DE60121342T2

DE60121342T2 - Einfach markierte oligonukleotidsonden

Info

Publication number: DE60121342T2
Application number: DE60121342T
Authority: DE
Inventors: T. Carl Salt Lake City WITTWER; O. Andrew West Valley CROCKETT; E. Brian Salt Lake City CAPLIN; Wade West Jordan STEVENSON; A. Lori Salt Lake City WAGNER; Jian Sandy CHEN; Noriko Salt Lake City KUSUKAWA
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Idaho Technology Inc
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Biofire Defense LLC
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-08-11
Also published as: JP5213297B2; ES2267803T3; WO2002014555A2; CA2417986A1; US20030022177A1; WO2002014555A3; DE60121342D1; ATE332398T1; CA2417986C; EP1307592A2; US6635427B2; EP1307592B1; JP2004506431A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum homogenen Nachweis und Test von Nukleinsäuresequenzen mit einfach markierten Oligonukleotidsonden, deren Fluoreszenzemission sich als Reaktion auf Sonden-Target-Hybridisierung und -Dissoziation ändert, und insbesondere Verfahren zum Test von ein oder mehreren Nukleinsäureloci mit diesen Sonden. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Veränderungen in der Fluoreszenz bei einfach markierten Sonden zur Schmelzkurvenanalyse, zur Genotypisierung und zum Nachweis von Pathogenen sowie ein Verfahren zur Quantifizierung spezifischer Sequenzen beim Echtzeit-Monitoring einer Nukleinsäureamplifikation.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
Die Sondenhybridisierung ist ein zum Nachweis, zur Analyse und zur Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen weithin übliches Verfahren. Gewöhnlich verwendete Methoden umfassen Southern-Hybridisierung, Dot Blotting, Gelshift-Assays und lösungsbasierte homogene Tests und sind oft mit Polymerasekettenreaktion (PCR) gekoppelt. Die grundlegenden Geräte, die für diese Methoden verwendet werden, umfassen Elektrophoresegele, auf Oberflächen von Glasträgern, Kügelchen, Membranen oder Mikrotiterplatten immobilisierte DNA-Arrays, sowie Apparaturen für homogene Tests, beispielsweise das LightCycler-System (Roche Molecular Biochemicals), das Sequenznachweissystem ABI PRISM7700 (PE Applied Biosystems) und das iCycler-System (Bio-Rad Laboratories). Homogene Tests, mit Amplifikationsverfahren gekoppelte Nachweisverfahren, führen Amplifikation und Analyse in einem kontinuierlichem Ablauf durch, wodurch ein Transfer der Proben zwischen den beiden Verfahren vermieden oder minimiert wird. Ein Schlüsselelement der Funktionsweise homogener Tests ist ein bei der Hybridisierung von Sonde und Target erzeugtes Reportersignal, das, ohne dass freie Sonden weggewaschen werden müssen, nachweisbar ist.
Derzeitige homogene Tests verwenden entweder an Nukleinsäuren bindende Farbstoffe wie Ethidiumbromid und SYBR Green I als Reportermoleküle (Higuchi, U.S. Patent-Nr. 5,994,056 und Wittwer et al., U.S. Patent-Nr. 6,174,670) oder mindestens zwei auf Sonden immobilisierte Fluorophore. Die beiden Fluorophore können entweder einzeln an getrennte Oligonukleotide gebundene Donor-Akzeptor-Paare (U.S. Patent-Nr. 6,174,670 und DiCesare, U.S. Patent-Nr. 5,716,784) oder an ein einziges Oligonukleotid gebundene Reporter-Quencher-Paare sein (Mayrand, U.S. Patent-Nr. 5,691,146, Pitner et al., U.S: Patent-Nr. 5,888,739 und Livak et al., U.S. Patent-Nr. 6,030,787). Homogene Tests, die an DNA bindende Farbstoffe verwenden, sind bequem, sie liefern jedoch nur eingeschränkt Informationen über die Sequenz. Verfahren, die auf Systemen mit zwei Farbstoffen basieren, können, ungeachtet dessen, ob es sich bei den Farbstoffen um Donor-Akzeptor- oder Donor-Quencher-Kombinationen handelt, eine größere Nachweispezifität bieten und werden in Systemen wie dem „Hybridization Probe"-Assay (U.S. Patent-Nr. 6,174,670), dem Taqman-Assay (U.S. Patent-Nr. 5,691,146), dem „Molecular Beacon"-Assay (Tyagi et al., 1998. Nature Biotechnology, 4: 359–363) und dessen Varianten und dem "Scorpions"-Primersystem (Whitcombe et al., 1999, Nature Biotechnology, 17: 804–807) eingesetzt.
Bei Tests mit Hybridisierungssonden verwendet man zwei Oligonukleotidsonden zum Nachweis der Anwesenheit einer bestimmten Sequenz. Ein Reportersignal wird detektiert, wenn ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen dem Donorfarbstoff an einer Sonde und dem Akzeptor an der anderen Sonde erfolgt, nachdem die zwei Farbstoffe durch Annealing der Sonden mit dem Target in Nachbarschaft miteinander gebracht wurden Wenn die Sonden hybridisiert haben, kann die Fläche unter einer Sonde auf mögliche Sequenzabweichungen hin untersucht werden. Dies kann erreicht werden, indem man die Probe erhitzt und die Temperatur verfolgt, bei der aufgrund von Dissoziation (oder „Schmelzen") der Sonde ein Signalverlust auftritt. Sequenzabweichungen können durch einen Shift der Schmelztemperatur (Tm) gegenüber einer Referenzprobe nachgewiesen werden, und solche Tm-Verschiebungen lassen sich. mit Hilfe von Software-Berechnungen vorhersagen (Schütz et al., 1999, BioTechniques, 27: 1218–1224). Die Fläche unter der zweiten Sonde kann jedoch zu einer „Blindzone" werden, die nicht auf Sequenzabweichungen hin analysiert wird. Das Vorhandensein von Blindzonen kann problematisch sein, wenn große DNA-Segmente auf Sequenzabweichungen hin analysiert werden müssen und zahlreiche Sondenpaare verwendet werden müssen.
Beim Taqman- und „Molecular Beacon"-Assay wird jeweils eine einzige Oligonukleotidsonde eingesetzt, an die sowohl ein Reporter- als auch ein Quencherfarbstoff gebunden sind. Die Oligonukleotidsonde hybridisiert an die Target-Sequenz und der Reporter und der Quencher werden entweder durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase oder aufgrund von Konformationsänderungen bei der Hybridisierung an die Target-Sequenz getrennt. Bei den aktuelle Verfahren ist die Synthese dieser zweifach markierten Sonden relativ schwierig. Auch Taqman-Sonden liefern eine indirekte Messung der Hybridisierung, weil auch weiterhin ein Signal erzeugt wird, wenn der Reporter und der Quencher durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase voneinander getrennt sind.
Über Veränderungen der Fluoreszenzeffizienz von Fluorophoren mit anderen Mitteln als Energietransfer wurde berichtet. Verschiedene Farbstoffe der Fluoresceinfamilie sind pH-empfindlich und ihre Emissionsintensität nimmt bei pH-Werten unterhalb ihres pK_a ab und bei pH-Werten nahe ihrem pK_a oder oberhalb davon zu (Sjöback et al., 1995, Spectrochim Acta A 51, L7). Fluorescein wird ferner. durch Konjugation an Biopolymere um mehr als 50% gequencht (Der-Balian et al., 1988, Analytical Biochemistry, 173: 9). Dies sind generelle Fluoreszenzänderungen, die durch externe Faktoren ausgelöst werden. Es ist auch bekannt, dass das Annealing eines fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids mit seinem unmarkierten Komplementärstrang bei der Bildung von Duplex-DNA zum Quenching der Sondenfluoreszenz und einem Shift der Emissionswellenlänge führen kann (Cooper et al., 1990, Biochemistry, 29: 9261–9268; Lee et al., 1994, Analytical Biochemistry, 220: 377–383; und Yguerabide et al., Analytical Biochemistry, 241: 238–247). Änderungen der Fluoreszenzintensität wurden auch bei Verwendung von ungebundenem Farbstoff- und einzelnen Nukleotid- und Nukleosidmolekülen (Seidel et al., 1996, J. Phys. Chem., 100: 5541–5553), bei RNA-Substrat-Ribozym-Wechselwirkungen (Walter et al, 1997, RNA, 3: 392–404) und bei der Bildung von Nukleinsäureduplices mit Hilfe von mit asymmetrischen Cyaninfarbstoffen markierten Sonden gezeigt (Ishiguro et al., 1996, Nucleic Acids Research, 24: 4992–4997; und Svanvik et al., 2000, Analytical Biochemistry, 281: 26–35). Diese Literaturstellen lehren jedoch nicht die Konstruktion von Sonden, die sequenzabhängige Fluoreszenz ausnutzen.
Das Dokument EP0710668 (Becton Dickinson and Co., 18.07.1995) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Target-Nukleinsäure in einer biologischen Probe durch einen Hybridisierungsassay (Seite 2, Zeile 38–40) mit einer Oligonukleotidsonde, bei der der Fluoreszenzmarker an einen G-Rest gebunden ist (Seite 5, Zeile 10 und 23). Bei Hybridisierung nimmt die Fluoreszenzemission des Markers zu (Seite 3, Zeile 37–39).
Das Dokument WO98/26093 (US Govt., 18.06.1998) offenbart Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Target-Nukleinsäure mit Sonden mit einem einzigen Fluoreszenzmarker, umfassend die Amplifikation des Targets mit einem Primerpaar und den Nachweis der amplifizierten Produkte mit einer Sonde, deren Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung zunimmt (siehe Abstract und Seite 14–15).
Das Dokument WO97/28177 (Amersham International Plc., 07.08.1997) offenbart Oligonukleotide, die einen Fluoreszenzmarker umfassen, der an ein Basenanalogon gebunden ist (Seite 1–8). Die hier beschriebenen Analoga sind dafür ausgelegt, um entweder als endständiges Nukleotid (Beispiel 11 und 12) oder intern (Seite 5, Zeile 17–24) in Oligonukleotide eingebaut zu werden.
Das Dokument EP0754765 (LI-COR, Inc., 16.07.1996) offenbart eine Nukleinsäure, die im Wesentlichen aus einem einfach markierten Polynukleotid besteht, das eine Sequenz umfasst, die zu einem Locus der Target-Nukleinsäure komplementär ist, und einen Fluoreszenzmarker, der an ein basenanaloges Nukleotid gebunden ist, das ausgewählt ist aus 5-Nitroindol, 3-Nitropyrrol und Inosin (Seite 3, Zeile 27–34; Seite 4, Zeile 45–52; Seite 5, Zeile 22–24; und die Formeln 1–3 auf Seite 6). Die Nukleinsäure ist das Produkt des Sequenzierungsprozesses mit einem „Universalterminator", der nach den Ansprüchen einen an ein Basenanalogon gebundenen Fluoreszenzmarker umfasst. Dieses Sequenzierungsprodukt wird mit denaturierender Elektrophorese analysiert, d.h., es wird zum Nachweis in Einzelstrang-Konfiguration isoliert und ist daher als fluoreszenzbasierte Sonde zur Analyse einer Target-Nukleinsäure geeignet. Es tritt jedoch nicht unter Bildung einer Zusammensetzung mit dem Target in Kontakt.
Ein erster Aspekt der Erfindung sieht eine fluoreszenzbasierte Sondenzusammensetzung zur Analyse einer Target-Nukleinsäure vor, die im Wesentlichen besteht aus:
einer einfach markierten Polynukleotidsonde, welche eine Sequenz mit wenigstens 80% Homologie zu einem Locus der Target-Nukleinsäure und einen Fluoreszenzmarker umfasst, der an ein Nukleotid der Sonde gebunden ist, wobei das Nukleotid ein Basenanalogon ist, das ausgewählt ist aus 5-Nitroindol, 4-Nitroindol, 6-Nitroindol, 3-Nitropyrroldesoxynukleosiden, 5-Iodcytidin, Inosin und Nebularindesoxynukleosiden; und der Target-Nukleinsäure.
Das Nukleotid ist vorzugsweise ein endständiges Nukleotid oder ein innerer Rest.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe vor, umfassend:
Vereinigen einer einfach markierten Oligonukleotidsonde mit der Target-Nukleinsäure, wobei die Sonde eine Oligonukleotidsequenz mit wenigstens 80% Homologie zu einem Locus der Target-Nukleinsäuresequenz und einen Fluoreszenzmarker besitzt, der mit einem Nukleotid der Oligonukleotidsequenz verknüpft ist, wobei das Nukleotid ein Basenanalogon ist, das ausgewählt ist aus 5-Nitroindol, 4-Nitroindol, 6-Nitroindol und 5-Iod-2'-cytidin, und der Fluoreszenzmarker eine von der Hybridisierung abhängige Emission zeigt, und die Sonde eine von der Hybridisierung abhängige Zunahme der Fluoreszenzemission zeigt;
Bestrahlen der Sonde; und
Monitoring der von der Hybridisierung abhängigen Fluoreszenzemission.
Der Monitoringschritt umfasst vorzugsweise das Monitoring der Fluoreszenzabnahme nach Dissoziation der Sonde von der Target-Nukleinsäure.
Ein dritter Aspekt der Erfindung sieht einen Kit zur Analyse einer eine Nukleinsäuresequenz umfassenden Probe vor, umfassend:

