FI118690B - Diagnostinen menetelmä ja siinä käyttökelpoisia tuotteita - Google Patents

Description

118690

Diagnostinen menetelmä ja siinä käyttökelpoisia tuotteita Keksinnön ala

Keksintö liittyy menetelmään ja siinä käyttökelpoisiin välineisiin sellaisten bakteerilajien samanaikaiseksi havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi, joita 5 todennäköisesti voidaan käyttää bioterrorismissa. Esillä oleva keksintö liittyy erityisesti Bacillus anthraciksen, Yersinia pestiksen ja Francisella tularensiksen läsnäolon tai poissaolon yhtäaikaiseksi havaitsemiseksi yksittäisessä reaaliaikaisessa PCR-testissä. Keksintö liittyy myös keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisiin lajispesifisiin alukkeisiin ja Taqman MGB-koettimiin. Li-10 säksi keksintö liittyy kittiin, jota voidaan käyttää bakteriaalisten bioterroris-miagenssien diagnosoinnissa. Keksintö liittyy myös infektiovapaaseen kontrol-liplasmidiin, jolla varmistetaan keksinnön mukaisen reaaliaikaisen PCR-ana-lyysimenetelmän tulokset.

Keksinnön tausta 15 Yhdysvalloissa sijaitseva Centres for Disease Control and Preventi on (CDC) luokittelee bioterrori-iskuissa mahdollisesti käytettävät biologiset aineet kolmeen luokkaan: A, B ja C. CDC.n mukaan luokkaan A kuuluvat organismit aiheuttavat suurimman riskin yleiselle turvallisuudelle. Luokkaan A kuuluvat organismit leviävät helposti, ja niiden torjunnassa tarvitaan nopeita toi-20 mia. Näiltä aineilta suojautuminen edellyttää lisäksi mittavia julkisen tervey- ··· denhuollon investointeja. Luokkaan A kuuluu useita viruksia ja kolme bakteeri- φ · φ · • lajia: B. anthracis, Y. pestis ja F. tularensis, jotka vastaavasti aiheuttavat per- φφ φ . .·. naruttoa, ruttoa ja jänisruttoa.

Biologisten aseiden käyttö ei välttämättä tule ilmi välittömästi, sillä φ φ · ΓΥ 25 organismien itämisaika tartunnan saaneessa voi olla useita päiviä, jopa viikko- ::i.* ja. On tärkeää kehittää diagnostisia menetelmiä, jotka mahdollistavat nopean φ # *···* diagnoosin, sillä kliinisten oireiden puhjettua kliininen vaste antimikrobiaaliseen hoitoon alentuu merkittävästi. Tästä syystä näille patogeeneille altistumisen • φ : *·· nopea ja tehokas havaitseminen on oleellista ennalta ehkäisevän hoidon aloit- ··* 30 tamisessa ennen oireiden puhkeamista. Antimikrobiaalisen hoidon lisäksi en-naita ehkäisevään hoitoon kuuluu esimerkiksi rokottaminen.

• # ttt#: Perinteisiin menetelmiin S. anthraciksen, Y. pestiksen ja F. tularen- φ · . siksen havaitsemiseksi kuuluu mikrobiologisten viljelmien sekä entsymaattis- φ·φ : ten, kemiallisten ja immunologisten testien käyttö. Perinteiset mikrobiologiset 35 diagnosointimenetelmät ovat usein aikaa vieviä ja viljelyt voivat kestää useita 2 118690 päiviä. Ylimääräisten rikastustestien tarve voi vielä hidastaa toimenpidettä, sillä patogeenit pitää erottaa muista läheistä sukua olevista lajeista. Lisäksi baktee-rilajien viljely ja rikastaminen voivat aiheuttaa terveysriskin esimerkiksi siirrettävässä kenttälaboratoriossa työskentelevälle laboratoriohenkilökunnalle. Näin 5 ollen tarvitaan nopeita ja tarkkoja analyysejä, joissa käytetään molekyylien monistustekniikoita B. anthradksen, Y. pestiksen ja F. tularensiksen havaitsemiseksi, jotta voidaan varmistaa oikea lääkehoito, jos epäillään aineen tahallista vapauttamista.

Pernaruton diagnosointiin soveltuvimmat mikrobiologiset testit on 10 kehitetty veriviljelyä, lumbaalipunktiota tai märkäpesäkkeitä varten, jolloin näytteitä viljellään yhden päivän ajan, minkä jälkeen suoritetaan tunnistus. Perna-ruton nopeaan havaitsemiseen on käytettävissä myös fluoresoivia vasta-ainetestejä, joiden avulla tulos voidaan saada muutamassa tunnissa. Tulos on kuitenkin varmistettava vaihtoehtoisella menetelmällä, kuten PCR:llä, koska näi-15 den testien spesifisyys ei ole 100-prosenttisen luotettava. WO 2004070001 kuvaa hybiridisaatioon perustuvan menetelmän B. anthradksen nukleiinihapon määrittämiseksi näytteessä. Menetelmä perustuu kahteen määrityskoettlmeen, jotka ovat spesifisiä geneettiselle materiaalille, jota sisältyy pX01- ja pX02-plasmideihin. Testi on spesifinen ja luotettava, käytetty hybridisaatioteknilkka 20 asettaa kutienkin tiettyjä vaatimuksia laboratoriotyöskentelylle, erityisesti jos bakteerikantoja tulee viljellä kenttäolosuhteissa. Lisäksi analyysi on aikaa vie- . vää.

·· · ;··; Perinteisiin menetelmiin ruton tunnistamiseksi liittyy useita epäkoh- "Y tia. Y. pestis kasvaa yleisessä ravinteikkaassa väliaineessa, mutta sen kasvu ni.1 25 vauhti on hitaampi kuin useimpien muiden bakteerien. Tästä syystä nopeam-• · * min monistuvat organismit voivat peittää sen läsnäolon. Lisäksi Y. pestis : -soluille tyypillinen bipolaarinen värjäytyminen ei ole ainoastaan Y. pestikseen rajoittuva piirre. Enteerisellä bakteerilla Yersinia spp:llä ja muilla Gram- ··· negatiivisilla organismeilla, etenkin Pasteurella spp:llä, voi värjäyksessä esiin- ( 30 tyä samoja piirteitä. Y. pestiksen diagnosoimiseksi suoritettavissa immunologi- *···. sissa testeissä voi esiintyä ristiinreagointia, joten testit eivät ole täysin tuotetta- • # • · · ♦ . via.

F. tularensis voidaan tunnistaa tutkimalla suoraan eritteitä, tuleh-dusnesteitä tai kudosnäytteitä käyttäen suoraan fluoresoivaa vasta-ainetta tai 35 immunohistokemikaalisia pigmenttejä. F. tularensis vaatii tietyn kasvuympäris- • · * .I, · tön, mikä tekee sen viljelystä vaikeaa. F. tularensis on myös infektiivisimpiä » · • · 3 118690 ihmisen tuntemia bakteereja, joten infektoituneiden näytteiden käsittely aiheuttaa henkilökunnalle turhaa vaaraa ja työskentelyssä on suositeltavaa soveltaa 3-tason bioturvallisuusprotokollaa. F. tularensiksen tunnistamisessa voidaan käyttää vasta-aineen havainnointitestejä, PCR-testejä sekä vasta-ainereak-5 tioihin perustuvia testejä (ELISA). Seerumin vasta-ainetiittereillä ei saavuteta diagnostista tasoa kuin vasta 10-14 päivän kuluttua sairauden puhkeamisesta. Tästä syystä serologinen testaus on hyödyllistä ainoastaan takautuvasti: Jotta sairaus voitaisiin vahvistaa laboratoriossa aukottomasti, tarvitaan veriviljely ja spesifisten vasta-aineiden lisääntyminen parittaisissa seerumeissa. Näin ollen 10 F. tularensista ei voida käytettävissä olevilla menetelmillä tunnistaa nopeasti.

Perinteisten mikrobiologisten menetelmien vaihtoehdoiksi on kehitetty polymeraasi-ketjureaktio-analyysejä (PCR). Perinteinen PCR perustuu päätepisteanalytiikkaan, jossa monistettua geneettistä materiaalia voidaan tutkia vain geelielektroforeesilaitteella PCR-reaktion jälkeen. Tuloksen varmista-15 miseksi ja PRC-prosessin aikaisen saastumisen mahdollisuuden poissulkemiseksi tarvitaan sarja positiivisia ja negatiivisia PCR-kontrolleja.

Reaaliaikainen PCR-analyysi kohdegeenille suunnitelluilla spesifisillä koettimilla ja alukkeilla mahdollistaa PCR-reaktioiden havaitsemisen jo reaktion aikana. Reaaliaikaisesta PCR:stä on useita etuja analysoitaessa biologisia 20 aineita, joita voidaan käytttää bioterrori-iskussa. Reaaliaikainen PCR on ensinnäkin nopea, mikä on ensisijaisen tärkeää, jos tällaisia biologisia aineita vapautetaan tahattomasti tai tahallisesti. Toiseksi reaaliaikainen PCR sopii sensi-tiiviseen ja spesifiseen patogeenien havaitsemiseen, sillä se suoritetaan her- • · ·.: ; meettisesti suljetuissa säiliöissä, mikä vähentää huomattavasti ristisaastumi- 25 sen riskiä, mikä puolestaan vähentää virheellisten positiivisten tulosten mah- • dollisuutta. Kolmanneksi reaaliaikaisen PCR:n yhteydessä ei tarvita PCR:n jäi- m · : :*· keistä analyysiä.

