DE19915141C2

DE19915141C2 - Detektion von Nucleinsäure-Amplifikaten

Info

Publication number: DE19915141C2
Application number: DE19915141A
Authority: DE
Inventors: Guido Krupp
Original assignee: ARTUS GES fur MOLEKULARBIOLOG
Current assignee: AMPTEC GMBH, 22767 HAMBURG, DE
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: EP1165841A1; DE19915141A1; AU5981799A; WO2000058505A1; AU772693B2

Description

Die vorliegende Patentanmeldung betrifft insbesondere Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetek tion von Nukleinsäuren sowie Kits zur Durchführung der Verfahren.

Zur Vervielfältigung von Desoxyribonucleinsäuren (DNA) oder Ribonucleinsäuren (RNA) wurden bislang verschie dene Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT), wie zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA®), entwickelt. Auf diesen Amplifikationstechniken basierende Assays werden beispielsweise für den hochsensitiven Nachweis und/oder die Quantifizierung von Erregern im medizinisch-dia gnostischen Bereich eingesetzt.

DNA-Amplifikationstechniken wie PCR führen zur Erzeugung großer Mengen amplifizierter Target-DNA (oder über einen initialen Reverse Transkriptase-Schritt zu amplifizierter RNA). Üblicherweise werden die Amplifikationsprodukte nach einer definierten Zeit mit Hilfe von Post-Amplifikationsmethoden - im allgemeinen durch Hybridisierung - nach gewiesen (Endpunktanalyse).

Gemäß einem neuen Ansatz - "TaqMan®" - zur quantitativen PCR wird Fluorescence Resonance Transfer (FRET; vgl. Heid et al., Genome Res. 6 (1996) 986-994) mit doppelt fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden zur Echtzeitdetektion der DNA-Amplifikation vorgeschlagen). Ein Nachteil dieser Methode ist, daß die Sonde am Target haften bleibt, bis sie durch die 5'-Exonuklease-Aktivität der Taq DNA-Polymerase entfernt wird. Die Stringenz ist aufgrund des Temperatur profils der PCR nur sehr schwer kontrollierbar, und die Lösung dieses Problems durch entsprechende Sondenkonstruk tion ist nur unter großem Aufwand denkbar. Ein weiterer Nachteil des TaqMan® ist die Erzeugung eines äquimolaren Si gnals, d. h., daß pro Amplifikationszyklus nur ein Sondenmolekül pro amplifiziertem DNA Target-Molekül gespalten wird, was ein vergleichsweise schwaches Signal zur Folge hat.

Bei NASBA® handelt es sich - im Gegensatz zur thermozyklischen PCR - um eine homogene, isotherme in vitro Am plifikation (vgl. z. B. T. Kievits et al. J. Vir. Meth. 35 (1991) 273-286), EP 0 329 822 sowie R. Sooknanan et al. in "Mo lecular Methods for Virus Detection", D. L. Wiedbrauk und D. H. Farkas (Ed.), Academic Press 1995, Kapitel 12, 261-285). Gegenüber anderen Amplifikationsverfahren weisen die NASBA® und andere isotherme Reaktionen den Vor teil auf, daß sie ohne besonderen technischen Aufwand durchgeführt werden können, da die Amplifikation bei einem ein zigen Temperaturwert erfolgt und diese Reaktionsbedingungen während des gesamten Prozesses beibehalten werden. Damit verkürzt nicht auch die Dauer jedes Amplifikationsschrittes. In Verbindung mit der z. B. im Vergleich zur PCR ho hen Amplifikationseffizienz werden so mit Hilfe der NASBA® und anderer isothermer Amplifikationstechniken hohe Amplifikat-Konzentrationen in kurzer Zeit erreicht. Ein weiterer Vorteil der NASBA® gegenüber der PCR ergibt sich aus der selektiven Nachweismöglichkeit von RNA. Dies spielt insbesondere im Zusammenhang mit der Amplifikation bzw. Quantifizierung von zellulärer mRNA eine Rolle, bei der mögliche zelluläre DNA-Kontaminationen vermieden werden können.

Ein Nachteil der NASBA® und anderer isothermer Amplifikationsstrategien ist jedoch, daß eine Echtzeitdeketion mit Hilfe von Fluoreszenz wie bei dem auf PCR basierenden TaqMan (Perkin Elmer) oder Light-Cycler (Roche Diagnostics) nicht möglich ist.

Die in diesem Zusammenhang vorgeschlagene Endpunktanalyse zur Quantifizierung ist mit Schwierigkeiten verbun den, da im Falle des Nachweises unterschiedlicher Target-RNA-Konzentrationen manche Proben bereits das Sättigungs niveau (Plateauphase) erreicht haben können, während sich andere Proben noch in der Phase steigender Amplifikat-Kon zentrationen befinden (vgl. auch Heid et al., a. a. O.). Ferner ist diese Endpunktsanalyse aufgrund zusätzlicher Arbeits schritte nach der erfolgten RNA-Amplifikation aufwendiger und zeitintensiver. Aufgrund des Erfordernisses, die Reak tionsgefäße für die Quantifizierungsschritte zu öffnen, besteht außerdem das Risiko einer Kreuzkontamination hocham plifizierter RNA- und DNA-Targets.

Von Leone et al. (Nucleic Acids Research 26 (1998) 2150-2155) wurde ein Ansatz zur Echtzeitdetektion von NAS BA®-amplifizierter RNA vorgeschlagen, bei dem man eine zweifach fluoreszenzmarkierte DNA-Sonde verwendet. Im Gegensatz zum PCR-Verfahren (vgl. Heid et al., a. a. O.) haftet die Sonde am Target an und wird bei der Amplifikations reaktion nicht entfernt. Dies führt zu potentiellen Komplikationen, da die DNA-Sonden während der frühen Amplifika tionsstufen mit der Bindung an die ersten Antisense-RNA-Amplifikate interferieren können, was zum RNase H-Abbau und damit zu Eliminierung von RNA-Substraten und in der Folge zu einer fehlerhaften Konzentrationsbestimmung füh ren kann. Die Genauigkeit der quantitativen Target-Bestimmung hängt ferner in entscheidendem Maß von der Menge der zugesetzten Sonde ab.

Das von Leone et al. vorgeschlagene System erlaubt allerdings nur eine sehr schlechte Quantifizierung, unabhängig davon, ob man die bevorzugte Auswertung auf Basis des Schwellenwerts (vgl. Leone et al., Fig. 7; Kurven für 100 fg und 1 pg überlappen zu Beginn) oder nach Erreichen des Plateaus (vgl. Leone et al., Fig. 7; Kurven für 1 pg und 10 pg über lappen am Ende) durchführt.