(a) eine fluoreszierende Detektionseinheit, welche im Wesentlichen aus einer einfach markierten Oligonukleotidsonde mit einem Fluoreszenzmarker besteht, der mit einem endständigen Nukleotid des Oligonukleotids verknüpft ist, wobei das endständige Nukleotid ein Basenanalogon ist und wobei das Basenanalogon ausgewählt ist aus 4-Nitroindol, 5-Nitroindol, 6-Nitroindol, Inosin, 5-Iod-2'-cytidin, Nebularindesoxynukleosiden und 3-Nitropyrroldesoxynukleosiden, und wobei die Sonde für eine Hybridisierung an einen einzelsträngigen Locus der Nukleinsäuresequenz ausgelegt ist, so dass die Stärke der Fluoreszenzemission des Fluoreszenzmarkers durch Hybridisierung der Sonde an den Locus zunimmt; und
(b) Komponenten zur Amplifikation der Nukleinsäuresequenz, wobei die Komponenten ein zur Amplifikation eines Segments dieser Nukleinsäuresequenz ausgelegtes Paar Oligonukleotidprimer und eine thermostabile DNA-Polymerase umfassen.

Ferner umfasst der Kit vorzugsweise:
ein zweites Primerpaar, das zur Amplifikation eines zweiten Segments dieser Nukleinsäuresequenz, die einen zweiten einzelsträngigen Locus umfasst, ausgelegt ist; und
eine zweite fluoreszierende Detektionseinheit, welche im Wesentlichen aus einer zweiten einfach markierten Oligonukleotidsonde mit einem zweiten, mit einem zweiten Fluoreszenzmarker verknüpften Oligonukleotid besteht, wobei die zweite Sonde für eine Hybridisierung an den zweiten Locus ausgelegt ist, so dass die Stärke der Fluoreszenzemission des zweiten Fluoreszenzmarkers bei Hybridisierung der zweiten Sonde an die Target-Nukleinsäuresequenz zunimmt oder abnimmt.
Weitere Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden für einen Fachmann bei Betrachtung der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen ersichtlich, welche die beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung, wie sie derzeit verstanden wird, veranschaulichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Daten der Fluoreszenzerfassung für die drei in Tabelle 1 gezeigten Sets von Sonden und Targets, Set A (––––––), set B (------), Set C (–––-–––).
2 ist eine dF/dT-Diagramm der in 1 gezeigten Daten, wobei die Schmelzkurven in Schmelzpeaks umgerechnet wurden.
3 ist ein Diagramm von Zykluszahl gegen relatives Fluoreszenzquenching.
4A und 4B sind Diagramme von Schmelzkurvendaten für das Faktor V-Gen. 4A zeigt die Fluoreszenz gegen die Temperatur und 4B zeigt die erste Ableitung dF/dT.
5A und 5B zeigen Schmelzkurven für Mutationsanalysen durch Sonden-Multiplexing. 5A zeigt „Keine Fehlpaarung" gegen „Fehlpaarung" mit Fluoresceinsonde und 5B zeigt „Keine Fehlpaarung" gegen „Fehlpaarung" mit Quenchersonde oder mit beiden Sonden.
6 zeigt die homogene Echtzeit-Genotypisierung von Faktor V-Leiden (G1691A) mit einer im Inneren markierten Fluoresceinsonde, wobei die Schmelzkurvendaten als Diagramm der ersten Ableitung dargestellt sind. Gezeigt sind die Kurven für homozygoten Wildtyp (––––––), homozygote Mutante (------) und heterozygote Genotypen (.......).
7 zeigt die homogene Echtzeit-Genotypisierung von Faktor V-Leiden mit einer Fluorescein-Entquenchersonde. Die Schmelzkurvendaten sind als Diagramme der negativen ersten Ableitung für homozygoten Wildtyp, homozygote Mutante, heterozygote Genotypen und Negativkontrolle dargestellt.
Die 8A und 8B sind Diagramme der aus Schmelzkurven erhaltenen Peakflächen entweder gegen Puffer-pH (8A) oder Kationenkonzentration des Puffers (8B). Daten für die Quenchersonde (ausgefüllte Symbole) und für die Entquenchersonde (unausgefüllte Symbole) sind mit Pufferbedingungen von 10 mM Tris, 100–160 mM KCl (Quadrate); 10 mM Tris pH 8,3–8,8 (Kreise) und 10 mM 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 160 mM KCl (Dreiecke) gezeigt.
9 ist ein Diagramm der Schmelzkurvendaten für die Entquenchersonde, wobei Stärke und Richtung der Fluoreszenzänderung vom pH des Puffers beeinflusst werden. Es sind Kurven für Puffer mit pH 7,2, pH 7,7, pH 8,2 und pH 8,8 gezeigt.
10 ist ein Diagramm von Schmelzpeakfläche gegen Sonden-Tm.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Sonde in einem homogenen Testsystem verwendet, wobei Nachweis und Analyse von Nukleinsäuresequenzen zusammen mit der Amplifikation eines Target-Polynukleotids erfolgen. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Sonden unabhängig von der Targetamplifikation bei Tests zur Feststellung des Endpunkts verwendet werden. Die Bindungsstelle der einfach markierten Oligonukleotidsonden findet sich in der Regel im Inneren einer Target-Nukleinsäure, üblicherweise zwischen den Primern, die zur Amplifikation des Targets verwendet werden. Bei manchen Ausführungsformen jedoch findet die Hybridisierung der Sonde an die Target-Sequenz in der Nähe oder am Ende des Target-Sequenz statt, und bei manchen Ausführungsformen bildet sich bei der Sonden-Target-Hybridisierung ein stumpfes Ende aus, beispielsweise bei Verfahren, bei denen die Sonde auch als Primer zur Targetamplifikation fungiert.
Der Ausdruck „Oligonukleotid", wie er hier verwendet wird, umfasst lineare Oligomere aus natürlichen oder modifizierten Monomeren oder Bindungen, die Desoxyribonukleoside, Ribonukleoside, Proteinnukleinsäurenukleoside und dergleichen einschließen, die in der Lage sind, durch Basenpaarwechselwirkungen spezifisch an ein Target-Polynukleotid zu binden.
Der Ausdruck „einfach markiertes Oligonukleotid", wie er hier verwendet wird, umfasst Oligonukleotide mit einem einzigen Fluoreszenzmarker. Der Marker kann in verschiedener Weise an dem Oligonukleotid vorliegen, einschließlich gebunden an ein Ende des Phosphat-Zucker-Gerüsts oder eine Base des Oligonukleotids, oder der Farbstoff kann verwendet werden, um eine Base als Teil einer „virtuellen Nukleotid-Struktur" zu ersetzen. Der Ausdruck „einfach markiertes Oligonukleotid" schließt jedoch Konstrukte mit mehreren gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen, wie beispielsweise Tagman-Sonden, aus.
Wenn ein Oligonukleotid als Buchstabenfolge angegeben ist, bezeichnet, soweit nicht anders angegeben, „A" Desoxyadenosin, „T" Thymidin, „G" Desoxyguanosin und „C" Desoxycytidin. „(F)" bezeichnet einen Fluoreszenzmarker.
Der Ausdruck „Base", wenn er zur Kennzeichnung der Position in einem Oligonukleotid verwendet wird, umfasst Basenanaloga wie ein 5-Nitroindol-2-desoxynukleosid.
Der Begriff „komplementär" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die zusammen eine basengepaarte Doppelhelix bilden. Bei der Diskussion von Oligonukleotiden bezeichnet „komplementär" den Gegenstrang und bei der Diskussion einzelner Basen eines Oligonukleotids bezeichnet „komplementär" die Position oder Base auf dem Gegenstrang. „Im Allgemeinen komplementäre" Sequenzen sind zwei Nukleinsäuresequenzen mit wenigstens 80% Homologie. Solche Sequenzen haben also Fehlpaarungen, sind aber ausreichend homolog, um miteinander basengepaarte Doppelhelixstrukturen auszubilden.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren ändert sich bei einfach markierte Sonden bei der Bildung und Dissoziation einer Sonde-Target-Duplex die Effizienz (oder Intensität) der Fluoreszenzemission, wobei das Verfahren umfasst, die Sonde so zu positionieren, dass bestimmte Bedingungen bezüglich der Lage bestimmter Reste auf dem Target-Strang erfüllt sind.
In einem Vergleichsbeispiel ist der spezielle Rest ein einzelner G-Rest auf dem Target-Strang. Bei dieser Ausführungsform ist die Änderung der Fluoreszenz bei Duplexbildung und Duplexdissoziation am ausgeprägtesten, wenn das G, wie in nachfolgendem Diagramm gezeigt, gegenüber dem Fluoreszenzmarker (F) das erste überhängende Nukleotid darstellt (die vertikalen Linien bedeuten Basenpaarung):
Sonde oder
Target
Alle beide Positionen umfassen „Position +1". Fluoreszenzänderung, obschon geringer, ist auch zu beobachten, wenn G eine der folgenden Positionen einnimmt:
Position +2

Sonde oder
Target

Position 0

Sonde oder
Target
während einzelne G-Reste in Position +3 und Position –1, die unten gezeigt sind, wenig Einfluss auf die nachgewiesene Fluoreszenz haben.

