WO2005030991A1 - Methode de detection d’agents bacteriens ou viraux de bioterrorisme - Google Patents

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WO2005030991A1
WO2005030991A1 PCT/FR2004/002300 FR2004002300W WO2005030991A1 WO 2005030991 A1 WO2005030991 A1 WO 2005030991A1 FR 2004002300 W FR2004002300 W FR 2004002300W WO 2005030991 A1 WO2005030991 A1 WO 2005030991A1
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seq
dna
bacterial
primer
sequence
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Application number
PCT/FR2004/002300
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Rémi CHARREL
Bernard La Scola
Didier Raoult
Original Assignee
Universite De La Mediterranee (Aix-Marseille Ii)
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention provides a method for detecting the presence of a bacterial or viral DNA agent in a sample containing DNA to be tested, in which an enzymatic amplification reaction of DNA of the PCR type is carried out. DNA extracted from said test sample and from a synthetic DNA fragment comprising a specific sequence of said bacterial or viral agent in a positive control sample.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit useful for the implementation of a detection method according to the invention.
  • bioterrorism agents Following cases of anthrax inhaled in Florida in October 2001, health authorities have intensified preparedness and prevention programs against bioterrorism agents.
  • the Center for Diseases Control and Prevention (CDC, Atlanta, USA, http://www.cdc.gov/) has listed potential bioterrorism agents in different priority categories A and B (Table 1).
  • the detection of these agents must be able to be carried out on environmental samples such as powders, clinical samples or on bacteria or viruses isolated in culture. Molecular detection of an infectious agent is achievable by most laboratories, provided that they have minimal equipment to implement these techniques because these techniques have an initial stage of nucleic acid extraction which makes these agents non-infectious.
  • the present invention essentially consists in providing as positive control, a large synthetic fragment, in particular integrated into a plasmid of Escherichia coli, grouping a plurality of synthetic DNA fragments specific to a plurality of bioterrorism agents and / or agents respectively. confounding, preferably at least 4 and more particularly from 4 to 8, said specific synthetic DNA fragments being modified by the substitution of part of the original sequence by an exogenous DNA sequence which contains a restriction site not present in any of the specific sequences of origin of said bioterrorism agents or confounding agents.
  • the present invention provides a method for detecting the presence of a bacterial or viral DNA bioterrorism agent in a sample containing DNA to be tested, in which an enzymatic amplification reaction is carried out.
  • DNA of the PCR type of DNA extracted from said test sample and a synthetic DNA fragment comprising a specific sequence of said bacterial or viral agent in a positive control sample characterized in that: a / - it is detected whether said test sample includes DNA from a bacterial or viral agent belonging to • a group of at least 4 bacterial or viral agents with bioterrorism DNA, preferably from 4 to 8, or
  • a group of at least 4 bacterial or viral DNA agents comprising at least one bacterial or viral agent with bioterrorism DNA and at least one bacterial or viral agent with confounding DNA, and b / - a synthetic fragment of positive control DNA is used as a large synthetic DNA fragment grouping together second synthetic DNA fragments each comprising a specific sequence respectively of each of said bioterrorism agents and, where appropriate, of said agents confounding of said group, said specific sequence of each said bacterial or viral agent being modified by substitution of a part of the corresponding authentic sequence of said bacterial or viral agent by an exogenous sequence comprising a sequence corresponding to a cleavage site by a restriction enzyme , said site not being present in any one of said authentic specific sequences of said bacterial or viral agents of said group, said exogenous sequence preferably being of different size, more preferably still greater than that of said portion of authentic sequence replaced.
  • an enzymatic amplification reaction of the PCR type is carried out on the DNA of at least one said specific sequence of at least one of said bacterial or viral bioterrorism agents and, where appropriate, said confounding agents, in the extracted DNA said samples to be tested and in the DNA of the positive control sample, namely in said large first fragment of synthetic DNA, using at least one set of primers capable of amplifying both at least said authentic specific sequence and said second fragment comprising said modified specific sequence,
  • the size of said replaced authentic sequence part does not exceed 10% of the size of said authentic sequence, this with the aim that the modified sequence is sufficiently different from the authentic sequence to be able to differentiate it but sufficiently similar to be behave in the same way during amplification reactions.
  • the size of said replaced authentic sequence part can be from 5 to 20 nucleotides, the size of the cleavage site corresponding to a polynucleotides from 5 to 10 nucleotides.
  • the difference in size between said exogenous sequence and said portion of authentic sequence will be sufficient to allow the detection of this difference in size by the method used and, in any event, will not exceed 10%. of the largest.
  • Said exogenous sequence may be smaller but preferably will be larger than said portion of authentic sequence replaced. More particularly, in step 3-, false positives are detected after incubation of the amplifiers from said samples to be tested in the presence of said restriction enzyme in order to cut, if necessary, said second DNA fragments which it contains, and thus detecting the presence of false positives, namely in the case where digestion of said second DNA fragments occurs.
  • bacterial or viral bioterrorism agent means the DNA genome agents defined by the CDC as bioterrorism agents of classes A and B, namely acillus anthracis, Yersinia pestis, Francise / tularensis, Bruce / sp., Burkholderia mallei, Burkholde ⁇ a pseudomallei, Chlamydia psittaei, Coxie / la btirnetii, kickettsia prowa ⁇ ekii, Rickettsia rickettsii and smallpox virus.
  • specific sequence means a sequence of the genome of said bacteria or virus which is not found in any other genome of a living organism.
  • DNA fragment is understood to mean a DNA fragment or oligonucleotide whose sequences are written below in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction.
  • the term “confounding bacterial or viral agent” means a bacterial or viral agent whose clinical manifestations are identical or similar to those of said bacterial or viral bioterrorism agent (from the same said group) to which we refer.
  • the method according to the invention makes it possible to have a single positive control or control without having to manipulate samples of said authentic bioterrorism agent, thanks to the use of synthetic DNA fragments specific for said bioterrorism agent.
  • the modification of the sequence of the specific synthetic fragment of said bioterrorism agent by an exogenous sequence which includes a site for cleavage of a restriction enzyme allows the detection with certainty of false positives by cleavage of the PCR products by the enzyme sus cited, but also by sequencing the amplified fragment, or by different properties of the amplifiers when they are studied by agarose gel electrophoresis, or by the appearance of the fusion curves they generate in real-time PCR systems . It is also possible to destroy any contaminants of the sample to be tested by the control sample before the PCR type amplification reaction by digestion with the abovementioned enzyme before carrying out the PCR reaction.
  • Last but not least, bringing together a plurality of modified synthetic DNA fragments of bioterrorism agents and / or confounding agents guarantees the speed of the detection test by reducing the number of control samples to be handled and by authorizing carrying out so-called "multiplex" PCR using only one positive control.
  • the invention provides an advantageous detection method allowing with a single control, and preferably by the implementation of a single group amplification reaction carried out under the same conditions, to detect the rapid presence of a selected bioterrorism agent among a plurality of bioterrorism agents, detecting possible false positives from the sample of positive controls.
  • step 1 - a plurality of simultaneous enzymatic PCR amplification reactions of each of said specific sequences of the bacterial or viral agents of said group are implemented, using a plurality of different sets of specific primers of each of the different said specific sequences of each of said bacterial or viral agents, the sequences of the different primers not crossing between the different said bacterial or viral agents and said primers being able to be used in an enzymatic amplification reaction carried out according to the same protocol and, in particular, at the same hybridization temperature.
  • This type of simultaneous reaction is sometimes called "multiplex PCR".
  • a plurality of PCR amplification reactions will be carried out with a single set of primers specific for a single said bacterial or viral bioterrorism agent and, where appropriate, a confounding agent, and we will carry out said PCR enzymatic amplification reactions one after the other for each said bioterrorism agent and, where appropriate, each said confounding agent.
  • the DNA to be amplified from the samples to be tested is decontaminated by bringing it into the presence of said restriction enzyme to cut, where appropriate, said second DNA fragments contained in said great first fragments of positive control DNA which they may contain following contamination by the sample of positive control DNA.
  • step 2- said verification is carried out using a probe of said specific sequence of a said bacterial or viral agent and, if necessary, using a plurality of specific probes of each of said bioterrorism agents and, where appropriate, of said confounding agents.
  • probe is understood here to mean an oligonucleotide, preferably 12 to 35, more preferably 20 to 30 nucleotides, hybridizing specifically with said specific sequence and therefore making it possible to detect or quantify it specifically.
  • primer is understood herein to mean an oligonucleotide preferably of 15 to 25 nucleotides which hybridizes specifically with one of the 2 ends of the sequence that the DNA polymerase will amplify in the PCR reaction.
  • the sequence of the said probe (s) is complementary to a part of the said authentic specific sequence (s), not overlapping with said part of the authentic sequence replaced by said exogenous sequence.
  • the said probe (s) therefore make it possible to detect either said authentic specific sequences and the modified specific sequences contained in said second fragments.
  • This embodiment is advantageous because it makes it possible to use the same probes to detect the specific sequences of a said bacterial or viral agent and the modified sequences of the positive control, so that said probes can be used in the context of a quantitative PCR amplification method in which it is necessary to determine the quantity of DNA of the test sample compared to a calibration of the quantity of DNA of positive control amplified.
  • said exogenous sequence comprises said polynucleotide corresponding to the specific cleavage site of said restriction enzyme, said polynucleotide being framed by flanking sequences which are not found in said authentic specific sequences of said bacterial or viral agents, said flanking sequences comprising n nucleotides and n being an integer from 3 to 10.
  • said flanking sequences make it possible, by their composition, to have a said exogenous sequence having a content of nucleotides G and C (G + C%) close to 50% .
  • This embodiment makes it possible to increase the size difference between said second fragments comprising a specific sequence modified by the exogenous sequence and the specific authentic sequences, so that in step 3- it is possible to differentiate the false positives , after the PCR enzymatic amplification step, by a plurality of techniques, namely as well: - by digestion of the samples to be tested in the presence of said restriction enzyme and verification of the possible cleavage of said second DNA fragments from contamination by control DNA that the test samples may contain,
  • said polynucleotide corresponding to said site of cleavage of the restriction enzyme which is part of said exogenous sequence is positioned substantially in the middle of said authentic specific sequence of said bacterial or viral agent. This makes it possible to provide an area for the hybridization of the specific probes while generating, after digestion with the restriction enzyme, 2 pieces of DNA whose size is clearly different (approximately half) from the undigested DNA.
  • the possible presence of a bacterial or viral bioterrorism agent belonging to a group of bacterial or viral agents is detected.
  • DNA consisting of the bacteria Bacillus anthracis, Yersinia pestis,
  • This group of bioterrorism agents corresponds to all class A bioterrorism agents, having DNA genomes listed by the CDC (Center for Diseases Control and Prevention).
  • Class A agents are those determined by the CDC to be the most dangerous, that is to say very pathogenic while being relatively easy to cultivate and therefore the most likely to be produced and then used by terrorist groups.
  • the other bioterrorism agents classified in class A by the CDC are RNA viruses.
  • test sample comprises DNA from a bioterrorism agent belonging to the group of bacteria
  • the methods for detecting groups of class A or B bacterial agents can be implemented on samples taken from the environment, on samples of human origin or on viral or bacterial strains isolated in culture.
  • said test sample comprises DNA from a bacterial or viral agent belonging to a group of bacterial or viral agents, consisting of the smallpox virus and the agents confounding with the virus smallpox manifesting as a vesicular rash fever, namely the "Monkeypox" virus, viruses of the genus Orthopoxvirus, Herpes simplex 1 and 2 (HSV1 and HSV2), Varicella zoster and the bacterium Rickettsia akari.
  • a bacterial or viral agent belonging to a group of bacterial or viral agents, consisting of the smallpox virus and the agents confounding with the virus smallpox manifesting as a vesicular rash fever, namely the "Monkeypox" virus, viruses of the genus Orthopoxvirus, Herpes simplex 1 and 2 (HSV1 and HSV2), Varicella zoster and the bacterium Rickettsia akari.
  • the smallpox virus is the only bioterrorism agent manifesting as vesicular eruptive fever, the above method therefore makes it possible to detect which bacterial or viral agent with vesicular eruptive fever is present, in particular if the bioterrorism agent (the virus of smallpox) is responsible for the clinical manifestations observed or, if it is another agent, which is responsible for it and for saying which it is.
  • a sample to be tested for DNA from a bacterial or viral agent belonging to the group of bacterial bioterrorism agents consisting of the bacteria Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Chlamjdia psittaci, Coxiella burnetii and possibly agent of very severe pneumonias like those of the SARS virus.
  • said authentic specific sequences of said bacterial or viral agents, from which said second modified specific synthetic DNA fragments are obtained, as well as said sets of primers and, where appropriate, said probes specific for said bacterial or viral agents have the following sequences as well as their reverse sequences and complementary sequences:
  • Seq n ° 4 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAAG
  • Seq # 10 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTAGCACGGCAGGTACCACTTTTAA TACAACAAATATAGTACTT-3 '
  • the rate of homology with any other sequence included in Genbank is less than 25%, with the exception of the sequences of agents belonging to the same genus for which the homology is less than 75%.
  • the exceptions are the sequences chosen for R. rickettsii which has 94% homology with Rickettsia mongolotimonae and R. prowa ⁇ ekii which has 90% homology with Rickettsia typhi.
  • Said second synthetic DNA fragments of each of said bioterrorism agents were obtained by insertion of said exogenous sequence in place of the deleted sequences of 12 nucleotides underlined above.