Ferner ist hur eine sehr geringe Stringenz möglich, da die Sonde am Target haften bleibt und die isotherme Reaktion bei relativ geringer Temperatur (41°C) erfolgt, was ein hohes Risiko falsch positiver Ergebnisse zur Folge hat. Offen sichtlich könnte, abhängig von der Sonde, ein maximales Signal sogar bei geringeren Temperaturen erhalten werden (vgl. Leone et al., Fig. 7), aber aufgrund der gewählten Versuchsdurchführung hätte dies ein zusätzliches Risiko für falsch positive Resultate zur Folge. Wie im Rahmen weiterer Untersuchungen anhand des von Leone et al. vorgeschla genen Protokolls festgestellt wurde, variiert die optimale Temperatur für die Hybridiserung des Fluoreszenzmarkers in Abhängigkeit von der Länge bzw. der Sequenz des hybridisierenden Target-Abschnitts.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren, insbeson dere von RNA, zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Methoden, insbesondere des Verfahrens von Leone et al., vermeidet und für Routineanwendungen geeignet ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5 gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion von Nu kleinsäuren, bei dem man

a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Sequenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nukleo tiden, angehängt ist, der für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "c_rel." nach folgender For mel bestimmt:
c_rel. = t_P/t_Ref.,
wobei
t_P der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
t_Ref. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, das aufgrund des über den Primer eingeführten bzw. an die Nukleinsäuream plifikate angehängten Sequenzmotivs A und des in der Sonde verwendeten Motivs B die Bildung eines Hammerkopf-Ri bozyms ermöglicht, kommt es zur Spaltung der Sonde und damit zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals. Das erfin dungsgemäße Prinzip ist schematisch in Fig. 1 (sowie Fig. 2 bis 16) dargestellt. Erfindungsgemäß ist es selbstverständ lich möglich, Sequenzen auszunutzen, die anstelle des Hammerkopf-Ribozyms zur Ausbildung anderer, kleinerer Ribo zyme (z. B. des "Hairpin-Ribozyms" oder des "Hepatitis Delta") geeignet sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Quantifizierung von RNA, DNA oder RNA/DNA-Chimä ren (d. h. Ribo- und Desoxyribonukleotiden enthaltenden Nukleinsäuren), die als "Target-Nukleinsäure" bezeichnet wer den, wobei gegebenenfalls eine dem Verfahren vorgeschaltete Aufschmelzung doppelsträngiger Nukleinsäuren zum Er halt von Einzelsträngen erforderlich ist.

Bei den im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Amplifikationsverfahren handelt es sich vorzugsweise um um isotherme Amplifikationsverfahren wie NASBA®, Transcription Mediated Amplification (TMA; vgl. z. B. M. Hirose et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 3122-6) oder Self-sustained Sequence Replication (3SR; vgl. E. Fahy et al. in PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1991, 25-33) oder um cyclische Amplifikationsverfah ren wie z. B. PCR.

Soweit hierin nichts anderes angegeben ist kann es sich bei den Nukleotiden A, C und G jeweils um Ribonukleotide (rNTP) oder Desoxyribonukleotide (dNTP) handeln. "N" kann für ein beliebiges Ribo- oder Desoxyribonukleotid ste hen. Im Falle von RNA/DNA-Chimären (d. h. Oligonukleotiden, die sowohl Ribo- als auch Desoxyribonukleotide ent halten) sind die obligatorischen Ribonukleotide mit dem Präfix "r" versehen (d. h. rA, tC, rG) bzw. U. Die Sequenzmo tive A und B der Sonden können somit entweder ausschließlich aus Ribonukleotiden (RNA-Sonde) bestehen oder RNA/ DNA-Chimäre sein. Beim Motiv A ist es jedoch erforderlich, daß am 3'-Ende in jedem Fall das Ribonukleotid Adenin (rA) eingesetzt wird (d. h. 5'-GAA(rA)-3'). Beim Motiv B (5'-CUGANGA-5') ist es erforderlich, daß Guanin als Ribo nukleotid vorliegt und Adenin am 3'-Ende ebenfalls ein Ribonukleotid (rA) ist (d. h. 5'-CU(rG)AN(rG)(rA)-3'). U kann gegebenenfalls durch T ausgetauscht sein.

Unter "Fluoreszenz-Schwellenwert" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenz-Wert verstanden, der um den Faktor 5-10 über der unter vergleichbaren Bedingungen (d. h. Reaktionsmischung ohne Target- oder Refe renz-Nukleinsäure) gemessenen Hintergrundschwankung liegt.

Die Zeit t_P entspricht derjenigen Zeit, die nach Start der Amplifikationsreaktion vergeht, bis soviele Amplifikate der Target-Nukleinsäure gebildet sind, daß der Fluoreszent-Schwellenwert (Schwellenwert) erreicht ist.

Die Zeit t_Ref. entspricht derjenigen Zeit, die nach Start der Amplifikationsreaktion vergeht, bis ausgehend von einer Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration soviele Amplifikate gebildet sind, daß der Schwellenwert erreicht ist. Die Referenznukleinsäure sollte in ihrer Nukleinsäuresequenz nur geringfügig von der Target-Nukleinsäuresequenz ab weichen, damit eine möglichst genaue Quantifizierung erreicht wird.

Um die Konzentration der Target-Nukleinsäure möglichst exakt bestimmen zu können mißt man vorzugsweise meh rere t_Ref.-Werte für Referenz-Nukleinsäuren unterschiedlicher Konzentration, so daß der gemessene t_P-Wert möglichst zwischen zwei t_Ref.-Meßpunkten liegt und somit eine bestimmte Konzentration zugeordnet werden kann. Vorzugsweise mißt man drei t_Ref.-Werte für eine Referenz-Nukleinsäure bei drei unterschiedlichen Konzentrationen und ermittelt die sich daraus ergebende Meßkurve (Eichkurve). Die Target-Nukleinsäure unbekannter Konzentration kann anschließend durch Bestimmung des t_P-Wertes durch Vergleich mit der Eichkurve bestimmt werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Target-Nu kleinsäure in gleichzeitiger Anwesenheit einer oder mehrerer, vorzugsweise von, drei Referenz-Nukleinsäuren bekannter Konzentration durchführt, und zur Detektion verschiedene sequenzspezifische, fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet, die ein unterschiedliches Fluoreszenzsignal erzeugen. Die Sequenzen der Referenz-Nukleinsäuren in einem Amplifika tionsansatz unterscheiden sich nur geringfügig voneinander und sollten Varianten der Target-Nukleinsäure sein. Auf diese Weise können in einem Reaktionsansatz die t_P- und t_Ref.-Werte gleichzeitig bestimmt und somit ohne zusätzlichen Arbeitsaufwand die Konzentration (c_rel.) der Target-Nukleinsäure bestimmt werden (sogen. "Multiplexing"; vgl. auch US 5,837,501).