Position –1

Sonde oder
Target

Position +3

Sonde oder
Target

Eine geringe Fluoreszenzänderung zeigte sich auch, wenn sich der G-Rest an Position +4 befindet.
Wenn sich mehr als ein G auf dem Target-Strang befindet, bewirken mehrere G-Reste an irgendeiner der Positionen 0, +1, +2, +3 und +4 eine Änderung der nachgewiesenen Fluoreszenz. Dies sind die „zugewiesenen (assigned) Positionen". Obwohl die obige Darstellung zugewiesener Positionen für G-Reste gezeigt ist, wird die gleiche Terminologie für die zugeordneten Positionen in der gesamten Beschreibung auch für andere Ausführungsformen verwendet.
In dieser Erfindung kann eine große Vielzahl von Fluorophoren als Marker für Sonden verwendet werden. Solche Gruppen umfassen Fluorescein und dessen Derivate, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, JOE, FAM, Rhodamine, Alexa Fluor 488, Oregon Green-Farbstoffe, Erythrosine und Eosine, Fluorescein-Cyanin-Konjugate wie Big Dyes und Derivate der Bispyrromethen-Bordifluorid-Farbstoffe wie BODIPY. Wenn diese Farbstoffe an Oligonukleotidsonden gebunden werden, wird die Fluoreszenz üblicherweise beim Annealing der Sonde mit ihrem komplementären Target-Strang gequencht, wenn das Target an der oder den zugewiesenen Position(en) G-Reste aufweist. Wie oben ausgeführt, kann man die Richtung der Fluoreszenzänderung jedoch umkehren, wenn man das Fluorophor an einem G-Rest an die Sonde bindet, vorzugsweise dann, wenn es keine anderen Gs an zugewiesenen Positionen auf dem Komplementärstrang gibt.
In ähnlicher Weise sieht man in einer Ausführungsform der Erfindung eine Zunahme der Fluoreszenz, wenn das Fluorophor an ein „Basenanalogon", beispielsweise 5-Nitroindol-2'-desoxynukleosid, gebunden ist. Generell eignen sich auch Basenanaloga wie 5-Nitroindol, 4-Nitroindol, 6-Nitroindol und 3-Nitropyrroldesoxynukleoside, die eine relativ stabile Paarbildung mit normalen Basen zeigen. Andere Basenanaloga wie Inosin, 5-Iod-2'-cytidin und Nebularindesoxynukleoside zeigen mit den normalen Basen schwache Basenpaarung, und um eine Fluoreszenzänderung bei Duplexbildung und -dissoziation beobachten zu können, ist es in der Regel erforderlich, dass sich kein G-Rest an Position +1 befindet.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Fluorophore aus der Gruppe der Cyanindimere und -monomere wie TOTO, YOYO, TO-PRO, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 usw. oder Farbstoffe wie LCRed 705 als Fluoreszenzfarbstoff verwendet werden. Man hat gefunden, dass Sonden, die diese Fluoreszenzfarbstoffe beinhalten, bei Sondenhybridisierung eher eine Zunahme der Fluoreszenz als ein Quenching zeigen.
Erfindungsgemäße Kits enthalten Sonden, die mit einem einzigen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Die Kits können zum Nachweis der An- oder Abwesenheit bestimmter Nukleinsäuresequenzen in einer Probe oder bei oder nach Herstellung des Targets in einem Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise PCR, verwendet werden. Ein Multiplexing mehrerer Sonden kann durch Tm, Farbe oder durch die Richtung der Fluoreszenzänderung erfolgen. Der Nachweis vielfarbiger Reportersignale könnte durch Anregung bei einer einzelnen Wellenlänge oder Anregung bei verschiedenen Wellenlängen erreicht werden. Die Kits können ferner zur quantitativen Analyse der anfänglichen Analytkonzentration eingesetzt werden.
Erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation des Targets umfassen im Stand der Technik bekannte, zur Amplifikation einer Nukleinsäure geeignete Methoden, vorausgesetzt, dass das Verfahren ein oder mehrere Target-Nukleinsäuresequenzen liefert, die an eine Oligonukleotidsonde hybridisieren können. Solche geeignete Methoden umfassen Polymerasekettenreaktion (PCR); Strangverdrängungsamplifikation (Strand Displacement Amplification, SDA); nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA); Cascade Rolling Circle Amplification (CRCA); Q-beta-Replikase-vermittelte Amplifikation; isotherme und chimäre primerinitiierte Amplifikation von Nukleinsäuren (Isothermal and Chimeric Primerinitiated Amplification of Nucleic acids, ICAN); transkriptionsvermittelte Amplifikation (Transcription Mediated Amplification, TMA) und dergleichen. Wenn der Ausdruck PCR verwendet wird, sind davon selbstverständlich auch andere alternative Amplifikationsverfahren umfasst.
Die Analyse kann bei der Amplifikation in einem homogenen Testsystem erfolgen. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 6,174,670. Alternativ dazu kann die Target-Nukleinsäure nach Amplifikation durch Schmelzkurvenanalyse untersucht werden. Andere Endpunkt-Analysen liegen ebenfalls im Rahmen der Erfindung und umfassen die Verwendung von Sonden, die immobilisiert sind oder mit nicht-fluoreszierenden Tags, wie Biotin, verwendet werden. Es versteht sich auch von selbst, dass auch eine amplifikationsunabhängige Nukleinsäureanalyse von der Erfindung umfasst wird. Wenn eine erfindungsgemäße Sonde in einem homogenen Test mit PCR verwendet wird, kann die Sonde komplementär zu einem zwischen den Primern liegenden Locus sein. Alternativ kann die Sonde selbst als einer der Primer fungieren.
Ein schneller und spezifischer Nachweis von Pathogenen kann mit einfach markierten Sonden mit Echtzeit-PCR und Schmelzkurvenanalyse nach der PCR erfolgen. Pathogene umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Salmonella, pathogene E. coli (wie E. coli O157:H7), Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio Cholerae und Clostridium botulinum. Zur PCR geeignete Proben können Lebensmittelproben, Fäkalien, Gewebehomogenat, Waschflüssigkeiten und andere beinhalten. Einfach markierte Sonden können auch zum Nachweis von Mutationen verwendet werden. Beispiele für Mutationen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Faktor V-Leiden, Mutationen von Hämoglobin C und S, die thermolabile Mutation von Methylentetrahydrofolatreduktase, die Faktor II-(Prothrombin) G20210A-Mutation, die Hämochromatose-assoziierten Mutationen C187G und G845A und die cystische Fibrose F508del-Mutation. Es versteht sich, dass diese Auflistungen nur beispielhaft und keinesfalls als vollständig anzusehen sind.
Vergleichsbeispiel 1
Beispiele für einfach markierte Sonden und Target-Sequenzen zum Quenchen von Guanin
Im Folgenden sind Beispiele für Sonden aufgeführt, die zum Nachweis einer Target-Sequenz oder zum Nachweis von Mutationen verwendet werden können. Ebenso werden Beispiele für Primer, die bei einer PCR eingesetzt werden können, gegeben.
Zum Nachweis von Salmonella kann ein DNA-Fragment aus dem SpaQ-Gen (GenBank Zugangs-Nr. U29364) mit PCR amplifiziert werden, beispielsweise mit den Primern SQF (5'TGGATGATTTAGTGTTTGC (SEQ ID NO: 1)), und SQR (5'CGCCCGTAAGAGAGTAAAAC (SEQ ID NO: 2)), wobei verschiedene Sonden zum Nachweis der Amplifikation verwendet werden können. Beispiele umfassen:
wobei der Fluoreszenzmarker entweder an das 3'- oder das 5'-Ende der Sonde gebunden ist. Bei den 5'-markierten Sonden kann eine Extension durch Zugabe eines 3'-Phosphats blockiert werden. Die obigen Sonden hybridisieren an eine der folgenden Target-Sequenzen
die in dem mit den Primern amplifizierten Segment enthalten ist. Je nachdem, welche Sonde verwendet wird, liefern diese Konstrukte G-Reste an den Positionen –1 und 0, 0 und +1 oder +1 und +2 auf dem Target-Strang. Je nachdem, welcher spezielle Fluoreszenzmarker verwendet wird, lässt sich bei Dissoziation der Sonde-Target-Duplex ein Quenching oder eine Verstärkung der Fluoreszenz beobachten. Durch Schmelzkurvenanalyse lässt sich beim Nachweis von Salmonella-Subspezien eine hohe Selektivität und Empfindlichkeit erreichen.
Schmelzkurvenanalyse kann während oder nach der PCR-Amplifikation erfolgen.
Genotypisierung der Faktor V-Leiden (G1691A)-Mutation kann mittels PCR-Schmelzanalyse mit einer einfach markierten Sonde erfolgen, beispielsweise
Die Sonde kann entweder am 5'-Ende (vorzugsweise unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden. Diese Sonden können dazu verwendet werden, an ein Segment des Faktor V-Gens (GenBank Zugangs-Nr. L32764) mit entweder der Sequenz
oder an eine Variante von entweder FVT1 oder FVT2 mit wenigstens etwa 80% Homologie zu hybridisieren. Bei Hybridisierung der Sonde an das Target befinden sich G-Reste entweder an den Positionen 0 und +1 oder +1 und +2 auf dem Target-Strang. Das Fragment, das die Target-Sequenzen des Faktor V-Gens enthält, kann mit Primern wie FVF (5'GAGAGACATCGCCTCTGGGCTA (SEQ ID NO: 19))
und FVR (5'TGTTATCACACTGGTGCTAA (SEQ ID NO: 20)) amplifiziert werden. Die Faktor V-Leiden-Mutation (eine C:A-Fehlpaarung) unterscheidet sich vom Normaltyp durch eine zu einer Abnahme von Tm führende Duplexdestabilisierung, die während der Schmelzanalyse nachweisbar ist.
Genotypisierung der Hämoglobin C (HbC)- und S (HbS)-Mutationen (GenBank Zugangs-Nr. U01317) kann durch Schmelzanalyse einer einfach markierten Sonde nach PCR erfolgen, wie
Die Sonde kann entweder am 5'-Ende (unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden. Diese Sonden hybridisieren an jede der Target-Sequenzen
oder an eine Variante von BGT1, BGT2 oder BGT3 mit 80% Homologie. Hybridisierung von Sonde und Target liefert G-Reste an den Positionen 0 und +1 oder +1 und +2 auf dem Target-Strang. Das Fragment, das die Mutationen enthält, kann mit Primern wie BGF (5'ACACAACTGTGTTCACTAGC (SEQ ID NO: 26)) und BGR (5'CAACTTCATCCACGTTCACC (SEQ ID NO: 27)) amplifiziert werden. Die Genotypen HbS (vollständige Paarung) und HbC (durchgehende G:T- und T:T-Fehlpaarungen) können aufgrund unterschiedlicher Tm vom Wildtyp (T:T-Fehlpaarung) unterschieden werden.
Genotypisierung der thermolabilen Mutation von Methylentetrahydrofolatreduktase (GenBank Zugangs-Nr. U09806) kann durch Schmelzanalyse mit einer einfach markierten Sonde erfolgen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Die Sonde kann entweder am 5'-Ende (unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden. Diese Sonden hybridisieren an jede der Target-Sequenzen
oder ihre Varianten mit wenigstens etwa 80% Homologie. Bei Hybridisierung der Sonde an das Target wird ein G an der Position +1 für die 5'-markierten Sonden oder G-Reste an den Positionen 0 und +1, 0, +1 und +2, oder +1, +2 und +3 für 3'-markierte Sonden bereitgestellt. Das Fragment der Methylentetrahydrofolatreduktase kann mit Primern wie MFF (5'TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA (SEQ ID NO: 33)) und MFR (5'AGGACGGTGCGGTGAGAGTG (SEQ ID NO: 34)) amplifiziert werden. Die Mutation resultiert in der äußerst stabilen G:T-Fehlpaarung, sie kann aber wegen der Duplexdestabilisierung, insbesondere mit nach einer Amplifikation stattfindenden Schmelzanalyse, unterschieden werden.
Genotypisierung der Faktor II (oder Prothrombin)-G20210A-Mutation (GenBank Zugangs-Nr. M17262 und M33691) kann durch Schmelzanalyse einer einfach markierten Sonde wie F2P 5'TCTCAGCAAGCCTCAATGCT (SEQ ID NO: 35) nach PCR erfolgen. Die Sonde kann entweder am 5'-Ende (unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden. Diese Sonde kann dazu verwendet werden, an die beiden Target-Sequenzen