  • said second synthetic DNA fragments of each of said bioterrorism agents and confounding agents mentioned below have the following sequences as well as the reverse and complementary sequences respectively:
  • Seq n ° 17 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATC ATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTA TTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC-3 'In which K represents G or T and S represents G or C.
  • Seq # 19 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGTCCTCA AGATAGAACTG-3 '- for Y.
  • Seq # 20 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAA GGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTATTATAGCGGCCG CTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3'
  • Seq # 25 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGG TTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCG GCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3 '- for R.
  • Seq n ° 30 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAG CGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGT ACACCAACAAGCGCCTGGCCC-3 '
  • Said large fragment groups together the 4 said second fragments comprising the said specific modified sequences of the 4 class A bioterrorism agents.
  • This large fragment groups the 6 second DNA fragments comprising the specific modified sequences of each of the 7 class B bioterrorism agents referred to above (6 fragments for 7 agents because a fragment is common to B. mallei and B. pseudomallei) .
  • synthetic constituting the control DNA comprising the following sequence or the reverse sequence or their complementary sequences:
  • Said large fragment corresponds to the grouping of said second synthetic DNA fragments comprising said specific sequences of bioterrorism agents or vesicular eruptive fever confounding agents referred to above.
  • probes comprising the following sequences or respectively their reverse sequences or complementary sequences:
  • the different nucleotides in particular K, S, R, W and Y, have the conventional meanings, namely K represents G or T, S represents G or C, R represents A or G, W represents A or T and Y represents C or T.
  • an equimolar mixture of two said nucleotides G and T is used to add a nucleotide K, G and C to add S, A and G to add R, A and T to add W and C and T to add Y.
  • the probe sequences, identified above, are included in the unmodified part of synthetic DNA between the sequences of the respective 5 ′ and 3 ′ primers, mentioned previously on the one hand, therefore outside of said exogenous sequence.
  • This embodiment makes it possible to use the same probes for the DNA of the positive control and the authentic DNA to be sought in the samples to be tested and therefore makes it possible to use them within the framework of a quantitative PCR method in which quantifies the DNA of the samples to be tested with reference to the calibration carried out on the DNA of the positive control.
  • said large modified synthetic DNA fragments constituting the DNA of the control sample are inserted into a plasmid.
  • This plasmid can then be expressed in a bacterium, in particular Eckerickia coli, the latter producing said sequence whose number of copies produced is measurable.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit, useful for the implementation of a method according to the invention, characterized in that it comprises samples of positive controls comprising a said large fragment of synthetic DNA grouping together said second modified synthetic DNA fragments specific for each of said bacterial or viral bioterrorism agents and, where appropriate, confounding agents as defined above, as well as preferably said sets of primers specific for said modified synthetic DNA fragments specific for said bacterial or viral agents according to the invention as defined above, and
  • the target sequences are modified by replacing 12 nucleotides with an exogenous sequence of 20 nucleotides which has in the center a NotI site of 8 nucleotides. This modification authorizes a pre-digestion with NotI in order to avoid any contamination by the DNA of the plasmids.
  • the amplified native DNA can be differentiated from the DNA of the control plasmid by: (1) a distinct electrophoresis profile, (2) digestion of the product amplified by the enzyme Notl,, (3) of the curves of different fusions in real-time PCR systems, (4) the sequence of the amplified fragments.
  • the choice of target sequences, the sensitivity and specificity tests, the quantification tests and the differentiation with false positives are described below.
  • target genes for B. anthracis and Y. pestis were made according to previously published work.
  • the target genes are those for which several sequences of the same gene were available in Genbank.
  • the sequences were aligned using CLUSTAL W on the PBIL website (http: //www.npsa- pbil.ibcp.fr) or CLUSTAL XI .81 under Windows.
  • the target sequences were chosen in the non-polymorphic zones.
  • the primers were determined manually or using CyberGene AB software (http://www.cybergene.se) in order to have primers with a T of about 58 ° C and a G + C% less 50% which are conditions ensuring easy PCR, in particular good separation of the DNA strands during the phase of separation of the 2 strands.
  • the target sequences and the primers were compared with the Genbank database using the Blastn software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) in order to ensure good specificity.
  • the homology threshold for the choice of target sequences has been set at ⁇ 25% homology with all Genbank sequences, except for sequences of agents of the same genus where the fixed threshold is ⁇ 75%. There are 2 exceptions to this rule, R. prowaz ⁇ ekii which presents 90% of homology with R. tjphi and R. Rickettsii which presents 94% of homology with R. mongolotimonae.
  • Table 1 describes the genes and primers used for the amplification of bioterrorism agents and their confounding agents and their presence in the various categories of plasmids are indicated. 2. Principles of syntheses of synthetic DNA inserts
  • sequences to be integrated into the plasmids have been synthesized separately by a specialized manufacturer (Eurogentec, Seraing, Belgium). Each sequence is specific for an agent except that of B. pseudomallei which is determined to also recognize B. mallei.
  • the sequences were organized in the same way in all of the constructions (see table 2 below): (1) an ATGCATGCATGC sequence ensuring the stabilization of the enzyme during the restriction step (called stabilization sequence [Sseq]) , (2) a hexanucleotide specific for a restriction enzyme useful for the assembly of the different sequences, (3) the specific sequence of the agent to be identified including its sites for fixing the 2 primers at the ends, as well as the exogenous sequence ATTATA-GCGGCCGC- TTATTA, which includes the NotI site (in bold), (4) a second hexanucleotide corresponding to a restriction site of an enzyme different from that mentioned in (2), (5) the same stabilization sequence as 'in (1) of 12 common nucleotides
  • Table 2 indicates the inserts comprising said large fragments of sequences no. 47 to 49 including the original specific sequences from Seq. n ° l to 15 mentioned above, with in addition the modified elements in which the following elements are distinguished:
  • the lower case bases are not specific to the bioterrorism agent or confusing, the upper case bases are specific.
  • the list of probe sequences corresponds to Seq sequences. n ° 80 to 94 mentioned above.
  • plasmids Three plasmids were constructed, CatA for category A agents, CatB for category B agents and CatVEF for vesicular eruptive fever agents (Table 2).
  • the construction of the plasmid CatA which corresponds to the 4 category A agents of the CDC (smallpox virus [seql], Bacillus anthracis [seq2], Francisella tularensis [seq3], and Yersinia pestis [seq4]), is presented as an example for construction.
  • the single-stranded DNA sequences were synthesized by the supplier, they were assembled into double-stranded DNA in order to be integrated into the PGEM-T plasmids. The steps are as follows (Table 3 represented in FIG.
  • PCR reactions are carried out in 50 ⁇ l with the OmM Tris- HC1 [pH 9.0], 1.5 mM MgCL2, 50 mM KCL 0.1% Triton X-100, 200 ⁇ M each dNTP, 0.4 ⁇ M of each primer, 0.4 ⁇ M of each DNA single strand, and 1.5 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France).
  • the PCR cycle was 5 min at 95 ° C, 35 cycles of 30 sec at 95 ° C, 30 sec at 55 ° C, and 1 min at 72 ° C followed by a final extension of 7 min. at 72 ° C.
  • the PCR products are purified on QIAquick PCR Purification Kit columns (Qiagen, Hilden, Germany) and eluted in 50 ⁇ l of RNAse free distilled water. When 2 or more bands are observed after electrophoresis, the band at the right size is excised and purified using the GenClean III Kit (Q-Bio-Gene, Carlsbad CA, USA).
  • reaction product is purified on a column in order to remove the fragments of 15n nucleotides corresponding to the stabilization sequences at the 5 'and 3' ends in order to avoid their religation to their complementary sequences.
  • T4 DNA ligase (Roche, Basel, Switzerland).
  • column purification as in b) above of the PCR products At this stage, the PCR product seql-2 can be cloned into the plasmid PGEM-T.
  • the products were sequenced to verify the absence of mutations due either to Taq DNA polymerase or to recombination, deletion or duplication events during the various assembly steps. Only the clones having 100% homology with the constructions provided in silico were used for the assembly. At the end, the final sequence of the parts cloned in the plasmids were sequenced to verify that their homology is 100% with the sequences provided in silico.
  • the sequences of the plasmids are 100% homologous to the sequences designated in silico.
  • the DNAs are extracted from the samples to be tested.
  • All DNA extractions were made by the use of ion exchange resin and in particular of the chelex® type.
  • the extracted DNA suspensions were buffered with 10X PCR buffer without MgCl 2 in order to obtain a final concentration of 0.5X, and stored at -20 ° C.
  • the extraction was also tested on B. anthracis spores to verify that the extraction kills the spores.
  • a suspension in PBS of a 96 h culture of B. anthracis was prepared. 10 ⁇ l of this suspension were deposited on a slide and colored by a coloration of spores. The spores, colored green, were counted. The suspension was then adjusted to a spore concentration of 10 7 / ml.
  • the samples were subjected to 45 amplification cycles in the ABI Prism 7000 Sequence Detection System instrument (PE Applied Biosystems) in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • the positivity ratio was calculated with a confidence index of 99.9 using the PE 7000 Sequence Detection System software.
  • the DNA quantification was calculated by generating a standard curve. by Notl PCR products was carried out for 1 hour at 37 ° C in a volume of 20 ⁇ l and the result observed in a 3% agarose gel.
  • the specificity of 13 pairs of primers was evaluated by (1) cross-amplification of the 13 agents of categories A / B and VEF whose sequences have been incorporated into the plasmids, (2) amplification of bacteria or similar viruses, (3 ) amplification of bacteria or viruses frequently isolated or detected in clinical microbiology laboratories.
  • the agents tested are: (i) the 13 agents to be detected: C. burnetii, F. tularensis, R. rickettsi,
  • the DNA extracts were digested with NotI.
  • a DNA suspension adjusted to a concentration 10 6 times greater than that of the detection limit of the technique was prepared from each plasmid.
  • Three solutions were then tested after extraction or subjected to a restriction by NotI at 37 ° C for 1 h: they were (1) the DNA of a plasmid alone simulating contamination by the plasmid of a sample negative, (2) DNA from a single plasmid mixed with target DNA to mimic a positive sample contaminated with the plasmid DNA, (3) target DNA to mimic a positive uncontaminated sample.
  • the 13 sequences of the bioterrorism agents to be tested and the 15 sequences present in the plasmids are specifically amplified by the primers designated in this work.
  • the amplifiers are easily differentiated from the amplifiers of the native DNA by Notl digestion, a different migration profile in agarose gel as well as the appearance of the fusion curves and the sequencing of the fragments. 2.
  • the present invention provides plasmids which group together several agents and which ensure perfect discrimination of their DNA with that of the DNA of the target agent. It has been demonstrated that this discrimination can be carried out a posteriori but also a priori by pre-digestion of the DNA extracts by NotI. As it is possible to avoid DNA contamination from bioterrorism agents by incorporating dUTP into the PCR mix, a pre-treatment with Uracile N glycosylase combined with NotI must ensure a non-contaminable PCR reaction.
  • the second originality of the strategy is to combine bioterrorism agents in the plasmids in a logical manner.
  • the first 2 plasmids (CatA and CatB) are intended to be integrated into detection reactions looking for class A or class B agents in human or environmental samples.
  • the other plasmid (CatVEF) are intended for use in human samples. It was built to answer specific questions in the case of a patient presenting with clinical manifestations compatible with those due to a bioterrorism agent.
  • the plasmid CatVEF has been defined to be used as a positive control in the case of a sample originating from a patient with a rash fever resembling smallpox, but the plasmid also contains the sequences of the agents which exhibit the same clinical manifestations.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de détection de la présence d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme à ADN, caractérisée en ce que : a) on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux à ADN de bioterrorisme et, éventuellement au moins un agent bactérien ou viral à ADN confondant ; et b) on utilise un fragment synthétique d'ADN témoin positif, un grand premier fragment d'ADN synthétique regroupant des séquences spécifiques respectivement de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants, lesdites séquences spécifiques étant modifiées par substitution d'une partie de la séquence authentique correspondante dudit agent bactérien ou viral par une séquence exogène comprenant un site de clivage par une enzyme de restriction. Ladite séquence exogène étant de préférence de taille différente, de préférence supérieure à celle de ladite partie de séquence authentique remplacée.

Description

METHODE DE DETECTION D'AGENTS BACTERIENS OU VIRAUX DE BIOTERRORISME
La présente invention fournit une méthode de détection de la présence d'un agent bactérien ou viral à ADN dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en œuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR de l'ADN extrait dudit échantillon à tester et d'un fragment d'ADN synthétique comprenant une séquence spécifique dudit agent bactérien ou viral dans un échantillon témoin positif.
La présente invention concerne également une trousse de diagnostic utile pour la mise en œuvre d'une méthode de détection selon l'invention.
A la suite des cas d'anthrax inhalé en Floride en octobre 2001, les autorités sanitaires ont intensifié les programmes de préparation et prévention contre les agents de bioterrorisme. Le Center for Diseases Control and Prévention (CDC, Atlanta, USA, http://www.cdc.gov/) a dressé la liste des agents potentiels de bioterrorisme en différentes catégories de priorité A et B (Tableau 1). La détection de ces agents doit pouvoir être réalisée sur des prélèvements d'environnement comme des poudres, des prélèvements cliniques ou encore sur des bactéries ou des virus isolés en culture. La détection par biologie moléculaire d'agent infectieux est réalisable par la plupart des laboratoires, à condition qu'ils possèdent un équipement minimal pour mettre en œuvre ces techniques parce que ces techniques possèdent une étape initiale d'extraction des acides nucléiques qui rend ces agents non-infectieux.
