JP2004024035A - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】同一の蛍光色素で標識されたプローブを用い、多数種の核酸を同時に検出するための方法を提供する。
【解決手段】同一のインターカレーター性蛍光色素で標識され、少なくとも２種の１本鎖核酸に対し相補的結合が可能な塩基配列を有したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブのそれぞれを同一反応液（容器）に添加し、温度を変化させて蛍光強度を経時的に測定することによって前記インターカレーター標識プローブのＴｍ値を識別し、それによって複数種類の標的核酸を同時に検出する、核酸の検出方法。
【選択図】図３
【解決手段】同一のインターカレーター性蛍光色素で標識され、少なくとも２種の１本鎖核酸に対し相補的結合が可能な塩基配列を有したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブのそれぞれを同一反応液（容器）に添加し、温度を変化させて蛍光強度を経時的に測定することによって前記インターカレーター標識プローブのＴｍ値を識別し、それによって複数種類の標的核酸を同時に検出する、核酸の検出方法。
【選択図】図３
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される特定核酸配列の分析方法に関するものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の高感度な検出法として標的核酸を増幅する方法の利用が可能である。特定のＤＮＡ配列の増幅法としては、ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。ＰＣＲ法は、急激な温度の上げ下げが必要で、このことが反応時間の短縮や自動化の大きな障壁となっている。一方、一定温度の核酸増幅法としては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、およびリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応によりＲＮＡ増幅を行うもので、一定温度の増幅が可能であり、連続処理や自動化に適した方法であるといえる。
【０００３】
いずれの方法の場合も、増幅産物は電気泳動などの分離分析やハイブリダイゼイション法などの既知の核酸検出方法で検出するのが一般的である。特に特異的に増幅産物を検出する場合は検出可能な信号を発する物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼイション法が用いられる。
【０００４】
ハイブリダイゼイション法では、ＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ法によって増幅した核酸を反応液から分離したうえで、オリゴヌクレオチドプローブと接触させるのが普通である。ところが、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以後、インターカレーター標識プローブと呼ぶことがある）を用いるハイブリダイゼイション法では、オリゴヌクレオチドプローブ存在下でＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ法を実施しつつ、反応液の蛍光特性の変化を測定することが可能である。インターカレーター標識プローブは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸と相補的な２本鎖を形成するとインターカレーター部分が前記２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない検出が可能となる（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７）。従って、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブと前記特定ＲＮＡ配列増幅法を組み合わせることで、温度の上げ下げが不要で、かつ増幅産物を取り出して分離分析する必要のない特異的な測定が可能となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
インターカレーター標識プローブと前記特定ＲＮＡ配列増幅法を組み合わせることによって、自動化に適した測定法を提供することが可能となった。しかし、同時に２種類以上の核酸を検出しようとする場合には、解決しなければならない課題が存在していた。即ち、標識に使用するインターカレーター性蛍光色素の種類は豊富であるものの、同時に区別して検出し得るインターカレーター性蛍光色素を選択することは容易ではないし、同時に多波長の蛍光測定が必要となり、場合によっては励起波長も多波長にする必要もあるため、検出装置を提供することが困難になったり、提供できたとしても複雑化して高額化する等の課題があった。しかも、例えば３種類以上の核酸を同時に検出しようとすると、３種類以上の、相互に区別し得るインターカレーター性蛍光色素を予め選択し、オリゴヌクレオチドに結合させ、３種類以上のインターカレーター標識プローブを調製しておかねばならない等、プローブの調製に長時間を要するという課題や、実際の操作において検出しようとする核酸の種類が増加した場合には、迅速に対応できないという課題もあった。
【０００６】
１種類のインターカレーター性蛍光色素のみで上記課題を回避することが不可能な訳ではない。例えば検出しようとする核酸の種類数に対応した数の反応液（容器）を準備し、検出しようとする核酸に対応したオリゴヌクレオチドを有するインターカレーター標識プローブを添加すれば、１種類のインターカレーター性蛍光色素のみで２種類以上の核酸を検出することが可能である。しかしこの場合には、１試料中の２種類以上の核酸について検出を行う場合、少なくとも核酸種数と同数の反応液を準備して検出を行う必要があり、コスト面や、増幅反応及び検出を行うための装置に高い処理能力が要求される等という、別の課題が生じてしまう。また更に、反応液を２種類以上準備する必要があるため、検出に要する試料量も増加してしまう。