oder ihre Variante mit wenigstens etwa 80% Homologie zu hybridisieren. Hybridisierung von Sonde und Target liefert einen G-Rest an Position +1 auf dem Target-Strang, wenn die Sonde 5'-markiert ist, und an den Positionen +1, +2 und +3, wenn die Sonde 3'-markiert ist. Das Fragment, das den Mutationsort enthält, kann mit Primern wie F2F (5'ATTGATCAGTTTGGAGAGTAGGGG (SEQ ID NO: 38)) und
F2R (5'GAGCTGCCCATGAATAGCACT (SEQ ID NO: 39)) amplifiziert werden. Die Wildtyp-Duplex weist eine C:A-Fehlpaarung auf und unterscheidet sich aufgrund der Duplexdestabilisierung von der Mutation.
Genotypisierung der Hämochromatose-assoziierten Mutation C187G (GenBank Zugangs-Nr. Z92910) kann durch Schmelzanalyse mit einfach markierten Sonden erfolgen, beispielsweise:
Die Sonde kann entweder am 5'-Ende (unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden. Diese Sonden hybridisieren an jede der Target-Sequenzen
oder eine Variante mit wenigstens etwa 80% Homologie. Hybridisierung von Sonde und Target liefert G-Reste auf dem Target-Strang an den Positionen 0 und +1 oder +1 und +2 für die 5'-markierten Sonden und ein G an Position 0 oder +1 für 3'-markierte Sonden. Das Fragment, dass den Mutationsort enthält, wird mit Primern wie HHDF (5'CACATGGTTAAGGCCTGTTG (SEQ ID NO: 45)) und HHDR (5'GATCCCACCCTTTCAGACTC (SEQ ID NO: 46)) amplifiziert. Die Mutation kann vom Wildtyp unterschieden werden, da der Wildtyp eine C:C-Fehlpaarung aufweist und eine niedrigere Tm besitzt.
Genotypisieung der Hämachromatose-assoziierten Mutation G845A (GenBank Zugangs-Nr. Z92910) kann durch Schmelzanalyse nach PCR mit einfach markierten Sonden erfolgen, wie beispielsweise:
Diese Sonden können entweder am 5'-Ende (unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden. Diese Sonden hybridisieren an jede der Target-Sequenzen:
oder eine Variante mit wenigstens etwa 80% Homologie. Hybridisierung von Sonde und Target liefert G-Reste auf dem Target-Strang an den Positionen 0 und +1 oder +1 und +2 für die 5'-markierten Sonden und ein G an der Position +1 für 3'-markierte Sonden. Das Fragment, dass den Mutationsort enthält, wird mit Primern wie HCYF (5'TGGCAAGGGTAAACAGATCC (SEQ ID NO: 51)) und HCYR (5'TACCTCCTCAGGCACTCCTC (SEQ ID NO: 52)) amplifiziert. Die Mutation (C:A-Fehlpaarung) kann wegen der niedrigeren Tm vom Wildtyp unterschieden werden.
Genotypisierung der bekannten, mit cystischer Fibrose assoziierten Deletion von 3 Basenpaaren (F508del) kann mit einer einfach markierten Sonde erfolgen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Die Sonde kann entweder am 5'-Ende (unter Zugabe eines 3'-Phosphats) oder am 3'-Ende markiert werden und hybridisiert an jede der Target-Sequenzen
oder deren Varianten mit wenigstens etwa 80% Homologie. Hybridisierung von Sonde und Target liefert ein G an der Position +1 auf dem Target-Strang bei 5'-Markierung und ein G an der Position 0 oder +1 bei 3'-Markierung. Das Fragment, dass den Mutationsort (GenBank Zugangs-Nr. M55115) enthält, kann mit Primern wie CFF (5'GGAGGCAAGTGAATCCTGAG (SEQ ID NO: 57)) und CFR (5'CCTCTTCTAGTTGGCATGCT (SEQ ID NO: 58)) amplifiziert werden. Die Mutation führt zu einer Duplexdestabilisierung und einer entsprechenden Abnahme der Tm.
Bei allen obigen Beispielen ist die fluoreszierende Einheit am 5'- oder 3'-Ende des Nukleotids vorgesehen und wenigstens ein G befindet sich an Position 0, +1 oder +2 auf dem Target-Strang. Es versteht sich von selbst, dass sich die fluoreszierende Einheit auch an einem Nukleotid befinden kann, das intern am Ende der Oligonukleotidsonde liegt, wenn die fluoreszierende Einheit ausreichend Zugang zu einem G-Rest hat. Wenn eine geeignete Linker-Struktur gegeben ist, kann die fluoreszierende Einheit beispielsweise, wie im Stand der Technik bekannt, eine Base weiter innen vom Ende gebunden sein, und die Fluoreszenz kann von einem G-Rest, der sich an den Positionen +1, 0 oder –1 befindet (relativ zur Position der fluoreszierenden Einheit) gequencht werden. Weitere Konstrukte, bei denen der Linker ausreichend flexibel ist, um einen Zugang der fluoreszierenden Einheit zu einem G-Rest zu ermöglichen, werden als vom Umfang der Erfindung erfasst angesehen.
Beispiel 2
Monitoring von Sonden-Target-Dissoziation mit 3'-markierten Sonden
Die in Tabelle 1 gezeigten DNA-Oligonukleotide wurden durch übliche DNA-Synthese mit Festphasen-Phosphoramiditchemie mit den üblichen Schritten zur Entfernung von Schutzgruppen und anschließenden Schritten zum Entsalzen und Reinigen mit einer Sephadex G-25-Säule und C₈-Reversed-Phase-HPLC hergestellt. Die Sondenoligonukleotide wurden am 3'-Ende unter Verwendung von Fluorescein-CPG- Säulenträgern (Katalog-Nr. BGX-6190-1, BioGenex Inc., San Ramon, CA) mit einem Fluoresceinmolekül (einer 5-Carboxyfluoresceingruppe mit einem cyclischen C₆-Linker) markiert.
Ein Thermocycler-Gerät für schnelle Echtzeit-PCR (LightCycler-Instrument, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) wurde zum Monitoring von Änderungen der Fluoreszenzemission bei der Denaturierung (oder Dissoziation) der Sonde vom Target verwendet. Die Proben bestanden aus 0,1 μM Sondenoligonukleotid, 0,12 μM oder 0,24 μM Target, 5 mM MgCl₂, 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 50 mM Tris-Puffer (voreingestellte Kristalle, pH 8,3 bei 25°C). Die Proben wurden zunächst bei 95°C denaturiert und schnell abgekühlt, um ein Annealing von Sonde und Target sicherzustellen. Anschließend wurde die Intensität der Fluoreszenzemission gemessen, wenn die Temperatur mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 0,2°C/s von 40°C auf 97°C verändert wurde. Die Proben wurden bei 470 nm angeregt. Die Fluoreszenzemission wurde im Step-Acquisition-Gerätemodus mit einem bei 530 nm zentrierten 20 nm-Bandpassfilter detektiert. Bei Sets A und B war eine Zunahme der Fluoreszenz zu beobachten, wenn die Temperatur anstieg und über die Schmelztemperatur (Tm) der Sonde hinausging (76°C für Set A und 66°C für Set B) (1). Der Grad der Zunahme der Fluoreszenz war bei der höheren Target-Menge größer. Die Änderung der Fluoreszenz wird durch Auftragen der ersten Ableitung der Fluoreszenzdaten nach der Temperatur deutlicher (2). Set C zeigte, wenn überhaupt, eine nur sehr geringe Änderung der Fluoreszenzintensität.
TABELLE 1
Beispiel 3
Effekt von Basenanaloga auf das Fluoreszenzsignal
Der G-Rest am 3'-Ende der in Set B (Beispiel 2) beschriebenen Sonde wurde durch verschiedene Basenanaloga substituiert, die in Tabelle 2 gezeigt sind. Die Basenanaloga wurden als Phosphoramidite (Glen Research, Sterling, VA) erhalten und bei der DNA-Synthese in die Oligonukleotide eingebaut. Die Änderung der Fluoreszenzintensität bei Dissoziation der Sonde vom Target wurde wie in Beispiel 2 gemessen. Die Änderung der Fluoreszenz bei Hybridisierung von Sonde und Target wurde mit einem Fluorimeter gemessen. Jede Probe enthielt 0,1 μM Sonde und 0,12 μM Target. Die Änderung der Emissionswellenlänge von Fluorescein bei Annealing von Sonde und Target war sehr gering. Die Proben mit den Basenanaloga 5-Nitroindol- und 5-Iod-2'-cytidindesoxynukleosiden zeigten eine Zunahme der Fluoreszenz bei Hybridisierung von Sonde und Target und einen Abnahme der Fluoreszenz nach Dissoziation der Sonde vom Target. Wenn das G an der Position +1 auf dem Target-Strang in T geändert wurde, war ein erhöhtes Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung und ein Fluoreszenzquenching bei Sondendissoziation mit diesen und anderen Basenanaloga außer 6-Methoxyaminopurin, das keine Fluoreszenzänderung verursachte, beobachten. Die Richtung der Fluoreszenzänderung war der des ursprünglichen G-Rests entgegengesetzt (Tabelle 2).
TABELLE 2
Vergleichsbeispiel 4
Monitoring von Sonde-Target-Dissoziation mit 5'-markierten Sonden: Position und Dosiseffekte von Guaninen
Die in Tabelle 3 gezeigten Oligonukleotide wurden von Operon Technologies Inc. (Alamada, CA) erhalten. Die Sondenoligonukleotide waren 27 Nukleotide lang, am 5'-Ende mit einem 5-Fluoresceinmolekül markiert, das an eine mit Thioharnstoff verknüpfte C₆-Alkylkette gebunden war, und Extension war mit einem 3-Phosphat blockiert. Die Target-Oligonukleotide waren zu den Sonden komplementär, außer, dass sie vier zusätzliche überhängende Nukleotide am 3'-Ende besaßen. Annealing von komplementären Paaren von Sonden (0,2 μM) und Target (0,4 μM) erfolgte in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, und 250 μg/ml BSA, und es wurde unter kontinuierlicher Erfassung der Fluoreszenz mit 0,1°C/s auf 90°C erhitzt, um die Änderung der Fluoreszenzintensität bei Dissoziation der Sonde zu beobachten. Die prozentuale Änderung der Fluoreszenz bei Dissoziation der Sonde wurde durch Extrapolation der linearen Abnahme der Fluoreszenz bestimmt, die von oberhalb des Schmelzübergangs bis zu Werten unterhalb des Schmelzübergangs gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass wenigstens ein G an den Positionen 0, +1 oder +2 auf dem Target-Strang für eine signifikante Änderung der Fluoreszenz bei Dissoziation der Sonde vom Target nötig ist. Die Stärke der Fluoreszenzänderung wurde maximal, wenn die G-Reste alle drei Positionen einnahmen. Position +3 hatte marginale Wirkung. Ähnliche Ergebnisse (nicht gezeigt) zeigen, dass ein G-Rest an Position +4 ebenfalls marginale Wirkung hatte. Position –1 hatte, wenn überhaupt, nur sehr geringe Wirkung, was auch der Fall war, wenn sich keine G-Reste an den Positionen –1 bis +3 befanden (Tabelle 3).
TABELLE 3
Vergleichsbeispiel 5
Monitoring von Sonden-Target-Dissoziation mit 5'-markierten Sonden: Effekt der Base unter dem Marker
Oligonukleotide mit der gleichen Kernstruktur wie in Beispiel 4 beschrieben wurden mit kleineren Änderungen in ihren Sequenzen wie in Tabelle 4 gezeigt hergestellt. Wie in Beispiel 4 wurden diese Oligonukleotide dazu verwendet, Änderungen in der Intensität der Fluoreszenzemission bei Dissoziation der Sonde vom Target zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vorhandensein eines G-Rests an Position 0 auf dem Target-Strang bei Dissoziation der Sonde vom Target zu einer signifikanten Zunahme der Fluoreszenz führt (Set W).
Der C-Rest an Position 0 führte dazu, dass sich die Fluoreszenz in entgegengesetzter Richtung änderte, d.h. der C-Rest störte das Quenching durch den 5'-markierten G-Rest und das Fluoreszenzsignal wurde nochmals beim Schmelzen der Duplex gequencht (Tabelle 4). Dieser Effekt ist jedoch am besten zu sehen, wenn sich kein G-Rest an den Positionen –1 oder +1 befindet.
TABELLE 4
Vergleichsbeispiel 6
Monitoring der Amplifikation und Quantifizierung durch Fluoreszenzquenching mit 5'-markierten Sonden
Eine 5' mit Fluorescein markierte, 27 Nukleotide lange Oligonukleotidsonde 5'CCAGGAAAACATAGTAAAAAATGGAAT (SEQ ID NO: 62), die am 3'-Ende mit Phosphat blockiert war, wurde zum Nachweis der Amplifikation eines Fragments aus dem Lipoproteinlipasegen (GenBank Zugangs-Nr. AF050163) verwendet. Die Sonde wurde so positioniert, dass der Target-Strang G-Reste an den Positionen 0 und +1 relativ zum Fluoresceinmarker aufwies. Die PCR-Reaktionen wurden mit jeweils 0,2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0,1 μM Sonde, 3 mM MgCl₂, KlenTaq-Polymerase (AB Peptides, St. Louis, MO, 0,4 U/Reaktion), 50 mM Tris (pH 8,3, 25°C) und BSA (500 μg/ml) durchgeführt. Die Primer waren