.···. Useissa tutkimuksissa on esitetty reaaliaikaisen PCR-testiajon käyt- • · tö sellaisten eristettyjen bakteeriorganismien analysoimiseksi, joita voidaan 30 käyttää bioterrori-iskussa. Chase C.J. et ai., 2005, Clin Chem 51(10): 1778-1785, kuvaavat Y. pestiksen uniikkiin kromosomisekvenssiin kohdistettuja • *·;·* PCR-testiajoja. Tutkimus osoittaa, että reaaliaikaisen PCR-testiajon avulla Y.

·:·*: pestis voidaan erottaa muista Yersinia-lajeista ja läheistä sukua olevasta Y.

····· pseudotuberculosiksesta. Bell C.A. et ai., 2002, J Clin Microbiol 40:2897-2902, 35 esittävät nopeasyklisen reaaliaikaisen PCR-havaintoanalyysin B. anthraciksen • · · ) viljellyille isolaateille LightCycler -välinettä käyttäen (Roche Applied Science, • * t • *· m « 4 118690

Indianapolis) Emanuel P.A. et a!., 2003, J Clin Microbiol 41:689-693, esittävät F tularensiksen havaitsemisen tartunnan saaneissa hiiren kudoksissa käyttäen kannettavaa lämpösykleriä ja vertaamalla tulosta kudosnäytteiden reaaliaikaiseen PCR-analyysiin. Missään näistä julkaisuista ei kuitenkaan esitetä use-5 ämmän kuin yhden patogeenilajin samanaikaista havainnointia reaaliaikaiseen PCR:ään perustuvan menetelmän avulla.

Huolimatta siitä, että useamman kuin yhden mahdollisesti bioterrori-iskussa käytettävän bakteeripatogeenin samanaikaisesta analysoinnista on tunnustettu olevan ilmeisiä etuja, tarpeeksi spesifiä ja sensitiivistä analyysiä ei 10 ole tähän mennessä kehitetty.

Varma Basil et ai., 2004, Clin Chem 50(6): 1060-1063, kuvaavat reaaliaikaista PCR-testiajoa, joka havaitsee samanaikaisesti neljä bakteeri-agenssia, joita voidaan käyttää bioterrori-iskussa. Tämä tutkimus perustuu perustuu molekyylibeaconeihin, jotka sitoutuvat F. tularensiksesta, Burkholderia 15 malleista, Y. pestiksestä ja B. anthraciksesta syntyneisiin amplikoneihin. Analyysissä hyödynnetään 16S rRNA -geenisekvenssejä, jotka ovat erittäin kon-servoituneita bakteereissa. Kuvatulla testiajolla voitiin samanaikaisesti havaita neljä patogeeniä. Käytetty Y. pestis -testi kuitenkin reagoi voimakkaasti ristiin näytteissä olevien 4 kontrollibakteerilajikkeen kanssa. Tällainen testi ei olisi 20 hyväksyttävä, sillä virheellinen positiivinen tulos luokkaan A kuuluvien aineiden kohdalla johtaisi huomattaviin taloudellisiin menetyksiin ja heikentäisi suuren yleisön luottamusta viranomaisiin.

Koska luokkaan A kuuluvien aineiden havainnoinnin on oltava abso- luuttisen tarkkaa, nopeaa ja luotettavaa, tarvitaan uusia menetelmiä luokkaan : 25 A kuuluvien aineiden tehokkaaseen havainnointiin.

• · · • · • · · ;*Y Keksinnön lyhyt selostus • · · • · · Y/ Tunnettujen analyysien epäkohtien eliminoimiseksi kehitettiin uusi *···* menettelytapa. Varma Basil et ai., supra, kuvaamassa reaaliaikaisessa PCR- testissä käytetään 16S rRNA -geenisekvenssejä ja molekyylibeaconeja, kun : 30 taas esillä olevassa keksinnössä hyödynnetään lajispesifisiä geeni- tai plasmi- • · · disekvenssejä, ja näistä lajispesifisistä geeni- tai plasmidisekvensseistä saa-daat alukkeita ja koettimia, joilla on optimaalinen konsentraatio, jolloin saadaan aikaan erittäin sensitiivinen PCR-reaktio käyttäen identtisiä lämpötilaparamet- * · reja. Tällainen PCR-reaktio mahdollistaa bakteeriluokkaan A kuuluvien ja M· v : 35 mahdollisesti bioaseina tai bioterrorismissa käytettävien patogeenien samanai- φ · \*·· kaisen havainnoinnin.

5 118690

Keksinnön tavoitteena on siis kehittää uusia menetelmiä ja välineitä mahdollisesti bioterrorismissa käytettävien bakteerilajien havaitsemikseksi ja tunnistamiseksi.

Keksinnön tavoitteena on myös kehittää uusia menetelmiä ja väli-5 neitä, joilla on mahdollista samanaikaisesti havaita ja tunnistaa bioterrorismissa mahdollisesti käytettäviä bakteerilajeja oleellisesti nopeammin kuin aikaisemmin on ollut mahdollista, jolloin oikea ja tehokas hoito tai ennalta ehkäisevä hoito tartunnan saaneille sekä yhtä tärkeät toimenpiteet taudin ja aineiden leviämisen estämiseksi voidaan aloittaa entistä aikaisemmin.

10 Keksinnön tavoitteena on lisäksi tarjota välineitä ja menetelmiä, jot ka ovat käyttökelpoisia mahdollisesti bioterrorismissa käytettävien bakteerilajien havaitsemisessa ja tunnistamisessa ja jotka ovat luotettvia, sensitiivisiä ja joilla voidaan tunnistaa erityisesti vain halutut bakteerilajit.

Esillä oleva keksintö liittyy menetelmään Bacillus anthraciksen, Yer-15 sinia pestiksen ja Francisella tularensiksen läsnäolon tai poissaolon yhtäaikaiseksi havaitsemiseksi yksittäisessä reaaliaikaisessa PCR-testiajossa käyttäen spesifisiä Taqman MGB-koettimia ja lajispesifisiä alukkeita, jossa a) B. anthraciksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteis-alukkeella on sekvenssit numero 1 ja vastaavasti 2, jotka ovat peräisin pagA-gee-20 nistä, ja sekvenssit numero 4 ja vastaavasti 5, jotka ovat peräisin capB-geenistä, . b) Y. pestiksen eteenpäin suuntaavalla alukeella ja käänteisaluk- ·1· ;··; keella on sekvenssit numero 7 ja vastaavasti 8, jotka ovat peräisin p/a-gee- M ‘ nistä, ja 25 c) F. tularensiksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteis- • 1 ·,: · alukkeella on sekvenssit numero 10 ja vastaavasti 11, jotka ovat peräisin 23 kDa -geenistä, ja jolloin eteenpäin suuntaavien alukkeiden ja käänteisalukkeiden • · · konsentraatiot on optimoitu alueelle 50-900 nM samoissa lämpötilaparamet- :·. 30 reissä.

• ·· *···, Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät spesifiset Taq- » · T man MGB-koettimet ovat: pag>4-geenistä saatu seksvenssinumero 3 ja capB- geenistä saatu sekvenssinumero 6 B. anthracikselle, pla-geenistä saatu sek- •i1" venssinumero 9 Y. pestikselle ja 23 kDa -geenistä saatu sekvenssinumero 12 .···. 35 F. tularensikselle.

• 1 · · • · i • #· • 1 6 118690

Keksinnön eräässä suoritusmuodossa käytetään multiplex-PCR-formaattia, jossa reaktiot suoritetaan yhdessä testiputkessa käyttäen erilailla leimattuja Taqman MGB-koettimia.

Esillä oleva keksintö liittyy myös uusiin lajispesifisiin alukkeisiin, jot-5 ka ovat käyttökelpoisia keksinnön mukaisessa menetelmässä ja joilla on sek-venssinumerojen 1 ja 2 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin 6. anthracis pagA -geenistä, sekvenssinumerojen 4 ja 5 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin B. anthracis capB -geenistä, Y. pestis -alukkeilla on sekvenssinumerojen 7 ja 8 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin p/a-geenistä, ja F. tularensis 10 -alukkeilla on sekvenssinumerojen 10 ja 11 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin 23 kDa -geenistä, ja niiden käyttöön PCR:ään perustuvissa testeissä B. anthraciksen, Y. pastiksen ja F. tularensiksen havitsemiseksi.

Esillä oleva keksintö liittyy myös uusiin Taqman MGB-koettimiin, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnössä ja joilla on sekvenssinume-15 ron 3 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis pagA -geenistä, sek-venssinumeron 6 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis capB -geenistä, sekvenssinumeron 9 mukainen sekvenssi, joka on peräisin Y. pestis pla -geenistä, tai sekvenssinumeron 12 mukainen sekvenssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa -geenistä, ja niiden käyttöön PCR:ään perustuvissa tes-20 teissä.

Esillä oleva keksintö liittyy lisäksi diagnostiseen kittiin käytettäväksi . sellaisten bakteerilajien diagnoosissa, joita voidaan käyttää bloterrorismiagens- ··· ;·· j seinä, jolloin kitti käsittää « · a) edellä määritellyt keksinnön mukaiset lajispesifiset alukkeet, 25 b) edellä määritellyt keksinnön mukaiset spesifiset Taqman MGB- · :.· ; alukkeet, ja vaihtoehtoisesti c) sisäiset positiiviset kontrollit ja reagenssit, jotka vaaditaan monis-tus-, hybridisaatio-, pesu-ja/tai havaitsemisvaiheissa.