L'utilisation accrue des techniques de diagnostic moléculaire rend la détection des acides nucléiques d'agents de bioterrorisme accessible à la plupart des laboratoires de microbiologie clinique. Toutefois, les facteurs limitant à l'utilisation de ces techniques sont liés à la quasi impossibilité d'obtenir des témoins positifs, à l'impossibilité liée aux restrictions de diffusion des ces agents et à la diversité des niveaux d'équipement des laboratoires et l'impossibilité d'avoir des contrôles calibrés pour des déterminations quantitatives notamment par les techniques de type PCR. Parallèlement, l'extrême anxiété des populations vis-à-vis de ces agents, fait que les faux positifs par contamination (l'inconvénient majeur des techniques de PCR) sont ici particulièrement indésirables.
Le principal problème pour étendre l'utilisation des techniques de détection moléculaire dans les laboratoires de microbiologie clinique, est d'avoir accès à. des témoins positifs. La seule solution proposée à ce jour est que les laboratoires de référence fournissent aux autres l'ADN extrait des agents de bioterrorisme à rechercher. Cette solution présente, tout de même, certains inconvénients : elle pose le problème d'une large diffusion d'un ADN identique à celui des agents de bioterrorisme avec les dangers que cela comporte en terme de risque de détection de faux positifs, qui dans ce cas, risque d'entraîner de fausses alertes dans le public et au niveau des autorités de santé.
Un certain nombre d'autres inconvénients limite la diffusion de ces techniques pour la détection des agents de bioterrorisme :
(1) en raison des limitations liées à la circulation de ces agents, il est quasi impossible d'obtenir de l'ADN de ces bactéries pour étalonner les résultats dans le cadre de techniques qualitatives ou quantitatives. Or, dans certains cas comme la détection de spores d'anthrax, pour lesquelles le risque de forme pulmonaire apparaît avec des inoculums supérieurs à 105 spores, il est nécessaire de réaliser une détection quantitative,
(2) dans le cas de prélèvements d'environnement suspects, plusieurs agents seront à rechercher, ce qui augmente d'autant les risques de contamination et le nombre de réactions à réaliser,
(3) bien que de large diffusion, les techniques moléculaires utilisées par les différents laboratoires sont très hétérogènes. En matière de détection d'agents de bioterrorisme, outre la certitude du résultat et notamment l'absence de faux positifs, un autre problème principal est la rapidité du test de détection et sa possibilité de le mettre en œuvre sur des prélèvements de l'environnement aussi bien que des prélèvements cliniques.
La présente invention consiste essentiellement à fournir comme témoin positif, un grand fragment synthétique, notamment intégré dans un plasmide d'Escherichia coli, groupant une pluralité de fragments d'ADN synthétiques spécifiques respectivement d'une pluralité d'agents de bioterrorisme et/ou agents confondants, de préférence au moins 4 et plus particulièrement de 4 à 8, lesdits fragments d'ADN synthétiques spécifiques étant modifiés par la substitution d'une partie de la séquence d'origine par une séquence d'ADN exogène qui contient un site de restriction non présent dans l'une quelconque des séquences spécifiques d'origine desdits agents de bioterrorisme ou agents confondants.
Plus précisément, la présente invention fournit une méthode de détection de la présence d'un agent de bioterrorisme bactérien ou viral à ADN dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en œuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR de l'ADN extrait dudit échantillon à tester et un fragment d'ADN synthétique comprenant une séquence spécifique dudit agent bactérien ou viral dans un échantillon témoin positif, caractérisée en ce que : a/- on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à • un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN de bioterrorisme, de préférence de 4 à 8, ou
• un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN, de préférence de 4 à 8, comprenant au moins un agent bactérien ou viral à ADN de bioterrorisme et au moins un agent bactérien ou viral à ADN confondant, et b/- on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif, un grand fragment d'ADN synthétique regroupant des deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants dudit groupe, ladite séquence spécifique de chaque dit agent bactérien ou viral étant modifiée par substitution d'une partie de la séquence authentique correspondante dudit agent bactérien ou viral par une séquence exogène comprenant une séquence correspondant à un site de clivage par une enzyme de restriction, ledit site n'étant pas présent dans l'une quelconque desdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux du dit groupe, ladite séquence exogène étant de préférence de taille différente, de préférence encore supérieure à celle de ladite partie de séquence authentique remplacée. c/- on réalise les étapes suivantes dans lesquelles :
1- on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et le cas échéant desdits agents confondants, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon témoin positif, à savoir dans ledit grand premier fragment d'ADN synthétique, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ledit deuxième fragment comprenant ladite séquence spécifique modifiée,
2- on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et
3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de témoin positif, en vérifiant si la séquence desdits amplifiats comprend une dite séquence exogène, et notamment donc le site de restriction de l'enzyme sus citée. Cette vérification peut se faire en comparant la taille et/ou la séquence des amplifiats provenant des échantillons témoins et échantillons à tester, ou des différences dans les températures des courbes de fusion sur les systèmes d'amplification 'en temps réel, ou en digérant les amplifiats par l'enzyme de restriction.
De préférence, la taille de ladite partie de séquence authentique remplacée n'excède pas 10% de la taille de ladite séquence authentique, ceci dans le but que la séquence modifiée soit suffisamment différente de la séquence authentique pour pouvoir la différencier mais suffisamment semblable pour se comporter de la même façon lors des réactions d'amplification. En pratique, la taille de ladite partie de séquence authentique remplacée peut être de 5 à 20 nucléotides, la taille du site de clivage correspondant à un polynucléotides de 5 à 10 nucléotides. De même, de préférence encore, la différence de taille entre ladite séquence exogène et ladite partie de séquence authentique sera suffisante pour permettre la détection de cette différence de taille par la méthode employée et, en tout état de cause, n'excédera pas 10% de la plus grande. Ladite séquence exogène peut être plus petite mais de préférence sera plus grande que ladite partie de séquence authentique remplacée. Plus particulièrement, à l'étape 3-, on détecte les faux positifs après incubation des amplifiats provenant desdits échantillons à tester en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN qu'elle contient, et ainsi détecter la présence de faux positifs, à savoir dans le cas où une digestion desdits deuxièmes fragments d'ADN intervient.
On entend par "agent bactérien ou viral de bioterrorisme" les agents à génome ADN définis par le CDC comme agents de bioterrorisme de classes A et B, à savoir acillus anthracis, Yersinia pestis, Francise/la tularensis, Bruce/la sp., Burkholderia mallei, Burkholdeήa pseudomallei, Chlamydia psittaei, Coxie/la btirnetii, kickettsia prowa^ekii, Rickettsia rickettsii et le virus de la variole. On entend par "séquence spécifique", une séquence du génome de ladite bactérie ou virus qu'on ne retrouve dans aucun autre génome d'organisme vivant.
On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'→3'.
On entend par "agent bactérien ou viral confondant", un agent bactérien ou viral dont les manifestations cliniques sont identiques ou similaires à celles dudit agent bactérien ou viral de bioterrorisme (du même dit groupe) auquel on se réfère. La méthode selon l'invention permet de disposer d'un seul témoin ou contrôle positif sans avoir à manipuler des échantillons dudit agent de bioterrorisme authentique, grâce à l'utilisation de fragments synthétiques d'ADN spécifiques dudit agent de bioterrorisme.
La modification de la séquence du fragment synthétique spécifique dudit agent de bio terrorisme par une séquence exogène qui comporte un site de clivage d'une enzyme de restriction, permet la détection avec certitude des faux positifs par clivage des produits de PCR par l'enzyme sus citée, mais aussi par séquençage du fragment amplifié, ou par des propriétés différentes des amplifiats quand ils sont étudiés par electrophorese en gel d'agarose, ou par l'aspect des courbes de fusion qu'ils génèrent dans les systèmes de PCR en temps réel. Il est possible aussi de détruire les contaminants éventuels de l'échantillon à tester par l'échantillon témoin avant la réaction d'amplification de type PCR par digestion par l'enzyme sus citée avant réalisation de la réaction de PCR. Enfin et surtout, le fait de regrouper une pluralité des fragments d'ADN synthétiques modifiés d'agents de bioterrorisme et/ou d'agents confondants, garantit la rapidité du test de détection en diminuant le nombre d'échantillons témoins à manipuler et en autorisant la réalisation de PCR dite "multiplex" n'utilisant qu'un seul témoin positif. L'invention fournit un procédé avantageux de détection permettant avec un seul témoin, et de préférence par la mise en œuvre d'une seule réaction d'amplification groupée réalisée dans les mêmes conditions, de détecter la présence rapide d'un agent de bioterrorisme choisi parmi une pluralité d'agents de bioterrorisme, en détectant les faux positifs éventuels provenant de l'échantillon de témoins positifs.
En effet, dans un mode de réalisation avantageux, à l'étape 1 -, on met en œuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de chacune desdites séquences spécifiques des agents bactériens ou viraux dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents bactériens ou viraux et lesdites amorces pouvant être mises en œuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation. Ce type de réaction simultanée est parfois dénommé "PCR multiplex".
Ce mode de réalisation permet d'augmenter d'autant plus la rapidité du test de la méthode de détection conformément au but de l'invention. Dans un autre mode de réalisation, on mettra en oeuvre une pluralité de réactions d'amplification PCR avec un seul jeu d'amorces spécifique d'un seul dit agent bactérien ou viral de bioterrorisme et le cas échéant d'agent confondant, et on réalisera lesdites réactions d'amplifications enzymatiques PCR les unes après les autres pour chaque dit agent de bioterrorisme et, le cas échéant, chaque dit agent confondant.
Dans un mode de réalisation, avant de réaliser lesdites réactions d'amplifications enzymatiques de type PCR de l'étape 1-, on décontamine l'ADN à amplifier provenant des échantillons à tester en le mettant en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN contenus dans lesdits grands premiers fragments d'ADN du témoin positif qu'ils pourraient contenir suite à une contamination par l'échantillon d'ADN témoin positif.
Dans ce mode de réalisation où l'on coupe les ADN provenant de contamination éventuelle par le témoin positif avant la réaction d'amplification PCR, il reste avantageux de maintenir la détection de la contamination éventuelle après la réaction d'amplification enzymatique PCR, conformément à l'étape 3- visée ci-dessus. En effet elle permet de détecter des contaminations éventuelles par le témoin positif, intervenues dans les échantillons des amorces ou des enzymes et tampons d'amplification mises en œuvre éventuellement. Cela concerne cependant surtout la contamination éventuelle des échantillons desdites amorces mises en œuvre à l'étape 1- et non pas uniquement sur les échantillons d'ADN à tester.
Avantageusement, à l'étape 2-, ladite vérification est réalisée à l'aide d'une sonde de ladite séquence spécifique d'un dit agent bactérien ou viral et, le cas échéant, à l'aide d'une pluralité de sondes spécifiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants.
On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence 12 à 35, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter ou de la quantifier de façon spécifique.
On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymerase amplifiera dans la réaction de PCR.
Avantageusement encore, la séquence de la ou desdites sondes est complémentaire d'une partie de la ou desdites séquences spécifiques authentiques, ne se chevauchant pas avec ladite partie de la séquence authentique remplacée par ladite séquence exogène. La ou lesdites sondes permettent donc de détecter indifféremment lesdites séquences spécifiques authentiques et les séquences spécifiques modifiées contenues dans lesdits deuxièmes fragments. Ce mode de réalisation est avantageux car il permet de mettre en œuvre les mêmes sondes pour détecter les séquences spécifiques d'un dit agent bactérien ou viral et les séquences modifiées du témoin positif, de sorte que lesdites sondes peuvent être utilisées dans le cadre d'une méthode d'amplification PCR quantitative dans laquelle il est nécessaire de déterminer la quantité d'ADN de l'échantillon testé par rapport à un étalonnage de la quantité d'ADN de témoin positif amplifié. En effet, si les sondes se chevauchaient avec la séquence supprimée des séquences authentiques, elles permettraient de distinguer les séquences authentiques et les fragments provenant du témoin positif mais ne permettrait plus de réaliser une quantification puisque le témoin ne serait plus reconnu. Avantageusement encore, ladite séquence exogène comprend ledit polynucléotide correspondant au site de clivage spécifique de ladite enzyme de restriction, ledit polynucléotide étant encadré par des séquences flanquantes qu'on ne retrouve pas dans lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, lesdites séquences flanquantes comprenant n nucléotides et n étant un nombre entier de 3 à 10. De préférence lesdites séquences flanquantes permettent, de par leur composition, d'avoir une dite séquence exogène ayant un contenu en nucléotides G et C (G+C%) proche de 50%.
Ce mode de réalisation permet d'augmenter la différence de taille entre lesdits deuxièmes fragments comprenant une séquence spécifique modifiée par la séquence exogène et les séquences spécifiques authentiques, de telle sorte qu 'à l'étape 3- il soit possible de différencier les faux positifs, après l'étape d'amplification enzymatique PCR, par une pluralité de techniques, à savoir aussi bien : - par digestion des échantillons à tester en présence de ladite enzyme de restriction et vérification de la coupure éventuelle desdits deuxièmes fragments d'ADN provenant d'une contamination par l'ADN témoin que les échantillons à tester pourraient contenir,
- par séquençage des produits d'amplification et comparaison des séquences par rapport à la séquence authentique, - par comparaison des courbes de fusion dans les systèmes de PCR en temps réel.
