例えば水槽超音波処理装置中）。溶解物を冷却して（例えば氷上）、標的配列の一本鎖ＤＮＡ型（ｓｓＤＮＡ）維持を補助することも可能である。溶解後、標準法を用いた重力または遠心分離によって（例えば微量遠心分離機中で１分間）、細胞破片を液体から分離することも可能である。さらなる試料調製工程には、例えば溶解物中のＲＮＡの加水分解（例えばＤＮＡ標的を検出するのに特異的なプローブとともに使用するため）が含まれることも可能である。ＲＮＡの加水分解は、塩基溶液を溶解物に添加し（例えば最終濃度０．８ＭＬｉＯＨ）、混合物を加熱し（例えば６０℃で１５分間）、そして次いで塩基を中和する（例えば酸および緩衝液で）ことによって、達成可能である。

少なくとも２つの核酸オリゴマープローブであって、ｐＸＯ１プラスミドに通常所持される遺伝子に特異的な少なくとも１つ、およびｐＸＯ２プラスミドに通常所持される遺伝子に特異的な少なくとも１つである、前記核酸オリゴマープローブを用いるハイブリダイゼーション反応中で、溶解物のアリコットを用いる。プローブオリゴマーは、プローブが相補的標的配列に特異的に結合して、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で、相補的塩基対形成によって、溶解物中の核酸配列にハイブリダイズする。こうしたハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野に周知であり、そして日常的な試験を行うことによって、いかなる配列および長さの核酸プローブに関しても、容易に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｐｐ．１．９０−１．９１、９．４７−９．５３、および１１．５５−１１．５７）。プローブおよびその意図される標的間の安定なハイブリダイゼーション複合体の形成は、プローブのすべての塩基が標的配列に完全に相補的であるか、またはプローブ中の塩基が、意図される標的配列に実質的に相補的である、ハイブリダイゼーションから生じうる。本発明の検出プローブは、その意図される標的に少なくとも８０％相補的であり、そしてより好ましくは標的配列に９０〜１００％の範囲で相補的である。オリゴマープローブが結合する標的配列は、安定なハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするいかなる型であることも可能である。例えば、標的核酸は、完全遺伝子またはプラスミドにクローニングされた遺伝子（スーパーコイル型または弛緩環状型、または直鎖型）のように、完全でそして損なわれていないことも可能であるし、あるいはプローブが結合し、そして安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するのを可能にするのに十分であれば、標的核酸は、標的遺伝子の一部を含有する連続配列のように、断片であることも可能である。

ハイブリダイゼーション条件および方法は周知であり、そして別の箇所に詳細に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１．１０１−１．１０２、９．４７−９．６２、１１．７−１１．８、１１．１２−１１．１３、１１．１７−１１．１９、１１．４５−１１．６１、付録Ｂ、Ｃ、およびＥ）。関連する動力学が好ましいため、溶液相ハイブリダイゼーションが好ましい（Ｋｏｈｎｅ、米国特許第４，８５１，３３０号）。例えば、上述のような細菌溶解物のアリコットを、緩衝塩溶液などのハイブリダイゼーション緩衝液と、そして少なくとも、ｐＸＯ１およびｐＸＯ２プラスミド上の配列に独立に、そして特異的にハイブリダイズする核酸プローブと混合する。アッセイの内部対照または較正として働く、既知の配列にハイブリダイズするプローブなど、さらなるプローブまたは核酸が混合物に含まれていることも可能である。混合物を、それぞれの標的配列に対するプローブのＴ_ｍより低い温度で、数分から数時間インキュベーションして、標的へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。プローブのＴ_ｍは、オリゴマーの長さおよびＧＣ含量に基づき標準対数（ｓｔａｎｄａｒｄｌｏｇａｒｉｔｈｍ）を用いることによって計算可能であるし（例えばＴ_ｍ＝０．４０１（長さｎｔ）＋０．５７６（％Ｇ＋Ｃ）＋２４．８５２）、またはプローブのＴ_ｍは、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１１．５５−５７）を用いることによって、実験的に決定可能である。ハイブリダイゼーション後、多様な既知の方法のいずれかを用いることによって、例えばプローブに会合したシグナル、または標的にプローブが結合することから生じるシグナル、または酵素もしくは酵素基質などの、シグナルを生じる別の物質とプローブが相互作用することから生じるシグナルを検出することによって、安定な複合体を検出する。１つの態様において、例えば、５０μｌ〜１００μｌの溶解物を、等体積のハイブリダイゼーション緩衝液（例えば０．９Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５、０．１６％ＳＤＳ）、並びにｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的配列に対する標識核酸プローブ（各０．２ｐｍｏｌ）と混合する。オリゴマープローブおよびそれぞれの標的の計算されたＴ_ｍより低い温度で、混合物をインキュベーションして（例えば５５〜６０℃で２０分間〜１時間）、プローブおよび標的配列が特異的にハイブリダイズするのを可能にする。安定なハイブリダイゼーション複合体に存在するプローブを検出するのに適した方法いずれかを用いることによって、安定なハイブリダイゼーション複合体を検出する。

未結合オリゴマーを除去し、そして残ったプローブ（すなわち複合体中で結合しているもの）を検出した後、複合体中で検出されるか、または続いて複合体から分離されるかいずれかで、プローブ−標的の安定なハイブリダイゼーション複合体の検出を達成することも可能である。結合したプローブが未結合プローブと区別される均質系を用いることによって、安定なハイブリダイゼーション複合体の検出を達成することも可能である。好ましい態様において、均質検出工程を用いて、直ちに、それぞれの標的核酸に結合する標識プローブを検出する（例えばその詳細が本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１５８８−１５９４（１９８９）、Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号、並びにＬｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号）。「均質検出可能標識」を、プローブオリゴマーに直接または間接的に付着させることも可能であり、そして標識は、プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたかどうかに基づいて検出される。結合した均質検出可能標識は、未結合プローブ上の標識とは区別可能であるため、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズした標識プローブを物理的に分離することなく、標識を検出可能である。こうした均質検出可能標識が知られ、こうした標識を核酸オリゴマーに付着させてそしてこれらを検出する方法もまた知られる（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号、およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号）。本発明の方法のため、標識からのシグナルを検出可能ないかなる検出装置も使用可能である。以下に例示する態様において、照度計（例えばＧＥＮ−ＰＲＯＢＥ（登録商標）ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いることによって、均質検出反応において、化学発光シグナル（「相対光単位」またはＲＬＵ）を検出した。