Esillä oleva keksintö liittyy lisäksi infektiovapaaseen kontrolliplasmi- t 30 diin, joka käsittää osittaiset sekvenssit Bacillus anthracis pagA- ja capB-gee- .···. neistä, joilla on sekvenssinumerojen 21 ja vastaavasti 22 mukaiset sekvenssit, • · ’·' Yersinia pestis pla -geenistä, jolla on sekvenssinumeron 23 mukainen sek- venssi, ja Francisella tularensis 23 kDa -geenistä, jolla on sekvenssinumeron 24 mukainen sekvenssi, ja sopiviin promoottori- ja regulaatiosekvensseihin.

*«· • · • i · 1 · · · • ·· • · 7 118690

Kuvioiden selostus

Kuvio 1 esittää bakteeriorganismeja, joita käytetään testattaessa keksinnön mukaisen menetelmän spesifisyyttä.

Kuvio 2 esittää sairastuneen lehmän kudosnäytteen reaaliaikaista 5 PCR-analyysiä käyttäen ABI 7300 Taqman-MGB-testiä, joka on kohdistettu B. anthraciksen plasmideihin pX01 (pagA) ja pX02 (capB). Kolme erillistä isolaa-tiota (1,2 ja 3) ajettiin duplikaatteina. Ct-arvot on esitetty oikealla.

Kuvio 3 esittää tartunnan saaneen jäniksen kudosnäytteen reaaliaikaista PCR-analyysiä käyttäen ABI 7300 Taqman MGB-testiä, joka on kohdis-10 tettu F. tularensiksen 23 kDa -geeniin. Kolme erillistä isolaatiota (1, 2 ja 3) ajettiin duplikaatteina. Ct-arvot on esitetty oikealla.

Kuvio 4 esittää kymmenen kliinisen F. tularensis -isolaatin PCR-analyysiä käyttäen F. tularensiksen 23 kDa -geeniin kohdistuvaa ABI 7300 Taqman MGB-testiajoa.

15 Keksinnön yksityiskohtainen selostus

Esillä oleva keksintö perustuu tutkimuksiin, joissa on yritetty löytää nopeampia ja spesifisempiä vaihtoehtoja sellaisten biologisten aineiden diagnosoimiseksi ja havaitsemiseksi, joita voidaan käyttää bioterrori-iskussa. Odottamatta havaittiin, että useampaa kuin yhtä A-luokkaan kuuluvaa bakteerilajia 20 voidaan monistaa ja havaita samanaikaisesti spesifisellä ja luotettavalla tavalla reaaliaikaisia PCR-tekniikoita käyttäen. Tämä saatiin aikaan kehittämällä uusia reaaliaikaisia PCR-alukkeita ja -koettimia B. anthracis, Y. pestis ja F. tularensis • · · -bakteereille ja säätämällä näiden lajispesifisten aluke- ja koetinsekvenssien ]·«1 toimintaolosuhteita siten, että kaikilla oli sama sulamislämpötila täysin komp- : 25 lementaaristen kohteiden läsnäollessa.

• ♦ :.· · Esillä oleva keksintö liittyy erityisesti menetelmään bakteerilajien

Bacillus anthracis, Yersinia pestis ja Franciselia tularensis läsnäolon tai poissaolon havaitsemiseksi yksittäisessä reaaliaikaisessa PCR-testiajossa käyttä-en spesifisiä Taqman MGB-koettimia ja lajispesifisiä alukkeita, jolloin .···. 30 a) B. anthraciksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteis- • · alukkeella on sekvenssit numero 1 ja vastaavasti 2, jotka ovat peräisin pagA-geenistä, ja sekvenssit numerot 4 ja vastaavasti 5, jotka ovat peräisin capB- *!2: geenistä, ··· • · · • · · • 1 · • 1» 2 • · 8 118690 b) Y. pestiksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteisaluk-keella on sekvenssit numero 7 ja vastaavasti 8, jotka ovat peräisin pla-geenistä, ja c) F. tularensiksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja kään-5 teisalukkeella on sekvenssit numero 10 ja vastaavasti 11, jotka ovat peräisin 23 kDa -geenistä, ja jolloin eteenpäin suuntaavien alukkeiden ja käänteisalukkeiden konsentraatiot on optimoitu alueelle 50-900 nM samoissa lämpötilaparamet-reissa.

10 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät spesifiset Taq- man MGB-koettimet ovat: pagA-geenistä saatu seksvenssinumero 3 ja capB-geenistä saatu sekvenssinumero 6 B. anthracikselle, p/a-geenistä saatu sek-venssinumero 9 Y. pestlkselle ja 23 kDa -geenistä saatu sekvenssinumero 12 F. tularensikselle.

15 Tässä yhteydessä ilmauksella "havaitaan samanaikaisesti" tarkoite taan sitä, että yksittäinen reaaliaikainen PCR-testiajo suoritetaan samanaikaisesti kullekin bakteerille joko erillisissä reaktioastioissa, kuten säiliöissä tai putkissa, tai samassa reaktioastiassa käyttäen lajispesifisiä aiukkeita ja Taqman MGB-koettimia. Ajo suoritetaan edullisesti erillisissä reaktioastioissa. Eräässä 20 keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuodossa käytetään kuitenkin mul-tiplex-PCR-formaattia, jolloin reaktiot suoritetaan samassa testiputkessa käyttäen erilailla leimattuja Taqman MGB-koettimia.

Esillä oleva keksintö liittyy myös uusiin lajispesifisiin alukkeisiin, jot-: .·. ka ovat hyödyllisiä keksinnön mukaisessa menetelmässä ja joilla on sekvens-

"V 25 sinumerojen 1 ja 2 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin B. anthracis pagA

• · · -geenistä, sekvenssinumerojen 4 ja 5 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin j,:.: B. anthracis capB -geenistä, Y. pestis -alukkeilla on sekvenssinumerojen 7 ja 8 • * · : mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin p/a-geenistä, ja F. tularensis -aluk- keillä on sekvenssinumerojen 10 ja 11 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin 30 23 kDa -geenistä, ja niiden käyttöön PCR:ään perustuvissa analyyseissä.

• *·· Esillä oleva keksintö liittyy myös uusiin Taqman MGB-koettimiin, jot- f *]: ka ovat käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnön mukaisessa menetelmässä ja joilla on sekvenssinumeron 3 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anth-. racis pagA -geenistä, sekvenssinumeron 6 mukainen sekvenssi, joka on peräi- 35 sin B. anthracis capB -geenistä, sekvenssinumeron 9 mukainen sekvenssi, jo- :T: ka on peräisin Y. pestis pla -geenistä, tai sekvenssinumeron 12 mukainen sek- • · • * * • · * • · 9 118690 venssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa -geenistä, ja niiden käyttöön PCRrään perustuvissa analyyseissä.

Esillä oleva keksintö liittyy lisäksi diagnostiseen kittiin käytettäväksi sellaisten bakteerilajien diagnoosissa, joita voidaan käyttää bioterrorismi-5 agensseina, jolloin kitti käsittää a) lajispesifiset alukkeet Bacillus anthracis, Yersinia pestis ja Fran-cisella tularensis -bakteereille, jolloin B. anthraciksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteisalukkeella on sekvenssinumerojen 1 ja 2 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin pagA-geenistä ja sekvenssinumerojen 4 ja 5 mu-10 kaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin B, anthracis capB -geenistä, V. pestiksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteisalukkeella on sekvenssinumerojen 7 ja 8 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin p/a-geenistä ja F. tularensik-sen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteisalukkeella on sekvenssinumerojen 10 ja 11 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin 23 kDa -geenistä, 15 b) spesifisillä Taqman MGB-koettimilla B.anthracis, Y. pestis and F.

tularensis -bakteereille on sekvenssinumeron 3 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis pagA -geenistä, sekvenssinumeron 6 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis capB -geenistä, sekvenssinumeron 9 mukainen sekvenssi, joka on peräisin Y. pestis pla -geenistä, tai sekvenssinumeron 20 12 mukainen sekvenssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa -geenistä, sekä vaihtoehtoisesti c) sisäiset positiiviset kontrollit ja reagenssit, jotka vaaditaan monis- ... tus-, hybridisaatio-, pesu, ja/tai havaitsemisvaiheissa.

*."!t Esillä oleva keksintö liittyy myös infektiovapaaseen kontrolliplasmi- •·γ 25 diin, joka käsittää osittaiset sekvenssit Bacillus anthracis pagA- ja capB- • · · [·'··' geeneistä, joilla on sekvenssinumerojen 21 ja vastaavasti 22 mukaiset sek- :.: : venssit, Yersinia pestis pla -geenistä, jolla on sekvenssinumeron 23 mukainen • · · sekvenssi, ja Francisella tularensis 23 kDa -geenistä, jolla on sekvenssinume- ron 24 mukainen sekvenssi, sekä sopiviin promoottori- ja regulaatiosekvens-30 seihin.

·1.„ Esillä olevan keksinnön mukaiset alukkeet ja MGB-koettimet suunni- .···. teltiin siten, että valituista nukleiinihapposekvensseistä saatiin mahdollisimman lajispesifisiä ja että ne saatiin liittymään ainoastaan kohdeorganismiensa vas- • 1 taaviin DNA-sekvensseihin. Alukkeiden ja koettimien suunnittelussa käytettiin "2: 35 Primer Express ver. 2.0 -ohjelmistoa (Applied Biosystems, CA, USA). Aluk- • aa • 1 · a a a • a a · · a «a 2 • · 10 118690 keen ja Taqman MGB-koettimen yhdistelmät suunniteltiin NCBI:n julkisesta tietokannasta saatujen sekvenssien perusteella.