Die Ausgangsmatrize war ein gereinigtes PCR-Produkt mit 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 100, 10 und 0 Kopien pro Reaktion. Eine Rapid-Cycle-PCR mit Fluoreszenzmonitoring wurde in 10 μl-Volumina durchgeführt, wobei das LightCycler-Gerät verwendet wurde. Die Amplifikation erfolgte durch Denaturieren bei 94°C, Annealing bei 50°C, einem Übergang von 1°C/s auf 54°C, einem Übergang von 3°C/s auf 74°C und Extension bei 74°C für 10 Sekunden, was ein 169 bp-Produkt lieferte. Die Fluoreszenz wurde einmal pro Zyklus bei 54°C erfasst. Die Amplifikation benötigte 39 Minuten für 45 Zyklen. 3 zeigt die Fluoreszenzdaten, die als relative Menge Quenching über Background gegen die Zykluszahl aufgetragen sind. Die ursprünglichen Fluoreszenzdaten wurden durch 1) Inversion (Verwendung des Kehrwerts der Fluoreszenz), 2) proportionale Backgroundangleichung jeder Kurve über den relevanten Zyklusintervall (LightCycler-Software) und 3) Subtraktion des Kontrollwerts ohne Matrize von jeder Probe bei jedem Zyklus angepasst. Die Ergebnisse zeigten, dass das System eine so geringe Menge wie eine Kopie pro Reaktion nachweisen kann und dass eine zuverlässige Quantifizierung der anfänglichen Matrizenkopien möglich ist.
Vergleichsbeispiel 7
Amplifikation, Nachweis und Typisierung von Salmonella-Stämmen mit 3'-markierten Sonden
Sechzehn Salmonella-Serovare des Salmonella Reference Collection C wurden vom „Salmonella Genetic Stock Centre", University of Calgary, Kanada, erhalten. Diese Serovare (Nummern der Stämme des "Centers for Disease Control and Prevention": 151-85, 3472-64, 346-86, 409-85, 156-87, 678-94, 2584-68, 287-86, 750-72, 2703-76, 1363-65, 347-78, 2439-64, 5039-68 und Stämme S 6623, Institute Pasteur E88.374) stellen einen genetisch diversen Querschnitt von Salmonellen dar, da alle sieben Subspezies von Salmonella enterica und Salmonella bongorii vertreten sind. Es wurden auch fünf E. coli-Stämme aus der E. coli-Reference Collection als Negativkontrolle bezogen. Die Bakterien wurden über Nacht in Luria-Broth kultiviert und die genomische DNA wurde mit einem Kit zur Matrizenpräparation (Roche Molecular Biochemicals, High Pure PCR Template Preparation kit) gereinigt. Oligonukleotidprimer SQF (SEQ ID NO: 1) und SQR (SEQ ID NO: 2) wurden zur Amplifikation des SpaQ-Gens verwendet. Die Sonden SQP1 (SEQ ID NO: 3), SQP2 (SEQ ID NO: 4) und SQP3 (SEQ ID NO: 5) wurden ähnlich den in Beispiel 2 beschriebenen Beispielen am 3'-Ende mit Carboxyfluorescein markiert. Die Sonde SQP8 (SEQ ID NO: 10) wurde ähnlich den in Beispiel 4 beschriebenen Beispielen am 5'-Ende mit Fluorescein markiert. Die PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 6 durchgeführt, mit den folgenden Ausnahmen: 0,5 μM Primer SQF, 0,25 μM Primer SQR, 0,6 mM dUTP anstelle von dTTP, 0,2 μM von einer der Sonden, 4 mM MgCl₂, Zugabe von TagStart-Antikörper (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, 10 ng/Reaktion), BSA (250 μg/ml) und 2 ng von jeder DNA pro Reaktion. Eine PCR mit Fluoreszenzmonitoring wurde in 10 μl-Volumina im LightCycler-Gerät durchgeführt. Die Amplifikationsbedingungen waren 94°C (0 Sekunden, 20°C/Sekunde Übergangsgeschwindigkeit); 55°C (10 Sekunden, 20°C/Sekunde Übergangsgeschwindigkeit); 74°C (10 Sekunden, 2°C/Sekunde Übergangsgeschwindigkeit). Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte am Ende der 40 PCR-Zyklen bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 0,2°C/Sekunde. Alle 16 Salmonella-Serovare wurden mit der Schmelzkurvenanalyse nachgewiesen, die Schmelzpeaks bei den entsprechenden Tms erzeugte (64°C und 54°C für Sonde SQP1 (SEQ ID NO: 3) und 62°C und 52°C für SQP2 (SEQ ID NO: 4), 61°C und 51°C für Sonde SQP3 (SEQ ID NO: 5), 60°C und 50°C für Sonde SQP8 (SEQ ID NO: 10)), es wurde jedoch keine der E. coli-Spezies nachgewiesen. Die Salmonella-Subspezies IV und VI waren aufgrund eines Shifts der Schmelztemperatur der Sonde-Amplicon-Duplex von 10°C leicht von den anderen Subspezies zu unterscheiden.
Vergleichsbeispiel 8
Genotypisierung mit 5'-markierten Sonden
Bei allen folgenden Beispielen wurde eine PCR mit Fluoreszenzmonitoring wie in Beispiel 6 durchgeführt, außer dass jede Reaktion jeweils 0,5 μM Primer, 0,4 U Taq-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) anstelle von KlenTaq-Polymerase und 50 ng gereinigte genomische DNA enthielt. Soweit nicht anders angegeben wurden die Temperaturübergangsgeschwindigkeiten auf 20°C/Sekunde programmiert und die Haltezeit war 0 Sekunden. Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte unter kontinuierlicher Erfassung der Fluoreszenz von Fluorescein beim Erhitzen auf 95°C, Annealing bei 40°C für 60 Sekunden und Schmelzen mit 0,1°C/s bis auf 80°C. Die charakteristischen Tm-Shifts aller hier gezeigten Allele sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Die Tabelle zeigt auch, dass Vorhersage-Tools für einfach markierte Sonden verwendet werden können.
Faktor V: Hundert Proben genomischer DNA mit unbekanntem Genotyp für den Faktor V-Leiden wurden aus klinischen Proben erhalten, die bei „Associated Regional and University Pathologists" (ARUP, Salt Lake City, UT) eingereicht worden waren. Der Faktor V-Locus wurde mit den Primern FVF (SEQ ID NO: 19) und FVR (SEQ ID NO: 20) amplifiziert und mit der einfach 5'-Fluorescein-markierten Sonde FVP1 (SEQ ID NO: 14) analysiert. Eine Rapid-Cycle-PCR wurde 45 Zyklen lang mit Denaturierung bei 94°C, Annealing bei 50°C für 10 Sekunden und einem Übergang von 1°C/s auf 72°C durchgeführt, was ein 222 bp-Produkt lieferte. Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte automatisch nach der PCR, wobei die Fluoreszenz von Fluorescein beim Erhitzen auf 94°C, Annealing bei 40°C für 2 Minuten und Schmelzen mit 0,1°C/s bis auf 75°C kontinuierlich erfasst wurde. Die Amplifikation benötigte 41 Minuten und das Schmelzprotokoll 9 Minuten. Die Ergebnisse wurden mit denen herkömmlicher Hybridisierungssondenassays mit Donor-Rezeptor-Farbstoffkombinationen (Lay et al., 1997, Clinical Chemistry, 43: 2262–2267) verglichen. Die Übereinstimmung der beiden Verfahren betrug 100%. 87 Wildtypproben, 12 heterozygote Proben und 1 Probe einer homozygoten Mutante wurden mit den charakteristischen Tm-Verschiebungen identifiziert (4).
Beta-Globin: Eine Rapid-Cycle-PCR (Primer BGF (SEQ ID NO: 26) und BGR (SEQ ID NO: 27)) wurde 35 Zyklen lang mit Denaturierung bei 94°C, Annealing bei 50°C für 10 Sekunden und einem Übergang von 1°C/s bis auf 70°C durchgeführt, was ein 110 bp-Produkt lieferte. Eine Schmelzkurvenanalyse mit der 5'-Fluorescein-markierten Sonde BGP1 (SEQ ID NO: 21) erfolgte nach der PCR, wobei die Fluoreszenz von Fluorescein beim Erhitzen auf 95°C, Annealing bei 40°C für 30 Sekunden und Schmelzen mit 0,1°C/s bis auf 80°C kontinuierlich erfasst wurde. Die Amplifikation benötigte 35 Minuten und das Schmelzprotokoll 9 Minuten. Der Genotyp aller 3 Allele (Wildtyp, HbS, HbC) wurde durch charakteristische Tm-Shifts identifiziert.
Methylentetrahydrofolatreduktase: Eine Rapid-Cycle-PCR (Primer MFF (SEQ ID NO: 33) und MFR (SEQ ID NO: 34)) wurde 40 Zyklen lang mit Denaturierung bei 94°C und Annealing/Extension bei 60°C für 20 Sekunden durchgeführt, was ein 198 bp-Produkt lieferte. Zu jeder Reaktion wurde TagStart^TM-Antikörper (88 ng) gegeben. Die Amplifikation benötigte 27 Minuten und das Schmelzprotokoll 8 Minuten. Die Genotypisierung erfolgte mit einem 5'-Fluorescein-markierten Primer MFP1 (SEQ ID NO: 28). Der Genotyp des Wildtyps und der Mutation wurde durch charakteristische Tm-Shifts identifiziert.
Faktor II (Prothrombin): Eine Rapid-Cycle-PCR (Primer F2F (SEQ ID NO: 38) und F2R (SEQ ID NO: 39)) wurde 35 Zyklen lang mit Denaturierung bei 94°C, Annealing bei 58°C für 15 Sekunden und einem Übergang von 1°C/s bis auf 72°C durchgeführt, was ein 154 bp-Produkt lieferte. Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte mit einer 5'-Fluorescein-markierten Sonde F2P (SEQ ID NO: 35). Die Amplifikation benötigte 29 Minuten und das Schmelzprotokoll 8 Minuten. Die Allele von Mutation und Wildtyp unterschieden sich durch charakteristische Tm-Shifts.
Erbliche Hämochromatose: Eine Rapid-Cycle-PCR (Primer HHDF (SEQ ID NO: 45) und HHDR (SEQ ID NO: 46) für die Mutation C187G und Primer HCYF und HCYR für die Mutation G845A) wurde 35–50 Zyklen lang mit Denaturierung bei 94°C, Annealing bei 60°C für 10 Sekunden und einem Übergang von 1°C/s bis auf 72°C durchgeführt. Die Schmelzkurvenanalyse erfolgte mit den 5'-Fluorescein-markierten Sonden HHDP1 (SEQ ID NO: 40) für das C187G-Allel und HCYP1 (SEQ ID NO: 47) für das G845A-Allel. Wildtyp-Allel und mutiertes Allel wurden aufgrund ihrer charakteristischen Tm-Shifts identifiziert.
Cystische Fibrose: Eine Rapid-Cycle-PCR (Primer CFF (SEQ ID NO: 57) und CFR (SEQ ID NO: 58) wurde 44 Zyklen lang mit Denaturierung bei 95°C und Annealing/Extension bei 60°C für 20 Sekunden durchgeführt, was ein 256 bp-Produkt lieferte. TaqStart-Antikörper (88 ng) wurde zu jeder Reaktion gegeben. Die Schmelzanalyse erfolgte mit einem 5'-Fluorescein-markierten Primer CFP1 (SEQ ID NO: 53). Die Amplifikation benötigte 25 Minuten und das Schmelzprotokoll 8 Minuten. Das Allel mit der Deletion unterschied sich aufgrund seines charakteristischen Tm-Shifts vom Wildtyp-Allel.
TABELLE 5: Gemessene und vorhergesagte Tms mit einfach markierten Fluorescein-Sonden
Vergleichsbeispiel 9
Nachweis von Mutationen durch Sondenmultiplexing
Hergestellt wurden eine 3'-Fluorescein-markierte Oligonukleotidsonde Y 5'CTTGATGAGGATCCCAAAGACCACCCCCAAGACCAC(F) (SEQ ID NO: 65) und eine zweite Oligonukleotidsonde Z 5'(F)ACCAGCAGAATGCCAACCA (SEQ ID NO: 66), die am 5'-Ende mit dem Quencherfarbstoff BlackHole (BHl, BioSearch Technologies, Novato, CA) markiert war. Auf dem Target-Strang befand sich ein G-Rest an Position 0 relativ zum Fluoresceinmarker. Vier Target-Oligonukleotide, 55 Nukleotide lang, eines vollständig komplementär zu beiden Sonden, ein zweites mit einer einzelnen Basenfehlpaarung mit Sonde Y (SEQ ID NO: 65), das dritte mit einer einzelnen Basenfehlpaarung mit Sonde Z (SEQ ID NO: 66) und ein viertes mit einzelnen Fehlpaarungen jeweils mit Sonde Y (SEQ ID NO: 65) und Sonde Z (SEQ ID NO: 66) wurden ebenfalls hergestellt. Die zwei Sonden wurden gleichzeitig an das Target hybridisiert und eine Schmelzanalyse mit Fluoreszenzmonitoring erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben. Eine Zunahme der Fluoreszenz war zu beobachten, wenn Sonde Z (SEQ ID NO: 66) (mit dem Quencherfarbstoff) von der Matrize dissoziierte (Tm = 70°C), gefolgt von einer weiteren Zunahme der Fluoreszenz, wenn die mit Fluorescein markierte Sonde Y (SEQ ID NO: 65) dissoziierte (Tm = 77,5°C). Die einzelnen Basenfehlpaarungen mit der mit Fluorescein markierten Sonde (5A) sowie mit der Quenchersonde (5B) wurden jeweils durch für jede der Fehlpaarungen charakteristische Tm-Shifts nach unten nachgewiesen. Die Doppelfehlpaarung (d.h. eine Fehlpaarung mit jeder Sonde) wurde ebenfalls unzweifelhaft nachgewiesen (5B).