均質アッセイで使用するのに好ましい標識は、化学発光化合物（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号および第５，６３９，６０４号）である。こうした化学発光標識にはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば標準的ＡＥまたはその誘導体、例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥが含まれる。好ましい標識は、実質的に先に記載されるようなリンカーを介して、プローブ配列に付着した化学発光ＡＥ化合物である（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号、特に第１０欄第６行から第１１欄第３行および実施例８、これらの技術的詳細が本明細書に援用される）。例えば、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドプローブでは、配列番号１、配列番号８、配列番号１４、配列番号２８および配列番号３０のｎｔ１４および１５の間、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のｎｔ１２および１３の間、配列番号１３のｎｔ１０および１１の間、配列番号１５および配列番号１６のｎｔ１１および１２の間、配列番号４、配列番号６および配列番号７のｎｔ９および１０の間、配列番号５および配列番号７のｎｔ１３および１４の間、並びに配列番号２のｎｔ１９および２０の間に、ＡＥ標識を付着させた。オリゴヌクレオチドプローブのさらなる態様には、配列番号１のｎｔ８および９、またはｎｔ１１および１２の間；配列番号４のｎｔ１１および１２の間、またはｎｔ１４および１５の間、またはｎｔ２０および２１の間；並びに配列番号７のｎｔ１５および１６の間、またはｎｔ１８および１９の間に、ＡＥ標識を付着させたものが含まれる。

ｐＸＯ１およびｐＸＯ２核酸配列を検出するためのキット
本発明はまた、ｐａｇＡ遺伝子配列に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸オリゴマー、およびｃａｐＢ遺伝子配列に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸オリゴマーを用いることによって、炭疽菌の存在を検出するアッセイを行うためのキットも含む。こうしたキットの態様は、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能にする、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のいずれか１つに含有される標的配列に十分に相補的な少なくとも１つの核酸オリゴマー、および標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能にする、配列番号２５または配列番号２６に含有される標的配列に十分に相補的な少なくとも１つの核酸オリゴマーを含有する。特定の好ましいキットは、セレウス菌複合群の１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいはｒＲＮＡをコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの核酸オリゴマーをさらに含有する。こうしたキットの態様は、配列番号３１に含有される１６ＳｒＲＮＡまたはそのコード配列に特異的な標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的である核酸オリゴマー、その相補配列、またはＲＮＡ均等物、および／または配列番号３２に含有される２３ＳｒＲＮＡまたはそのコード配列の標的配列への特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的である核酸オリゴマー、その相補配列、またはＲＮＡ均等物を含有する。キットの他の態様には、バチルス属種が存在しなくても、真性細菌標的配列にハイブリダイズし、そして該配列を検出するため、内部対照として働く、少なくとも１つの核酸プローブが含まれる。真性細菌プローブの好ましい態様は、ｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする。

典型的なキットには、ｐａｇＡ標的配列に特異的に結合する少なくとも１つの核酸オリゴマーであって、配列番号１〜配列番号８のいずれか１つの配列からなる、前記オリゴマー、およびｃａｐＢ標的配列に特異的に結合する少なくとも１つの核酸オリゴマーであって、配列番号９〜配列番号１４のいずれか１つの配列からなる、前記オリゴマーが含まれる。キットの他の態様にはまた、少なくとも１つのｐａｇＡ特異的オリゴマーおよび少なくとも１つのｃａｐＢ特異的オリゴマーに加えて、配列番号１５〜配列番号２０および配列番号２７〜配列番号３０のいずれか１つからなるオリゴマーなどのセレウス菌複合群のｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードするＤＮＡの標的配列に特異的に結合するオリゴマーが含まれることも可能である。セレウス菌複合群のｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードするＤＮＡの標的配列に特異的に結合するオリゴマーを含むキットには、少なくとも１つの標識プローブオリゴマー、および少なくとも１つの非標識ヘルパーオリゴマーであって、どちらも各ｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ標的をコードするＤＮＡに特異的な前記オリゴマーが含まれることも可能である。こうしたキットの態様には、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードするＤＮＡの標的配列に特異的なオリゴマーを含有するものが含まれ、ここで、標識オリゴマーは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９および配列番号２０のいずれか１つからなる配列を有し、そして非標識ヘルパーオリゴマーは、配列番号１７および配列番号１８のいずれか１つからなる配列を有する。こうしたキットの他の態様には、２３ＳｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードするＤＮＡの標的配列に特異的なオリゴマーを含有するものが含まれ、ここで、標識オリゴマーは、配列番号２８または配列番号３０からなる配列を有し、そして非標識ヘルパーオリゴマーは、配列番号２７および配列番号２９からなる配列を有する。他の態様には、オリゴマーが含まれ、ここで配列番号４０が標識プローブであり、そして場合によって、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３の１以上のヘルパーオリゴマーが含まれる。本発明のキットは、少なくとも１つのｐａｇＡ特異的オリゴマーおよび少なくとも１つのｃａｐＢ特異的オリゴマーがあるという条件で、こうした核酸オリゴマーのいかなる組み合わせを含むことも可能である。

キットはまた、ｉｎｖｉｔｒｏのハイブリダイゼーション反応で検出しようとする炭疽菌核酸を部分的に精製するのに使用可能な、オリゴヌクレオチドを含む試薬を含有することも可能である。例えば、キットは、試料からｐＸＯ１および／またはｐＸＯ２標的核酸を精製するための捕捉オリゴマーとして働く１以上のオリゴマーを含有することも可能である。捕捉オリゴマーの例は、ｐＸＯ１および／またはｐＸＯ２プラスミド核酸の部分に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドの配列を有する。こうした捕捉オリゴマーは、試料から特定の遺伝子でなく、これらの遺伝子配列を含有するプラスミドを部分的に精製し、そして濃縮するように働くため、ｐａｇＡまたはｃａｐＢ遺伝子配列いずれかの中の配列に特異的にハイブリダイズする必要はない。こうした捕捉工程は、ハイブリダイゼーション反応に加えて、プラスミドの存在を検出するためのものである。捕捉オリゴマーの態様は、ｐＸＯ１および／またはｐＸＯ２核酸中の配列に相補的な配列を有する。捕捉オリゴマーは、先に詳細に記載されるように、プラスミド核酸に相補的でないが、相補配列にハイブリダイズして標的核酸を捕捉する、共有結合した３’配列または５’配列を有することも可能である（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、米国特許第６，１１０，６７８号）。

本発明の方法を実施するのに有用なキットには、互いに組み合わせてパッケージングされる、本明細書に開示する核酸オリゴヌクレオチドいずれかを含むものが含まれることも可能である。キットにはまた、試料から、ｐａｇＡ遺伝子およびｃａｐＢ遺伝子の中の標的配列を所持するｐＸＯ１プラスミドおよびｐＸＯ２プラスミドを精製するための捕捉オリゴマーが含まれることも可能であり、捕捉オリゴマーは、プローブと組み合わせてパッケージングされることも可能である。したがって、当業者には、本発明が多くの異なるキット形態を含むことが明らかであろう。