Esillä olevan keksinnön mukaisten uusien alukkeiden ja koettimien suunnittelussa käytettiin seuraavia kriteerejä: ennustettu ristireaktiivisuus käy-5 tettävissä olevien geenipankin sekvenssien kanssa, alukedimeerin formaation puuttuminen, nukleotidin itsestään sitoutuminen, alukkeiden +10 Celsiusastetta koettimien sulamislämpötilaa korkeampi sulamislämpötila, ei useamman kuin neljän identtisen nukleotidin jaksoja, ei guaniinia koettimen 5'-päässä. Kohdesekvenssien piti myös olla mahdollisimman lyhyitä, jotta voitiin 10 välttää kohdegeeneissä tapahtuvien mutaatioiden mahdollisesti aiheuttama ei-spesifisyys. Applied Biosystems (Cheshire, England) valmisti synteettisesti keksinnön mukaiset alukkeet ja koettimet.

Erityisesti B. anthraciksen spesifisten eteenpäin suuntaavien alukkeiden (pagF ja capF; sekvenssinumero 1 ja sekvenssinumero 4) ja kään-15 teisalukkeiden (pagR ja capR; sekvenssinumero 2 ja sekvenssinumero 5) ja Taqman MGB-koettimien (pagTM ja capTM; sekvenssinumero 3 ja sekvenssi-numero 6) ja B. anthracis pagA -geenin (geenipankin talletusnumero M22589) ja capS-geenin (geenipankin talletusnumero M24150) suunnittelussa käytettiin vastaavasti B. anthraciksen virulenssiplasmideja pXOI ja pX02. Plasmidin 20 pX01 pagA-geeni koodaa suojaavaa antigeeniä, joka on yksi kolmesta B. anthraciksen toksiinikompleksia koodaavasta geenistä. CapB-geeni on yksi plasmidi pX02:n kolmesta geenistä, joka on välttämätön suojaavan polypepti-... dekapselin biosynteesissä (Hanna, P., 1988, Curr.Top.Microbiol.Immunol.

225:13-35). Suunnittelukriteereiden perusteella pagA-koodisekvenssin nukleo- • · · 25 tidit 3400-3488 ja capB-koodisekvenssin nukleotidit 1106-1174 osoittautuivat • · · [*J·* testin sensitiivisimmiksi kohteiksi. Koska molempien plasmidien pX01 ja pX02 : on oltava läsnä, jotta B. anthraciksen isolaatti olisi virulentti, sekä pagA- että • · :,· : capB-geeni sisällytettiin analyysiin. Apatogeeniset B. anthracis -kannat, joista puuttui joko toinen plasmidi tai molemmat plasmidit, eristettiin ympäristöstä. 30 CapB- ja pagA-geenien havaintokohdat määriteltiin vain 68 ja 84 emäsparin pi- ·*·.. tuisiksi, mikä vähensi mutaatioiden todennäköisyyttä.

.···. Y. pestiksen spesifiset alukkeet (plaF, plaR) altistettiin Y. pestiksen '·*. virulentin plasmidin pCP1 kohdepiasminogeenin aktivaattorigeenille p/a (gee- : nipankin talletusnumero M27820). Plasminogeenin aktivaattorigeenin on ha- 35 vaittu olevan kaikkein sensitiivisin kohde, sillä se voi kopioitua jopa 186 kertaa .*:*. bakteeria kohti (Loiez C. et ai., 2003, J Clin Microbiol 41:4873-4875). Kään- • · * * • * · • · 11 118690 teisaiuke (plaR; sekvenssinumero 8) ja Taqman MGB-koetin (plaTM; sekvenssiini mero 9) suunniteltiin erikseen. Eteenpäin suuntaavana alukkeena (plaF; sekvenssinumero 7) käytettiin Loiez C. et ai., supra -julkaisussa kuvattua alu-ketta. Pia-geenin monistuskohde määriteltiin vain 62 emäsparin pituiseksi, mi-5 kä teki siitä hyvin lajispesifisen ja vähensi mutaatioiden todennäköisyyttä.

F. tularansiksen alukkeet ja koettimet kohdistuvat 23 kDa -geeniin (geenipankin talletusnumero Y08861), joka on tärkeä tekijä F. tularansiksen makrofaageissa solujenvälisessä kasvussa. Taqman MGB-koetin (23 kDaTM; sekvenssinumero 12) suunniteltiin erikseen, mutta koska 23 kDa -geeniä on 10 käytetty onnistuneesti reaaliaikaisessa Taqman PCR-testissä, tunnettuja koet-timia voitiin käyttää (23F ja 23R; sekvenssinumerot 10 ja 11) (Versage, J. L, et ai., 2003, J Clin Microbiol 41:5492-5499). Tässäkin 23 kDa -geenin monistus-kohde oli lyhyt, vain 83 emäsparia.

Termillä “TaqMan-koetin" viitataan yleisesti ja myös tässä keksin-15 nössä oligonukleotideihin, jotka sisältävät fluoresoivaa väriainetta, tyypillisesti 5-emäksessä, ja fluoresoivaa sammutusväriainetta (sammuttajaa, "quencher"), tyypillisesti 3-emäksessä. Säteilytettäessä virittynyt fluoresoiva väriaine siirtää energiaa lähellä olevalle sammuvalle värimolekyylille fluoresoitumisen sijasta, jolloin tuloksena on ei-fluoresoiva substraatti. Termillä “TaqMan MGB-20 koetin” viitataan TaqMan-koettimeen, joka on konjugoitu MGB:hen (minor groove binder) koettimen 3'-päässä. MGB on tripeptidi-1,2-dihydro-(3H)-pyrrolo[3,2-e]indoli-7-karboksylaatti (CDPI3), joka sitoutuu DNA:n pienempään uraan korkealla affiniteetilla. Van der Waalsin voimien stabilointi nostaa MGB-: ’·. koettimien sulamislämpötilaa (Tm) kasvattamatta koettimien pituutta, jolloin on "V 25 mahdollista käyttää lyhyempiä koettimia kuin normaalissa reaaliaikaisessa .1“ Taqman PCR.ssä. Lisäksi taustafluoresenssi saadaan sammutettua tehok- * ♦ · ;1γ kaammin MGB-koettimien avulla. Esillä olevassa keksinnössä käytettiin Taq- • · ♦ : Man MGB-koettimia (Applied Biosystems). Koettimien lajispesifiset sekvenssit olivat 15-21 nukleotidin pituisia.

30 Esillä olevassa keksinnössä käytetyt alukkeet ja koettimet on esitet- j2·. ty taulukossa 1.

*·1 • · * ♦ ·1 • ♦ • · • ·· • · · • » 1 φ · • · · * 1· 2 • · 12 118690

Taulukko 1. Alukkeet ja koettimet

Fragmen- SEKVENS-

Alukkeet ja tin koko SINRO: koettimet Alukesekvenssi Koetinpositio1 (bp) pag 84 pagF 5'- CGG ATA GCG GCG GTT AAT C -3' 3400-3418 1 pagR 5‘-CAA ATG CTA TTT TAA GGG CTT CTT TT -3' 3484-3459 2 pagTM 5 -TAG AAA CGA CTA AAC CGG ΑΤΑ T-3' 3431-3452 3 cap 68 capF 5’-TTG GGA ACG TGT GGA TGA TTT -3' 1106-1126 4 capR 5 -TCA GGG CGG CAA TTC ΑΤΑ AT-3' 1174-1155 5 capTM 5'-TAG TAA TCT AGC TCC AAT TGT -3‘ 1133-1153 6 pla 62 plaF 5'- GAA AGG AGT GCG GGT AAT AGG TT -3' 816-838 7 plaR 5'- CCT GCA AGT CCA ATA TAT GGC ATA -3' 878-855 8 plaTM 5 -TAA CCA GCG CTT TTC-3' 840-854 9 23 kDa 83 23F 5'- TGA GAT GAT AAC AAG ACA ACA GGT AAC A -3' 551-578 10 23R 5'- GGA TGA GAT CCT ATA CAT GCA GTA GG A -3' 634-608 11 23TM 5'-CCA TTC ATG TGA GAA CTG-3’ 589-606 12 ‘Perustuvat geenipankin talletusnumeroihin M22589 (pagA), M24150 (capC), M27820 (pla) ja Y08861 (23 kDa).

*«· t··· : 5 Kaikki reaaliaikaiset PCR-järjestelmät perustuvat fluoresoivan indi- M· · ; ·1· kaattorin havaitsemiseen ja kvantifikaatioon. Kyseisen indikaattorin signaali • · : .·. kasvaa suorassa suhteessa reaktiossa muodostuvan PCR-tuotteen määrään.

• · · ·2·1 Tällaiset indikaattorit voivat olla hybridisaatiokoettimia, jotka perustuvat fluore- • 1 · *!!/ senssin resonanssienergian siirtoon (FRET) kvantifikaatiota varten. Esillä ole- ***** 10 vassa keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa loisteainetta fluore soivan Taqman MGB-koettimen muodostamisessa. Sopivia fluoresoivia merk- • 2 kejä ovat esimerkiksi FAM/SYBR vihreä, VIC/JOE, NED/TAMRA/ Cy3, ROX/Texas punainen ja Cy5-väriaineet. Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa koettimen 5-päässä oleva fluoresoiva indikaattoriväri oli 6-15 karboksifluoresiini (FAM), ja 3'-päässä ei-fluoresoivana sammuttajana käytet-tiin Applied Biosystemsin valmistamaa sammuttajaa.