- par comparaison des profils d'électrophorèse sur gel des produits d'amplification provenant de l'échantillon témoin et des échantillons à tester. Plus particulièrement, ledit polynucléotide correspondant audit site de clivage de l'enzyme de restriction qui fait partie de ladite séquence exogène, est positionné sensiblement au milieu de ladite séquence spécifique authentique dudit agent bactérien ou viral. Ceci permet de ménager une zone pour l'hybridation des sondes spécifiques tout en générant après digestion par l'enzyme de restriction, 2 morceaux d'ADN dont la taille est clairement différente (environ la moitié) de l'ADN non digéré.
Selon une première variante de réalisation de la méthode dé l'invention, on détecte la présence éventuelle d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux à
ADN, consistant dans les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis,
Francise/la t larensis et un virus de la variole.
Ce groupe d'agents de bioterrorisme correspond à tous les agents de bioterrorisme de classe A, ayant des génomes à ADN répertoriés par le CDC (Center for Diseases Control and Prévention).
Les agents de classe A sont ceux déterminés par le CDC comme étant les plus dangereux, à savoir très pathogènes tout en étant relativement faciles à cultiver et donc les plus susceptibles d'être produits puis utilisés par des groupes terroristes. Les autres agents de bioterrorisme classés en classe A par le CDC sont des virus à ARN.
Selon une seconde variante de réalisation de la méthode de détection de l'invention, on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent de bioterrorisme appartenant au groupe des bactéries
Burkholderia mallei, Burkho/deria pseudomal/ei, Chlamjdia psittaci, Coxiel/a bumetii, Bruce/la spp., Rickettsia prowa^ekii et Rickettsia ricketsii.
Il s'agit de la totalité des bactéries de bioterrorisme répertoriées par le CDC en classe B, tous les autres étant des virus à ARN. Cette classe B regroupe les agents considérés comme moins dangereux que ceux de classe A cités ci-dessus, en tant qu'il sont qu'ils ont un pouvoir pathogène moindre que les agents de classe A ou qu'ils sont moins faciles à manipuler.
On comprend que les méthodes de détection des groupes d'agents bactériens de classe A ou B peuvent être mises en œuvre sur des échantillons prélevés de l'environnement, sur des prélèvements d'origine humaine ou sur des souches virales ou bactériennes isolées en culture.
Selon une troisième variante, on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux, consistant dans le virus de la variole et les agents confondants avec le virus de la variole se manifestant par une fièvre éruptive vésiculaire, à savoir le virus "Monkeypox", les virus du genre Orthopoxvirus, Herpès simplex 1 et 2 (HSV1 et HSV2), Varicelle- zona et la bactérie Rickettsia akari. Le virus de la variole est le seul agent de bioterrorisme se manifestant par une fièvre éruptive vésiculaire, la méthode ci-dessus permet donc de détecter quel agent bactérien ou viral à fièvre éruptive vésiculaire est présent, notamment si l'agent de bioterrorisme (le virus de la variole) est responsable des manifestations cliniques observées ou s'il s'agit d'un autre agent qui en est responsable et de dire duquel il s'agit. Selon une quatrième variante, on détecte si ledit échantillon à tester de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant au groupe d'agents bactériens de bioterrorisme consistant dans les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Chlamjdia psittaci, Coxiella burnetii et éventuellement d'agent de pneumonies très sévères comme celles du virus du SRAS.
Ces bactéries appartiennent soit aux bactéries répertoriées en classe A ou B par le CDC mais ont en commun de donner des manifestations cliniques de pneumopathie sévère chez l'homme. Cette méthode permet donc de déterminer si un agent de bioterrorisme donnant des pneumopathie sévère est concerné dans le cas d'un patient présentant des manifestations cliniques similaires à celles d'une pneumopathie sévère.
Dans les différentes variantes de réalisation mentionnées ci-dessus, avantageusement lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, à partir desquelles sont obtenus lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques spécifiques modifiés, ainsi que lesdits jeux d'amorces et, le cas échéant, dites sondes spécifiques desdits agents bactériens ou viraux, ont les séquences suivantes ainsi que leurs séquences inverses et séquences complémentaires :
- pour le virus de la variole : Seq n°l = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATCATACAG
TCACAGACACTGTCTCATACACTACAGTAAGTACATCATCTGAAATTGTCACT ACTAAATCAAC-3' dans laquelle K représente G ou T, et S représente G ou C Ces différentes séquences correspondent aux différents variants connus du virus de la variole.
- pour Bacillus anthracis : Seq n°2 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCA AGAAACAACTGCACGTATCATTTTTAATGGAAAAGTTAAATCTGGTAGAAAG GCGGATA-3' - pour Francisella tularensis : Seq n°3 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTAACAAGGACAATACTTGGGGTCCTCAAGATAGA ACTG-3'
- pour Yersinia pestis : Seq n°4 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAAG
GAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTTCTATGCCATATAT TGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3'
- pour Burkho/deri pseudomal/ei et B. ma/lei : Seq n°5 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCA GCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCGATGGTTG ÇGGAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3'
- pour Chlamjdia psitt aci : Seq n°6 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATC TAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAACGTTAATCGACGCT GACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3'
- pour Coxiella btirnetii : Seq n°7 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCGG CTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGGCAAATTAGAA GTCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3' - pour Brucella spp.: Seq n°8 = 5'-TGCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCC GTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGG TTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3'
- pour Rickettsia prowa^ekii : Seq n°9 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGT
TCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTGATATAGGTA AÇGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3'
- pour Rickettsia rickettsii : Seq n°10 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTAGCACGGCAGGTACCACTTTTAA TACAACAAATATAGTACTT-3'
- pour le virus monkeypox : Seq n°l l = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG
ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATAATACTATCTGG ATCTACACCAGAAACTATTTCTGA-3'
- pour les virus appartenant au genre Orthopoxvirus: Seq n°12 = 5'-ACCAAGGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAAATCATTCACTGCTAAAGAT GCCGGTACTTATGTATG-3'
- pour le virus de la varicelle-zona: Seq n°13 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACC TTTACAGTTGGAGGAAAACGTCTTTTTTTTGTGCGCTCTAACGTTCG AGAAAGTCTGCTG-3'
- pour les virus herpès simplex 1 et 2: Seq n°14 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTT TGTÇÇTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAAC AAGCGCCTGGCCC-3' - pour Rickettsia akari : Seq n°15 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCGGAAGCTCCACTTTCAGA ATTCAATTTTGCTGCACCGA-3'
Dans les séquences Seq n°l à 15 ci-dessus, les séquences de 12 nucléotides qui seront supprimées puis remplacées par la séquence exogène ont été soulignées.
Lesdites séquences spécifiques mentionnées ci-dessus ont été déterminées en fonction des critères suivants : - ils appartiennent à des zones non polymorphiques c'est à dire communs au différents isolats d'une même espèce ou éventuellement à plusieurs espèces dans les cas de B. mallei et B. pseudomallei ou Brucella spp.
- le taux d'homologie avec toutes autre séquence comprise dans Genbank, est inférieur à 25%, à l'exception des séquences d'agents appartenant au même genre pour lesquelles Fhomologie est inférieure à 75%. Les exceptions sont les séquences choisies pour R. rickettsii qui possède 94% d'homologie avec Rickettsia mongolotimonae et R. prowa^ekii qui possède 90% d'homologie avec Rickettsia typhi.
- lesdites séquences sont disponibles dans base de donnée Genbank.
Il s'agit plus particulièrement de séquences choisies dans les gènes indiqués dans le tableau ci-après.
Agent Gène cible n°d'accès Genbank Bacillus anthracis pag AF065404 Yersinia pestis pla M27820 Francisella tularensis fopA AF097542 Brucella spp. omp19 L27997 Burkholderia mallei AF11790 fliC Burkholderia pseudomallei U82287 Chlamydia psittaci ompA AF269265 Coxiella burnetii sodB M74242 Rickettsia prowazekii ompB AF161079 Rickettsia rickettsii ompA U83451 Rickettsia akari ompB AF123707 Variola virus hemagglutinin AF377893 Monkeypox virus Hemagglutinin AF375114 Virus du genre Orthopoxvirus Hemagglutinin AF377892 Varicella-Zona virus IE 62 X04370 transactivator Herpès simplex virus 1 and 2 DNA polymerase X14112 Dans un mode de réalisation particulier, lesdites séquences spécifiques ont été modifiés avec ladite séquence exogène suivante ou respectivement une séquence inverse ou leur séquence complémentaire :
- Seq n°16 = 5 ' - ATTATAGCGGCCGCTTATTA-3' Cette séquence comprend ladite séquence du site de clivage de l'enzyme Not I de 8 nucléotides soulignée ci-dessus, encadrée par deux séquences flanquantes arbitraires de 6 nucléotides.
Desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques de chacun desdits agents de bioterrorisme, ont été obtenus par insertion de ladite séquence exogène en lieu et place des séquences supprimées de 12 nucléotides soulignées ci-dessus.
Plus particulièrement encore, lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et agents confondants mentionnés ci-après, ont les séquences suivantes ainsi que respectivement les séquences inverses et séquences complémentaires :
- pour le virus de la variole : Seq n°17 = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATC ATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTA TTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC-3' Dans laquelle K représente G ou T et S représente G ou C.
- pour B .anthracis : Seq n°18 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGC AAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCGGCCGCTTATTA AAGATTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATA-3'
- pour F. tularensis : Seq n°19 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGTCCTCA AGATAGAACTG-3' - pour Y. pestis : Seq n°20 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAA GGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTATTATAGCGGCCG CTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3'
- pour B. mallei et pseudomallei : Seq n°21 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACC AGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCATTATAGC GGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3'
- pour C. psitt aci : Seq n°22 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAAT
CTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAATTATAGCGGCCGC TTATTAGCTGACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3'
- pour C. btirnetii : Seq n°23 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCG GCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATAGCGG CCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3'
- pour Brucella spp. : Seq n°24 = 5'-TGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGG GCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCG CTTATTAACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3'
- pour R. prowa^ekii : Seq n°25 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGG TTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCG GCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3' - pour R. rickettsii : Seq n°26 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAACC ACTTTTAATACAACAAATATAGTACTT-3'
- pour le virus monkeypox : Seq n°27 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG
ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATTATAGCGGCCG CTTATTAGGATCTACACCRGAAACTATTTCTGA-3'
- pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n°28 = 5'-ACCAAGGATAAARTATC TACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAATTATAGCGGCCGCTTATTA CTAAAGATGCCGGGTACTTATRTATG-3'
- pour le virus de la varicelle-zona : Seq n°29 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACA
GTTGGAGGAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGA GAAAGTCTGCTG-3'
- pour les virus herpès simplex 1 et 2: Seq n°30 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAG CGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGT ACACCAACAAGCGCCTGGCCC-3'
- pour R. akari : Seq n°31 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTAT TATTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGA-3'
En regroupant les séquences desdits deuxièmes fragments mentionnés ci-dessus pour les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis et le virus de la variole, on peut obtenir un dit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin, comprenant la séquence suivante ou respectivement la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires :
- Seq n°32 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGACCAATTACTAATAAAGAAGA TCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTATTAC ATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCATACAGGCTCGAACTGGAG TGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCGGC CGCTTATTAAAGTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATACCCGGGGCTAATAATT TCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCT TATTAACTTGGGGTCCTCAAGATAGAACTGGAATTAATTCAATAATGGAGCT TATACCGGAAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCT TTATTATAGCGGCCGCTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATTG-3 ' Cette séquence a été déposée dans Genbank sous le numéro d'accès :
AY333963. De même, une souche de Escherichia coli portant un plasmide contenant ladite séquence a été déposée dans la collection nationale de culture et micro-organisme de l'institut Pasteur Paris — France, sous le numéro 13087.
Ledit grand fragment regroupe les 4 dits deuxièmes fragments comprenant lesdites séquences spécifiques modifiées des 4 agents de bioterrorisme de classe A.
En regroupant les séquences desdits deuxièmes fragments mentionnés ci-dessus pour les bactéries Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamjdia psitt aci, Coxiella burnetii, Brucella spp., Rickettsia prowa^ekii et Rickettsia ricketsii, on peut obtenir un dit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin, comprenant la séquence suivante ou respectivement la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires :
- Seq n°33 = 5'-GATCCTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCAGC GCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCATTATAGCGGCCGCTT ATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAACGAGCTCATGCATGCATATGCA TGCATGCGGATCCAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATCTAGAA AATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAATTATAGCGGCCGCTTATTAGCTGAC AAATGGTCAATCACTGGTGAAGCCCGGGGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAAT AATCATTTCGGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATA GCGGCCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATCGAATTCTGCCCC GGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTC CTTTACGATATTATAGCGGCCGCTTATTAACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCA GGAGACGTCATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGTTCTATTCA GTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCGGCCGCTTATTAGGTG GTGTTAATGCTGCGTTACAACACAGCCGGGCACGTTTGGTGGAGCTCATAA GTTACAAACTATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCT TATTAACCACTTTTAATACAACAAATATAGTACTTG-3' Cette séquence a été déposée dans Genbank sous le numéro d'accès :
AY333965. De même, une souche de Esckerickia coli portant un plasmide contenant ladite séquence a été déposée dans la collection nationale de culture et micro-organisme de l'institut Pasteur Paris — France, sous le numéro 13088.