本発明は、比較的少ない試薬および方法工程を用いることによって、試料中の炭疽菌の存在を検出するのに有用である。該方法は、大規模な生化学反応または複雑な装置を必要としないため、試料を受け取り、そして微生物学工程を行って、生物を増殖させ、そして試料中の炭疽菌に関して生物の表現型を調べる実験室に特に有用である。本発明の比較的単純な方法は、細胞溶解物中の核酸に核酸オリゴヌクレオチド（検出プローブ）をハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに関連する標識を検出して、試料中の病原性に関連する炭疽菌遺伝物質の存在を示す工程を含む。この比較的単純な試験は、洗練された微生物学および／または分子生物学の技術が利用可能でないか、または日常的に実施されない実験室またはフィールド条件において用いるのに役立つ。さらに、該アッセイは、比較的短いインキュベーション期間の数工程しか必要としないため、多くの臨床アッセイに比較して、比較的短い期間で、試料中の炭疽菌を検出し、そして同定する。該アッセイは、炭疽菌の毒性と関連する少なくとも２つのマーカーの検出に頼り、そしてこうして、無毒性炭疽菌株（すなわちｐＸＯ１および／またはｐＸＯ２を欠くもの）または他のバチルス属種に比較して、毒性株を検出する利点を提供する。ｒＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする遺伝子の検出に特異的なプローブもまた含む態様はまた、セレウス菌複合群のありうるメンバーの同定を制限する利点も有し、これは炭疽菌に関して陰性と評価される試料に関してさらなる情報を提供する。内部対照を含む態様は、バチルス属種がまったく検出されなかったとしても、アッセイが適切に行われたことを示す、さらなる情報を提供する。

本明細書に開示する方法は、実行が技術的に容易であり、そしてＬＲＮレベルＡ実験室（ネットワーク実験室は、ＣＤＣによってレベルＡ〜Ｄに指定され、これは安全性、封じ込めおよび技術的熟練の前進的に厳しくなるレベルである）を含む多くの実験室で使用可能である。該アッセイには、ｉｎｖｉｔｒｏ増幅法は必要でないため、試料交差汚染および実験室汚染の可能性が最小限となり、したがって、偽陽性結果を得る可能性が最小限になる。開示する方法は、１つの小さい細菌コロニーと均等な約１０^７ＣＦＵから出発する、炭疽菌の高感度でそして特異的な検出を提供し、試料を実験室培養して、８〜１２時間以内で試験が行われることを可能にし、そしてアッセイを開始して約１時間以内に試験結果を提供する。開示する方法は、臨床試料または環境試料由来の培養標本中の炭疽菌を検出するための、信頼性が高く、そして迅速なアッセイを提供する。該方法は、非炭疽菌試料を排除する（すなわち炭疽菌を含有すると疑われる試料を排除する）方式で、バチルス属培養物を正確に同定するため、該アッセイは、Ｂ．チューリンゲンシスを含有するものなどのさらなる試験を必要としない試料を迅速に同定する。該アッセイはまた、ＬＲＮレベルＢ（またはより高次の）実験室に、あるいは炭疽菌株同定照会実験室に送るべきものなど、さらなる試験を必要とする試料も同定する。

本発明の一般的な原理は、いくつかの態様を代表する、以下の実施例を参照することによって、より完全に認識可能である。

（実施例１）
ｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的配列の調製
ｐａｇＡおよびｃａｐＢ遺伝子配列由来の２つの合成遺伝子標的配列を合成して、毒性炭疽菌の取り扱いを必要とすることなく、プラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２に所持される遺伝子を検出する、オリゴヌクレオチド試験の既知の標準を提供した。

ｐａｇＡ標的配列（配列番号３３）は、標準的分子生物学技術を用いることによって、ｐＸＯ１プラスミドからクローニングした、ｐａｇＡ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２２５８９）のサブ配列からなる。簡潔には、標準的微生物学法を用いて、ｐＸＯ１プラスミドを含有する細胞を実験室培地上で増殖させ、細胞を収集して、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５の存在下で、混合物を９５℃で２０分間インキュベーションして、そして６０℃で１０〜１５分間超音波処理することによって、溶解した。溶解物のアリコット（０．５〜３μｌ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号）において、プライマーとともに、テンプレートとして用いて、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２２５８９のｎｔ２３９３〜３５００を含有する１．１０８ｋｂの断片を増幅した。日常的なクロマトグラフィー法を用いて、増幅された合成断片を精製し、そして精製された断片を配列決定して、配列番号３３を含有することを確認した。精製断片をプラスミドベクターにクローニングし、そして挿入された断片を含有するクローンを同定した。クローン由来のプラスミドＤＮＡを精製し、そして挿入物を配列決定して、配列番号３３であることを確認した。標準的分光光度法を用いることによって、配列番号３３を含有する、精製されたプラスミドＤＮＡを定量化し、そして適切に希釈して、以下の実施例のいくつかに記載するように、試験中、既知の数のｐａｇＡ標的配列を提供した。

ｃａｐＢ標的配列は、プラスミドｐＸＯ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１８８９３５）に含有される５６０ｂｐ配列（配列番号３４）である。ｃａｐＢ遺伝子中の重複配列を含有する、一連の合成一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチド、すなわち１または２の他のｓｓＤＮＡオリゴマーの末端と、５’端および／または３’端で約２０ｎｔ重複した各ｓｓＤＮＡオリゴマーをともにハイブリダイズさせることによって、このｃａｐＢ標的配列をｉｎｖｉｔｒｏで合成し、そして重複端を相補端配列とハイブリダイズさせて、連続配列を含有する部分的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を産生した。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用い、そして部分的ｄｓＤＮＡ中のハイブリダイズしたオリゴマー配列をテンプレートとして用いることにより、部分的ｄｓＤＮＡ中のｓｓＤＮＡの３’端を伸長させることによって、ｉｎｖｉｔｒｏで相補鎖を合成して、主鎖にギャップを持つ完全ｄｓＤＮＡを形成した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いることによって、合成鎖の末端をともに連結して、共有結合した完全ｄｓＤＮＡを産生して、これをＰＣＲ反応で増幅した。日常的なクロマトグラフィー法を用いることによって、増幅されたＤＮＡを精製し、そして精製されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニングし、そして標準法を用いることによって、大腸菌宿主細胞に形質転換した。日常的なクロマトグラフィー法を用いることによって、ｃａｐＢ標的断片の予測されるサイズを持つプラスミドを含有するクローンを同定し、そして２つのこうしたクローン由来の挿入断片を配列決定して、これらが配列番号３４（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２４１５０のｎｔ４７１〜１０３０に対応する）を含有することを示した。クローニングされた、ｃａｐＢ標的配列を含有するプラスミドＤＮＡを精製し、そして標準法を用いて定量化して、以下の実施例のいくつかに記載される試験において、既知の数のｃａｐＢ標的配列を提供した。