【０００７】
そこで、１種類のインターカレーター性蛍光色素のみを使用した場合であっても、上記課題が生ずることのない検出方法が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、少なくとも２種類の標的核酸を、同一容器内でかつ同一蛍光波長で同時検出する方法を提供するものである。すなわち請求項１の発明は、試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、前記核酸のそれぞれに対して異なるＴｍ値で相補的２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、同一の蛍光物質で標識された核酸プローブと前記核酸との２本鎖を形成させ、該２本鎖のＴｍ値を識別することによって、前記核酸のそれぞれを同一容器内で同時に検出することを特徴とする、核酸の検出方法である。請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記蛍光物質で標識された核酸プローブが前記核酸と相補的２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成されていることを特徴とする。
【０００９】
請求項３の発明は、請求項２の発明に係り、試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、（１）前記核酸のそれぞれに対して相補的な２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、該２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブを試料に添加する工程、（２）該試料の温度を連続的に変化させ、温度変化に伴う蛍光強度を測定する工程、（３）該蛍光強度の変化から得られたＴｍ値より前記核酸のそれぞれを同時に検出する工程、からなることを特徴とする。
【００１０】
請求項４の発明は、請求項３の発明に係り、試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、（１）前記核酸のそれぞれを鋳型として、プロモーター配列を末端に有する２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型として転写を行うことによって前記核酸のそれぞれに由来するＲＮＡ産物を生産し、さらに該ＲＮＡ産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡが合成される反応が連鎖的に起こる条件で核酸増幅を実施する工程、（２）該核酸増幅の反応前あるいは反応後に、前記核酸増幅産物のそれぞれに対して相補的な２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、該２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブを添加する工程、（３）前記核酸増幅産物の温度を連続的に変化させ、温度変化に伴う蛍光強度を測定する工程、（４）該蛍光強度の変化から得られたＴｍ値より前記核酸のそれぞれを検出する工程、からなることを特徴とする。
【００１１】
請求項５の発明は、請求項２から請求項４のいずれかの発明に係り、前記２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブが、オリゴヌクレオチドにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたものであることを特徴とする。以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、少なくとも２種類の検出しようとする核酸（以下、標的核酸ということがある）を、同時に検出する方法、具体的には、同一の蛍光色素、好ましくはインターカレーター性蛍光色素で標識した、標的核酸に対し相補的結合が可能な塩基配列を有するインターカレーター標識プローブであって、相互に異なるＴｍ値を有するものを同一の反応液（容器）に添加し、温度を変化させて蛍光強度を測定する方法を提供するものである。
【００１３】
一般に、相互に相補的に結合した２本鎖核酸の水溶液に熱を加えていくと、やがて１本鎖に変性することが知られている。この際、２本鎖核酸の５０％が１本鎖に開裂する温度をＴｍと呼んでおり、２本鎖核酸の安定性の指標とされている。Ｔｍ値は、相補結合を形成する配列の長さ、および該配列に含まれるグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の割合などに依存している事が知られており、任意のＴｍ値を有するプローブを設計することが可能である。従って、本発明に使用する、異なるＴｍ値を有するプローブも任意に作製することが可能である。
【００１４】
プローブの作製に当たっては、Ｔｍ値が可能な限り大きく異なるようにすることが好ましい。本発明における「異なる」の意味は、本発明の実施に際して使用する蛍光強度の測定に用いる装置の検出感度や、本発明の実施に際して採用する温度変化の様式及び温度を変化させるに際しての温度上昇率（単位時間当たりの温度の上昇幅）等において、それぞれＴｍ値が区別して検出し得ることを意味する。一般的には、より検出感度の高い測定装置を使用し、連続的に、時間をかけてゆっくりと温度を変化させるのであれば、Ｔｍ値の相違は小さくとも十分に区別して検出することが可能であり、その一例を示せば、後の実施例に記載したように３℃程度の相違でも十分である。逆に、検出感度の低い装置を使用したり、断続的（例えば５℃きざみ）に温度を変化させたり、より短時間の間に温度変化を行う等するのであれば、大きくＴｍ値が異なるプローブを使用するべきである。
【００１５】