Ce grand fragment regroupe les 6 deuxièmes fragments d'ADN comprenant les séquences spécifiques modifiés de chacun des 7 agents de bioterrorisme de classe B visés ci-dessus (6 fragments pour 7 agents car un fragment est commun à B. mallei et B. pseudomallei) . En regroupant les séquences desdits deuxièmes fragments mentionnés ci-dessus pour le virus Monkejpox, les virus du genre Orthopoxvirus, Herpès simplex 1 et 2, varicelle-zona et la bactérie Rickettsia akari, on peut obtenir un dit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin, comprenant la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires :
- Seq n°34 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGAACCAATTACTAATAAAGAAG ATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTATTA CATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCAAAGTAGATTATGAAGAAT ACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATTAT AGCGGCCGCTTATTAGGATCTACACCAGAAACTATTTCTGACCCGGGACCAA GGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTACAA TTAATTATAGCGGCCGCTTATTACTAAAGATGCCGGGTACTTATGTATGCAAT TAATTGGGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTGGAG GAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGAAAGTCTG CTGGACGTCCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAGCGGCCGCTTA TTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAACAAGCGCCT GGCCCGCCGGCATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTCTTATGGCA GGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTATTATTCAGAATTCAA TTTTGCTGCACCGAG-3 ' Cette séquence a été déposée dans Genbanck sous le numéro d'accès
: AY333966. De même, une souche de Esckerickia coli portant un plasmide contenant ladite séquence a été déposée dans la collection nationale de culture et micro-organisme de l'institut Pasteur Paris — France, sous le numéro 13089.
Ce dit grand fragment correspond au regroupement desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant lesdites séquences spécifiques des agents de bioterrorisme ou agents confondants à fièvre éruptive vésiculeuses visés ci-dessus.
Dans les 3 séquences, n°32 à 34 ci-dessus, desdits grands fragments d'ADN synthétiques modifiés mentionnés ci-dessus, on retrouve lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant les séquences spécifiques modifiées de chacun desdits agents de bioterrorisme et/ou agents confondants, séparés par des séquences correspondant à des sites de clivage d'enzymes de restriction différents du site de clivage de la séquence exogène et ayant permis la construction desdits grands fragments par ligature des différents fragments comprenant des fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et agents confondants.
Pour les séquences spécifiques des 15 bactéries et virus mentionnés précédemment, dans un mode de réalisation aux étapes d'amplification enzymatique d'ADN, on utilise des jeux d'amorces choisis parmi les suivants ou respectivement les séquences inverse ou leurs séquences complémentaires en tant que de besoin :
- pour Bacillus anthracis :
Amorce 5' : Seq n°35 = 5'-AGGCTCGAACTGGAGTGAA-3' Amorce 3' : Seq n°36 = 5'-CCGCCTTTCTACCAGATTT-3'
- pour Yersini pestis :
Amorce 5' : Seq n°37 = 5'-ATGGAGCTTATACCGGAAAC-3' Amorce 3' : Seq n°38 = 5'-GCGATACTGGCCTGCAAG-3'
- pour Francisella tularensis : Amorce 5' : Seq n°39 = 5'-TAATAATTTCATTGCTCCTTTTG-3' Amorce 3' : Seq n°40 = 5'-TTCTATCTTGAGGACCCCAA-3'
- pour Brucella spp. :
Amorce 5' : Seq n°41 = 5'-CCGGTGAACTGGCTAATCT-3' Amorce 3' : Seq n°42 = 5'-TGAAGAATAGAGCGAGGCAA-3'
- pour Burkholderia mallei/ 'Pseudomallei :
Amorce 5' : Seq n°43 = 5'-GACGCTGGCGCTGTCGA-3' Amorce 3' : Seq n°44 = 5'-CGGCTTGTTGACCGCGTT-3*
- pour Chlamjdia psitt aci : Amorce 5' : Seq n°45 = 5'-ATTGCTTCGATTCAGATCAAC-3' Amorce 3' : Seq n°46 = 5'-ACCAGTGATTGACCATTTGT-3'
- pour Coxiella burnetii :
Amorce 5' : Seq n°47 = 5'-CTTTTTACCGACTCCGCAAA-3' Amorce 3' : Seq n°48 = 5'-ACGAGCGTTGACAGTGCTT-3' - pour Rickettsia prowaχekii :
Amorce 5' : Seq n°49 = 5'-GCTCTTATGAATAATAATGCTC-3' Amorce 3' : Seq n°50 = 5'-TGTTGTAACGCAGCATTAACA-3'
- pour Rickettsia rickettsii :
Amorce 5' : Seq n°51 = 5'-TTTGGTGGAGCTCATAAGTTA-3' Amorce 3' : Seq n°52 = 5'-GTACTATATTTGTTGTATTAAAAG-3'
- pour Rickettsia akari :
Amorce 5' : Seq n°53 = 5'-TTGGTGGGAATAATTGTAATGT-3' Amorce 3' : Seq n°54 = 5'-TGCAGCAAAATTGAATTCTG-3'
- pour le virus de la variole : Amorce 5' : Seq n°55 = 5'-GACKTCSGGACCAATTACTA-3'
Amorce 3' : Seq n°56 = 5'-TTGATTTAGTAGTGACAATTTCA-3'
- pour le virus Monkeypox :
Amorce 5' : Seq n°57 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTC-3' Amorce 3' : Seq n°58 = 5'-CAGAAATAGTTTCGACAATTTCA-3'
- pour les virus du genre Orthopoxvirus:
Amorce 5' : Seq n°59 = 5'-ACCAAGGATAAARTATC TACG-3' Amorce 3' : Seq n°60 = 5'-ATAYATAAGTACCCGGCATCT-3' - pour le virus de la varicelle-zona :
Amorce 5' : Seq n°61 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATC-3' Amorce 3' : Seq n°62 = 5'-CAGCAGACTTTCTCGAACG-3'
- pour les virus Herpex simplex 1 et 2:
Amorce 5' : Seq n°63 = 5'-CCGACCCGGAGAGGGAC-3' Amorce 3' : Seq n°64 = 5'-CCAGGCGCTTGTTGGTGT-3'
Dans un mode de réalisation, à l'étape 2-, on utilise des sondes comprenant les séquences suivantes ou respectivement leurs séquences inverses ou séquences complémentaires :
- pour le virus de la variole : Seq n°65 = 5'-AAGATCATACAGTCACAGACACTGT-3'
- pour B. anthracis : Seq n°66 = 5'-TACCGCAAATTCAAGAAACAACTGC-3'
- pour F. tularensis : Seq n°67 = 5'-TTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACT-3' - pour Y. pestis: Seq n°68 = 5'-AAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAA-3*
- pour B. mallei/ . pseudomallei : Seq n°69 = 5'-AACCAGCGCGCTGTCCGCGAC-3'
- pour C. psitt aci : Seq n°70 = 5'-ATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTA-3'
- pour C. burnetii: Seq n°71 = 5'-ATCATTTCGGCTCGGGATGGGC-3'
- pour Brucella spp. : Seq n°72 = 5'-AATGGCAAGCAACTCGTCCTTTAC-3'
- pour R. prowa^ekii : Seq n°73 = 5'-TGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGT-3'
- pour R. rickettsii : Seq n°74 = 5'-TATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGAT-3'
- pour R. akari : Seq n°75 = 5'-ACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAG-3' - pour le virus Monkeypox : Seq n°76 = 5'-TTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCG-3'
- pour les virus du genre rthopoxvirus: Seq n°77 = 5'-TCCATACGATGATCTAGTTACAACTA-3'
- pour le virus de la varicelle-zona : Seq n°78 = 5'-ATGCCACCTTTACAGTTGGAGGAA-3'
- pour les virus Herpex simplex 1 et 2: Seq n°79 = 5'-ACCGCCGAACTGAGCAGACACC-3'
Dans les séquences Seq n°l à 79, les différents nucléotides, notamment K, S, R, W et Y, ont les significations conventionnelles, à savoir K représente G ou T, S représente G ou C, R représente A ou G, W représente A ou T et Y représente C ou T.
En pratique, pour la synthèse d'un oligonucléotide comprenant un nucléotide K, S, R, W ou Y, on met en œuvre un mélange équimolaire de deux dits nucléotides G et T pour ajouter un nucléotide K, G et C pour ajouter S, A et G pour ajouter R, A et T pour ajouter W et C et T pour ajouter Y. Les séquences de sondes, identifiées ci-dessus, sont comprises dans la partie non modifiée d'ADN synthétique entre les séquences des amorces 5' et 3' respectives, mentionnées précédemment d'une part, donc en dehors de ladite séquence exogène. Ce mode de réalisation permet d'utiliser les mêmes sondes pour l'ADN du témoin positif et l'ADN authentique à rechercher dans les échantillons à tester et permet donc de les mettre en oeuvre dans le cadre d'une méthode PCR quantitative dans laquelle on quantifie l'ADN des échantillons à tester en référence à l'étalonnage réalisé sur l'ADN du témoin positif.
Avantageusement encore, lesdits grands fragments d'ADN synthétiques modifiés constitutifs de l'ADN de l'échantillon témoin, sont insérés dans un plasmide.
Ce plasmide peut alors être exprimé dans une bactérie, notamment Eckerickia coli, celle-ci produisant ladite séquence dont le nombre de copies produites est mesurable.
Le fait de disposer d'un contrôle positif sous forme de plasmide permet de réaliser un étalonnage en vue d'une méthode d'amplification du type PCR quantitative. Cette caractéristique est importante car pour certains agents de bioterrorisme comme l'anthrax (Bacillus anthracis), seuls des inoculums importants (environ 105 spores) sont à l'origine des formes pulmonaires qui sont quasi constamment mortelles.
La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic, utile pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend des échantillons de témoins positifs comprenant un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et, le cas échéant, d'agents confondants tels que définis ci-dessus, - ainsi que de préférence desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdits agents bactériens ou viraux selon l'invention tels que définis ci-dessus, et
- de préférence encore le cas échéant, desdites sondes de l'invention telles que définies ci-dessus.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre, faite en référence à un listage de séquence.
Pour permettre la détection des agents de bioterrorisme sans encourir les risques de faux positifs et pour atteindre les buts assignés, on a construit 3 plasmides (CatA, CatB et CatVEF) qui peuvent être utilisés comme témoins positifs. Deux sont dédiés à la détection des agents de
Catégorie A et B du Centers for Disease Control and Prévention (CDC,
Atlanta, USA), respectivement. On a aussi construit 1 plasmide destiné à être utilisés pour la détection d'agents responsables de fièvres eruptives vésiculeuses (ressemblant à la variole). Des séquences spécifiques de 4 à 6 bactéries ou virus ont été groupées dans ces plasmides. Une séquence exogène qui modifie la séquence native et introduit un site Notl, a été incorporée dans chaque séquence spécifique. Les mêmes amorces de PCR permettant l'amplification des séquences natives et des séquences modifiées, des plasmides ont été déterminées. De même, des sondes spécifiques de 18 agents inclus dans la liste des agents classés du CDC ou leurs agents confondants, ont été déterminées.
Dans les plasmides, les séquences cibles sont modifiées par le remplacement de 12 nucléotides par une séquence exogène de 20 nucléotides qui comporte au centre un site Notl de 8 nucléotides. Cette modification autorise une pré-digestion par Notl afin d'éviter toute contamination par l'ADN des plasmides. De plus, quand un plasmide est utilisé comme témoin positif, l'ADN natif amplifié peut être différencié de l'ADN du plasmide témoin par : (1) un profil en electrophorese distinct, (2) une digestion du produit amplifié par l'enzyme Notl, , (3) des courbes de fusions différentes dans les systèmes de PCR en temps réel, (4) la séquence des fragments amplifiés. Le choix des séquences cibles, les tests de sensibilité et spécificité, les tests de quantification et la différentiation avec les faux positifs sont décrites ci-après. I- Protocole expérimental
1. Choix des séquences cibles, des amorces et test de spécificité In silico
Le choix des gènes cibles pour B. anthracis et Y. pestis a été fait selon des travaux déjà publiés. Pour les autres micro-organismes, les gènes cibles sont ceux pour lesquels plusieurs séquences d'un même gène étaient disponibles dans Genbank. Pour chaque espèce, les séquences ont été alignées à l'aide du CLUSTAL W sur le site du PBIL (http://www.npsa- pbil.ibcp.fr) ou CLUSTAL XI .81 sous Windows. Les séquences cibles ont été choisies dans les zones non polymorphiques. Les amorces ont été déterminées manuellement ou à l'aide du logiciel de CyberGene AB (http://www.cybergene.se) afin d'avoir des amorces avec un T d'environ 58° C et un G + C % de moins de 50% qui sont des conditions assurant une PCR aisée, notamment une bonne séparation des brins d'ADN lors de la phase de séparation des 2 brins. Les séquences cibles et les amorces ont été comparées à la base de donnée Genbank database à l'aide du logiciel Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) afin d'assurer une bonne spécificité. Le seuil d'homologie pour le choix des séquences cibles a été fixé à < 25% d'homologie avec toutes les séquences de Genbank, à l'exception des séquences d'agents du même genre où le seuil fixé est à <75%. Il existe 2 exceptions a cette règle, R. prowazζekii qui présente 90% d'homologie avec R. tjphi et R. Rickettsii qui présente 94% d'homologie avec R. mongolotimonae.