（実施例２）
プラスミドｐＸＯ１およびプラスミドｐＸＯ２に対するプローブ
二次構造が最小限であり、そしてＴ_ｍが約５９〜７５℃の範囲である、ｐａｇＡ（配列番号３３）配列およびｃａｐＢ（配列番号３４）配列内の領域を選択することによって、プローブを設計した。本実施例は、各標的配列に対する２つのプローブを用いて得た結果を示す。

ハイブリダイゼーションおよび検出反応において、プラスミドｐＸＯ１のｐａｇＡ遺伝子配列に特異的な配列番号４および配列番号７、並びにプラスミドｐＸＯ２のｃａｐＢ遺伝子配列に特異的な配列番号９および配列番号１１のＡＥ標識プローブ（反応あたり各０．２ｐｍｏｌ）を用いて、該プローブがそれぞれの標的に特異的にハイブリダイズすることを示した。反応混合物は、加熱および超音波法を用いて、実質的に上述のとおりに作成したバチルス属（非炭疽菌種）の溶解物であった。溶解混合物を、定義される量の標的配列（実施例１に記載）と混合して、各個々の反応混合物が、ｐａｇＡ遺伝子配列（配列番号４および配列番号７両方に相補的）を１０^９または１０^１０コピー、あるいはｃａｐＢ遺伝子配列（配列番号９および配列番号１１両方に相補的）を１０^９または１０^１０コピー含有するようにした。ｐａｇＡ検出のための配列番号４と配列番号７のプローブ、およびｃａｐＢ検出のための配列番号９と配列番号１１のプローブを含有する別個のハイブリダイゼーション反応において、反応あたり各プローブ０．２ｐｍｏｌと、反応混合物を、溶液中、６０℃で２０〜３０分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、実質的に先に記載されるように（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号）、未結合プローブ上の標識を加水分解して、そして結合したプローブ由来の発光を相対光単位（「ＲＬＵ」）として照度計で検出した。同一標的およびプローブを用いるが、ヘルパーオリゴマーとして作用する非標識オリゴヌクレオチド（反応あたり各２ｐｍｏｌ）もまた含む、第二のセットの実験を以下のように行った：配列番号３および配列番号８の非標識オリゴマーを、配列番号４および配列番号７の標識プローブ（各０．２ｐｍｏｌ）を含有するハイブリダイゼーション反応に添加し、そして配列番号１０および配列番号１２の非標識オリゴマーを、配列番号９および配列番号１１の標識プローブ（各０．２ｐｍｏｌ）を含有するハイブリダイゼーション反応に添加した。（非標識オリゴヌクレオチドは、あらかじめ、リンカーアームを介してＡＥ標識されていたが、オリゴヌクレオチドをこれらの反応に添加する前にＡＥを加水分解した）。各組み合わせに関して、反応を４回行い、そしてこれらの反応に関して、検出されたＲＬＵの平均を表１に示す。

表１．ｐａｇＡおよびｃａｐＢハイブリダイゼーション結果

結果は、ハイブリダイゼーション反応において、開示した標識オリゴヌクレオチドを用いることによる、炭疽菌のプラスミドｐＸＯ１およびｐＸＯ２に特異的な配列の検出を示す。１０^１０標的を含有する反応中の非標識オリゴマーの存在は、こうした非標識オリゴマーが存在しない類似の反応に比較して、これらの試料に関して、幾分高いシグナルを提供した。

（実施例３）
細菌溶解物の試験
実施例２に実質的に記載するようにプローブ混合物を用いて、一晩コロニーから調製した細菌細胞の溶解物を同様にアッセイした。これらの試験のため、血液寒天プレートに細菌を接種して、一晩（１８〜２４時間）増殖させた。接種したプレートからコロニーを選択し、そして２つの１μｌループ分の細菌を０．３ｍｌの溶解試薬（０．１％ＬＬＳ、２０ｍＭコハク酸リチウム、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．５）に添加し、そして混合物を１００〜１０５℃で１５分間加熱し、そして次いで水槽超音波処理装置中で１５分間超音波処理した。ハイブリダイゼーション反応のため、配列番号４（塩基９および１０の間でリンカーを用いて標識）、配列番号７（塩基１３および１４の間でリンカーを用いて標識）、配列番号９（塩基１２および１３の間でリンカーを用いて標識）、および配列番号１１（塩基１２および１３の間でリンカーを用いて標識）のＡＥ標識プローブを含有する、５０μｌの２Ｘハイブリダイゼーション試薬（２０ｍＭＥＧＴＡ、２０ｍＭＥＤＴＡ、２％ＬＬＳ、１００ｍＭコハク酸、１．２Ｍ塩化リチウム、２３０ｍＭ水酸化リチウム、ｐＨ４．７）に、５０μｌの超音波処理した溶解物を添加して、理論的にはプローブあたり最大４ｘ１０^６ＲＬＵを達成し、そして混合物を６０℃で２０〜３０分間インキュベーションして、ハイブリダイゼーションを可能にした。加水分解（ｐＨ８．５で塩基試薬を添加した後、６０℃で１０分間）によって、未結合プローブ上の標識を不活性化し、そして照度計を用いることによって、結合プローブについて検出されたＲＬＵを測定した。４０，０００より高いＲＬＵが検出されたらアッセイを「陽性」とスコア付けし、２０，０００より低いＲＬＵが検出されたらアッセイを「陰性」とスコア付けし、そして２０，００１〜３９，９９９の間のＲＬＵが検出されたら「疑わしい」とスコア付けした。大部分の場合、元来の溶解物の１以上のさらなるアリコットに対して試験を反復することによって、疑わしいアッセイを陰性または陽性いずれかに決定した。試験は「盲検」様式で行われ、すなわち１人の人が試料を調製し、そして含有される試料が何であるかを知らず、そして結果が得られた後に試料の内容物を知る、第二の人によって、アッセイを行った。各試料溶解物に関して、二つ組以上のアッセイを行った。陰性対照は、セレウス菌の溶解物であり、１つの陽性対照は、ｐＸＯ１およびｐＸＯ２両方を含有する炭疽菌（ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋、パスツール株）の溶解物であり、そして別の陽性対照は、ｐＸＯ１プラスミドのみを含有する炭疽菌（ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２−、スターン株）であった。セレウス菌溶解物は、常に陰性結果を提供し、炭疽菌ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋溶解物は、常に陽性結果を提供し、そして炭疽菌ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２−溶解物は、陽性または疑わしい結果を提供した。セレウス菌および炭疽菌ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋の２：１混合物から作成した溶解物は、疑わしい結果を提供した（平均３１，９２５ＲＬＵ）。実験試料（すなわち対照試料を含まない）に対して行った試験の累積結果を表２に示す。