本願発明の標的核酸としては、１本鎖および２本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡを用いることができる。例えば、１本鎖ＲＮＡとして、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡなどが例示できる。また、１本鎖ＤＮＡは、Ｍ１３ベクター上に挿入してファージ生産させ、該ファージより核酸抽出するなどして得ることが可能であり、また２本鎖核酸は熱変性あるいはアルカリ変性し、必要に応じて１本鎖核酸を分離するなどして使用可能であるが、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法に代表される特定ＲＮＡ配列の増幅法によって標的核酸を増幅し、生産された１本鎖ＲＮＡ産物として用いることが好ましい。前記特定ＲＮＡ配列増幅法は、少なくとも一方にプロモーター配列を含む１組のプライマー、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメレース（必要に応じてリボヌクレエースＨを添加しても良い）のそれぞれが機能する条件で、標的核酸を鋳型としてプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、特定ＲＮＡ配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応により特定ＲＮＡ配列の増幅を行うものである。前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡは、標的核酸がＲＮＡの場合にはＲＮＡを鋳型として逆転写酵素のＤＮＡ合成により生成されるが、２本鎖ＤＮＡを標的核酸とする場合も既知の遺伝子工学的手法を用いることによって生成できることはいうまでもない。前記ＲＮＡ増幅法の産物は、変性処理することなく、引き続いてＴｍの測定に用いることができる。
【００１６】
本発明で用いるプローブは、同一の蛍光物質で標識されたものである。特に好ましくは、標的核酸と２本鎖を形成することによって蛍光強度が変化するように構成したものを使用する。このようなものとして、オリゴヌクレオチドにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたインターカレーター標識プローブが例示できる。標的核酸と２本鎖を形成することによって蛍光強度が変化するように構成した標識したプローブでは、検出される蛍光シグナル自体が標的核酸と２本鎖を形成している場合としていない場合で変化するため、標的核酸と結合したプローブと未結合のプローブを分離する必要がなく、従って温度を変化させつつ、Ｔｍ値を測定することが可能である。一方、標的核酸と２本鎖を形成しても蛍光強度が変化しないように構成した標識したプローブを使用する場合には、温度を保った状態で標的核酸と結合したプローブ又は未結合のプローブのいずれか一方（両方でも良い）を分離し、検出を行えば良い。分離のためには、例えば固相に結合したオリゴヌクレオチド等を用いて標的核酸を固相にトラップし、トラップされた標的核酸とプローブがハイブリダイズ可能な状態で液相を分離する操作を行うことが例示できる。以後は、主としてインターカレーター標識プローブを使用する場合について説明する。
【００１７】
前記ＲＮＡ増幅法と前記インターカレーター標識プローブを用いた場合、前記インターカレーター標識プローブは反応の任意の時点で添加することが可能である。例えば、インターカレーター標識プローブをあらかじめＲＮＡ増幅反応液中に添加し、ＲＮＡ増幅反応を実施し、同時に蛍光強度を経時的に測定することによって増幅産物量をモニターすることも可能である。引き続いて、蛍光強度を経時的に測定しながら、前記ＲＮＡ増幅反応の産物を徐々に加熱するか、加熱して一旦変性状態とした後に徐々に冷却するか、あるいは加熱して一旦変性状態とした後に急冷し、続いて徐々に加熱するなどの温度制御を行うことによって核酸の融解曲線を得ることができる。
【００１８】
Ｔｍ値は、該融解曲線の変曲点と変曲点の中点から求めることが可能であり、該中点は融解曲線の微分値（絶対値）をとった場合の最大値として求めることもできる。この場合、得られたＴｍ値と前記プローブのＴｍの設計値を比較することによって観察された蛍光増加が特異的なＲＮＡ増幅産物に由来するものかどうかを確認することも可能である。
【００１９】
前記工程に従えば、同一のインターカレーター性蛍光色素で標識された複数種類の核酸プローブを用いてＴｍ値を識別することにより同一容器内で同時に複数種類の核酸を検出できる。すなわち、少なくとも２種の標的核酸のそれぞれが増幅し得る条件で前記特定ＲＮＡの増幅を行い、該増幅反応の反応前あるいは反応後に、それぞれの増幅産物に対し相互に異なるＴｍ値にて相補的に結合し得る配列を有し、同一のインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを添加し、引き続いて、蛍光強度を経時的に測定しながら前記に記載のように温度を変化させる。これにより、融解曲線が得られ、該融解曲線を前記記載のように解析することで前記プローブのそれぞれのＴｍ値における微分値のピークの有無を判別し、標的核酸の有無を判断することができる。なお、本発明の方法に使用できる蛍光分光光度計としては、温度制御および温度モニターしながら蛍光強度を測定できる機能を有するものであれば特に限定しない。このような装置として、ライトサイクラー クイックシステム３３０（ロシュ・ダイアゴノスティックス（株）製）などが例示できる。
【００２０】
【発明の実施形態】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１ 標的ＲＮＡの増幅およびＴｍ値の測定
（１）使用した標準ＲＮＡは、ｉｎｖＡ（サルモネラの侵入性因子関連遺伝子配列を含む１９５４塩基のＲＮＡ）、ＶＴ２（大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素２型遺伝子配列を含む１３６１塩基のＲＮＡ）、ｔｄｈ２（腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒遺伝子配列を含む６１６塩基のＲＮＡ）である。
【００２１】
これらの配列の標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１００００コピー／１０μｌになるように各々調製しＲＮＡ試料とした。
【００２２】