Le tableau 1 , ci-après, décrit les gènes et amorces utilisés pour l'amplification des agents de bioterrorisme et leurs agents confondants et leurs présences dans les différentes catégories de plasmides sont indiquées. 2. Principes des synthèses des inserts d'ADN synthétiques
Les séquences à intégrer dans les plasmides ont été synthétisées séparément par un fabricant spécialisé (Eurogentec, Seraing, Belgium). Chaque séquence est spécifique d'un agent sauf celle de B. pseudomallei qui est déterminé pour reconnaître aussi B. mallei. Les séquences ont été organisées de la même façon dans toutes les constructions (voir tableau 2 ci-après) : (1) une séquence ATGCATGCATGC assurant la stabilisation de l'enzyme pendant l'étape de restriction (nommée séquence de stabilisation [Sseq]), (2) un hexanucléotide spécifique d'une enzyme de restriction utile pour l'assemblage des différentes séquences, (3) la séquence spécifique de l'agent à identifier incluant ses sites de fixation des 2 amorces aux extrémités, ainsi que la séquence exogène ATTATA-GCGGCCGC- TTATTA, laquelle inclut le site Notl (en gras), (4) un second hexanucléotide correspondant à un site de restriction d'une enzyme différente de celle mentionnée en (2), (5) la même séquence de stabilisation qu'en (1) de 12 nucléotides communs.
Ainsi, toutes les séquences avant ligation contiennent invariablement 56 nucléotides exogènes.
Le tableau 2, ci-après, indique les inserts comprenant lesdits grands fragments des séquences n°47 à 49 incluant les séquences spécifiques originales parmi les Séq. n°l à 15 mentionnées ci-dessus, avec en outre les éléments modifiés dans lesquelles sont distingués les éléments suivants :
- les séquences de stabilisation destinées à optimiser l'activité des enzymes de restriction, ajoutées aux extrémités en vue de l'assemblage, écrites en minuscules,
- les sites de clivages des enzymes de restriction d'assemblage aux extrémités, écrites aussi en lettres minuscules (les noms des enzymes sont indiqués dans le tableau 2), - les amorces spécifiques aux extrémités des fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdits agents de bioterrorisme ou agents confondants, écrites en lettres majuscules, incluant la séquence exogène Seq. ID n°16 ajoutée, écrite en lettres minuscules, - les sondes de détection comprises entre les amorces en dehors de la zone de la séquence exogène, écrites en lettres capitales.
Les bases en minuscules ne sont pas spécifiques de l'agent de bioterrorisme ou confondant, les bases en majuscules sont spécifiques.
La liste des amorces 5' et 3' utilisées pour les différents agents correspond aux séquences Séq. n°50 à 79 mentionnées ci-dessus.
La liste des séquences des sondes correspond aux séquences Séq. n°80 à 94 mentionnées ci-dessus.
3. Construction des plasmides
Trois plasmides ont été construits, CatA pour les agents de catégorie A, CatB pour les agents de catégorie B et CatVEF pour les agents à fièvres eruptives vésiculeuses (Tableau 2). La construction du plasmide CatA, qui correspond aux 4 agents de catégorie A du CDC (virus de la variole [seql], Bacillus anthracis [seq2], Francisella tularensis [seq3], et Yersinia pestis [seq4]), est présentée comme exemple pour la construction. Une fois que les séquences simple brin d'ADN ont été synthétisées par le fournisseur, elles ont été assemblées en ADN double brins afin d'être intégrées dans les plasmides PGEM-T. Les étapes sont les suivantes (tableau 3 représenté en figure 1): a) amplification par PCR à l'aide d'amorces s'hybridant avec la séquence de stabilisation de chacune des 4 séquences (en gris et rouge du tableau 2). Les réactions de PCR sont réalisées dans 50 μl avec l OmM Tris- HC1 [pH 9.0], 1.5 mM MgCL2, 50 mM KCL 0.1 % Triton X-100, 200 μM each dNTP, 0.4 μM de chaque amorce, 0.4 μM de chaque ADN simple brin, et 1.5 U de Taq ADN polymerase (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Le cycle de PCR était 5 min à 95°C, à 35 cycles de 30 sec à 95°C, 30 sec à 55°C, et 1 min à 72°C suivis d'une extension finale de 7 min. à 72°C. b) Les produits de PCR sont purifiés sur colonnes QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany) et élues dans 50 μl d'eau distillée RNAse free. Quand 2 ou plusieurs bandes sont observées après electrophorese, la bande à la bonne taille est excisée et purifiée à l'aide du GenClean III Kit (Q-Bio-Gene, Carlsbad CA, USA). c) L'assemblage a été réalisé par paires, seql avec seq2 (résultant en seql -2), seq3 avec seq4 (résultant en seq3-4) ; ensuite seql -2 avec seq3-4 (résultant en seql -2-3-4) . d) Des volumes égaux (10μl) de seql - et seq2- ADN double brin purifiés ont été incubés à 37°C en présence de Sac I. Le site Sac I est placé aux extrémités 3' et 5' de seql et seq2 respectivement. e) Le produit de la réaction est purifié sur colonne afin de retirer les fragments de 15n nucléotides correspondant aux séquences de stabilisation aux extrémité 5' et 3' afin d'éviter leur religation à leurs séquences complémentaires. f) Incubation une nuit à 4°C en présence de l'enzyme T4 ADN ligase. 10 μl de la réaction est incubée avec la T4 ADN ligase (Roche, Basel, Switzerland) . g) amplification par PCR utilisant les amorces externes selon les même conditions qu'en a) ci-dessus. h) purification sur colonne comme dans b) ci-dessus des produits de PCR . A ce stade, le produit le produit de PCR seql-2 peut être clone dans le plasmide PGEM-T. i) La même procédure a été réalisée pour seq3 et seq4 j) à la fin, seql -2 et seq3-4 sont assemblées de la même façon (étapes a) à i)) . Le produit final est clone dans le plasmide PGEM-T qui comprend seql -2-3-4.
A chaque étape d'assemblage, les produits ont été séquences pour vérifier l'absence de mutations dues soit à la Taq ADN polymerase ou à des événements de recombinaison, délétion ou duplication pendant les différentes étapes de l'assemblage. Seuls les clones présentant 100 % d'homologie avec les constructions prévues in silico ont été utilisés pour l'assemblage. A la fin, la séquence finale des parties clonées dans les plasmides ont été séquencées pour vérifier que leur homologie est de 100% avec les séquence prévues in silico.
Les séquences des plasmides sont 100% homologues aux séquences désignées in silico. Les séquences spécifiques des plasmides CatA, CatB et CatVEF, représentées au tableau 4 ci-après, ont été déposées dans Genbank sous les numéros : AY333963, AY333965, AY333966 respectivement. Les souches d'E. coli portant les plasmides CatA, CatB et CatVEF, ont été déposées dans la collection CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux - 75724 Paris cedex 15, France) sous les numéros 1-3087, 1-3088 et 1-3089 respectivement. 4. Extraction de l'ADN, amplification, séquençage et restriction
Avant amplification, les ADN sont extraits des échantillons à tester.
Toutes les extractions d'ADN ont été faites par l'utilisation de résine échangeuse d'ions et notamment du type chelex®. Les suspensions d'ADN extraites ont été tamponnées avec du tampon 10X PCR sans MgCl2 afin d'obtenir une concentration finale de 0.5X, et conservées à -20°C. L'extraction a aussi été testée sur des spores de B. anthracis afin de vérifier que l'extraction tue bien les spores. Une suspension en PBS d'une culture de 96h de B. anthracis a été préparée. 10 μl de cette suspension ont été déposés sur une lame et colorés par une coloration de spores. Les spores, colorées en vert, ont été comptées. La suspension a ensuite été ajustée à une concentration en spore de 107/ml. Un aliquot a ensuite été soumis a une extraction puis inoculé sur une gélose au sang pour vérifier l'absence de pousse de B. anthracis. La même manipulation sans étape de chauffage a été réalisée comme contrôle. Les conditions d'amplification par PCR étaient les suivantes: (1)
Protocole classique à 35 cycles avec hybridation à 55°C (détaillé en section a) de l'assemblage des plasmides); (2) PCR dans l'appareil ABI 7000 (Perkin Elmer Applied Biosystem, Roche, USA). 10 μl d'une dilution décimale d'ADN ont été combinées avec 50 pmol de chaque amorce et 10 p ol de sondes marquées au FAM-/ou VIC- (molécules fluorescentes appelées "reporter" et TAMRA- (molécule fluorescente appelée "quencher") dans un volume reactionnel de 50-μl utilisant le TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Roche, USA). Les échantillons ont été soumis à 45 cycles d'amplification dans l'appareil ABI Prism 7000 Séquence Détection System instrument (PE Applied Biosystems) conformément aux recommandations du constructeur. Le ratio de positivité a été calculé avec un indice de confiance de 99.9 à l'aide du logiciel PE 7000 Séquence Détection System. La quantification d'ADN a été calculée en générant une courbe standard. La digestion par Notl des produits de PCR a été réalisée pendant 1 heure à 37°C dans un volume de 20μl et le résultat observé dans un gel d'agarose à 3%.
5. Evaluation de la spécificité des amorces
La spécificité de 13 paires d'amorces a été évaluée par (1) amplification croisée des 13 agents des catégories A/B et VEF dont les séquences ont été incorporées dans les plasmides, (2) amplification des bactéries ou des virus proches, (3) amplification des bactéries ou des virus fréquemment isolés ou détectés dans les laboratoires de microbiologie clinique. Les agents testés sont les suivants: (i) les 13 agents à détecter: C. burnetii, F. tularensis, R. rickettsi,
R. akari, R. prowa^eckii, Y. pestis, B. anthracis, C. psitacci, B. melitensis, Vaccinia virus, varicella-zoster virus, herpesvirus 1 et 2. En raison des limitations liées à la circulation des agents de bioterrorisme qui font l'objet du présent travail, le virus de la variole, du monkeypox, B. mallei et B. pseudomallei n'ont pu être testés
(ii) 5 micro-organismes proches: Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Bacillus thurigiensis.
(iii) 28 pathogènes humains fréquemment isolés: Corjnebacterium groupe ANF, Nocardia astéroïdes, Shigella flexneri, Mycobacterium aυium, Campylobacter jejuni, Streptococcus agalactiae, streptococcus pyogenes, Pseudomonas paucimobilis, A.ctinomyces viscosus, Shigella sonnei, Streptococcus bovis, Burkholderia cepacia, Eisteria monocytogenes, Clostridium perfringens, Actinomyces meyerii, Fusobacterium nucleatum, Esckerickia coli, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnés, Haemophilus influence, Bacteroides fragilis, Salmonella enterica Typhi, Kingella kingae, Enterobacter aerogenes, Corynebacterium striatu , Bartonella quintana, Eegionella pneumophila, Neisseria meningitidis.
6. Evaluation de la sensibilité des amorces
Ces tests ont été réalisés dans l'appareil LightCycler (Roche) utilisant le protocole de détection par SYBRGreen recommandé par le fabricant sur des volumes finals de 20μl.
7. Décontamination utilisant la pré-digestion par Notl
Afin de vérifier la possibilité de décontamination avant amplification, les extraits d'ADN ont été digérés par Notl. Une suspension d'ADN ajustée à une concentration 106 fois supérieure à celle de la limite de détection de la technique a été préparée à partir de chaque plasmide. Trois solutions ont ensuite été testées après extraction ou soumises à une restriction par Notl à 37°C pendant lh: il s'agissait de (1) l'ADN d'un plasmide seul simulant une contamination par le plasmide d'un prélèvement négatif, (2) l'ADN d'un plasmide seul mélangé avec l'ADN cible afin de mimer un prélèvement positif contaminé par l'ADN du plasmide, (3) l'ADN cible afin de mimer un prélèvement positif non contaminé.
II- Résultats 1. Amplification des agents à détecter
Les 13 séquences des agents de bioterrorisme à tester et les 15 séquences présentes dans les plasmides sont amplifiées de façon spécifique par les amorces désignées dans ce travail. Les amplifiats sont facilement différenciés des amplifiats de l'ADN natif par digestion par Notl, un profil de migration différent en gel d'agarose ainsi que l'aspect des courbes de fusion et le séquençage des fragments.2.
2. Tests de sensibilité
Plasmide Micro organisme Nombre de molécules détectées
Cat. A Smallpox virus 5-50
Cat A Y. pestis 5-50
Cat A B. anthracis 5
Ca A F. tularensis 500
Cat B Brucella sp. 65
Cat B R. prowazeckii 65
Cat B R. rickettsii 100
Cat B B. mallei/pseudomallei 65
Cat B C. burnetii 6
Cat B C. psitacci 65
Cat. VEF Smallpox virus 5
Cat. VEF Monkeypoxvirus 5-50
Cat. VEF Orthopoxvirus 5
Cat. VEF Varicella-zoster virus 5
Cat. VEF Herpesvirus 1/2 5-50
Cat. VEF R. akari 5 3. Tests de spécificité Parmi l'ensemble des réactions de PCR réalisées avec les 15 paires d'amorces avec les différents virus et bactéries contrôles ((il) et (iϋ)), aucun n'a donné un produit d'amplification.
4. Pré-digestion par Notl Aucun amplifiât provenant des plasmides n'a été obtenu avec les suspensions d'ADN contaminées par l'ADN des plasmides. En revanche, la pré-digestion ne gène pas l'amplification de l'ADN natif.
5. Elimination des spores de B. anthracis par l'extraction par une résine Chelex® Aucune colonie n'était visible sur les suspensions de spores traitées par la résine, en revanche, elles étaient visibles lors de la procédure sans ébullition, démontrant que la technique est efficace et que l'absence de croissance n'est pas due à la seule présence des billes de Chelex®.