表２．細菌の異なる種および株を用いて得た結果

これらの試験は、炭疽菌（ｐＸＯ１＋／ｐＸＯ２＋）株を含有することが知られる２４の試料に対して行う６１の別個のアッセイ、および１６の他のバチルス属種および２８の非炭疽菌種（エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびパエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む）、および少なくとも３９の異なる株を含む試料に対して行った１３０のアッセイを含んだ。炭疽菌含有試料に関しては、結果は６２，４００ＲＬＵの平均値、６４，９００ＲＬＵの中央値を有し、そしてアッセイ感度は９８．４％であった。炭疽菌を含有しない試料に関しては、結果は、４，５２０ＲＬＵの平均値、４，０００ＲＬＵの中央値を有し、そしてアッセイ特異性は９８．５％であった。これらの結果は、該アッセイが、生物学的試料から作成された溶解物中に存在する炭疽菌を有効に検出することを示す。

（実施例４）
セレウス菌複合群種における２３ＳｒＲＮＡ配列の検出
本実施例は、２３ＳｒＲＮＡ配列およびｒＲＮＡをコードするＤＮＡが、配列番号３２の標的配列に特異的な配列番号３５のオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、セレウス菌複合群のメンバーを検出可能であることを示す。本実施例はまた、２０分間インキュベーションした後のプローブおよび標的配列のハイブリダイゼーションが、ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にするのに十分であったことを示す。これらの試験のため、オリゴヌクレオチドに対してリンカーを用いて、配列番号３５のプローブオリゴヌクレオチドを、残基１０および１１間で、ＡＥで標識した。

セレウス菌複合群に対する標識プローブの特異性を示すため、生物、セレウス菌および巨大菌細胞を血液寒天プレート上で一晩増殖させ、そして各試験試料について、各生物に関し、３つの１μｌループ分の細胞を収集した。０．１５ｍｌの溶解試薬（０．１％ＬＬＳ、２０ｍＭコハク酸リチウム、ｐＨ５．５、１ｍＭＥＤＴＡ）に細胞を懸濁し、１０秒間ボルテックス混合し、そして混合物を１００℃で１５分間加熱して、細胞を溶解させ、そして溶解物を５秒間ボルテックスした。対照１セットに、各溶解物５μｌを１ｍｌの溶液（０．４ＭＬｉＯＨ、０．４ＭＨＣｌ、５０ｍＭコハク酸リチウム）に希釈し、そこから０．１ｍｌを取って、ｒＲＮＡおよびｒＲＮＡをコードするＤＮＡの真性細菌配列（Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，６７９，５２０号）、すなわちセレウス菌および巨大菌両方にある配列に結合する非標識ヘルパーオリゴマー（配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３）とともに、陽性対照標識プローブ（配列番号４０）を用いて、ハイブリダイゼーション試験した。０．１ｍｌの２ＭＬｉＯＨ（最終濃度、０．８ＭＬｉＯＨ）と混合して、そして６０℃で１５分間加熱し、そして次いで０．２５ｍｌの中和試薬（０．８ＭＨＣｌ、１００ｍＭコハク酸Ｌｉ）を添加して、５〜５．５の間のｐＨを生じることによって、溶解物の残った部分を塩基性条件下でプロセシングした（「塩基プロセシングされた」と称する）。溶解物は、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含有し、一方、塩基プロセシングされた溶解物は、ＤＮＡを含有するが、ＲＮＡをほとんどまたはまったく含有しないと予測される。

ハイブリダイゼーション反応のため（各試料に関して二つ組で行う）、０．１ｍｌの溶解物（１：３００に希釈）または塩基プロセシングされた溶解物を、試験したＡＥ標識オリゴヌクレオチドプローブ（約０．２ｐｍｏｌ）各々と独立に混合して、反応あたり約２ｘ１０^７ＲＬＵを提供した。各混合物を、６０℃で４５分間インキュベーションして、ハイブリダイゼーションを可能にし、そして次いで、０．３ｍｌの選択試薬（１８２ｍＭＮａＯＨ、６００ｍＭホウ酸、１％ｖ／ｖＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）を添加し、そして混合物を６０℃で１０分間インキュベーションして、均質反応混合物における未結合標識プローブ上の標識を加水分解した。次いで、結合したプローブからの発光シグナル（ＲＬＵ）を、照度計（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０、Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）中で２秒間検出した。陰性対照を同一に、しかしプローブのみを含有し、そして細菌標的核酸を含有せずに処理した（「なし」）。

これらの試験の結果を表３に示し、この表は、各試料に関して検出される二つ組ハイブリダイゼーション反応の平均ＲＬＵを示す。塩基プロセシングされなかった溶解物（第５列）に関しては、配列番号４０の標識プローブ（ヘルパーオリゴマーを伴う）を用いることによって検出されるハイブリダイゼーションシグナルは、試料調製中、ＲＮＡが加水分解されないため、ｒＲＮＡおよびｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（ｒＤＮＡ）両方に対するハイブリダイゼーションを検出する。塩基プロセシングされた試料の結果（第３列および第４列）は、これらの試料のＲＮＡが加水分解されているため、ｒＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを検出する。

表３：巨大菌と比較したセレウス菌におけるｒＲＮＡおよびｒＤＮＡの検出

これらの結果は、配列番号３５プローブ（第３列）がセレウス菌試料に対して陽性シグナルを提供し、そしてセレウス菌複合群にないバチルス属種である、巨大菌を含有する試料に関しては、有意に減少したシグナル、すなわち陰性結果を提供したことを示す。したがって、配列番号３５は、他のバチルス属種からセレウス菌複合種を区別して認識するプローブである。真性細菌標的配列に対する、標識した配列番号４０のプローブ（第４列および第５列）は、すべての試料に対して陽性シグナル（１０，０００ＲＬＵより高いシグナル）を提供し、そしてアッセイの内部陽性対照として働いて、試料プロセシング工程およびハイブリダイゼーション工程が適切に行われたこと、並びに試料が、陽性シグナルを産生するのに十分な数の標的核酸を含有したことを示す。

類似の実験において、配列番号３５の標識プローブおよびセレウス菌を含有する試料を用いるアッセイで、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間を短くした。上述の方法を用いて、セレウス菌試料（血液寒天上で一晩増殖させたもの由来の２つの１μｌループ分）を収集し、そして溶解し、塩基プロセシングし、そして２０〜４５分間の間で標識プローブとハイブリダイズさせた。表４に示すように、試料１および２に関して、溶解は１０分間であり、塩基プロセシングは１０分間であり、そしてハイブリダイゼーションは４０分間であり；そして３〜８の試料に関して、溶解は１５分間であり、塩基プロセシングは１５分間であり、そしてハイブリダイゼーションは２０〜４０分間であった。次いで、すべての試料に関して、ハイブリダイゼーション混合物を選択試薬で処理し、そして上述のようにシグナル（ＲＬＵ）を検出した。陽性対照は、実験試料と同じ最終濃度の溶解試薬およびハイブリダイゼーション試薬の混合物であるが、溶解物の代わりに合成ＤＮＡオリゴマー（配列番号３２）を添加した。陰性対照は、標識プローブオリゴマーのみを添加した、試薬の類似の混合物である（すなわち標的核酸なし）。これらのアッセイの結果（二つ組試験の平均ＲＬＵ）を表４に示す。