（２）以下の組成のｉｎｖＡ、ＶＴ２、ｔｄｈ２増幅用反応液（それぞれ２０μｌ）を０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これらに上記ＲＮＡ試料５μｌをそれぞれ添加した。なお、第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー）、第二のオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）、第三のオリゴヌクレオチド（標準ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末端にアミノ基（ＮＨ２）を結合して修飾）及びインターカレーター標識プローブは、ｉｎｖＡ用が配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０であり、ＶＴ２用が配列番号２、配列番号５、配列番号８及び配列番号１１であり、ｔｄｈ２用が配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１２である。
【００２３】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．７ｍＭ 塩化マグネシウム
１２０ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド（配列番号１、２及び３）
１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド（配列番号４、５及び６）
０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド（配列番号７、８及び９）
１３％ ＤＭＳＯ
２５ｎＭ インターカレーター標識プローブ（配列番号１０、１１及び１２）
容量調整用蒸留水
（３）なお、上記各標準ＲＮＡに相補的なインターカレーター標識プローブは、石黒ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４（２４）４９９２−４９９７（１９９６））に従い、インターカレーター蛍光色素としてオキサゾールイエローを結合させたものを使用した。またｉｎｖＡ用のもの（配列番号１０）は５’端から１３番目の「Ａ」のリンに、ＶＴ２用のもの（配列番号１１）は５’端から１２番目の「Ｔ」のリンに、そしてｔｄｈ２用のもの（配列番号１２）は５’端から１６番目の「Ｇ」のリンにリンカーを介してオキサゾールイエローを結合したものである。
【００２４】
（４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液５μｌを添加した。
【００２５】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ソルビトール
３．６μｇ牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製）
１Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＨ
容量調整用蒸留水
（５）引き続き上記ＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温し、ＲＮＡ増幅反応を行った。
【００２６】
（６）上記溶液を試料室内が温度調整できる蛍光分光光度計にセットし、蛍光強度を経時的に測定するとともに（励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）、上記反応液を９５℃で１秒間加熱後、４１℃に冷却し、４１℃から８５℃まで０．１℃／秒で温度を上昇させた。得られた蛍光強度の変化（融解曲線）からＴｍ値を求めた。
【００２７】
（７）各標準ＲＮＡを用いた場合の融解曲線を図１に、該融解曲線の微分値のグラフを図２に示した。前記３種類の（前記プローブを含む）増幅産物のそれぞれは固有のＴｍ値において微分値のピークが認められ、いずれも重なり合わないことが確認された。またこのようにＴｍ値が別個に検出できたことから、各遺伝子増幅産物、強いてはその増幅の鋳型となった各標準ＲＮＡの存在を確認することができた。
【００２８】
実施例２ ３種の標的ＲＮＡの同時増幅および検出
（１）実施例１で使用した標準ＲＮＡ（ｉｎｖＡ、ＶＴ２及びｔｄｈ２）を使用した。これらの配列の標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１００００コピー／１０μｌになるように調製し、ＲＮＡ試料とした。
【００２９】
（２）以下の組成の（ｉｎｖＡ、ＶＴ２、ｔｄｈ２同時増幅条件の）反応液２０ｕｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３０】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．７ｍＭ 塩化マグネシウム
１２０ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
各１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド（実施例１と同じ）
各１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド（実施例１と同じ）
各０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド（実施例１と同じ）
１３％ ＤＭＳＯ
各２５ｎＭ インターカレーター標識プローブ（実施例１と同じ）
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液５μｌを添加した。
【００３１】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ソルビトール
３．６μｇ牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製）
１Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＨ
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温し、ＲＮＡ増幅を行った。
【００３２】