Vergleichsbeispiel 10
Vergleich von Quencher- und Entquenchersonden
Oligonukleotidsonden (27 Nukleotide) wurden mit den Farbstoffen Fluorescein, JOE, Cy5 und LCRed 705 synthetisiert, die am 5'-Ende gebunden wurden. Ein Komplementärstrang aus 38 Nukleotiden mit zwei G-Resten an Position 0 und +1 wurde ebenfalls hergestellt. Die Sonden wurden an den Komplementärstrang hybridisiert und die Änderung der Fluoreszenz wurde wie in Beispiel 4 beschrieben gemessen, wenn die Sonde dissoziierte, außer dass für die Anregung und die Emissionsdetektion geeignete Filter verwendet wurden. Die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität betrug 28% bei Fluorescein, 20% bei JOE, was jeweils auf ein Quenchen bei Hybridisierung und ein Entquenchen bei Dissoziation der Duplex hindeutet, und –11% bei Cy5 und –12% bei LCRed 705, was auf eine Zunahme bei Hybridisierung und ein Quenchen bei Dissoziation der Duplex hindeutet.
Vergleichsbeispiel 11
Genotypisierung durch Quenchen/Verstärken einer Oligonukleotidsonde, die intern mit Fluorescein als virtuelles Nukleotid markiert ist
Ein Oligonukleotid, das zu dem Faktor V-Leiden (G1691A)-Locus (GenBank Zugangs-Nr. L32764) komplementär ist, wurde von Operon (Alamada, CA) erhalten und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Ein Fluorescein-ON-Phosphoramidit (Clontech, Palo Alto, CA) wurde an der Position, die zu der variablen Base komplementär ist, in die Sonde eingebaut, und die Extension der Sonde wurde mit einem 3'-Phosphat blockiert (6). Der Fluoresceinmarker ist also als „virtuelles Nukleotid" in die Sequenz CTGTATTCCTFGCCTGTCCAGG-P (SEQ ID NO: 67) eingebaut. Bei Hybridisierung an den Faktor V-Locus liegt das Fluorescein einem G- oder einem A-Rest gegenüber.
Eine PCR mit Fluoreszenzmonitoring wurde in 10 μl-Volumina in einem Rapid-Cycle-Echtzeit-PCR-Gerät (LightCycler, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) durchgeführt. Die Sonde war in der Mischung für die PCR-Amplifikation mit den Primern FVF (SEQ ID NO: 19) (0,5 μM) und FVR (SEQ ID NO: 20) (0,25 μM) enthalten. Jede Reaktion beinhaltete 0,1 μM der mit Fluorescein markierten Sonde, jeweils 100 μM dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 50 mM Tris, pH 8,3 (25°C), 3 mM MgCl₂, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,4 U Taq-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals), TagStart-Antikörper (88 ng, Clontech) und 50 ng gereinigte genomische DNA.
Genomische DNA bekannter Genotypen wurde aus einer früheren Studie erhalten (Lay MJ und CT Wittwer, Clin. Chem., 43: 12, 2262–2267, 1997). Eine Rapid-Cycle-PCR wurde 45 Zyklen lang mit Denaturierung bei 95°C, Annealing bei 50°C für 10 Sekunden und einem Übergang von 1°C/s bis auf 72°C durchgeführt, was ein 222 bp-Produkt lieferte. Temperaturübergangsgeschwindigkeiten, die nicht spezifiziert waren, wurden auf 20°C/s mit Haltezeiten von 0 Sekunden programmiert. Eine Schmelzkurvenanalyse erfolgte automatisch nach der PCR, wobei die Fluoreszenz des Fluoresceins beim Erhitzen auf 95°C, Annealing bei 40°C für 30 Sekunden und Schmelzen mit 0,1°C/s bis auf 75°C kontinuierlich erfasst wurde.
Für die Fluoreszenzanalyse der Schmelzkurve wurde die kommerzielle LightCycler-Software verwendet, außer dass anstelle der negativen Ableitung die positive Ableitung der Fluoreszenz gegen die Temperatur auf der Y-Achse aufgetragen wurde. Das zur Polynombestimmung der Ableitung verwendete Temperaturintervall betrug 8°C und das Digitalfilter war aktiviert.
Der homozygote Wildtyp-Genotyp führt zum Gegenüberliegen von F:G, zum Quenchen der Fluoreszenz von Fluorescein und zu einer Tm von 58,4°C, während der homozygote Faktor V-Leiden-Genotyp zum Gegenüberliegen von F:A und einer Verstärkung der Fluoreszenz mit einer ähnlichen Tm führt. Eine Heterozygote führt sowohl zum Gegenüberliegen von F:G als auch von F:A und einem in der Mitte liegenden Fluoreszenzwert. Es ist zu beachten, dass die Genotypisierung durch der Richtungsänderung der Fluoreszenz erhalten wird und nicht, wie bei den anderen Beispielen, durch die charakteristischen Tms jedes Allels. Alle Genotypen lassen sich klar voneinander unterscheiden.
Ein weiteres Beispiel für die Verwendung eines virtuellen Nukleotids wäre der Nachweis von Salmonellen mit einem Analogon der SEQ ID NO: 3, 5'CCAAAAGGNAGCGTCTGTTCC (SEQ ID NO: 59), bei dem N das den Fluoreszenzmarker enthaltende virtuelle Nukleotid ist, und Quenching bei Hybridisierung erfolgt, wenn das virtuelle Nukleotid in direkter Nachbarschaft zu dem G an Position 0 auf dem Komplementärstrang liegt.
Vergleichsbeispiel 12
Genotypisierung durch Entquenchen einer Oligonukleotidsonde mit einem Fluoreszenzmarker an einem G-Rest
PCR mit Fluoreszenzmonitoring wurde wie in Beispiel 11 beschreiben durchgeführt, jedoch mit den folgenden Änderungen: der Faktor V-Locus wurde mit einem Molverhältnis der Primer 5'AGAATAAATGTTATCACACTGGTGCTAA (SEQ ID NO: 68, 0,5 μM) und 5'GACATCGCCTCTGGGCTA (SEQ ID NO: 69, 0,06 μM) von 8:1 asymmetrisch amplifiziert; jede Reaktionsmischung enthielt 200 mM Tris, pH 8,7 (25°C), ohne Taq-Start-Antikörper und 0,2 μM Fluorescein-markierte Sonde 5'GGCGAGGAATACAGG(F) (SEQ ID NO: 70), in der das unterstrichene G der Leiden-Mutation gegenüberliegt.
Rapid-Cycle-PCR erfolgte mit einer Inkubation bei 95°C für 5 Sekunden zu Beginn, gefolgt von 45 bis 60 Zyklen mit Denaturierung (86°C), Annealing (55°C, 10 s) und Extension (mit einer Übergangsgeschwindigkeit von 1°C/s von 55°C auf 72°C). Dies lieferte ein 226 bp-Produkt aus humanen DNA-Proben. Schmelzkurvenanalyse erfolgte nach der PCR durch Erhitzen auf 95°C, Abkühlen auf 65°C, weiteres Abkühlen auf 30°C mit einer Geschwindigkeit von 0,25°C/s und Schmelzen mit einer Geschwindigkeit von 0,05°C/s bis auf 65°C, wobei die Fluoreszenz von Fluorescein kontinuierlich erfasst wurde. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Temperaturübergangsgeschwindigkeiten auf 20°C/s und die Haltezeiten auf 0 Sekunden programmiert. Fluoreszenzanalyse der Schmelzkurve erfolgte mit der kommerziellen LightCycler-Software, wobei wie üblich die negative erste Ableitung der Fluoreszenz gegen die Temperatur aufgetragen wurde.
Sonde-Target-Hybridisierung führte in einer Zunahme der Fluoreszenz. Der homozygote Wildtyp-Genotyp (G:C-Paarung) besaß eine Tm von 53°C und war leicht vom homozygoten Faktor V-Leiden-Genotyp (G:T-Fehlpaarung) zu unterscheiden, der eine niedrigere Tm von 45°C hatte. Ein heterozygoter Genotyp zeigte beide Tm-Werte (7).
Die besten Ergebnisse werden mit asymmetrischen PCR erhalten, bei der der mit der Sonde gleichsinnige Primer in kleineren Mengen als der gegenläufige Primer zur Verfügung gestellt wird. Bei der Durchführung von 45 Zyklen lieferte eine Primer-Asymmetrie von 1:4 das stärkste Signal. Bei 60 Zyklen war ein Verhältnis von 1:8 optimal. Verglichen mit dem 1:8-Verhältnis betrug die Peakfläche beim Entquenchen bei einem Verhältnis von 1:16 62%, bei 1:4 85% und bei 1:2 37%. Bei symmetrischen (gleichen) Primerkonzentrationen wurde mit diesem Sondensystem kein Signal erhalten.
Vergleichbeispiel 13
Optimierung von Quenchersonden
Schmelzkurvenanalysen mit Sonde 1 und Target P (Tabelle 3) wurden wie in Beispiel 4 durchgeführt, außer dass der pH und die Kationenkonzentration des Puffers variierten. Die Wirkung des Puffer-pHs wurde in einer Lösung von 100 mM KCl und 10 mM Tris untersucht, die mit HCl auf die verschiedenen pHs titiriert wurde (8A, gefüllte Rhomben). Ein Vergleich der relativen Signalstärke ist durch einen Vergleich der Peakflächenwerte der Schmelzkurvendaten möglich. Der optimale pH liegt zwischen 7,4 und 8,0, wobei das beste Signal bei einem pH zwischen 7,6 und 7,8 erhalten wird. Die Wirkung des Kationengehalts des Puffers wurde durch Zugabe verschiedener Konzentrationen an KCl zu einer 10 mM Tris-Lösung, pH 8,3, untersucht (8B, gefüllte Kreise). Bei KCl-Konzentrationen von 10 oder 20 mM war das Signal sehr schwach. Ein gutes Signal wurde bei 50–200 mM KCl beobachtet, und das beste Ergebnis wurde bei etwa 100 mM erhalten. Ähnliche Kationeneffekte wurden erhalten, wenn das Kation als Teil des Puffers, wie beispielsweise als, aber nicht beschränkt darauf, Tris+ und Tricin+, bereitgestellt wurde. Ein gutes Signal kann mit 100 mM Tris, pH 7,8, erhalten werden, was mit PCR kompatibel ist.
Vergleichsbeispiel 14
Optimierung von Entquenchersonden und Vertauschen von Quenchen gegen Entquenchen durch den pH
Die Sonde und das Target von Set V (Tabelle 4) wurden zur weiteren Untersuchung von Sondensystemen verwendet, die bei Hybridisierung entquenchen (das Signal verstärken). Schmelzkurvenanalyse erfolgte unter kontinuierlichem Monitoring durch Erhitzen der Sonde-Target-Mischungen auf 95°C für 0 Sekunden, Abkühlen auf 40°C für 15 Sekunden, gefolgt von einer Rampe von 0,1°C/s bis auf 94°C.
9 zeigt den Einfluss des Puffer-pHs auf die Signalstärke und die Richtung der Signaländerung. In dieser Figur war der Puffer 100 mM Tris mit 500 μg/ml BSA. Wenn der pH basischer (alkalischer) ist als 8, entquencht die Sonde bei Hybridisierung. Wenn der pH jedoch saurer als pH 8 ist, quencht die Sonde bei Hybridisierung. Anders ausgedrückt ist das Quenchien oder Entquenchen nicht allein eine Eigenschaft der Sonde oder nicht einmal der Kombination aus Sonde und Matrize, sondern hängt auch von den Pufferbedingungen (Kationenkonzentration und pH) ab. Dies wird in 8A (offene Rhomben- und offene Dreiecksymbole) näher veranschaulicht, bei der pH-Bereiche von 7,2–9,0 und 8,7–10,7 mit 10 mM Tris-Puffer bzw. 10 mM 2-Amino-2-methyl-1-propanolpuffer in Gegenwart von 160 mM KCl untersucht wurden. Das Entquencher-Signal wird bei einem pH von 8,0–10,7 erhalten, wobei die besten Ergebnisse bei oder über pH 8,6 erhalten werden. Bei einem pH von etwa 8,0 wurde ein sehr schwaches Signal erhalten, und ein leichtes Quenchen wurde bei saurerem pH beobachtet. Es können auch 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiolpuffer verwendet werden, um eine für diese Anwendung geeignete basische Pufferlösung zu liefern.
8B (offene Kreise) zeigt den Effekt von Kationen auf das Entquencher-Signal. Das Signal ist bei 10–20 mM KCl sehr schwach, bei 50–320 mM KCl jedoch sehr stark, wobei die besten Ergebnisse bei 80–160 mM KCl erhalten werden. Ähnliche Kationeneffekte wurden mit Li⁺-, Na⁺-, Cs⁺- und Tetramethylammonium⁺-Ionen erhalten oder wenn das Kation als Teil des Puffers, wie beispielsweise als, aber nicht beschränkt darauf, Tris+ und Tricin+, bereitgestellt wurde. Gute Signale wurden auch mit 200 mM Tris, pH 8,7–8,8 erhalten, was mit PCR kompatibel ist und in Beispiel 12 verwendet wurde. Verbindungen wie Glycerin und Tetrapentylammonium⁺ inhibierten das Entquencher-Signal.
Vergleichbeispiel 15
Abhängigkeit der Schmelzpeakfläche auf die Sonden-Tm im Zusammenhang mit der PCR-Annealing-Temperatur