Anstelle der Verwendung eines das Sequenzmotiv A enthaltenen Primers und einer das Sequenzmotiv B enthaltenden Sonde ist auch die umgekehrte Kombination gleichermaßen geeignet, d. h. die Kombination aus einem das Motiv B ent haltenden Primer und einer das Motiv A enthaltenden Sonde.

Als Reporter kommen praktisch alle Fluoreszenz-Farbstoffe und insbesondere die in Tab. 17 angegebenen Farbstoffe (vor allem FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue (TIB MOLBIOL) in Frage. Vorzugsweise handelt es sich bei den Reporter-Farbstoffen um Substanzen mit hohem Fluores zenzsignal (d. h. hoher "Lichtausbeute") bei geringem "Photobleaching".

Als Quencher können Farbstoffe eingesetzt werden, die bei Wellenlängen < ca. 500 nm absorbieren. Unter den in Frage kommenden Substanzen sind TAMRA, LCR, CY-5 oder DABCYL bevorzugt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Reporter/Quencher-Kombinationen bevorzugt, die eine Anregung bei ca. 490 nm und eine Emission bei < ca. 650 nm (TaqMan® SDS 7700, Perkin Elmer) oder < 700 (Light Cycler, Boehringer) gestatten. Die Fluoreszenz kann praktisch mit jedem handelsüblichen Fluorimeter gemessen werden.

Beim Multiplexing bietet sich die Kombination des universellen Quenchers DABCYL mit Reporter-Farbstoffen wie Coumann (emittierte Fluoreszenz bei 475 nm), FAM (emittierte Fluoreszenz bei 515 nm), BODIPY (emittierte Fluores zenz bei 525 nm), TAMRA (emittierte Fluoreszenz bei 575 nm), Texas Red (emittierte Fluoreszenz bei 615 nm), CY-5 (emittierte Fluoreszenz bei 674 nm) usw. an (vgl. z. B. S. Tyagi et al., Nature Biotech. 16 (1998) 49-53).

Sollte die zu amplifizierende Nukleinsäure bereits die Sequenzmotive 5'-GAAA-3 oder 5'-CUGANGA-3' ("Ribozym- Motive") enthalten, kann das Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion erfindungsgemäß eben falls durchgeführt werden, wobei - aufgrund des bereits in der Target-Nukleinsäure enthaltenen Ribozym-Motivs - un markierte Primer einsetzt werden, d. h. Primer, an die Motiv A oder Motiv B nicht angehängt sind. Die Detektion erfolgt schließlich, indem man die Nukleinsäure-Amplifikation - vorzugsweise NASBA®, TMA, 3SR oder PCR - in Gegenwart eines Überschusses einer Sonde durchführt, die das jeweils zum in der Target-Nukleinsäure enthaltenen Ribozym-Motiv "komplementäre" Motiv enthält. Unter "komplementäres Motiv" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Motiv verstanden, das - abhängig von dem in der Target-RNA enthaltenen Ribozym-Motivs (5'-GAAA-3' oder 5'-CUGANGA- 3') zur Ausbildung einer Hammerkopf-Ribozym-Struktur (Hammerhead-Ribozym) erforderlich ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetektion einer das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) oder einer das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthaltenden Nu kleinsäure, bei dem man

a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der für das Motiv A im Transkript kodiert, amplifiziert wird, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses, vorzugsweise in einer Konzentration von 50 bis 500 nM, einer Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) ent hält, durchführt, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, und man
c) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "c_rel" nach folgender For mel bestimmt:
c_rel. = t_P/t_Ref.,
wobei
t_P der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
t_Ref. für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist somit erstmals eine quantitative Echtzeitdetektion von Nukleinsäuren (d. h. RNA, DNA oder RNA-DNA-Chimären) im Rahmen einer isothermen Nukleinsäureamplifikation, z. B. mittels NAS BA®, TMA oder 3SR, möglich. Im Falle der NASBA® werden insbesondere die dem System von Leone et al. (a. a. O.) anhaftenden Probleme umgangen. Ferner kommt es nicht zu einer möglichen Konkurrenz zwischen Detektion und Am plifikation, da die Sonde - eine RNA-Substratsonde - nicht am Target haften bleibt sondern abgespalten und freigesetzt wird, wodurch ein nachweisbares Signal erzeugt wird. Ferner ist von Vorteil, daß RNase H die Target-RNA im Hybrid aus RNA-Substratsonde und RNA-Target nicht abbauen kann. Ferner ist die Menge der RNA-Substratsonde nicht kri tisch, und sie kann in einem sehr hohen Überschuß, wie z. B. 500 nM gegenüber 2 nM Ribozym-Target oder 0,066 nM Ribozym, eingesetzt werden.

Gegenüber den auf der PCR basierenden Echtzeitverfahren wie TaqMan® oder Light Cycler weist das erfindungsge mäße Verfahren unter isothermen wie unter cyclischen Temperaturbedingungen (PCR) ebenfalls Vorteile auf. Aufgrund der Möglichkeit, im Rahmen eines Amplifikationsschrittes mehrere Sonden zu spalten, kann ein vergleichsweise höheres Signal generiert werden. Dieses führt zu einer höheren Sensitivität der Reaktion und zu einer verkürzten Reaktionszeit. Zudem ist die Signalgenerierung aufgrund der enzymatischen Spaltung grundsätzlich steuerbar. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der hohen Spezifität der Reaktion, da nur eine exakte Hybridisierung der Sonde mit der Zielsequenz zum Spaltungsprozeß und damit zum Entstehen eines signifikanten Signals führt. Ferner ist insbesondere im Vergleich zum TaqMan® keine aufwendige Sondenkonstruktion notwendig, da sich die Sonde nach jedem Spaltungspro zeß von der Zielsequenz löst. Ein weiterer Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht in der Möglichkeit des Multiple xing.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt aufgrund der enzymatischen Spaltung der Sonde eine sehr gute und exakte li neare Quantifizierung. Im erfindungsgemäßen Ribozym-System erzeugt die Hybridisierung selbst nur ein sehr schwa ches Signal, während jedes in der amplifizierten Nukleinsäure vorhandene Ribozym eine Vielzahl von Nukleinsäure- Substratsonden spaltet. Diese weitere Amplifikation ist sehr spezifisch und erfordert das Vorliegen einer vollständig hybridisierenden Sequenz (vgl. Singh et al., Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 6 (1996) 165-168). Ohne das Risiko, falsch positive Resultate zu erhalten, können Temperatur und sonstige Reaktionsbedingungen optimiert werden, um zu einem maximalen Fluoreszenzsignal zu kommen. Beispielsweise können synthetische Peptide (vgl. Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994) 422-429), CTAB (Nedbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-7) oder GAP-DH (Sioud et al., J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789) zugesetzt werden, die die Effizienz, wie z. B. die Hybridisierungsgeschwindigkeit, und die Spezifität der Target-Erkennung erhöhen können.