• · 1 · « f · • i· 2 • · 13 118690

Jotta B. anthracis, F. tularensis ja Y. pestis voitiin havaita tehokkaasti samanaikaisesti samanlaisia termosyklisiä profiileja käyttäen, alukkei-den ja koettimien konsentraatiot optimoitiin. Optimointikokeet perustuivat ABI 7300 -käsikirjaan (Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System; 5 Training course manual, kappale 12) ja suoritettiin seuraavasti. Kunkin aluk-keen ja koettimen erilaisia konsentraatioita testattiin matriisimuodossa siten, että käänteisalukkeiden 50, 300 tai 900 nM:n konsentraatioita testattiin yhdessä eteenpäin suuntaavien alukkeiden 50, 300 tai 900 nM:n konsentraatioiden kanssa. Koettimien konsentraatiot optimoitiin muuttelemalla konsentraatioita 10 välillä 50-250 nM. Optimaaliset konsentraatiot valittiin alhaisimman Ct;n (aikaisin syklikynnys) ja suurimman päätepisteen fluoresenssin perusteella. Konsentraatioiden optimoinnin ansiosta kolmea bakteeria voitiin analysoida samanaikaisesti sen sijaan, että jokaiselle bakteerille olisi pitänyt suorittaa oma analyysinsä.

15 Optimaaliset PCR-olosuhteet olivat seuraavat: B. anthracis -testissä 300 nM eteenpäin suuntaavaa aluketta ja 900 nM käänteisaluketta, Y. pestis -testissä 50 nM eteenpäin suuntaavaa aluketta ja 300 nM käänteisaluketta ja F. tularensis -testissä 300 nM eteenpäin suuntaavaa aluketta ja 900 nM käänteisaluketta. Taqman MGB-koettimen 250 nM:n konsentraatio tuotti erittäin hy-20 vin toisinnettavissa olevia ja sensitiivisiä testejä, joten sitä käytettiin kaikissa testeissä.

Keksintöä sovellettaessa reaaliaikainen PCR-testi pernaruttoa, jä-. nisruttoa ja ruttoa aiheuttavien bakteerien samanaikaiseksi havaitsemiseksi ja »M ' * ;··; tunnistamiseksi suoritettiin ABI 7300 -lämpösyklerin avulla (Applied Biosys- • · · !·!*· 25 terns, Foster City, CA, USA). Alan ammattilaisille on kuitenkin ilmeistä, että analyysi oltaisiin voitu suorittaa myös muilla fluoresenssiin perustuvilla lämpö- • · !.: ! syklereillä, jotka mahdollistavat nopean syklisoinnin ja monistustuotteen sa- manaikaisen havainnoinnin, edellyttäen että järjestelmät voivat hyödyntää läs-näolevia testireagensseja.

30 Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä analysoitavana ;·.φί näytteenä voi olla bakteeriviljelmä, kudosfragementti, eritenäyte, kuten yskös '.···. tai harjausnäyte, verinäyte, lumbaalipunktiosta tai märkäpesäkkeestä saatu • · *"4 kliininen näyte tai muut sopiva näyte, joka on otettu potilaasta, jonka epäillään sairastavan kyseessä olevaa tartuntatautia. Näyte voi myös olla ympäristöstä 35 otettu näyte, kuten tutkittavalta alueelta kerätty maanäyte, paperinäyte tai il- • · · • · * « • · · • *· • · 14 118690 manäyte tai muu ympäristöstä otettu näyte, josta voidaan eristää nukleiinihappoa.

Koska keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyt alukeparit ovat hyvin spesifisiä, analyysiin tarvitaan vain pieni määrä näytteitä ja sopivat 5 näytteet voidaan analysoida jopa ilman edeltäviä nukleiinihapon puhdistus- ja eristysvaiheita. Edullisesti DNA kuitenkin eristetään analysoitavasta näytteestä jonkin perinteisen menetelmän avulla, kuten kaupallisesti saatavilla olevien DNA-isolaatiokittien avulla (esim. MagNAPure LC System, Roche, High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche; NucleoSpin, BD Biosciences Clon-10 tech; tai QIAamp DNA Mini-kit, Qiagen) tai perinteisesti uuttamalla. Edullisesti käytetään kaupallisesti saatavilla olevia kittejä, koska niitä on yleisesti saatavilla, ne ovat nopeita ja turvallisia käyttää sekä mahdollistavat toistettavuuden.

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä DNA-monis-tuksessa käytettävät reagenssit voivat olla mitä tahansa reagensseja, joita on 15 perinteisesti käytetty DNA:n monistuksessa ja jotka ovat alan ammattilaisten tuntemia. Sopivin ja helpoin käyttää on kaupallisesti saatavilla oleva Universal PCR -sekoitus (Applied Biosystems), joka koostuu seuraavista aineista: dNUTP'S, MgCl2, reaktiopuskuri, AmpErase®urasiili-N-glykosylaasi (UNG), ROX passiivinen referenssi ja AmpliTaq Gold®. On kuitenkin myös mahdollista 20 käyttää erityyppisiä termostabiileja DNA-polymeraaseja ja niiden puskureita (esim. AmpliTaqLD, DyNAzyme, TaqPlus Precision ja HotStartTaq), nukleotidejä tai esivalmistettuja nukleotidiseoksia (esim. Sigma, Applied Biosystems, Amersham Biosystems), MgCI2:a (jolloin yleensä käytetään Taq-polymeraasin ·**·. valmistajalta saatavaa tuotetta).

• · · **Y 25 Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän suurin etu on se, et- • ti tä bioterrorismiagenssien B. anthraciksen, Y. pestiksen ja F. tularensiksen ha- • 99 vaitseminen on hyvin nopeaa, koska kaikki kolme bakteeria voidaan havaita ί» : samanaikaisesti. Ennen esillä olevaa keksintöä nämä bakteerit oli onnistuttu «·· havaitsemaan reaaliaikaisen PCR:n avulla kolmessa eri testiajossa. Loiez C. et 30 ai., supra, kuvaa Y. pestiksen ja Versage J.L. et ai., supra, kuvaa F. tularensik-sen havaitsemista reaaliaikaisella PCR:llä. Näitä menetelmiä ei kuitenkaan voida käyttää kaikkien kolmen bakteerin yhtäaikaiseen havaitsemiseen ilman *·· * . PCR-olosuhteiden optimoimista, kuten kuvataan tässä keksinnössä.

WO 2005030991 ja Charrel R.N. et ai., 2004, BMC Microbiology, 4:21, 1-11 * 35 osoittavat PCR-pohjaisen menetelmän bioterrorismiin käytettävän bakteriaali- sen tai viraalisen DNA-aineen läsnäolon havaitsemiseksi. Tämän menetelmän • • · • · · • ·· ♦ § 15 118690 mukaan bakteriaalisesta DNA:sta PCR:llä monistetut fragmentit sijaitsevat B. anthracis pagA-, Y. pestis pla-, F. tularensis fopA- ja variolaviruksen hemaglu-tiniinigeeneissä. Lisäksi, WO 2005030991 ei osoita capB-geenin käyttöä B. anthraciksen havaitsemiseksi. Menetelmä sallii siten myös avirulentin B. anth-5 racis -kannan havaitsemisen.

Keksinnön mukainen menetelmä on hyvin sensitiivinen jokaisen kolmen A-luokkaan kuuluvan aineen yhdelle bakteerisolulle. B. anthraciksen havaitseminen on ainakin yhtä sensitiivistä kuin tunnetussa tekniikassa (Bell, C.A., et ai., 2002, J Clin Microbiol 40:2897-2902; Ellebrok, H., H. et ai., 202, 10 FEMS Microbiol Lett 214:51-59; Reif, T.C., et ai., 1994. Appi Environ Microbiol 60:1622-1625). F. tularensiksen havaitsemisen sensitiivisyydeksi saatiin 0,1 genomista ekvivalenssia (GE). Aiemmissa tutkimuksissa on raportoitu sensitii-visyysarvoksi 5 (GE) (Bastien, M., et ai., 2005, ASM Biodefence Research Meeting 2005, abstrakti). Y. pestiksen havaitsemisen sensitiivisyys oli 0,2 15 GE:tä. Aiemmissa tutkimuksissa sensitiivisyydeksi on raportoitu noin 20 GE:tä (Chase, C.J. et ai., 2005, Clin Chem 51:1778-1785).

Yhtä tärkeää on se, että keksinnön mukainen menetelmä on erittäin spesifinen, sillä siinä ei havaita yhtään läheistä sukua olevaa bakteerilajia.

Esillä olevan keksinnön etuna on lisäksi se, että luokkaan A kuulu-20 vat bakteriaaliset bioterrorismiagenssit saadaaan diagnosoitua nopeasti. Keksinnön mukaisella ABI 7300 96-levytestiliä analyysi saadaan suoritettua alle 120 minuutissa näytteen prosessoinnin jälkeen. DNA saadaan uutettua 30 mi-. nuutissa käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia kittejä. Kaikkiin reaktioihin kuu- ;*·; luu sisäisiä positiivisia kontrolleja, joita voidaan käyttää näytteissä olevien hi- • · * 25 dastavien tekijöiden arvioinnisssa, mikä vähentää analyysiin tarvittavaa aikaa. Näytteen prosessointiin ja analyysiin kuluu yhteensä alle kolme tuntia.