（５）上記溶液を試料室内が温度調整できる蛍光光度計にセットし、蛍光強度を経時的に測定する（励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）とともに、９５℃で１秒間加熱後、４１℃に冷却し、４１℃から８５℃まで０．１℃／秒で温度を上昇させた。得られた蛍光強度の変化（融解曲線）からＴｍ値を求めた。
【００３３】
前記３種の標準ＲＮＡを同時増幅して得られたＲＮＡ産物の融解曲線について、一次微分の負の値をとったグラフを図３に、実施例１および実施例２の結果（図２及び図３）から得られたＴｍ値を表１に示した。前記３種類の同時増幅産物をＴｍ値における微分値のピークでそれぞれ識別することができた。以上から、本発明により、同一のインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを用い、複数項目を同一容器内で同時検出可能であることが示された。またこのようにＴｍ値が別個に検出できたことから、各遺伝子増幅産物、強いてはその増幅の鋳型となった各標準ＲＮＡの存在を確認することができた。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明によれば、同一の蛍光色素を標識として使用しつつ、同時に２種類以上の核酸を検出することが可能となる。この結果、相互に区別し得る蛍光色素を予め選択し、オリゴヌクレオチドに結合させ、複数のプローブを調製しておく必要がなく、プローブの調製に長時間を要するという課題や、実際の操作において検出しようとする核酸の種類が増加した場合に、迅速に対応できないという課題を解決することができる。
【００３６】
本発明は、Ｔｍ値から標的核酸を検出するものである。そのため、同一の蛍光色素を標識として使用するにもかかわらず、標的核酸種数と同数の反応液を準備する必要はなく、結果的に増幅反応及び検出を行うための装置に高い処理能力が要求される等という課題や、検出に要する試料量が増加するという課題が生じることはない。
【００３７】
本発明において、インターカレーター標識プローブを用いれば、Ｔｍ値の検出の際に標的核酸と結合したプローブと未結合のプローブを分離する必要もなくなる。従って、インターカレーター標識プローブを用いる本発明の形態は、特に自動化に適した測定法を提供するために好適である。即ち、複数の反応液に対する複数の温度変化機構や複数の検出機構（光学系等）を設ける必要なしに、複数の標的核酸を同時に検出することが可能になる。このように本発明は、装置の簡便化、低コスト化、および自動化にとって有効なものである。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】各標準ＲＮＡを個別に増幅し、それぞれの（インターカレーター標識プローブ含有）ＲＮＡ増幅産物の温度を変化させて、蛍光強度を測定した融解曲線である。
【図２】図１に示した融解曲線について、一次微分の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）をとり、該微分値のピーク（Ｔｍ値）を示した。
【図３】３種類の標準ＲＮＡを１本のチューブ内で同時に増幅し、その増幅産物の温度を変化させて蛍光強度を測定した融解曲線について、一次微分の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）をとり、該微分値のピーク（Ｔｍ値）を示した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される特定核酸配列の分析方法に関するものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の高感度な検出法として標的核酸を増幅する方法の利用が可能である。特定のＤＮＡ配列の増幅法としては、ポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。ＰＣＲ法は、急激な温度の上げ下げが必要で、このことが反応時間の短縮や自動化の大きな障壁となっている。一方、一定温度の核酸増幅法としては、逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、およびリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応によりＲＮＡ増幅を行うもので、一定温度の増幅が可能であり、連続処理や自動化に適した方法であるといえる。
【０００３】
いずれの方法の場合も、増幅産物は電気泳動などの分離分析やハイブリダイゼイション法などの既知の核酸検出方法で検出するのが一般的である。特に特異的に増幅産物を検出する場合は検出可能な信号を発する物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼイション法が用いられる。
【０００４】
ハイブリダイゼイション法では、ＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ法によって増幅した核酸を反応液から分離したうえで、オリゴヌクレオチドプローブと接触させるのが普通である。ところが、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以後、インターカレーター標識プローブと呼ぶことがある）を用いるハイブリダイゼイション法では、オリゴヌクレオチドプローブ存在下でＰＣＲ法やＮＡＳＢＡ法を実施しつつ、反応液の蛍光特性の変化を測定することが可能である。インターカレーター標識プローブは、オリゴヌクレオチド中のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたもので、標的核酸と相補的な２本鎖を形成するとインターカレーター部分が前記２本鎖部分にインターカレートして蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない検出が可能となる（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７）。従って、インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブと前記特定ＲＮＡ配列増幅法を組み合わせることで、温度の上げ下げが不要で、かつ増幅産物を取り出して分離分析する必要のない特異的な測定が可能となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