Gegenüber den im Stand der Technik angewandten oder vorgeschlagenen Amplifikationsverfahren mit Target-Quan tifizierung können durch die vorliegende Erfindung die Stabilität der RNA-Sonde erhöht und deren Kosten gleichzeitig reduziert werden. So ist es z. B. möglich, nahezu alle, bei der chemischen Synthese teuereren Ribonukleotide durch 2'- Desoxyribonukleotide zu ersetzen, die billiger und gegenüber Abbau (durch längerfristige Lagerung, Einwirkung von Nukleasen, Metallionen wie Magnesium, sowie Hitze usw.; vgl. Bratty et al., Biochim. Biophys. Acta 1216 (1993) 345- 359) stabiler sind.

Im Hinblick auf eine Verbesserung der allgemeinen Ribozym-Struktur und Effizienz des Verfahrens sind unter ande rem folgende Modifikationen möglich:
Um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen, d. h. um mehr Signale bezogen auf die Anzahl amplifizierter Nuklein säure-Moleküle zu erzeugen, sollte auf den Spaltungsort des Ribozyms die Sequenz UA folgen (vgl. Clouet-d'Orval et al., Biochemistry 36 (1997) 9087-9092). Ferner sollte die Position X (vgl. Fig. 4B) die modifizierte Base Pyridin-4-on (vgl. Burgin et al., Biochemistry 35 (1996) 14090-14097) enthalten, was ebenfalls zu einer Erhöhung der Reaktionsge schwindigkeit der Detektionsstufe führt.

Durch das Ersetzen der meisten Ribonukleotide durch Desoxyribonukleotide können die Kosten für eine RNA-Sonde um bis das 10fache gesenkt werden. An vier Positionen sind Ribonukleotide jedoch essentiell, die z. B. in Fig. 2B, 4B, 15 und 16 mit "r" gekennzeichnet sind (vgl. Byang et al., Biochemistry 31 (1992) 5005-5009). In den hierin vorhandenen Tabellen werden zur Unterscheidung von Desoxy- und Ribonukleotiden ferner Großbuchstaben (für dNTPs) und Klein buchstaben (für rNTPs) verwendet.

Ferner hat sich gezeigt, daß chimäre DNA/RNA Hammerkopf-Ribozyme eine erhöhte katalytische Effizient und Sta bilität aufweisen (N. R. Taylor et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 4559-4565). Dieses Prinzip kann man erfin dungsgemäß insbesondere für Amplifikationsverfahren wie z. B. PCR ausnutzen, die bei höheren Temperaturen oder bei cyclischen Temperaturprofilen durchgeführt werden.

Zusätze wie z. B. das Protein GAP-DH (vgl. Sioud et al., J. Mol. Biol. 257 (1996) 775-789), kurze synthetische Pep tide, die vom Viral coat protein (vgl. Müller et al., J. Mol. Biol. 242 (1994) 422-429) abgeleitet sind oder die chemische Substanz CTAB (Netbal et al., Biochemistry 36 (1997) 13552-13557) sind geeignet, die Effektivität des Verfahrens im Hinblick auf das Auffinden von in großen Nukleinsäure-Strukturen "versteckten" Targets, d. h. Ribozym-Motiven, zu er höhen.

Auf Basis der vorliegenden Erfindung ist es erstmals möglich, mehrere verschiedene Targets simultan durch Verwen dung entsprechender Ribozym-Sonden mit unterschiedlichen Reporter-Farbstoffen nachzuweisen. Dabei sind Sequenz spezifische Sonden . erforderlich, die selektiv an den jeweils nachzuweisenden Target-Nukleinsäuren anhaften und bei Ribozym-Spaltung Fluoreszenz-Signale unterschiedlicher Wellenlänge erzeugen. Beispielsweise ist es möglich, den Quencher DABCYL mit Reporter-Farbstoffen, wie z. B. Cumann (Fluoreszenzemission bei 475 nm), FAM (Fluores zenzemission bei 515 nm), BODIPY (Fluoreszenzemission bei 525 nm), TAMRA (Fluoreszenzemission bei 575 nm), Texas red (615 nm), CY-5 (674 nm) usw., zu kombinieren (vgl. Tyagi et al., Nature Biotech. 16 (1998) 49-53). Mit die sem sogenannten "Multiplexing" ist es somit möglich, innerhalb eines Reaktionsansatzes gleichzeitig eine Target-RNA sowie mehrere Referenzproben bekannter Konzentration, deren Sequenzen sich im Primer-bindenden Abschnitt jeweils geringfügig voneinander unterscheiden, zu amplifizieren, wobei durch Sequenzspezifische Sonden, die unterschiedliche Reporter/Quencher-Kombinationen tragen, eine Quantifizierung erfolgen kann, ohne daß getrennte Amplifikationen und Fluoreszenzmessungen mit den RNA-Referenzproben durchgeführt werden müssen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung der oben genannten Verfahren, der entweder

a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure-Sequenz, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 40 Nu kleotiden, angehängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (oder 5'-CUGANGA-3') im Transkript kodiert,
b) einen weiteren Amplifikationsprimer,
c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung der Amplifikationsreaktion,
d) eine Nukleinsäure-Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (oder 5'-GAAA-3') enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt,

oder

a) zwei Amplifikationsprimer,
b) Enzyme zur Durchführung der Amplifikation,
c) eine Nukleinsäure-Sonde vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (oder 5'-GAAA-3') enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, sowie gegebenenfalls
d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel

umfaßt.

Gemäß einem Teilaspekt der vorliegenden Erfindung werden erstmals ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäu ren sowie Kits zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung gestellt.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA- 3' (Motiv A) oder das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthalten, bei dem man eine die Nukleinsäure enthal tende Probe mit einer Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nu kleotide) in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wo bei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweisen muß und man die Nukleinsäure durch Erhalt eines der Wahl der Reporter- und Quencher-Moleküle entsprechendes Fluoreszenz signals nachweist.

Ein erfindungsgemäßer Kit zur Durchführung dieses Nachweisverfahrens umfaßt neben zur Durchführung der Reak tion erforderlichen Lösungsmittel und Reagenzien eine Sonde, vorzugsweise mit einer Länge von 25 bis 60 Nukleotiden (besonders bevorzugt etwa 50 Nukleotide), die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül (s. o.) angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz auf weist.