表４：多様なハイブリダイゼーション時間後の、配列番号３５を用いた２３ＳｒＲＮＡの検出

これらの結果は、多様な条件およびわずか２０分間のハイブリダイゼーションを用いて、配列番号３５のプローブが、試料中のセレウス菌複合群ｒＲＮＡの存在を検出することを示す。

（実施例５）
ｃａｐＢ標的配列の検出
これらの実験において、標的核酸としてプラスミドにクローニングされたｃａｐＢ配列（配列番号３４）を用いて、ｃａｐＢ標的配列に特異的なプローブを試験した。標準法を用いることによって、配列番号３４を含有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクション大腸菌から単離し、標準的分光光度法を用いることによって定量化し、そして損なわれていない環状プラスミドまたは直鎖プラスミドＤＮＡ（すなわち制限エンドヌクレアーゼで切断することによって直鎖にしたもの）いずれかとしてハイブリダイゼーション試験に用いた。標的ＤＮＡをハイブリダイゼーション反応あたり、２ｘ１０^７〜２ｘ１０^９コピーでアッセイした（環状ＤＮＡでは２ｘ１０^７および２ｘ１０^８、そして直鎖ＤＮＡでは２ｘ１０^８および２ｘ１０^９）。標識プローブは配列番号９または配列番号１１のオリゴマーであり、これらオリゴマーを、さらなる非標識オリゴヌクレオチド（配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２）を伴い、または伴わず、ハイブリダイゼーション反応に用いた。非標識オリゴヌクレオチドは、あらかじめリンカーアームを介してＡＥ標識されていたが、オリゴヌクレオチドをこれらの反応に用いる前に、ＡＥ標識を加水分解した。

実施例４に記載するのと、実質的に同一の方法を用いて、偽の溶解物として反応物を調製した。簡潔には、最終体積１５０μｌ中、非標識オリゴヌクレオチド（表５に示すように、各１０ｐｍｏｌの配列番号１０および配列番号１１または配列番号１０および配列番号１２）を含む、または含まない溶解試薬と、プラスミドＤＮＡ（約１０^８、１０^９または１０^１０コピーを含有する１０μｌ）を混合し、そして１００℃で１５分間加熱して溶解条件を模倣した。次いで、１００μｌの２ＭＬｉＯＨを添加して、そして混合し、そして混合物を６０℃で１５分間加熱した。次いで、２５０μｌの中和試薬（０．８ＭＨＣｌ、１００ｍＭコハク酸Ｌｉ）を添加して、ｐＨ５〜５．５を生じた。ハイブリダイゼーション前に、標的含有混合物を１００℃で５分間加熱し、そして次いで氷上で迅速に冷却する（ハイブリダイゼーション前１００℃）か、または室温で維持することを許した（ハイブリダイゼーション前ＲＴ）。プローブを添加して、そして混合物を６０℃で４５分間インキュベーションすることによって、各混合物１００μｌの二つ組アリコットを、反応あたり約２ｘ１０^７ＲＬＵ（すなわち約０．２ｐｍｏｌ）に均等の配列番号９または配列番号１１のＡＥ標識プローブとのハイブリダイゼーションに関して試験した。次いで、未結合プローブ上の標識を不活性化するため、３００μｌの選択試薬を各反応混合物に添加して、その後、６０℃で１０分間インキュベーションし、そして前述のように、照度計を用いることによって、発光（ＲＬＵ）を検出した。これらの試験のため、標識プローブの陰性対照は、標識プローブオリゴマーを含有するが、標的ＤＮＡまたは非標識オリゴマーを含有しない、類似の組成混合物であり、そして非標識オリゴマーの陰性対照は、非標識オリゴマーおよび標的ＤＮＡ（２ｘ１０^８〜２ｘ１０^９コピー／反応）を含有するが、標識プローブオリゴマーを含有しない類似の組成混合物であった。すべての対照を実験試験試料と同様に処理した。これらのアッセイの結果（検出された平均ＲＬＵ）を表５に示す。

表５：ｃａｐＢ標的配列の検出

結果は、配列番号９および配列番号１１のどちらのプローブも、試験したすべてのコピー数（反応あたり２ｘ１０^７〜２ｘ１０^９コピー）でｃａｐＢ標的配列に有効にハイブリダイズし、そしてｃａｐＢ標的配列を検出したことを例示する。どちらのプローブも環状ＤＮＡまたは直鎖ＤＮＡいずれのｃａｐＢ標的配列も検出した。室温（ＲＴ）で処理した試料に比較して、ハイブリダイゼーション前に標的を含有する試料を１００℃に加熱しても、ｃａｐＢ標的の検出には有意に影響を及ぼさず、そして多くの場合で、対応する加熱試料に比較して、ＲＴ試料で、より高いＲＬＵが検出された。非標識オリゴヌクレオチドを使用しなくても、すべての実験試料に関して、バックグラウンド（標識プローブの対照のＲＬＵ）より高い検出可能シグナルが得られた。これらの結果は、配列番号９および配列番号１１のプローブとのハイブリダイゼーションによって、多様な試料条件を用いて、ｃａｐＢ標的配列を有効に検出可能であることを示す。

アッセイの類似のセットにおいて、配列番号１０および配列番号１２の非標識オリゴマーを伴う、または伴わないアッセイ中、配列番号９および配列番号１１のプローブの組み合わせを用いた。ハイブリダイゼーション反応あたり２ｘ１０^８および２ｘ１０^９コピーを用いて、上述のように、環状プラスミドＤＮＡとして、実験試料中に標的ｃａｐＢ配列（配列番号３４）を含んだ。各々反応あたり約２ｘ１０^７ＲＬＵに均等で、そして約０．２ｐｍｏｌである、両方の標識プローブ、配列番号９および配列番号１１を同じハイブリダイゼーション反応混合物に添加したことを除いて、本質的に、上記と同じ方法を行った。これらの試験の結果を表６に示す（二つ組試料の平均ＲＬＵ）。

表６：組み合わせプローブを用いた、ｃａｐＢ標的配列の検出

結果は、異なるｃａｐＢ標的配列に特異的に結合する多数の標識プローブを用いることによって、ハイブリダイゼーションが、より高い検出シグナルを提供し、該シグナルは、各プローブを独立に用いて得られるシグナルをほぼ加算したものであることを例示する（すなわち表６の結果を、同じ数の環状標的に対して各プローブを独立にハイブリダイズさせた表５のものと比較されたい）。これらの結果はまた、非標識オリゴマーが反応混合物に含まれる、いくつかの場合、増加した陽性シグナルが得られるが、非標識オリゴマーは、陽性シグナルを得るのに必要ではないことも示す。