6. Discrimination sur les températures de fusion Au tableau 5, on représente la discrimination entre les amplicons obtenus à partir d'ADN natif (c'est à dire des agents bactériens ou viraux recherchés) et ceux générés à partir des plasmides CatA, Cat B et CatVEF sur la base de la taille des amplifiats (paires de bases) et de la température des courbes de fusions obtenues par PCR temps réel sur Light Cycler à 58°C.
III- Conclusion
La présente invention fournit des plasmides qui groupent plusieurs agents et qui assurent une parfaite discrimination de leur ADN avec celui de l'ADN de l'agent cible. Il est démontré que cette discrimination peut être réalisée a posteriori mais aussi a priori par pré-digestion des extraits d'ADN par Notl. Comme il est possible d'éviter les contaminations dues à l'ADN des agents de bioterrorisme par l'incorporation de dUTP dans les mix de PCR, un pré-traitement à l'Uracile N glycosylase combiné avec Notl doit assurer une réaction de PCR non contaminable.
La seconde originalité de la stratégie est de combiner des agents de bioterrorisme dans les plasmides de façon logique. Les 2 premiers plasmides (CatA et CatB) sont destinés à être intégrés dans des réactions de détection à la recherche d'agents de classe A ou classe B dans des prélèvements humains ou d'environnement. L'autre plasmide (CatVEF) sont destinés à une utilisation pour des prélèvements humains. Il a été construit pour répondre à des questions spécifiques dans le cas d'un patient se présentant avec des manifestations cliniques compatibles avec celles dues à un agent de bioterrorisme. Le plasmide CatVEF a été défini pour être utilisé comme témoin positif dans les cas d'un prélèvement provenant d'un patient avec une fièvre éruptive ressemblant à la variole, mais le plasmide comporte aussi les séquences des agents qui présentent cliniquement les mêmes manifestations.
Il est maintenant accepté que les techniques moléculaires sont les techniques de choix pour rechercher des agents de bioterrorisme à grande échelle. Les tests réalisés en PCR temps réel présentent l'avantage : (1) d'avoir une sensibilité supérieure, (2) d'avoir une spécificité supérieure et d'assurer une détection quantitative sur de grandes séries, (3) d'être moins facilement contaminables. L'utilisation de contrôles positifs ne risquant pas d'entraîner des faux positifs, permet l'accès à ces techniques à tous les laboratoires équipés.
Il est enfin démontré que l'extraction par chelex® assure une décontamination des prélèvements, notamment des très résistantes spores de J3. anthracis.
A la connaissance des inventeurs, il s'agit là de la première construction de plasmide qui propose des témoins positifs pour la détection d'agents de bioterrorisme sans avoir besoin d'utiliser de l'ADN natif de ces agents, et qui en plus, permet d'identifier facilement les faux positifs dus à des contaminants par les contrôles positifs. Ces plasmides où l'ADN qui en est extrait, est immédiatement utilisable par les laboratoires de microbiologie clinique possédant un équipement minimal pour réaliser des détections moléculaires. En raison du nombre très important de cibles moléculaires disponibles par les sequençages complets de génomes, les amorces et les fragments de séquences choisis dans ce travail sont évidemment remplaçables par d'autres.
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Tableau 2 (suite)
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Tableau 4
Plasmide CatA (ADN) nnnnnnnnnnnnnn_plasmide_GAΥCCAAGAC ïCCGGACCAAΥτACTAAΥAAAGAA GATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTATT ACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCATACAGGCTCGAACTGG AGTGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCG GCCGCTTATTAAAGTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATACCCGGGGCTAATAA TTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCG CTTATTAACTTGGGGTCCTCAAGATAGAACTGGAATTAATTCAATAATGGAG CTTATACCGGAAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCG CTTTATTATAGCGGCCGCTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATTG_ plasmide _nnnnnnn
Plasmide CatB (ADN) nnnnnnnnnnnnnn_p /ώrj^zV^GATCCTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTC GGCAACCAGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGC ATTATAGCGGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAA CGAGCTCATGCATGCATATGCATGCATGCGGATCCAAATTGCTTCG ATTCAGATCAACAAAATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTG TTGGTGCAATTATAGCGGCCGCTTATTAGCTGACAAATGGTCAATC ACTGGTGAAGCCCGGGGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCAT TTCGGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATA GCGGCCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATCGAATTC TGCCCCGGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGC AAGCAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCGCTTATTAACGGTT GCCTCGCTCTATTCTTCAGGAGACGTCATGCTCTTATGAATAATAAT GCTCTTGCAGCTGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTA CCGGTATTATAGCGGCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTA CAACACAGCCGGGCACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTAT ATTGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAA CCACTΥΥTAATACAACAAATATAGΥACTΥG^pJas∞ide_ιιntttιnnn
Plasmide CatVEF (ADN) nnvnntιnnnnnnnn_plasmide_GAΥCCAAGACΥTCCGGAACCAATTACTAAΥAAAGA AGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTAT TACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCAAAGTAGATTATGAAGA ATACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATT ATAGCGGCCGCTTATTAGGATCTACACCAGAAACTATTTCTGACCCGGGACC AAGGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTAC AATTAATTATAGCGGCCGCTTATTACTAAAGATGCCGGGTACTTATGTATGC AATTAATTGGGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTG GAGGAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGAAAGT CTGCTGGACGTCCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAGCGGCCGC TTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAACAAGCG CCTGGCCCGCCGGCATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTCTTATG GCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTATTATTCAGAATT CAATTTTGCTGCACCGAG_jζ) lasmide__ nnnnnnn Tableau 5
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détection de la présence d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme à ADN dans un échantillon contenant de l'ADN à tester, dans laquelle on met en œuvre une réaction d'amplification enzymatique d'ADN du type PCR de l'ADN extrait dudit échantillon à tester et d'un fragment d'ADN synthétique comprenant une séquence spécifique dudit agent bactérien ou viral dans un échantillon témoin positif, caractérisée en ce que : a/- on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à
• un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN de bioterrorisme, de préférence de 4 à 8, ou
• un groupe d'au moins 4 agents bactériens ou viraux à ADN, de préférence de 4 à 8, comprenant au moins un agent bactérien ou viral à ADN de bioterrorisme et au moins un agent bactérien ou viral à ADN confondant, et b/- on utilise comme dit fragment synthétique d'ADN témoin positif, un grand premier fragment d'ADN synthétique regroupant des deuxièmes fragments d'ADN synthétiques comprenant chacun une séquence spécifique respectivement de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, desdits agents confondants dudit groupe, ladite séquence spécifique de chaque dit agent bactérien ou viral étant modifiée par substitution d'une partie de la séquence authentique correspondante dudit agent bactérien ou viral par une séquence exogène comprenant un site de clivage par une enzyme de restriction, ledit site n'étant pas présent dans l'une quelconque desdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux du dit groupe, ladite séquence exogène étant de préférence de taille différente, de préférence supérieure à celle de ladite partie de séquence authentique remplacée. c/- on réalise les étapes suivantes dans lesquelles :
1 - on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents bactériens ou viraux de bioterrorisme et le cas échéant desdits agents confondants, dans l'ADN extrait desdits échantillons à tester et dans l'ADN de l'échantillon témoin positif, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ledit deuxième fragment comprenant ladite séquence spécifique modifiée, 2- on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et
3- on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de témoin positif, en vérifiant si la séquence desdits amplifiats comprend une dite séquence exogène.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape 3-, on détecte les faux positifs après incubation des amplifiats provenant desdits échantillons à tester en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN qu'elle contient, et ainsi détecter la présence de faux positifs.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que, à l'étape 1-, on met en œuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées de chacune desdites séquences spécifiques des agents bactériens ou viraux dudit groupe, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacun desdits agents bactériens ou viraux, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différents dits agents bactériens ou viraux et lesdites amorces pouvant être mises en œuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que, avant de réaliser lesdites réactions d'amplifications enzymatiques de type PCR de l'étape 1-, on décontamine l'ADN à amplifier provenant des échantillons à tester en le mettant en présence de ladite enzyme de restriction pour couper, le cas échéant, lesdits deuxièmes fragments d'ADN provenant desdits grands premiers fragments d'ADN du témoin positif qu'ils pourraient contenir suite à une contamination par l'échantillon d'ADN témoin positif.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'à l'étape 2-, ladite vérification est réalisée à l'aide d'une sonde de ladite séquence spécifique d'un dit agent bactérien ou viral et, le cas échéant, à l'aide d'une pluralité de sondes spécifiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et, le cas échéant, des dits agents confondants, la séquence de la ou desdites sondes étant complémentaire d'une partie de la ou desdites séquences spécifiques authentiques, ne se chevauchant pas avec la partie de la séquence authentique remplacée par ladite séquence exogène.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite séquence exogène comprend ledit polynucléotide correspondant au site de clivage spécifique de ladite enzyme de restriction, ledit polynucléotide étant encadré par des séquences flanquantes qu'on ne retrouve pas dans lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, lesdites séquences flanquantes comprenant n nucléotides et n étant un nombre entier de 3 à 10.
7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite séquence exogène comprend ledit polynucléotide correspondant au site de clivage spécifique de ladite enzyme de restriction, ledit polynucléotide étant encadré par des séquences flanquantes qu'on ne retrouve pas dans lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, lesdites séquences flanquantes comprenant n nucléotides et n étant un nombre entier de 3 à 10.
8. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polynucléotide de n nucléotides correspondant audit site de clivage de l'enzyme de restriction, est positionné sensiblement au milieu de ladite séquence spécifique authentique dudit agent bactérien ou viral.
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'on détecte la présence éventuelle d'un agent bactérien ou viral de bioterrorisme appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux à ADN, consistant dans les bactéries Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis et un virus de la variole.
10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent de bioterrorisme appartenant au groupe des bactéries
Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, Brucella spp., Rickettsia prowa^ekii et Rickettsia ricketsii.
11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'on détecte si ledit échantillon à tester comprend de l'ADN provenant d'un agent bactérien ou viral appartenant à un groupe d'agents bactériens ou viraux, consistant dans un virus de la variole et des agents confondants avec le virus de la variole se manifestant par une fièvre éruptive vésiculaire, à savoir les virus Monkeypox, les virus du genre rthopoxvirus, les virus herpès simplex 1 et2, le virus de la varicelle-zona et la bactérie Rickettsia akari.