Für den Fall, daß die Target-Nukleinsäuren keines der Sequenzmotive A oder B enthalten, kann die Nukleinsäure nachgewiesen werden, indem eines der Motive z. B. durch Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung eines oben ge nannten Primers eingeführt wird. Zur Detektion ist eine entsprechende doppelt fluoreszenzmarkierte Sonde (s. o.) erfor derlich, die ein zur Ribozym-Bildung geeignetes Sequenzmotiv enthält.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Kits wird - mit oder ohne Einsatz einer Nukleinsäure-Amplifikation - eine neue Methode zum Erreger-Nachweis zur Verfügung gestellt. Wie im folgenden angegeben enthält beispielsweise die 16S rRNA vieler Erreger-Spezies bereits natürlicherweise ein 5'-GAAA-3' Ribozym-Motiv, das zur Bildung des Ham merkopf-Ribozyms ausgenutzt werden kann. Falls die Nukleinsäuren der Erreger keine zur Ausbildung von Ribozymen geeignete Sequenzmotive enthalten können diese, wie oben angegeben, im Rahmen der Amplifikationsstufen durch Ver wendung entsprechender Primer eingeführt bzw. "addiert" werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Allgemeines Schema der NASBA® kombiniert mit Ribozymen zur Echtzeitdetektion.

Ribozym-Motiv innerhalb eines der zwei Primer. Es ist nur eine Möglichkeit gezeigt, bei der sich das Ribozym-Motiv am 3'-Ende der amplifizierten RNA befindet. Die RNA Substrat-Sonde ist mit einem Fluorezenzfarbstoffen markiert, dem Reporter (Kreis) und einem Quencher (Dreieck). In der intakten Sonde führt die effiziente Wechselwirkung beider Labels zum "FRET" or Quenching, d. h. zu keinem (or nur sehr schwachem) Reporter-Signal (leerer Kreis). Das Ribozym spal tet viele Sonden-Moleküle. In der gespaltenen Sonde werden beide Labels getrennt, und es wird ein starkes Reporter-Si gnal erzeugt (gefüllte Kreise).

Fig. 2A Allgemeine Struktur von Hammerkopf-Ribozymen. Es sind nur konservierte Nukleotide mit entsprechenden Buchstaben bezeichnet, alle nicht-konservierten Positionen sind mit N angegeben. Die Länge der hybridisierenden Arme können den jeweiligen Erfordernissen angepaßt werden. Drei Orte möglicher Hairpin-Schleifen sind durch gepunktete Linien dargestellt. Die Polarität (5'-3' Richtung) ist nur für den gespaltenen Abschnitt angegeben. B: Entspricht Fig. 2A, wobei die Positionen, an denen vorzugsweise Ribonukleotide eingesetzt werden mit dem Präfix "r" versehen sind, die üb rigen Nukleotide können jeweils entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide sein.

Fig. 3 Eine Möglichkeit zur Aufspaltung eines minimalen Ribozyms und einer Nukleinsäure-Substrat-Sonde. Das konservierte Ribozym-Motiv wurde auf GAAA verkürzt.

Fig. 4 A: Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit ist eine amplifizierte Nukleinsäure (dicke Linie) mit dem minimalen Ribozym-Motiv gezeigt. Die Nukleinsäure Substrat-Sonde enthält Reporter und Quencher (einige we nige Möglichkeiten sind unten angegeben) an beiden Enden, sie können aber auch mit anderen Positionen verknüpft wer den. B: Entspricht Fig. 4A, wobei die Positionen, an denen vorzugsweise Ribonukleotide eingesetzt werden mit dem Prä fix "r" versehen sind, die übrigen Nukleotide können jeweils entweder Ribo- oder Desoxyribonukleotide sein.

Fig. 5 Eine weitere Möglichkeit zur Aufspaltung einer Nukleinsäure-Substrat-Sonde. Das konservierte Ribozym-Mo tiv ist auf CUGA-N-GA reduziert.

Fig. 6 Basierend auf der in Fig. 5 dargestellten Möglichkeit ist eine amplifizierte Nukleinsäure (dicke Linie) mit dem minimalen Ribozym-Motiv gezeigt. Die Nukleinsäure Substrat-Sonde enthält Reporter und Quencher an beiden Enden, sie können aber auch mit anderen Positionen verknüpft werden (vgl. Fig. 4).

Fig. 7 Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge des Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.

Fig. 8 Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifi zierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.

Fig. 9 Basierend auf der in Fig. 3 dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung, gefolgt von einem sehr kurzen 3'-terminalen basengepaarten Abschnitt. Wie gezeigt ist, kann dieser Ab schnitt mit dem Ribozym-Motiv überlappen, und die Ausbuchtung kann so kurz sein, daß sie nur ein Nukleotid umfaßt. Oben ist das Hybrid zwischen primärer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nu kleinsäure und die Länge beider Basenpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nuklein säure mit dem vollständigen Ribozym-Motiv ist unten gezeigt.

Fig. 10 Basierend auf der in Fig. 2B dargestellten Möglichkeit enthält der reverse Primer das Ribozym-Motiv in einer Ausbuchtung gefolgt von einer einzigen rA-T Basenpaarung mit der Target-Sequenz. Oben ist das Hybrid zwischen pri märer Target-Nukleinsäure und Primer gezeigt. Die Position innerhalb der Target-Nukleinsäure und die Länge beider Ba senpaar-bildenden Streches kann variieren. Die resultierende amplifizierte Nukleinsäure mit dem vollständigen Ribo zym-Motiv ist unten gezeigt.

Fig. 11 Entspricht der in Fig. 10 dargestellten Möglichkeit. Hier enthält die Target-Sequenz jedoch bereits einen län geren Stretch des Ribozym-Motivs (oder, wie gezeigt, des vollständigen Motivs).

Fig. 12 Beispielhafte Struktur eines DNAzyms (= katalytische DNA). Das Substrat kann entweder vollständig RNA sein, oder es muß ein Minimum an rA vorhanden sein.

Fig. 13 Beispielhafte Struktur eines weiteren DNAzyms. Das Substrat kann entweder vollständig RNA sein, oder es muß ein Minimum an rKrY vorhanden sein.

Fig. 14 Entspricht Fig. 10, wobei der Primer den überwiegenden Teil des NAzym-Motivs (des katalytischen Nukle insäure-Motivs) enthält und nur die zwei letzten Nukleotide fehlen. Gezeigt ist hier eine Möglichkeit basierend auf "Pro totyp A". Für "Prototyp B" ermöglicht das Vorliegen längerer Motive (z. B. TCGTTG statt TCGT) ein deletierteres Mo tiv im Primer einzusetzen, wobei das 3'-terminale ACGA im elongierten Primer durch die Target-Sequenz geliefert wird.