Einfach markierte Sonden mit verschiedenen Tms wurden verwendet, um den Zusammenhang zwischen Sonden-Tm, PCR-Annealing-Temperatur und Signalstärke der Fluoreszenzänderung beim Schmelzen von Sonde-Target zu untersuchen. Bei den vorhergehenden Beispielen wurde die Signalstärke aus den relativen Werten für die Peakflächen bestimmt, die aus den Schmelzkurvendaten erhalten wurden. Die folgenden sechs Sonden, die 5' mit Fluorescein markiert und mit einem Phosphat am 3'-Terminus versehen waren, wurden so konstruiert, dass sie zu dem Bereich des mit Hämochromatose assoziierten G845A-Polymorphismus (GenBank Zugangs-Nr. Z92910) komplementär waren:

Sonde-a (21 ntd)	Wie Sonde HCYP2 plus einem zusätzlichen 3'-C-Rest
Sonde-b (21 ntd)	Wie Sonde-a, aber 4 Basen in 3'-Richtung verschoben
Sonde-c (17 ntd)	Wie Sonde-a, aber 4 Basen am 3'-Ende trunkiert
Sonde-d (17 ntd)	Wie Sonde-b, aber 4 Basen am 3'-Ende trunkiert
Sonde-e (13 ntd)	Wie Sonde-c, aber 4 Basen wurden am 3'-Ende trunkiert
Sonde-f (13 ntd)	Wie Sonde-d, aber 4 Basen am 3'-Ende trunkiert