• * : Esillä olevan keksinnön mukainen diagnostinen kitti on tarkoitettu · käytettäväksi sellaisten bakteerilajien diagnoosissa, joita voidaan käyttää bio- terrorismiagensseina. Kittii käsittää 30 a) lajispesifiset alukkeet Bacillus anthracis, Yersinia pestis ja Fran- cisella tularensis -bakteereille, jolloin B. anthraciksen eteenpäin suuntaavalla .···. alukkeella ja käänteisalukkeella on sekvenssinumerojen 1 ja 2 mukaiset sek- *·*' venssit, jotka ovat peräisin pagA-geenistä, ja sekvenssinumerojen 4 ja 5 mu- *!**: kaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin B. anthracis capB -geenistä, Y. pestiksen 35 eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteisalukkeella on sekvenssinumero- « jen 7 ja 8 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin p/a-geenistä, ja F. tularen- t · • * · • ·· t · 16 118690 siksen eteenpäin suuntaavalla alukkeella ja käänteisalukkeelia on sekvenssi-numerojen 10 ja 11 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin 23 kDa -geenistä, b) spesifisillä Taqman MGB-koettimilla B.anthracis, Y. pestis ja F. tularensis -bakteereille on sekvenssinumeron 3 mukainen sekvenssi, joka on 5 peräisin B. anthracis pagA -geenistä, sekvenssinumeron 6 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis capB -geenistä, sekvenssinumeron 9 mukainen sekvenssi, joka on peräisin Y. pestis pla -geenistä, tai sekvenssinumeron 12 mukainen sekvenssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa -geenistä, sekä vaihtoehtoisesti 10 c) sisäiset positiiviset kontrollit ja reagenssit, jotka vaaditaan monis tus-, hybridisaatio-, pesu, ja/tai havaitsemisvaiheissa.

Keksinnön mukaisen menetelmän PCR-analyysin positiivisen tuloksen varmistamiseksi voidaan muodostaa infektiovapaa kontrolliplasmidi. Kont-rolliplasmidi käsittää osittaiset sekvenssit Bacillus anthracis pagA ja capB 15 -geeneistä, joilla on sekvenssinumerojen 21 ja vastaavasti 22 mukaiset sekvenssit, Yersinia pestis pla -geenistä, jolla on sekvenssinumeron 23 mukainen sekvenssi, ja Francisella tularensis 23 kDa -geenistä, jolla on sekvenssinumeron 24 (taulukko 3) mukainen sekvenssi, ja sopivat promoottori-, replikaatio- ja regulaatiosekvenssit. B. anthraciksen pagA- ja capö-geenien, Y. pestiksen pla-20 geenin ja F. tularensiksen 23 kDa -geenin geenialueet monistetaan perinteisessä PCR:ssä käyttäen alukkeita, jotka sisältävät paikat restriktioentsyymeil-le, kuten on esitettu taulukossa 2. Monistetut geenialueet kloonataan erikseen . E. coli -vektorin pUC19 useisiin kloonauspaikkoihin. Tämän jälkeen neljä eri ··· ;··· plasmidia yhdistetään restriktio- ja ligaatioreaktioissa, joiden tuloksena saa- ♦ 25 daan infektiovapaa plasmidi, joka sisältää kaikki neljä geenialuetta. Näin ollen plasmidia voidaan käyttää kaikkien keksinnön mukaisten alukkeiden positiivi-·.: · sena kontrollina.

Keksinnön infektioriskivapaan kontrolliplasmidin merkittävä etu on se, että käyttämällä plasmidia, bioterrorismiaineiden B. anthraciksen, Y. pes-30 Uksen ja F. tularensiksen PCR-tulosten varmennus on hyvin spesifinen ja sen-sitiivisempi verrattuna tunnetun tekniikan mukaisiin kontroliiplasmideihin [···. (WO 2005030991 ja Charrel, R.N. et at, 2004, BMC Microbiology, 4:21,1-11).

• · ··· ' 1 • · ··» • · · • · · · • · · * ·1 • · 17 118690

Taulukko 2. Restriktioalukkeet infektiovapaan kontrolliplasmidin muodostamiseksi

Alukkeet Alukepositio* Fragmentin SEKVENSSINRO: koko (bp) B. anthracis pagA (AC M22589) 213

PagF (EcoR\) 3323-3343 13

5’ATTAGAATTCGTGAAGTGTTACCGCAAATTC

pagR (Kpni) 3535-3515 14 5’ ATTAGGTACCCGGTTATGTCTTTCCCTT-

GAT

Y. pestis pla (AC M27820) 212 plaF(Kpnl) 733-753 15 5’ ATTAGGJACCGG ATATCAGG AA-

ACACGTTTC

plaR (BamH\) 944-927 16

5’ ATTAGGATCCTGTGCCCGAACCCAGTCG

B. anthracis capB (AC M24150) 202 capF (BamH\) 1059-1079 17 5’ ATT AG;

GATCCTTCGTAAATGGTTTTGCAGCG

,ί. capR (Xba\) 1260-1241 18

J*'*, 5’ ATTATCTAGACAGTCGTTTCTCCAATCGCA

e e e ·*« e e • · e • · * F.tularensis -geeniä koodaava 23 kDa- 204 e e e ··· · proteiini • e : (ACY08861) *·· 23F {Xba\) 535-554 19

5’ ATT AT CT AG AGG AG AAT GATT AT G AGT G AG

23R (Psfl) 738-720 20

;***; 5’ ATTACTGCAGCCGAATCAGCTTTCGTGAC

e · e e e ·*·«· e · «»··* • e e • e# e · e e e e •' e e e e e • ee • e 18 118690

Taulukko 3. Infektiovapaan kontrolliplasmidin plasmidisekvenssit

Nimi__Plasmidisekvenssi__SEKVENSSINRO:__ gtgaagtgtt accgcaaatt caa- PAG gaaacaa ctgcacgtat catttt- ^' taat ggaaaagatt taaatctggt agaaaggcgg atagcggcgg ttaatcctag tgatccatta gaa-acgacta aaccggatat gacat-taaaa gaagccctta aaatag-catt tggatttaac gaaccgaatg gaaacttaca atatcaaggg aaa- __gacataa ccg___ ttcgtaaatg gttttgcagc _ CAP gaatgatccc tcatcaacat tacgtatttg ggaacgtgtg gat-gattttg gatatagtaa tctagctcca attgtaatta tgaattgccg ccctgaccgc gttgatcgta ctgagcagtt tgctagggat gttttgccat atattaaagc ggaaatagtt __attgcgattg gagaaacgac tg__ ggatatcagg aaacacgttt PLA cagttggaca gctacaggtg gttcatatag ttataataat ggagcttata ccggaaactt cccgaaagga gtgcgggtaa taggttataa ccagcgcttt tctatgccat atattggact tgcaggccag tatcgcatta at-gattttga gttaaatgca ttatt-taaat tcagcgactg __ggttcgggca ca___ ggagaatgat tatgagtgag at- ηλ 23 kDa gataacaa gacaacaggt aa- caagtggc gagaccattc atgt-gagaac tgatcctact gcatgta-tag gatctcatcc taattgtaga ttatttattg attctttaac ta-tagctggg gagaaacttg ataa- ·, aaatat cgttgctata gagggtg- ,,.ϊ gag aggatgtcac gaaagctgat : .·. _I—less__ * · · t»· · • I ·

Alan ammattilaiselle on ilmeistä, että tekniikan kehittyessä keksin- • · · J*:4: nön ajatus voidaan toteuttaa monin eri tavoin. Keksintö ja sen suoritusmuodot i.i i 5 eivät rajoitu alla kuvattaviin esimerkkeihin, vaan ne voivat vaihdella patentti- ··· vaatimusten puitteissa.

;·. Esimerkit • ·· .···. Esimerkki 1. Alukkeen ja koettimen valinta ( · ··· * . Alukkeiden ja Taqman MGB-koettimien yhdistelmät suunniteltiin nii- 10 den B. anthraciksen, Y. pestiksen ja F. tularensiksen sekvenssien perusteella, \ ’ jotka olivat saatavilla NCBI:n julkisesta tietokannasta :T: (http://www.ncbi.nlm.nih.aov/blast/)· Aluke- ja koetinsekvenssit valittiin seuraa- • · ·

• M

m * 19 118690 vien kriteereiden perusteella: ennustettu ristireaktiivisuus käytettävissä olevien geenipankin sekvenssien kanssa, alukedimeerin formaation puuttuminen, nukleotidin itsestään sitoutuminen, alukkeiden +10 Celsius-astetta koettimien su-lamislämpötilaa korkeampi sulamislämpötila, ei useamman kuin neljän identti-5 sen nukleotidin jaksoja, ei guaniinia koettimen 5'-päässä. Suunnittelu suoritettiin Primer Express ver. 2.0 -ohjelmistolla (Applied Biosystems, CA, USA).

Taqman MGB-koettimen 5'-päähän konjugoitu fluoresoiva indikaat-toriväri oli 6-karboksifluoresiiniä (FAM) ja 3’-päässä käytettiin ei-fluoresoivaa sammutinta (Applied Biosystems, CA, USA).

10 B. anthraciksen spesifiset alukkeet pagF (sekvenssinro 1), pagR

(sekvenssinro 2), capF (sekvenssinro 4), capR (sekvenssinro 5) ja Taqman MGB-koettimet pagTM (sekvenssinro 3) ja capTM (sekvenssinro 6) muodostettiin vastaavasti virulenttien plasmidien pX01 ja pX02 pag-geenistä (geenipankin talletusnumero M22589) ja cap-geenistä (geenipankin talletusnumero 15 M24150). V. pestiksen spesifiset alukkeet plaF (sekvenssinro 7) ja plaR (sek venssinro 8) muodostettiin kohdentumaan virulentin plasmidin pCP1 p/a-geeniin (geenipankin talletusnumero M27820). PlaF-aluke valittiin julkaisusta Loiez et ai., 2003, supra, ja plaR-aluke ja Taqman MGB plaTM -koetin suunniteltiin erikseen. F. tularensiksen alukkeet ja koettimet kohdistuivat 23 kDa-20 geeniin (geenipankin talletusnumero Y08861). Molemmat alukkeet 23F (sek-venssinumero 10) ja 23R (sekvenssinumero 11) valittiin julkaisusta Versage, J. L, et ai., 2003, J Clin Microbiol 41:5492-5499, ja Taqman MGB-koetin, 23 u kDaTM (sekvenssinro 12), suunniteltiin erikseen. Applied Biosystems (Che- ;··; shire, Englanti) valmisti alukkeet ja koettimet (taulukko 1) synteettisesti.