次の実施例に記載するように、類似の方法を用いて、ｃａｐＢおよびｐａｇＡ標的両方の個々の検出、および同一アッセイにおける検出を示した。
（実施例６）
ハイブリダイゼーションによる、ｃａｐＢおよびｐａｇＡ配列の検出
本実施例は、配列番号９および配列番号１１の標識ｃａｐＢ特異的プローブ、並びに配列番号４および配列番号７の標識ｐａｇＡ特異的プローブを、ヘルパーとして働きうる非標識オリゴマーを伴いまたは伴わずに用いることによって、実施例５に記載するのと類似の方法を用いて、調製した試料中のプラスミドが所持するｃａｐＢおよびＰａｇＡ配列を検出した。ｃａｐＢ特異的非標識オリゴマーは、配列番号１０および配列番号１２のものであり、そしてｐａｇＡ特異的非標識オリゴマーは、配列番号３および配列番号８のものであった。ｃａｐＢおよびｐａｇＡ標的配列（実施例１に記載するように、それぞれ配列番号３４および配列番号３３）を含有する環状プラスミドＤＮＡを、ハイブリダイゼーション反応あたり、２ｘ１０^８および２ｘ１０^９コピー用いた。

簡潔には、最終体積１５０μｌ中、非標識オリゴヌクレオチド（各１０ｐｍｏｌ）を伴いまたは伴わず、プラスミドＤＮＡ（約１０^９または１０^１０コピーを含有する１０μｌ）を溶解試薬と混合し、そして１００℃で１５分間加熱した。次いで、１００μｌの２ＭＬｉＯＨを添加し、混合し、そして混合物を６０℃で１５分間加熱した。次いで、２５０μｌの中和試薬（０．８ＭＨＣｌ、１００ｍＭコハク酸Ｌｉ）を添加して、室温でｐＨ５〜５．５の混合物を生じた。各混合物１００μｌアリコットを４つ分、反応あたり各プローブ約２ｘ１０^７ＲＬＵに均等の約０．２ｐｍｏｌを用いて、表７に示すようなＡＥ標識プローブの組み合わせとハイブリダイズさせ、そして混合物を６０℃で４５分間インキュベーションした。次いで、３００μｌの選択試薬を各混合物に添加し、これを６０℃で１０分間インキュベーションして、非結合プローブ上の標識を不活性化し、そして結合した標識プローブに関して、発光（ＲＬＵ）を検出した。陰性対照には、類似の組成混合物中のプローブのみ、および類似の組成混合物中の標的ＤＮＡを伴う非標識オリゴマーが含まれ、これらをすべて試験試料と同様に処理した。これらのアッセイの結果（４つの試験試料、または対照では二つ組に関して検出される平均ＲＬＵ）を表７に示す。

表７：プラスミドＤＮＡ中のｃａｐＢおよびｐａｇＡ標的配列の検出

結果は、該アッセイが、個々に、そして同一試料中でともに、プラスミドＤＮＡに存在するｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的遺伝子両方を検出することを例示する。これらのアッセイにおいて、ｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的遺伝子各々に１つある、２つの標的配列に特異的な標識プローブは、反応混合物中に非標識オリゴマーが存在してもまたしなくても、効率的にハイブリダイズした。

次の実施例は、ｐａｇＡおよびｃａｐＢ遺伝子に特異的なプローブの組み合わせを、真性細菌対照プローブとともに、同様に用いて、炭疽菌中の標的配列を検出した。
（実施例７）
炭疽菌における、ハイブリダイゼーションによるｃａｐＢおよびｐａｇＡ配列の検出
これらの試験において、実施例４に実質的に記載するように、試料をプロセシングした。用いた細胞は、炭疽菌（スターン株）またはセレウス菌であった。簡潔には、血液寒天プレート上で細胞を一晩増殖させ、そして１μｌループ分の細胞を各試験試料に関して収集し、０．１５ｍｌの溶解試薬に懸濁し、混合し、そして１００℃で１５分間加熱して、細胞を溶解させた。真性細菌配列を検出するのに、配列番号４０の標識プローブ（配列番号４１、４２および４３の非標識ヘルパーオリゴマーを伴う）を用いて試験するため、５μｌの溶解物を実施例４に記載するように、１ｍｌ溶液に希釈し、ここから０．１ｍｌを取って、セレウス菌および炭疽菌両方に存在するｒＲＮＡおよび／またはｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに対するハイブリダイゼーション試験に用いた。各生物に対して、塩基プロセシングを伴わずにハイブリダイゼーションに溶解物を用いるか、または実施例４に記載するように、塩基プロセシングされた溶解物を作成するために、処理した。二つ組試料を調製し、そして炭疽菌溶解物に関して試験した。０．１ｍｌの希釈溶解物または塩基プロセシングした溶解物をＡＥ標識プローブ（各々約０．０８〜０．１ｐｍｏｌ）と混合して用い、反応あたりプローブあたり約１ｘ１０^７ＲＬＵを提供して、実施例４に実質的に記載するように、ハイブリダイゼーション反応を行った。標識プローブは、実施例６に記載するようにｐａｇＡおよびｃａｐＢ配列を検出する配列番号４、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１の混合物、あるいは真性細菌種に一般的なｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ（Ｈｏｇａｎら、米国特許第５，６７９，５２０号）を検出する配列番号４０（配列番号４１、４２および４３の非標識ヘルパーオリゴマーを伴う）の混合物いずれかであった。ハイブリダイゼーション反応を６０℃で４５分間インキュベーションし、そして次いで０．３ｍｌの選択試薬を添加し、そして混合物を６０℃で１０分間インキュベーションして、その後、照度計（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０）で発光シグナル（ＲＬＵ）を検出した。陰性対照は、標的核酸を含有しないが、実験試料に存在する実質的に同一の試薬で構成された。陽性対照は、それぞれのプローブに特異的にハイブリダイズする標的核酸、すなわち相補的ｐａｇＡおよびｃａｐＢ配列を含有する合成ｓｓＤＮＡ、または真性細菌プローブに相補的な配列を含有する大腸菌ｒＲＮＡを含有した。表８に示す結果は、配列番号４、７、９および１１のプローブを用いて行うアッセイの試料あたり４回の試験の平均ＲＬＵ、並びに陰性対照の試料あたり２回の試験の平均ＲＬＵ、並びに配列番号４０のプローブ（配列番号４１、４２および４３の非標識オリゴマーを伴う）を用いて行う試験である。