Fig. 15 Beispiel für eine universelle Ribozym-Sonde.

Fig. 16 Beispiel für eine HIV Ribozym-Sonde.

Fig. 17A-C Für die erfindungsgemäße Echtzeitdetektion als Reporter/Quencher geeignete Farbstoffe.

BEISPIELE Material

Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Primer und Sonden sind auf dem Fachmann geläufigem Wege erhältlich, wie z. B. durch Oligonukleotidsynthese.

Beispiel 1 NASBA®-Reaktion in Kombination mit Ribozym-abhängiger Detektion

Alle Enzyme waren kommerziell von Pharmacia erhältlich, ausgenommen AMV-Reverse Transkriptase, die von Sei kagaku bezogen wurde.

23 µl NASBA® Reaktionsmischung, davon 5 µl aus der Aufreinigung nach Boom et al. (J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503) (finale Konzentration in 25 µl Reaktionsmischung: 40 mM Tris, pH 8,5, 12 mM MgCl₂, 42 mM KCl, 15% v/v DMSO, 1 mM jedes dNTP, 2 mM jedes NTP, 0,2 µM Primer 1, 0,2 µM Primer 2 und 0,1-0,5 µM Substrat-Sonde) wurden bei 65°C für 5 Minuten inkubiert um eine Destabilisation der Sekundärstrukturen in der RNA zu ermöglichen. Anschlie ßend wurde für das Primer-Annealing auf 41°C abgekühlt. Die Amplifikation wurde durch Zugabe von 2 µl Enzym-Mi schung (0,1 µg/µl BSA, 0,1 Einheiten RNase H, 40 Einheiten T7 RNA Polymerase und 8 Einheiten AMV Reverse Tran skriptase) gestartet. Die Reaktion wurde bei 41°C für 90 Minuten inkubiert. Während der Reaktion wurden die Fluores zenzsignale im ABI Prism 7700 Sequence Detector gemessen. Als Reporter/Quencher wurde die Kombination FAM/ TAMRA eingesetzt.

Experiment A

Primer 1: 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
Primer 2: 5'-GAA TCT CAT CAG TAG CGA GTG GGG GGA CAT CAA GCA GCC ATG CAA A-3'
Substrat A: 5'-TAMRA-Tga auc gaa acg cga aag cgu cua gcg u-FAM-3'

Experiment B

Primer 1: 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA-3'
Primer 2: 5'-ACG TAG TUT CGG CCT TTC GGC CTC ATC AGC GTG CAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CCA TGC AAA-3'
Substrat B: 5'-TAMRA-Tac gua guc cgu gcu-FAM-3'

Quantifizierung

Zur quantitativen Bestimmung der HIV-RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrollen, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mittels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzentration der Standards betrug:
Q1 ca. 1000000 Moleküle (RNA)
Q2 ca. 100000 Moleküle (RNA)
Q3 ca. 10000 Moleküle (RNA)
Q4 ca. 1000 Moleküle (RNA)

Die Experimente A und B führten zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Re porterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Molekül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 15 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Si gnal erreicht wurde (5 × Std. dev. des Backgrounds). Die weiteren Standards erreichten nach t = 20, 24 und 26 Minuten den entsprechenden Schwellenwert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Mo lekülmenge von ca. 200000 (t = 18) bzw. 15000 (t = 23). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekülen durch die hier beschriebene Technik möglich ist.

Beispiel 2

Universelle Erkennung beliebiger (full-size) amplifizierter RNA-Targets (ribozyme motive in reverse primer). Die entsprechende "Universelle Ribozym-Sonde" wurde dem NASBA®-Amplifikationskit zugesetzt.

An seinem 3'-Ende enthält der reverse Primer die übliche Target-specifische Sequenz (N) und zusätzlich an seinem 5'- Ende eine Sequenz, die für das allgemeine universelle Ribozym-Motiv codiert:
5'-GCG TTT CGA TTC CNN NNN N . . .

Das Transcript endet mit der Sequenz
5' . . . N NNN NNG GAA UCG AAACGC

Die Ribozym-Sonde wies folgende Sequenz auf:
5'-GCG UC - U AGC GGA AAC GCU ACU GAX GAG AUU CC (32-mer) - Spaltungsort

Zwei Farbstoffe, 5'-Q and 3'-R (oder 3'-Q und 5'-R) waren mit den Enden verknüpft.

Zur quantitativen Bestimmung der HIV RNA wurden 4 externe Kontrollen und 2 unbekannte Proben sowie 2 negative Kontrollen, in die oben beschriebene Amplifikation eingesetzt. Mittels der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die Konzentration der Standards betrug:
Q1 ca. 1000000 Moleküle (RNA)
Q2 ca. 100000 Moleküle (RNA)
Q3 ca. 10000 Moleküle (RNA)
Q4 ca. 1000 Moleküle (RNA)

Das Experiment in Beispiel 2 führte zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Re porterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Molekül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 12 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Si gnal erreicht wurde (5 × Std. dev. des Backgrounds). Die weiteren Standards erreichten nach t = 18, 22 und 25 Minuten den entsprechenden Schwellenwert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Mo lekülmenge von ca. 100000 (t = 18) bzw. 8000 (t = 23). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekülen durch die hier beschriebene Technik möglich ist.

Diese Beispiel-Sonde kann an einem oder beiden Enden durch mehr Basen-gepaarte Nukleotide verlängert sein.

Beispiel 3

Spezifische Erkennung einer amplifizierten Target Sequenz: proximal zu einem der Primer.

Das vorliegende spezifische Beispiele anhand einer NASBA®-gestützten Detektion von HIV (entspr. USP 5,837,501) durchgeführt.

Amplifiziertes Segment der HIV RNA

(es ist nur ein Strang gezeigt, die Primer-Sequenzen sind unterstrichen). Die proximale Sequenz ist ebenfalls hoch kon serviert und schließt den folgenden Abschnitt ein:

Der Vorwärtsprimer zur Einführung der T7 Promotor-Sequenz (Großbuchstaben) and 1 Punktmutation (fettgedruckter Großbuchstabe):

Das Transkriptionsprodukt enthält das GAAA Ribozym-Motiv, das mit der proximalen HIV-spezifischen Sequenz ver knüpft ist:

Es kann insbesondere mit der komplementären Ribozym-Sonde, entsprechend dem allgemeinen Versuchsprotokoll durchgefährt werden.