Asymmetrische Amplifikation erfolgte mit 0,0625 μM Primer HCYR und 0,5 μM Primer 5'GGCTGGATAACCTTGGCTGTA (SEQ ID NO: 71) mit der Reaktionsmischung aus Beispiel 8 mit TagStart-Antikörper (88 ng). Es wurden 50 PCR-Zyklen mit 94°C für 0 s, 60°C für 10 s und einer Geschwindigkeit von 5°C/s bis auf 72°C durchgeführt, gefolgt von abschließendem Erhitzen auf 94°C, Abkühlen auf 35°C, Halten für 10 s und kontinuierlicher Erfassung der Fluoreszenz mit 0,1°C/s bis auf 80°C. Die Peakflächen für jede abgeleitete Schmelzkurve wurden bestimmt und mit den Peakflächen, die mit den gleichen Sonden gegen synthetische Matrizen ohne PCR erhalten wurden, normiert. Die relativen Werte für die Peakflächen für Sonde-a und Sonde-e wurden bestimmt, indem die Peakfläche von Sonde-c als 100 bestimmt wurde. Die relativen Werte für die Peakflächen für Sonde-b und Sonde-f wurden bestimmt, indem die Peakfläche von Sonde-d als 100 bestimmt wurde. Die Peakflächenwerte wurden gegen die Tm der Sonden aufgetragen (10). Das maximale Hybridisierungssignal wurde beobachtet, wenn die Sonden-Tm etwa 5°C unter der Annealing-Temperatur der PCR lag. Bei Ausführungsformen, bei denen es nicht notwendig ist, bei jedem Zyklus ein Fluoreszenzmonitoring durchzuführen, sollte die Länge der Sonde so angepasst sein, dass die Sonden-Tm um 0–10°C und ganz besonders bevorzugt um etwa 5°C niedriger als die Annealing-Temperatur der PCR ist. Die Primer-Tms liegen oft im Bereich der bei der PCR verwendeten Annealing-Temperaturen, so dass sie optimale Sonden-Tm auch oft etwa 5°C unterhalb der Primer-Tms liegt.
Die Abnahme der Signalstärke, die bei Sonden mit höheren Tms als der Annealing-Temperatur zu sehen ist, kann entweder auf eine Hydrolyse der Sonde während der PCR oder auf eine Abnahme der Effektivität der PCR aufgrund der Blockade der Polymeraseextension durch die Sonde zurückzuführen sein. Die Abnahme der Signalstärke, die bei Sonden mit niedrigeren als den optimalen Tms zu beobachten ist, kann auf weniger verfügbare Sondenbindungsstellen, eine Folge des Annealings von Produktsträngen beim Abkühlen, oder auf die Bildung von Sekundärstrukturen innerhalb eines Strangs zurückzuführen sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fluoreszenzbasierte Sondenzusammensetzung zur Analyse einer Target-Nukleinsäure, im Wesentlichen bestehend aus: einer einfach markierten Polynukleotidsonde, welche eine Sequenz mit wenigstens 80% Homologie zu einem Locus der Target-Nukleinsäure und einen Fluoreszenzmarker umfasst, der an ein Nukleotid der Sonde gebunden ist, wobei das Nukleotid ein Basenanalogon ist, das ausgewählt ist aus 5-Nitroindol, 4-Nitroindol, 6-Nitroindol, 3-Nitropyrroldesoxynukleosiden, 5-Iodcytidin, Inosin und Nebularindesoxynukleosiden; und der Target-Nukleinsäure.
Sondenzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Nukleotid ein endständiges Nukleotid ist.
Sondenzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Nukleotid ein innerer Rest ist.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Target-Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe, umfassend: Vereinigen einer einfach markierten Oligonukleotidsonde mit der Target-Nukleinsäure, wobei die Sonde eine Oligonukleotidsequenz mit wenigstens 80% Homologie zu einem Locus der Target-Nukleinsäuresequenz und einen Fluoreszenzmarker besitzt, der mit einem Nukleotid der Oligonukleotidsequenz verknüpft ist, wobei das Nukleotid ein Basenanalogon ist, das ausgewählt ist aus 5-Nitroindol, 4-Nitroindol, 6-Nitroindol und 5-Iod-2'-cytidin, und der Fluoreszenzmarker eine von der Hybridisierung abhängige Emission zeigt, und die Sonde eine von der Hybridisierung abhängige Zunahme der Fluoreszenzemission zeigt; Bestrahlen der Sonde; und Monitoring der von der Hybridisierung abhängigen Fluoreszenzemission.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Monitoringschritt das Monitoring der Fluoreszenzabnahme nach Dissoziation der Sonde von der Target-Nukleinsäure umfasst.
Kit zur Analyse einer eine Nukleinsäuresequenz umfassenden Probe, umfassend: (a) eine fluoreszierende Detektionseinheit, welche im Wesentlichen aus einer einfach markierten Oligonukleotidsonde mit einem Fluoreszenzmarker besteht, der mit einem endständigen Nukleotid des Oligonukleotids verknüpft ist, wobei das endständige Nukleotid ein Basenanalogon ist und wobei das Basenanalogon ausgewählt ist aus 4-Nitroindol, 5-Nitroindol, 6-Nitroindol, Inosin, 5-Iod-2'-cytidin, Nebularindesoxynukleosiden und 3-Nitropyrroldesoxynukleosiden und wobei die Sonde für eine Hybridisierung an einen einzelsträngigen Locus der Nukleinsäuresequenz ausgelegt ist, so dass die Stärke der Fluoreszenzemission des Fluoreszenzmarkers durch Hybridisierung der Sonde an den Locus zunimmt; und (b) Komponenten zur Amplifikation der Nukleinsäuresequenz, wobei die Komponenten ein zur Amplifikation eines Segments dieser Nukleinsäuresequenz ausgelegtes Paar Oligonukleotidprimer und eine thermostabile DNA-Polymerase umfassen.
Kit nach Anspruch 6, ferner umfassend: ein zweites Primerpaar, das zur Amplifikation eines zweiten Segments dieser Nukleinsäuresequenz, die einen zweiten einzelsträngigen Locus umfasst, ausgelegt ist; und eine zweite fluoreszierende Detektionseinheit, welche im Wesentlichen aus einer zweiten einfach markierten Oligonukleotidsonde mit einem zweiten, mit einem zweiten Fluoreszenzmarker verknüpften Oligonukleotid besteht, wobei die zweite Sonde für eine Hybridisierung an den zweiten Locus ausgelegt ist, so dass die Stärke der Fluoreszenzemission des zweiten Fluoreszenzmarkers bei Hybridisierung der zweiten Sonde an die Target-Nukleinsäuresequenz zunimmt oder abnimmt.