表８：炭疽菌およびセレウス菌の標的配列のプローブ検出

これらの結果に示されるように、ｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的配列に特異的なプローブの組み合わせ（配列番号４、７、９、１１）を用いることによって、そして真性細菌ｒＲＮＡに特異的なプローブ（配列番号４０、ヘルパーオリゴマーを伴う）を用いることによって、炭疽菌を検出した。対照的に、セレウス菌は、ｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応では陰性であったが、真性細菌ｒＲＮＡ配列に対するプローブを用いたハイブリダイゼーション反応では陽性であった。したがって、ｐａｇＡおよびｃａｐＢ標的配列に特異的なアッセイは、セレウス菌複合群の別の種から、炭疽菌を区別し、そして真性細菌標的配列に対する内部対照プローブ（配列番号４０）は、ハイブリダイゼーション反応が適切に行われ、そしてすべての試料に、検出されるのに十分な標的配列が存在したことを示す。

本発明は、請求項によって定義され、この請求項は、上に記載し、そして例示した態様を含む。

Claims

配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３４、標的配列いずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）標的配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする、約２０〜約４０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド。
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４、ｐａｇＡ標的配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる配列に含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項１のオリゴヌクレオチド。
配列番号１または配列番号２からなる配列を有し、配列番号２１に含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項２のオリゴヌクレオチド。
配列番号３または配列番号４からなる配列を有し、配列番号２２に含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項２のオリゴヌクレオチド。
配列番号５または配列番号６からなる配列を有し、配列番号２３に含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項２のオリゴヌクレオチド。
配列番号７または配列番号８からなる配列を有し、配列番号２４に含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項２のオリゴヌクレオチド。
配列番号２５または配列番号２６、ｃａｐＢ標的配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる配列に含有されるｃａｐＢ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項１のオリゴヌクレオチド。
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２からなる配列を有し、配列番号２５に含有されるｃａｐＢ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項７のオリゴヌクレオチド。
配列番号１３または配列番号１４からなる配列を有し、配列番号２６に含有されるｃａｐＢ標的配列に特異的にハイブリダイズする、請求項７のオリゴヌクレオチド。
配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる標的配列に含有されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、約１８〜４０塩基のオリゴヌクレオチド。
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９からなる配列を有する、請求項１０のオリゴヌクレオチド。
配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる標的配列に含有されるバチルス属種の２３ＳｒＲＮＡまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、約２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチド。
配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号３６からなる配列を有する、請求項１２のオリゴヌクレオチド。
ＤＮＡ主鎖もしくはＲＮＡ主鎖、または混合ＤＮＡおよびＲＮＡ主鎖を有するか、あるいは塩基を連結する少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。
ＤＮＡ主鎖もしくはＲＮＡ主鎖、または混合ＤＮＡおよびＲＮＡ主鎖を有するか、あるいは塩基を連結する少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含有する、請求項１０のオリゴヌクレオチド。
ＤＮＡ主鎖もしくはＲＮＡ主鎖、または混合ＤＮＡおよびＲＮＡ主鎖を有するか、あるいは塩基を連結する少なくとも１つの２’−メトキシＲＮＡ基を含有する、請求項１２のオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結されたシグナル産生標識を有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結されたシグナル産生標識を有する、請求項１０のオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドに直接または間接的に連結されたシグナル産生標識を有する、請求項１２のオリゴヌクレオチド。
試料中の炭疽菌核酸を検出する方法であって：
炭疽菌核酸を含有する試料を提供し；
ｐＸＯ１プラスミドに含有されるｐａｇＡ標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、およびｐＸＯ２プラスミドに含有されるｃａｐＢ標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを提供し；
少なくとも１つのプローブをｐａｇＡ標的配列に、または少なくとも１つのプローブをｃａｐＢ標的配列に、あるいは少なくとも１つのプローブをｐａｇＡ標的配列にそして少なくとも１つのプローブをｃａｐＢ標的配列に、特異的にハイブリダイズさせ；そして
ｐａｇＡ標的配列またはｃａｐＢ標的配列にハイブリダイズした少なくとも１つのプローブの存在を検出して、試料中の炭疽菌の存在を示す
工程を含んでなる、前記方法。
ｐａｇＡ標的配列が、配列番号３３、またはその相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有され、そしてｃａｐＢ標的配列が、配列番号３４、またはその相補配列、またはＲＮＡ均等物の配列に含有される、請求項２０の方法。
ｐａｇＡ標的配列が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる配列に含有され、そしてｃａｐＢ標的配列が、配列番号２５または配列番号２６、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる配列に含有される、請求項２０の方法。
ハイブリダイズ工程が、ｐａｇＡ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の配列を有するオリゴヌクレオチドである、前記プローブを含む、請求項２０の方法。
ハイブリダイズ工程が、ｃａｐＢ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブであって、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４からなる配列を有するオリゴヌクレオチドである、前記プローブを含む、請求項２０の方法。
セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）複合種のなかで保存されている１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいは１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを提供し、少なくとも１つのプローブを、セレウス菌複合種のなかで保存されている１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいは１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズさせ、そしてセレウス菌複合種のなかで保存されている１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列あるいは１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズした少なくとも１つのプローブの存在を検出し、それによって、試料中のセレウス菌複合生物の存在を示す工程をさらに含んでなる、請求項２０の方法。
１６ＳｒＲＮＡまたは１６ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブが、配列番号３１、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする、１８〜４０塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項２５の方法。
オリゴヌクレオチドが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９からなる配列を有する、請求項２６の方法。
２３ＳｒＲＮＡまたは２３ＳｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブが、配列番号３２、その相補配列、またはＲＮＡ均等物からなる配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする、２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項２５の方法。
オリゴヌクレオチドが、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３５、または配列番号３６からなる配列を有する、請求項２８の方法。
提供工程が、真性細菌種に存在する遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするプローブを提供することをさらに含み、ハイブリダイズ工程が、プローブを、真性細菌種に存在する遺伝子配列に特異的にハイブリダイズさせることをさらに含み、そして検出工程が、真性細菌種に存在する遺伝子配列にハイブリダイズしたプローブを検出し、それによって、バチルス属配列がアッセイ中でまったく検出されなかった際も、方法工程が適切に行われたことを示す工程をさらに含む、請求項２５の方法。
プローブが配列番号４０からなる配列を有し、そして配列番号４０のプローブが検出されることが、試料中に真性細菌が存在することを示す、請求項３０の方法。
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなるｐａｇＡ標的配列に含有される配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブ、および配列番号２５または配列番号２６、これらの配列のいずれか１つの相補配列、またはＲＮＡ均等物からなるｃａｐＢ標的配列に含有される配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブを含んでなる、請求項２０の方法を実施するためのキット。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の配列を有するオリゴヌクレオチドである、ｐａｇＡ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブ、および配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４からなる配列を有するオリゴヌクレオチドである、ｃａｐＢ標的配列に特異的な少なくとも１つのプローブを含んでなる、請求項３２のキット。