· · • 1 · ··· · : ·1: 25 Esimerkki 2. Luokkaan A kuuluvien bakteerien reaaliaikainen PCR- 1 · : analyysi ··· · ;1: PCR-analyysiä varten DNA eristettiin kuviossa 1 luetelluista baktee- *** · .1·1. rikannoista ja isolaateista. Kannat 1-20 ja Y1-Y48 saatiin Haartman-instituutin bakteriologian ja immunologian osaston kokoelmista (Helsinki, Suomi). Baktee- ... 30 rikannat E1-E18 saatiin Helsingin yliopiston Eläinlääkintä- ja elintarviketutki- *...# muslaitokselta Suomesta. Kaikki isolaatit (1-20 ja E1-E18) ja positiiviset kont- **;·1 rollit: B. anthracis Sterne 7702, B. anthracis ATCC 4229, Y. pestis EV76-C ja F.

tularensis LVS -kannat oli kasvatettu perinteisin mikrobiologisin menetelmin.

·:··: Kannat 34-42 saatiin DSMZ:ltä (Braunschweig, Saksa) ja kasvatettiin DSMZ:n ..j.. 35 ohjeiden mukaisesti lukuun ottamatta Verromicrobium spinosumia, Borrelia **.1 . burgdorferia and F. philomiragia, jotka saatiin aktiivisesti kasvavina viljelminä.

• · · * · 1 • · 20 118690

Kaikki bakteeri-isolaatit puhdistettiin käyttäen automatisoitua Mag-NAPure LC -järjestelmää (Basel, Sveitsi) valmistajien toimittaman LC DNA Isolation Kit III -käsikirjan mukaisesti. B. anthraciksen, F. tularensiksen ja Y. pes-tiksen kontrollikantoja kasvatettiin yön yli, ja ne jaettiin näytteisiin, minkä jäl-5 keen ne puhdistettiin QiaAmp DNA miniKit -laitteella (Qiagen, Hilden, Saksa). Y. pseudotuberculosis -näytteet saatiin puhdistettuna DNA:na. Bakteeri-iso-aateista uutettu DNA:n kokonaismäärä mitatiin Genequant RNA/DNA -laitteella (BioChrom Ltd, Cambridge, UK).

Eristetyille DNA-näytteille suoritettiin reaaliaikainen PCR-analyysi. 10 Reaaliaikainen PCR-reaktiosekoitus koostui 2,5 pl:sta DNA-näytettä, 12,5 piistä 2 x Taqman Universal PCR -sekoitetta (Applied Biosystems), joka koostui seu-raavista aineista: dNUTP’S, MgCfe, reaktiopuskuri, AmpErase®urasiili-N-gly-kosylaasi (UNG), ROX passiivinen referenssi ja AmpliTaq Gold®. Lisäksi käytettiin 2,5 pliaa IPC-sekoitetta ja 0,5 pliaa IPC-synteettistä DNAita. Kaikki testit 15 suoritettiin 25 piin lopullisessa tilavuudessa.

Alukkeiden ja koettimien (esimerkki 1) konsentraatiot optimoitiin. Optimointikokeet perustuivat ABI 7300 -käsikirjan (Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System; Training course manual, kappale 12), ja ne suoritettiin seuraavasti. Kunkin alukkeen ja koettimen erilaisia konsentraatioita tes-20 tattiin matriisimuodossa siten, että käänteisalukkeiden 50, 300 tai 900 nM:n konsentraatioita testattiin yhdessä eteenpäin suuntaavien alukkeiden 50, 300 tai 900 nM:n konsentraatioiden kanssa. Koettimien konsentraatiot optimoitiin muuttelemalla konsentraatioita välillä 50-250 nM. Optimaaliset konsentraatiot f *! valittiin alhaisimman Ctin (aikaisin syklikynnys) ja suurimman päätepisteen • · · 25 fluoresenssin perusteella.

:.i.: Optimoidut PCR-olosuhteet olivat B. anthracis -analyysille seuraa- • ·

: vati 300 nM eteenpäin suuntaavaa aluketta, 900 nM käänteisaluketta ja 250 nM

j.f: fluoresenssilla leimattua Taqman-koetinta. S. anthracis -kantoja Sterne 7702 ϊ*"ϊ (pXOI+/pX02-) ja ATCC 4229 (pX01-/pX02+) käytettiin positiivisina kontrol- 30 leina. Y. pestiksen PCR-reaktiot sisälsivät 50 nM eteenpäin suuntaavaa aluket- ta, 300 nM käänteisaluketta ja 250 nM fluoresenssilla leimattua Taqman- *.··*. koetinta. Y. pestis -kantaa EV76-C käytettiin positiivisena kontrollina. F. tula- • ♦

"* rensis -analyyseissä käytettiin 300 nM eteenpäin suuntaavaa aluketta, 900 nM

*:**: käänteisaluketta ja 250 nM fluoresenssilla leimattua Taqman-koetinta. F. tula- 35 rensiksen LVS-kantaa käytettiin positiivisena kontrollina. Seuraavat kontrollire-aktiot sisällytettiin kaikkiin diagnostisiin testiajoihin: monistusta sisältämättä- * « · • · · • ·· • * 21 118690 missä kontrolleissa (NAC) templeetti korvattiin sisäisen positiivisen kontrollin (IPC) estäjällä ja templeettiä sisältämättömissä kontrolleissa (NTC) vedellä. Molemmat kontrollit toistettiin kuusi kertaa.

Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin samanaikaisesti B. anth-5 racikselle, Y. pestikselle ja F. tularensikselle 96-levyanalyysissä ABI 7300 -lämpösyklerillä (Applied Biosystems) käyttäen seuraavia parametrejä: 2 min 50 °C:ssa, 10 min 95 °C:ssa, 40 15 s:n sykliä 95 °C:ssa ja 1 min 60 °C:ssa. Saatu fluoresenssidata analysoitiin Sequence Detector -ohjelmistolla (Applied Biosystems).

10 Esimerkki 3. Keksinnön mukaisen menetelmän sensitiivisyys ja spesifisyys

Lineaarisuusalueen, havainnoinnin alarajan ja analyysin sisäisen variaation määrittämiseksi esimerkin 2 mukaisella menetelmällä analysoitiin B. anthraciksen, Y. pestiksen ja F. tularensiksen DNA:n yhdeksän 10-kertaisen 15 laimennoksen kolme replikaatiota TE-puskurissa (Tris 10mM, EDTA 1mM; asetettu pH-arvoon 8,0 HCIiilä), joka sisälsi noin 10 ng-0.1 fg DNA:ta. Ct-arvoista muodostettiin vakiokäyrät ja laskettiin korrelaatiokertoimet. Kaikki R2-arvot olivat yli 0,99 ja jyrkkyydet lähellä 3,3:a, joten PCR-monistuksen tehokkuus oli erittäin hyvä.

20 Keksinnön mukaisen reaaliaikaisen PCR-analyysin sensitiivisyys B.

anthraciksen pagA~ ja capfi-geenille oli 1 fg ja 10 fg, Y. pestiksen pla -geenille 0,1 fg ja F. tularensiksen 23 kDa -geenille 0,1 fg DNA:n kokonaismäärästä. Keksinnön mukaisen menetelmän sensitiivisyys vastaa yhtä bakteerisolua kai- t · ; kissa kolmessa luokkaan A kuuluvassa aineessa.

·,·*· 25 Keksinnön mukaisen PCR-analyysin spesifisyyden arvioimiseksi analysoitiin kliinisiä näytteitä ja ympäristöstä otettuja näytteitä (taulukko 1), jot- • :*· ta pystyttiin esittämään bakteriaalisen fylogeneettisen puun kokonaisdiversi- *·· · .**·. teetti. Bakteriaalisen fylogeneettisen puun päälinjat jätettiin huomiotta siksi, et tä näytteiden normaalit keruupaikat eivät kuuluneet niiden elinympäristöön.

30 Esimerkkinä voidaan mainita syvänmeren termofiiliset bakteerit. Puun jokai- *... sesta haarasta valittiin yksi laji edustamaan koko ryhmää.

*·"* Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin esimerkissä 2 kuvatulla ta- ·ί**! valla. Ainakin 1 ng DNA:n kokonaismäärästä ladattiin reaktiota kohti, jotta pys- ·:··: tyttiin havaitsemaan mahdollinen ristireaktio ei-spesifisten kohteiden kanssa.

/y, 35 Kaikki näytteet analysoitiin kahteen kertaan.

• ♦ • · · • ·· • · 22 118690

Monistumista havaittiin vain B. anthraciksen, Y. pestiksen ja F. tula-rensiksen (Sterne 7702, ATCC 4229, LVS, EV76-c) kontrollikannoissa ja spesifisissä F. tularensiksen kliinisissä näytteissä (ks. esimerkki 4). Ei-spesifisiä monistumistuotteita ei havaittu. Lisäksi sisäiset positiiviset kontrollit (IPC:t) mo-5 nistuivat onnistuneesti kaikissa analyyseissä eikä yhtään näytettä hylätty analyysistä tai jouduttu testaamaan uudestaan mahdollisten hidastavien tekijöiden takia.

Esimerkki 4. Kliinisten näytteiden analyysi

Kliiniset eläinkudosnäytteet pernaruttoon sairastuneesta lehmästä ja 10 jänisruttoon sairastuneesta jäniksestä saatiin vastaavasti Helsingin yliopiston ja Oulun yliopiston Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitokselta.