Das Experiment in Beispiel 3 führte zu folgendem Ergebnis: Die im ABI PRISM 7700 gemessene Fluoreszenz des Re porterfarbstoffs FAM, nahm entsprechend der eingesetzten Menge an Target-Molekül (RNA) zu. Es zeigte sich, daß nach t = 22 Minuten bei der höchsten eingesetzten Standard-Molekül-Menge der Schwellenwert für ein definiert positives Si gnal erreicht wurde (5 × Std. dev. des Backgrounds). Die weiteren Standards erreichten nach t = 24, 28 und 33 Minuten den entsprechenden Schwellenwert. Die unbekannten Proben erreichten nach ca. t = 18 und t = 23 Minuten ihren Schwellenwert. Anhand der mittels der Standards erstellten Eichkurve ergab sich für die unbekannten Proben eine Mo lekülmenge von ca. 400000 (t = 23) bzw. 10000 (t = 28). Die Negativkontrollen erreichten den Schwellenwert nicht. Dies zeigt, daß eine Quantifizierung von Targetmolekülen durch die hier beschriebene Technik möglich ist.

Beispiel 4 A. GAAA in rRNA-Abschnitten zur spezifischen Detektion von Bakterien-Spezies

In den obigen Tabellen sind die wichtigsten, durch Lebensmittel übertragene Pathogene aufgeführt.

Einzigartige Sequenzmotive (schattiert) liegen zwischen den Positionen 110 and 700 (gemäß E. coli Numerierungssy stem) vor.

Hoch-konservierte Primer zur 16S rRNA-Amplifikation sind bekannt: 110f and 700r [Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds. (New York: Willey), pp. 115-175].

B. Spezifischen Detektion von Sepsis-Erregern

In den obigen Tabellen sind ferner die wichtigsten Sepsis-Erreger aufgeführt.

Einzigartige Sequenzmotive (schattiert), die erfindungsgemäß ausgenutzt werden können liegen zwischen den Posi tionen 110 and 530 (gemäß E. coli Numerierungssystem) vor. Hoch-konservierte Primer zur 16S rRNA-Amplifikation sind bekannt: [Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow, eds. (New York: Willey), pp. 115-175].

Die in der 16S rRNA enthaltenen Sequenzmotive können für die erfindungsgemäßen Verfahren ausgenutzt werden, so daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verfahren zum Nachweis von Erregern, insbesondere von Sepsis-Er regern und Lebensmittelkeimen, und dafür vorgesehene Kits zur Verfügung gestellt werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitde tektion von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Se quenz mit einer Länge von bis zu 40 Nukleotiden ange hängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert, man
b) einen weiteren Primer verwendet, wobei man
c) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde durchführt, die das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Sondenmo lekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül an gehängt sind, wobei
d) die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv A enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv B enthaltenden Sonde ermöglicht, und man
e) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "c_rel." nach folgender Formel bestimmt:
c_rel. = t_P/t_Ref.,
wobei
t_P der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
t_Ref. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Kon zentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Errei chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.

2. Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitde tektion von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Primer verwendet, an den eine Nukleinsäure-Se quenz mit einer Länge von bis zu 40 Nukleotiden, ange hängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Mo tiv B) im Transkript kodiert, man
b) einen weiteren Primer verwendet, wobei man
c) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde durchführt, die das Sequenzmotiv 5'- GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei
d) die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv B enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv A enthaltenden Sonde ermöglicht, und man
e) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "c_rel." nach folgender Formel bestimmt:
c_rel. = t_P/t_Ref.,
wobei
t_P der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
t_Ref. der für eine Referenz-Nukleinsäure bekannter Kon zentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Errei chen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.

3. Verfahren zur Amplifikation und quantitativen Echtzeitdetek tion einer das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthalten den Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der Motiv A enthält, amplifiziert wird, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde durchführt, die das Sequenzmotiv 5'- CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Son denmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Mole kül angehängt sind, wobei
c) die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv A enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv B enthaltenden Sonde ermöglicht, und man
d) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "c_rel." nach folgender Formel bestimmt:
c_rel. = t_P/t_Ref.,
wobei
t_P der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
t_Ref. der für eine Referenz-RNA bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluo reszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.

4. Verfahren zur Amplifikation und zum quantitativen Nachweis einer das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthaltenden Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Sequenzen der verwendeten Primer so wählt, daß der Sequenzbereich der Nukleinsäure, der Motiv B enthält, amplifiziert wird, wobei man
b) die Amplifikation in Gegenwart eines Überschusses einer Nukleinsäure-Sonde durchführt, die das Sequenzmotiv 5'- GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmole kül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei
c) die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv B enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv A enthaltenden Sonde ermöglicht, und man
d) die ursprüngliche Konzentration der Nukleinsäure in der Probe durch Messen der zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz während der Amplifikation bestimmt, wobei man die relative Konzentration "c_rel." nach folgender Formel bestimmt:
c_rel. = t_P/t_Ref.,
wobei
t_P der für die Probe ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluoreszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht und
t_Ref. der für eine Referenz-RNA bekannter Konzentration ab Beginn der Amplifikation bis zum Erreichen des Fluo reszenz-Schwellenwerts gemessenen Zeit entspricht.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA- Chimär ist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäure- Sequenz eine Länge von bis zu 40 Nukleotiden aufweist.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 5 und 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die zu amplifizierende Nukleinsäure HIV-RNA ist und der Primer die Sequenz 5'-GCG TTT CGA TTC CNN NNN N . . . -3' aufweist, wobei er an seinem 3'-Ende eine Target- spezifische Sequenz (N) enthält oder der Primer die Sequenz 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CTA TGG AAA-3' aufweist.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden hat.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von etwa 50 Nukleotiden hat.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde die Sequenz 5'-[Q]-GCGU(rC)UAGCGGAAACGCUA CU(rG)AX(rG)(rA)GAUUCC-[R]-3' aufweist, wobei [Q] ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR ist, [R] ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET und ALEXA ist, X Pyridin-4-on ist und (rA), (rC) und (rG) Ribonukleotide sind oder die Sonde die Sequenz 5'-[FAM]-UUUUAAC(G/A)U(rC)UAGCGGAAACGCUACU(rG)AX(rG)(rA)CAU AGCUGC-[DABCYL]-3' aufweist, wobei X Pyridin-4-on ist und (rA), (rC) und (rG) Ribonukleotide sind.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß das Amplifikationsverfahren eine isothermes oder cyclisches Amplifikationsverfahren ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren aus der Gruppe bestehend aus NASBA®, TMA, 3SR, oder PCR ausgewählt ist.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeich net, daß man als Reporter einen Farbstoff aus der Gruppe be stehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und als Quencher einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR verwendet.

14. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmo tiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Repor ter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist und die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv A enthaltenden Sequenzabschnitt der Nukleinsäure und der das Motiv B enthaltenden Sonde ermöglicht.

15. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, die das Sequenzmo tiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) enthalten, bei dem man eine die Nukleinsäure enthaltende Probe mit einer Sonde in Kontakt bringt, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind, wobei die Sonde eine zur Hybridisierung mit der nachzuweisenden Nukleinsäure ge eignete Sequenz aufweist und die Sequenz der Nukleinsäure- Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf- Ribozyms aus dem das Motiv B enthaltenden Sequenzabschnitt der Nukleinsäure und der das Motiv A enthaltenden Sonde ermöglicht.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA-Chimär ist.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekenn zeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden hat.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von etwa 50 Nukleotiden hat.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Reporter einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und als Quencher einen Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR verwendet.

20. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure- Sequenz mit einer Länge von bis zu 40 Nukleotiden ange hängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-GAAA-3' (Motiv A) im Transkript kodiert,
b) einen weiteren Amplifikationsprimer,
c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung einer Nuklein säure-Amplifikation,
d) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-CU GANGA-3' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Sondenmole kül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt ist, sowie gegebenenfalls
e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel

umfaßt, wobei die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv A enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv B enthaltenden Sonde ermöglicht.

21. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) einen Amplifikationsprimer, an den eine Nukleinsäure- Sequenz mit einer Länge von bis zu 40 Nukleotiden ange hängt ist, die für das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) im Transkript kodiert,
b) einen weiteren Amplifikationsprimer,
c) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung einer Nuklein säure-Amplifikation,
d) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA- 3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt ist, sowie gegebenenfalls
e) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel

umfaßt, wobei die an den ersten Primer angehängte Nuklein säure-Sequenz und die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt sind, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv B enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv A enthaltenden Sonde ermögli chen.

22. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) zwei Amplifikationsprimer,
b) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung einer Nuklein säure-Amplifikation,
c) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-CU GANGA-3' (Motiv B) enthält, wobei an jedes Sondenmole kül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt ist, sowie gegebenenfalls
d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel

23. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) zwei Amplifikationsprimer,
b) Enzyme und Reagenzien zur Durchführung einer Nuklein säure-Amplifikation,
c) eine Nukleinsäure-Sonde, die das Sequenzmotiv 5'-GAAA- 3' (Motiv A) enthält, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt ist, sowie gegebenenfalls
d) für die Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel

umfaßt, wobei die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv B enthaltenden Sequenzabschnitt des Transkripts und der das Motiv A enthaltenden Sonde ermöglicht.

24. Kit nach den Ansprüchen 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure RNA, DNA oder ein DNA/RNA-Chimär ist.

25. Kit nach den Ansprüchen 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die an den Primer angehängte Nukleinsäure-Sequenz eine Länge von bis zu 40 Nukleotiden aufweist.

26. Kit nach den Ansprüchen 20, 24 und 25, dadurch gekennzeich net, daß die zu amplifizierende Nukleinsäure HIV-RNA ist und der Primer die Sequenz 5'-GCG TTT CGA TTC CNN NNN N . . . -3' aufweist, wobei er an seinem 3'-Ende eine Target-spezifische Sequenz (N) enthält oder der Primer die Sequenz 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CTA TGG AAA-3' aufweist.

27. Kit nach den Ansprüchen 20 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Sonde eine Länge von 25 bis 60 Nukleotiden hat.

28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Nu kleinsäure-Sonde eine Länge von etwa 50 Nukleotiden hat.

29. Kit nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde die Sequenz 5'-[Q]-GCGU(rC)UAGCGGAAACGCUA CU(rG)AX(rG)(rA)GAUUCC-[R]-3' aufweist, wobei [Q] ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR ist, [R] ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET und ALEXA ist, X Pyridin-4-on ist und (rA), (rC) und (rG) Ribonukleotide sind oder die Sonde die Sequenz 5'-[FAM]-UUUUAAC(G/A)U(rC)UAGCGGAAACGCUACU(rG)AX(rG)(rA)CAU AGCUGC-[DABCYL]-3' aufweist, wobei X Pyridin-4-on ist und (rA), (rC) und (rG) Ribonukleotide sind.

30. Kit nach den Ansprüchen 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren eine isothermes oder cycli sches Amplifikationsverfahren ist.

31. Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsverfahren aus der Gruppe bestehend aus NASBA®, TMA, 3SR, oder PCR ausgewählt ist.

32. Kit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Kit zur Durchführung einer NASBA® ist, wobei die Enzyme Reverse Transkriptase, T7 RNA Polymerase und RNase H sind oder deren Aktivität aufweisen.

33. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Sonde sowie gegebenenfalls weitere zur Durchführung der Reaktion erforderliche Geräte und Hilfsmittel umfaßt, wobei die Sonde das Sequenzmotiv 5'-CUGANGA-3' (Motiv B) oder 5'-GAAA-3' (Motiv A) enthält, eine zur Hybridisierung mit der nachzu weisenden Nukleinsäure geeignete Sequenz aufweist und die Sequenz der Nukleinsäure-Sonde so gewählt ist, daß sie die Bildung eines Hammerkopf-Ribozyms aus dem das Motiv A oder Motiv B enthaltenden Sequenzabschnitt der Nukleinsäure und der das Motiv B oder Motiv A enthaltenden Sonde ermöglicht, wobei an jedes Sondenmolekül ein Reporter-Molekül und ein Quencher-Molekül angehängt sind.

34. Kit nach den Ansprüchen 20 bis 33, dadurch gekennzeichnet, der Reporter ein Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET, ALEXA, Texas Red, Light Cycler Red, IRD 700, CY-7, IRD 41 oder La Jolla Blue und der Quencher ein Farbstoff aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR ist.

35. Nukleinsäure-Amplifikationsprimer, dadurch gekennzeichnet, daß er die Sequenz 5'-GCG TTT CGA TTC CNN NNN N . . . -3' aufweist, wobei er an seinem 3'-Ende eine Target-spezifische Sequenz (N) enthält.

36. Nukleinsäure-Amplifikationsprimer, dadurch gekennzeichnet, daß er die Sequenz 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG TGG GGG GAC ATC AAG CAG CTA TGG AAA-3' aufweist.

37. Nukleinsäuresonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz 5'-[Q]-GCGU(rC)UAGCGGAAACGCUACU(rG)AX(rG)(rA)GA UCC[R]-3' aufweist, wobei [Q] ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus TAMRA, CY-5, DABCYL, und LCR ist, [R] ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus FAM, HEX, TET und ALEXA ist, X Pyridin-4-on ist und (rA), (rC) und (rG) Ribonukleo tide sind.

38. Nukleinsäuresonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz 5'-[FAM]-UUUUAAC(G/A)U(rC)UAGCGGAAACGCUACU(rG)AX- (rG)(rA)CAUAGCUGC-[DABCYL]-3' aufweist, wobei X Pyridin-4-on ist und (rA), (rC) und (rG) Ribonukleotide sind.