12. Méthode selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques authentiques desdits agents bactériens ou viraux, à partir desquelles sont obtenus lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques spécifiques modifiés, ainsi que lesdits jeux d'amorces et, le cas échéant, dites sondes spécifiques desdits agents bactériens ou viraux, ont les séquences suivantes du listage de séquences ainsi que les séquences inverses et séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n°l = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATCATACAG TCACAGACACTGTCTCATACACTACAGTAAGTACATCATCTGAAATTGTCACT ACTAAATCAAC-3' - pour Bacillus anthracis : Seq n°2 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCA AGAAACAACTGCACGTATCATTTTTAATGGAAAAGATTTAAATCTGGTAGAA AGGCGGATA-3'
- pour Francisella tularensis : Seq n°3 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA
TAGCGCTTTGACTAACAAGGACAATACTTGGGGTCCTCAAGATAGA ACTG-3'
- pour Yersinia pestis : Seq n°4 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAAG GAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTTCTATGCCATATAT TGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3'
- pour Burkholderia pseudomallei et pour Burkholderia mallei : Seq n°5 = 5*-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACCA GCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCGATGGTTG CGCAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3*
- pour Chlamydia psittaci : Seq n°6 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAATC TAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAACGTTAATCGACGCT GACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3' - pour Coxiella burnetii : Seq n°7 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCGG CTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGGCAAATTAGAA GTCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3'
- pour Brucella spp.: Seq n°8 = 5'-TGCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCC GTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGG TTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3'
- pour Rickettsia prowa^ekii : Seq n°9 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGGT
TCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTGATATAGGTA ACGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3'
- pour Rickettsia rickettsii : Seq n°10 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTAGCACGGCAGGTACCACTTTTAA TACAACAAATATAGTACTT-3'
- pour le virus monkeypox_: Seq n°l l = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATAATACTATCTGG ATCTACACCAGAAACTATTTCTGA-3'
- pour les virus du genre Orthopoxvirus : Seq °12 = 5'-ACCAAGGATAAAATATCTTACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAAATCATTCACTGCTAAAGAT GCCGGTACTTATGTATG-3' - pour le virus varicelle-zona : Seq n°13 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACC TTTACAGTTGGAGGAAAACGTCTTTTTTTTGTGCGCTCTAACGTTCG AGAAAGTCTGCTG-3'
- pour les virus herpès simplex 1 et 2: Seq n°14 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCAGGACTT
TGTCCTCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGTACACCAAC AAGCGCCTGGCCC-3'
- pour Rickettsia akari : Seq n°15 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCGGAAGCTCCACTTTCAGA ATTCAATTTTGCTGCACCGA-3'
13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que lesdites séquences spécifiques ont été modifiés avec ladite séquence exogène suivante ou respectivement la séquence inverse ou séquence complémentaire :
- Seq n°16 = 5'-ATTATAGCGGCCGCTTATTA-3'
14. Méthode selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que lesdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques de chacun desdits agents de bioterrorisme et agents confondants mentionnés ci-après, ont les séquences suivantes ou les séquences inverses ou séquences complémentaires :
- pour le virus de la variole : Seq n°17 = 5'-AAGACKTCSGGACCAATTACTAATAAAGAAGATC
ATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGCCGCTTA TTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAAC-3'
- pour Bacillus anthracis : Seq n°18 = 5'-ATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGC AAATTCAAGAAACAACTGCACGTATCAATTATAGCGGCCGCTTATTA AAGATTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATA-3'
- pour Francisella tularensis : Seq n°19 = 5'-GCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAATACTTA TAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGTCCTCA AGATAGAACTG-3'
- pour Yersinia pestis : Seq n°20 = 5'-AATAATGGAGCTTATACCGGAAACTTCCCGAAA GGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTTATTATAGCGGCCG CTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT-3' - pour Burkholderia mallei I pseudomallei : Seq n°21 = 5'-TTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCGGCAACC AGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCATTATAGC GGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAAC-3' - pour Chlamydia psittaci : Seq n°22 = 5'-CAAATTGCTTCGATTCAGATCAACAAAATGAAAT CTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTGGTGCAATTATAGCGGCCGC TTATTAGCTGACAAATGGTCAATCACTGGTGAAG-3'
- pour Coxiella burnetii : Seq n°23 = 5'-GCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTCG
GCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATAGCGG CCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATC-3'
- pour Brucella spp. : Seq n°24 = 5'-TGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGG GCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATATTAT'AGCGGCCG CTTATTAACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGA-3'
- pour Rickettsia prowa^ekii : Seq n°25 = 5'-ATGCTCTTATGAATAATAATGCTCTTGCAGCTGG TTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCGGTATTATAGCG GCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAACACA-3'
- pour Rickettsia. rickettsii : Seq n°26 = 5'-ACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATAT TGTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAACC ACTTTTAATACAACAAATATAGTACTT-3' - pour le virus monkeypox : Seq n°27 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTG ATTGTAAATACAGATAGTGAATCGACTATAGACATTATAGCGGCCG CTTATTAGGATCTACACCRGAAACTATTTCTGA-3'
- pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n°28 = 5'-ACCAAGGATAAARTATC TACGATTCTCCATACG ATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAATTATAGCGGCCGCTTATTA CTAAAGATGCCGGGTACTTATRTATG-3'
- pour le virus varicelle-zona : seq n°29 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACA
GTTGGAGGAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGA AAGTCTGCTG-3'
- pour les virus herpès simplex 1 et 2: seq n°30 = 5'-CATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATAG CGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCGT ACACCAACAAGCGCCTGGCCC-3'
- pour Rickettsia. akarï : Seq n°31 = 5'-ATATTGGTGGGAATAATTGTAATGTAACACGTC TTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATTATAGCGGCCGCTTAT TATTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGA-3'
15. Méthode selon les revendications 9 et 15, caractérisée en ce que ledit grand fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin comprend la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n°32 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGACCAATTACTAATAAAG
AAGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCGGC CGCTTATTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCATAC AGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACAACT GCACGTATCAATTATAGCGGCCGCTTATTAAAGTTAAATCTGGTAG AAAGGCGGATACCCGGGGCTAATAATTTCATTGCTCCTTTTGCAAAT ACTTATAGCGCTTTGACTATTATAGCGGCCGCTTATTAACTTGGGGT CCTCAAGATAGAACTGGAATTAATTCAATAATGGAGCTTATACCGG AAACTTCCCGAAAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAACCAGCGCTTT ATTATAGCGGCCGCTTATTAATTGGACTTGCAGGCCAGTATCGCATT G-3'
16. Méthode selon les revendications 10 et 14, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin comprend la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires : - Seq n°33 = 5'-GATCCTTCCAGACGCTGGCGCTGTCGACTTCG
GCAACCAGCGCGCTGTCCGCGACCGACCAGGCGAACGCCACGGCAT TATAGCGGCCGCTTATTAGATCAACGCGGTCAACAAGCCGCAAACG AGCTCATGCATGCATATGCATGCATGCGGATCCAAATTGCTTCGATT CAGATCAACAAAATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTAGCTGTTG GTGCAATTATAGCGGCCGCTTATTAGCTGACAAATGGTCAATCACT GGTGAAGCCCGGGGCGCTTTTTACCGACTCCGCAAATAATCATTTC GGCTCGGGATGGGCTTGGCTCGTTAAAGATAACAATGATTATAGCG GCCGCTTATTATCTTAAGCACTGTCAACGCTCGTAATCGAATTCTGC CCCGGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAG CAACTCGTCCTTTACGATATTATAGCGGCCGCTTATTAACGGTTGCC TCGCTCTATTCTTCAGGAGACGTCATGCTCTTATGAATAATAATGCT CTTGCAGCTGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGTGCTATAATTACCG GTATTATAGCGGCCGCTTATTAGGTGGTGTTAATGCTGCGTTACAA CACAGCCGGGCACGTTTGGTGGAGCTCATAAGTTACAAACTATATT GTTCAAAGGAGCGGGAGATTGTATTATAGCGGCCGCTTATTAACCA CTTTTAATACAACAAATATAGTACTTG-3'
17. Méthode selon les revendications 11 et 14, caractérisée en ce que ledit grand premier fragment d'ADN synthétique constituant l'ADN témoin comprend la séquence suivante ou la séquence inverse ou leurs séquences complémentaires :
- Seq n°34 = 5'-GATCCAAGACTTCCGGAACCAATTACTAATAA AGAAGATCATACAGTCACAGACACTGTCTCATACACTAATTATAGCG GCCGCTTATTACATCTGAAATTGTCACTACTAAATCAACGAGCTCAA AGTAGATTATGAAGAATACTCCATAGAGTTGATTGTAAATACAGAT AGTGAATCGACTATAGACATTATAGCGGCCGCTTATTAGGATCTAC ACCAGAAACTATTTCTGACCCGGGACCAAGGATAAAATATCTTACGA TTCTCCATACGATGATCTAGTTACAACTATTACAATTAATTATAGCG GCCGCTTATTACTAAAGATGCCGGGTACTTATGTATGCAATTAATTG GGTTAAACGTTTGAATCCATCCGATTATGCCACCTTTACAGTTGGAG GAAAACGTCTTATTATAGCGGCCGCTTATTATCTAACGTTCGAGAAA GTCTGCTGGACGTCCATCACCGACCCGGAGAGGGACATCCATTATA GCGGCCGCTTATTATCACCGCCGAACTGAGCAGACACCCGCGCGCG TACACCAACAAGCGCCTGGCCCGCCGGCATATTGGTGGGAATAATT GTAATGTAACACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAGGTAGTGCATT ATAGCGGCCGCTTATTATTCAGAATTCAATTTTGCTGCACCGAG-3'
18. Méthode selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que, aux étapes d'amplification enzymatique d'ADN, on utilise les jeux d'amorces de séquences suivantes ou respectivement séquences inverses ou leurs séquences complémentaires en tant que de besoin:
- pour Bacillus anthracis : Amorce 5' : Seq n°35 = 5'-AGGCTCGAACTGGAGTGAA-3' Amorce 3' : Seq n°36 = 5'-CCGCCTTTCTACCAGATTT-3'
- pour Yersinia pestis :
Amorce 5' : Seq n°37 = 5'-ATGGAGCTTATACCGGAAAC-3' Amorce 3' : Seq n°38 = 5'-GCGATACTGGCCTGCAAG-3' - pour Francisella tularensis :
Amorce 5' : Seq n°39 = 5'-TAATAATTTCATTGCTCCTTTTG-3' Amorce 3' : Seq n°40 = 5'-TTCTATCTTGAGGACCCCAA-3'
- pour Brucella spp. :
Amorce 5' : Seq n°41 = 5'-CCGGTGAACTGGCTAATCT-3' Amorce 3* : Seq n°42 = 5'-TGAAGAATAGAGCGAGGCAA-3'
- pour Burkholderia mallei f 'Pseudomallei :
Amorce 5' : Seq n°43 = 5'-GACGCTGGCGCTGTCGA-3' Amorce 3' : Seq n°44 = 5'-CGGCTTGTTGACCGCGTT-3'
- pour Chlamydia psittaci : Amorce 5' : Seq n°45 = 5'-ATTGCTTCGATTCAGATCAAC-3' Amorce 3' : Seq n°46 = 5'-ACCAGTGATTGACCATTTGT-3'
- pour Coxiella burnetii :
Amorce 5' : Seq n°47 = 5'-CTTTTTACCGACTCCGCAAA-3' Amorce 3' : Seq n°48 = 5'-ACGAGCGTTGACAGTGCTT-3'
- pour Rickettsia prowa^ekii :
Amorce 5' : Seq n°49 = 5'-GCTCTTATGAATAATAATGCTC-3' Amorce 3' : Seq n°50= 5'-TGTTGTAACGCAGCATTAACA-3'
- pour Rickettsia rickettsii : Amorce 5' : Seq n°51 = 5'-TTTGGTGGAGCTCATAAGTTA-3'
Amorce 3' : Seq n°52 = 5'-GTACTATATTTGTTGTATTAAAAG-3'
- pour Rickettsia akari :
Amorce 5' : Seq n°53 = 5'-TTGGTGGGAATAATTGTAATGT-3' Amorce 3' : Seq n°54 = 5'-TGCAGCAAAATTGAATTCTG-3' - pour le virus de la variole :
Amorce 5' : Seq n°55 = 5'-GACKTCSGGACCAATTACTA-3' Amorce 3' : Seq n°56 = 5'-TTGATTTAGTAGTGACAATTTCA-3'
- pour le virus Monkeypox :
Amorce 5' : Seq n°57 = 5'-AAAGTAGATTATGAAGAATACTC-3' Amorce 3' : Seq n°58 = 5'-CAGAAATAGTTTCGACAATTTCA-3'
- pour les virus du genre Orthopoxvirus:
Amorce 5' : Seq n°59 = 5'-ACCAAGGATAAARTATCWTACG-3' Amorce 3' : Seq n°60 = 5'-ATAYATAAGTACCCGGCATCT-3'
- pour le virus de la varicelle-zona : Amorce 5' : Seq n°61 = 5'-GGTTAAACGTTTGAATCCATC-3' Amorce 3' : Seq n°62 = 5'-CAGCAGACTTTCTCGAACG-3'
- pour les virus Herpex simplex 1 et 2:
Amorce 5' : Seq n°63 = 5'-CCGACCCGGAGAGGGAC-3' Amorce 3' : Seq n°64 = 5'-CCAGGCGCTTGTTGGTGT-3'
19. Méthode selon la revendication 12 ou 18, caractérisée en ce qu'à l'étape 2-, on utilise des sondes comprenant les séquences suivantes ou séquences inverses ou leurs séquences complémentaires : - pour le virus de la variole : Seq n°65 = 5'-AAGATCATACAGTCACAGACACTGT-3'
- pour Bacillus anthracis : Seq n°66 = 5'-TACCGCAAATTCAAGAAACAACTGC~3'
- pour Francisella tularensis : Seq n°67 = 5'-TTGCAAATACTTATAGCGCTTTGACT-3'
- pour Y rsinia pesti s Seq n°68 = 5'-AAGGAGTGCGGGTAATAGGTTATAA-3'
- pour Burkholderia mallei/ B. pseudomai/ei : Seq n°69 = 5*-AACCAGCGCGCTGTCCGCGAC-3' - pour Coxiella psittaci : Seq n°70 = 5'-ATGAAATCTAGAAAATCTTGTGGTGTA-3'
- pour Chlamydia burnetii: Seq n°71 = 5'-ATCATTTCGGCTCGGGATGGGC-3*
- pour Brucella spp. : Seq n°72 = 5'-AATGGCAAGCAACTCGTCCTTTAC-3'
- pour Rickettsia pron>a ekii : Seq n°73 = 5'-TGGTTCTATTCAGTTAGATGGGAGT-3'
- pour Rickettsia rickettsii : Seq n°74 = 5'-TATATTGTTCAAAGGAGCGGGAGAT-3' - pour Rickettsia akari : Seq n°75 = 5'-ACGTCTTATGGCAGGAACAAATTTAG-3' - pour le virus Monkeypox : Seq n°76 = 5'-TTGATTGTAAATACAGATAGTGAATCG-3'
- pour les virus du genre Orthopoxvirus: Seq n°77 = 5'-TCCATACGATGATCTAGTTACAACTA-3' - pour le virus varicelle-zona : Seq n°78 = 5'-ATGCCACCTTTACAGTTGGAGGAA-3'
- pour les virus herpès simplex 1 et 2: Seq n°79 = 5'-ACCGCCGAACTGAGCAGACACC-3'
20. Méthode selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que lesdits grands fragments d'ADN synthétiques modifiés constitutifs de l'ADN de l'échantillon témoin, sont insérés dans un plasmide.
21. Trousse de diagnostic utile pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend des échantillons de témoins positifs comprenant un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits deuxièmes fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de chacun desdits agents " bactériens ou viraux de bioterrorisme et, le cas échéant, d'agents confondants tels que définis dans les revendications 1, 3 et 9 à 12 et 14 à 7, - ainsi que de préférence desdits jeux d'amorces spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques desdits agents bactériens ou viraux tels que définis dans les revendications 1, 3 et 18, et
- de préférence encore le cas échéant, desdites sondes telles que définies dans les revendications 5, 6 et 19, et - de préférence encore, une dite zone de restriction telle que définie dans les revendications 1 , 2, 4 et 13.
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