DNA:ta puhdistettiin formaldehydiin säilötystä infektoituneesta lehmän kudoksesta (20 mg) ja parafiiniin säilötystä jäniksen kudoksesta (10 x40 pm) QiaAmp DNA miniKit -välineellä (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan suositus-15 ten mukaisesti.

Näytteistä tehtiin kolme erillistä DNA-eristystä ja näytteet analysoitiin kahteen kertaan reaaliaikaisella PCR-testillä, kuten on esitetty esimerkissä 2.

Näiden näytteiden Ct-arvot vaihtelivat välillä 16-20 ja 21-22 (kuviot 20 2 ja 3), joten vahva positiivinen indikaatio saatiin jo testien varhaisessa vai heessa.

Lisäksi reaaliaikaisella PCR-testillä analysoitiin esimerkissä 2 kuva-tulla tavalla kliinisiä F. tularensiksen isolaatteja (näytteet nro 21-30), jotka oli • · : saatu Haartman-instituutin bakteriologian ja immunologian osaston kokoelmis- 25 ta (Helsinki, Suomi). Odotusten mukaisesti kaikista näytteistä saatiin positiivi- : :*: nen indikaatio. Tulokset on esitetty kuviossa 4.

• · t · ·

Esimerkki 5. Kontrollipiasmidin muodostaminen m · • ·

Reaaliaikaista PCR-analyysimenetelmää varten muodostettiin infek-tioriskistä vapaa kontrolliplasmidi sisällyttämällä plasmidiin B. anthraciksen pagA- • · Y" 30 ja capB-geenin ( sekvenssinumerojen 21 ja 22 mukaiset sekvenssit), Y. pestik-*···* sen pla -geenin (sekvenssinumeron 23 mukainen sekvenssi) ja F. tularensik- ·:*·: sen 23 kDa -geenin (sekvenssinumeron 24 mukainen sekvenssi; esitetty taulu- kossa 3) geenialueet. Geenialueet monistettiin perinteisellä PCR:llä käyttäen lajispesifisiä alukkeita, jotka sisälsivät paikat restrikitioentsyymeille (taulukko • · · Y ’ 35 2). Monistetut geenialueet kloonattiin erikseen E coli -vektorin pUC19 useisiin • · · • · * • · 23 118690 kloonauskohtiin. Tämän jälkeen neljä erilaista plasmidia yhdistettiin restriktio-ja ligaatioreaktioiden avulla molekyylibiologiassa yleisesti käytettyjen menetelmien mukaisesti. Tuloksena oli infektiovapaa plasmidi, joka sisälsi kaikki neljä geenialuetta. Plasmidia voidaan siten käyttää kaikkien keksinnön mukaisten 5 alukkeiden positiivisena kontrollina.

··· ·»·· • · • · · • · · • · ♦ • · · ··· • ♦ • · · • · ♦ ♦ ·· · • · • · # • · · ··· · ··· • t • · ·· · ·· • · • ·· * ♦ · • · ··· • · • ·

• M

♦ 1 · • · · t • · ·

• M

• t

Claims (10)

118690

1. Menetelmä Bacillus anthraciksen, Yersinia pestiksen ja Francisel-la tularensiksen läsnäolon tai poissaolon yhtäaikaiseksi havaitsemiseksi yksit- 5 täisessä reaaliaikaisessa PCR-testiajossa käyttäen spesifisiä Taqman MGB koettimia ja lajispesifisiä alukkeita, tunnettu siitä, että a) B. anthraciksen eteenpäinsuuntaavilla- ja käänteisalukkeilia on sekvenssit numero 1 ja vastaavasti 2, jotka ovat peräisin pagA geenistä ja sekvenssit numerot 4 ja vastaavasti 5, jotka ovat peräisin capB geenistä, 10 b) V. pestiksen eteenpäinsuuntaavalia- ja käänteisalukkeella on sekvenssit numero 7 ja vastaavasti 8, jotka ovat peräisin pla geenistä, ja c) F. tularensiksen eteenpäinsuuntaavalia- ja käänteisalukkeella on sekvenssit numero 10 ja vastaavasti 11, jotka ovat peräisin 23 kDa geenistä, ja jolloin mainittujen eteenpäinsuuntaavien alukkeiden ja mainittujen 15 käänteisalukkeiden konsentraatiot on optimoitu alueelle 50 - 900 nM samoissa lämpötilaparametreissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifisellä Taqman MGB koettimella on sekvenssinumeron 3 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis pagA geenistä, sekvenssinumeron 6 20 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis capB geenistä, sekvenssi-numero 9:n mukainen sekvenssi, joka on peräisin Y. pestis pla geenistä, tai sekvenssinumeron 12 mukainen sekvenssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa geenistä. I,·1: 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu :a:‘: 25 siitä, että optimaaliset olosuhteet reaaliaikaisessa PCR-testissä ovat B. anthra- • cikselle 300 nM eteenpäinsuuntaavaa aluketta, 900 nM käänteisaluketta ja 250 ··· · : .1. nM Taqman MGB koetinta, Y. pestikselle 50 nM eteenpäinsuuntaavaa aluket- *.···. ta, 300 nM käänteisaluketta ja 250 nM Taqman MGB koetinta, ja F. tularensik- • · selle 300 nM eteenpäinsuuntaavaa aluketta, 900 nM käänteisaluketta ja 250 30 nM Taqman MGB koetinta. » ·

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tun- • · *···' nettu siitä, että käytetään multiplex PCR-formaattia, jossa reaktiot suorite- ·:··: taan yhdessä testiputkessa käyttäen eri tavoin leimattuja Taqman MGB koet- ·.··· timia. ··» • · · • · · • · • ·· • » 118690

5. DNA alukeparien käyttö Bacillus anthracis, Yersinia pestis ja Francisella tularensis bakteerien yhtäaikaisessa havaitsemisessa, tunnet-t u siitä, että B. anthracis alukkeilla on sekvenssinumerojen 1 ja 2 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin B. anthracis pagA geenistä, sekvenssinumero- 5 jen 4 ja 5 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin B. anthracis capB geenistä, Y. pestis alukkeilla on sekvenssinumerojen 7 ja 8 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin pla geenistä ja F. tularensis alukkeilla on sekvenssinumerojen 10 ja 11 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin 23 kDa geenistä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että 10 alukepareja käytetään PCR-pohjaisissa testeissä.

7. Taqman MGB koetin, joka on käyttökelpoinen Bacillus anthracis, Yersinia pestis tai Francisella tularensis bakteerien havaitsemisessa, tunnettu siitä, että mainitulla Taqman MGB koettimella on sekvenssinumeron 3 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis pagA geenistä, sekvenssi- 15 numeron 6 mukainen sekvenssi, joka on peräisin B. anthracis capB geenistä, sekvenssinumero 9:n mukainen sekvenssi, joka on peräisin Y. pestis pla geenistä, tai sekvenssinumeron 12 mukainen sekvenssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa geenistä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukaisten Taqman MGB koettimien käyttö 20 reaaliaikaisissa PCR-pohjaisissa testeissä.

9. Diagnostinen kitti käytettäväksi sellaisten bakteerilajien diagnoosissa, joita voidaan käyttää bioterrorismiagensseina, tunnettu siitä, että se , käsittää ··· j a) lajispesifiset alukkeet Bacillus anthracis, Yersinia pestis ja Fran- : 25 cisella tularensis bakteereille, jolloin B. anthraciksen eteenpäinsuuntaavilla- ja v..: käänteisalukkeilla on sekvenssinumerojen 1 ja 2 mukaiset sekvenssit, jotka ovat peräisin pagA geenistä ja sekvenssinumerojen 4 ja 5 mukaiset sekvenssi*: sit, jotka ovat peräisin B. anthracis capB geenistä, Y. pestiksen eteenpäin- ·"*: suuntaavilla- ja käänteisalukkeilla on sekvenssinumerojen 7 ja 8 mukaiset sek- 30 venssit, jotka ovat peräisin pla geenistä ja F. tularensiksen eteenpäinsuuntaa- :·, villa- ja käänteisalukkeilla on sekvenssit numero 10 ja 11, jotka ovat peräisin • ·« *..., 23 kDa geenistä, b) spesifisillä Taqman MGB koettimilla B.anthracis, Y. pestis and F. *’·*’*· tularensis bakteereille on sekvenssinumeron 3 mukainen sekvenssi, joka on ·:*·: 35 peräisin B. anthracis pagA geenistä, sekvenssinumeron 6 mukainen sekvenssi·, si, joka on peräisin B. anthracis capB geenistä, sekvenssinumeron 9 mukainen • · · · • · · • *® • t 118690 sekvenssi, joka on peräisin Y. pestis pla geenistä, tai sekvenssinumeron 12 mukainen sekvenssi, joka on peräisin F. tularensis 23 kDa geenistä, ja mahdollisesti c) sisäiset positiiviset kontrollit ja reagenssit, jotka vaaditaan monis-5 tus-, hybridisaatio-, pesu, ja/tai havaitsemisvaiheissa.

10. Infektiovapaa kontrolliplasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää osittaiset sekvenssit Bacillus anthracis pagA ja capB geeneistä, joilla on sekvenssinumerojen 21 ja vastaavasti 22 mukaiset sekvenssit, Yersinia pestis pla geenistä, jolla on sekvenssinumeron 23 mukainen sekvenssi ja Francisella 10 tularensis 23 kDa geenistä, jolla on sekvenssinumeron 24 mukainen sekvenssi. ·1· ·»·· m · • · · • · · «M · • · · • · ♦ ·· • · t · t I 4 · ··· · • · * 1 1 I 1 · ··· · ··· * · • 1 ·· · ·· • ♦ « ·« * • # · • · • · T 1 • · ··· • « · * · · · • · · • M • · 118690