インターカレーター標識プローブと前記特定ＲＮＡ配列増幅法を組み合わせることによって、自動化に適した測定法を提供することが可能となった。しかし、同時に２種類以上の核酸を検出しようとする場合には、解決しなければならない課題が存在していた。即ち、標識に使用するインターカレーター性蛍光色素の種類は豊富であるものの、同時に区別して検出し得るインターカレーター性蛍光色素を選択することは容易ではないし、同時に多波長の蛍光測定が必要となり、場合によっては励起波長も多波長にする必要もあるため、検出装置を提供することが困難になったり、提供できたとしても複雑化して高額化する等の課題があった。しかも、例えば３種類以上の核酸を同時に検出しようとすると、３種類以上の、相互に区別し得るインターカレーター性蛍光色素を予め選択し、オリゴヌクレオチドに結合させ、３種類以上のインターカレーター標識プローブを調製しておかねばならない等、プローブの調製に長時間を要するという課題や、実際の操作において検出しようとする核酸の種類が増加した場合には、迅速に対応できないという課題もあった。
【０００６】
１種類のインターカレーター性蛍光色素のみで上記課題を回避することが不可能な訳ではない。例えば検出しようとする核酸の種類数に対応した数の反応液（容器）を準備し、検出しようとする核酸に対応したオリゴヌクレオチドを有するインターカレーター標識プローブを添加すれば、１種類のインターカレーター性蛍光色素のみで２種類以上の核酸を検出することが可能である。しかしこの場合には、１試料中の２種類以上の核酸について検出を行う場合、少なくとも核酸種数と同数の反応液を準備して検出を行う必要があり、コスト面や、増幅反応及び検出を行うための装置に高い処理能力が要求される等という、別の課題が生じてしまう。また更に、反応液を２種類以上準備する必要があるため、検出に要する試料量も増加してしまう。
【０００７】
そこで、１種類のインターカレーター性蛍光色素のみを使用した場合であっても、上記課題が生ずることのない検出方法が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、少なくとも２種類の標的核酸を、同一容器内でかつ同一蛍光波長で同時検出する方法を提供するものである。すなわち請求項１の発明は、試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、前記核酸のそれぞれに対して異なるＴｍ値で相補的２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、同一の蛍光物質で標識された核酸プローブと前記核酸との２本鎖を形成させ、該２本鎖のＴｍ値を識別することによって、前記核酸のそれぞれを同一容器内で同時に検出することを特徴とする、核酸の検出方法である。請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記蛍光物質で標識された核酸プローブが前記核酸と相補的２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成されていることを特徴とする。
【０００９】
請求項３の発明は、請求項２の発明に係り、試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、（１）前記核酸のそれぞれに対して相補的な２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、該２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブを試料に添加する工程、（２）該試料の温度を連続的に変化させ、温度変化に伴う蛍光強度を測定する工程、（３）該蛍光強度の変化から得られたＴｍ値より前記核酸のそれぞれを同時に検出する工程、からなることを特徴とする。
【００１０】
請求項４の発明は、請求項３の発明に係り、試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、（１）前記核酸のそれぞれを鋳型として、プロモーター配列を末端に有する２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型として転写を行うことによって前記核酸のそれぞれに由来するＲＮＡ産物を生産し、さらに該ＲＮＡ産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡが合成される反応が連鎖的に起こる条件で核酸増幅を実施する工程、（２）該核酸増幅の反応前あるいは反応後に、前記核酸増幅産物のそれぞれに対して相補的な２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、該２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブを添加する工程、（３）前記核酸増幅産物の温度を連続的に変化させ、温度変化に伴う蛍光強度を測定する工程、（４）該蛍光強度の変化から得られたＴｍ値より前記核酸のそれぞれを検出する工程、からなることを特徴とする。
【００１１】
請求項５の発明は、請求項２から請求項４のいずれかの発明に係り、前記２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブが、オリゴヌクレオチドにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたものであることを特徴とする。以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、少なくとも２種類の検出しようとする核酸（以下、標的核酸ということがある）を、同時に検出する方法、具体的には、同一の蛍光色素、好ましくはインターカレーター性蛍光色素で標識した、標的核酸に対し相補的結合が可能な塩基配列を有するインターカレーター標識プローブであって、相互に異なるＴｍ値を有するものを同一の反応液（容器）に添加し、温度を変化させて蛍光強度を測定する方法を提供するものである。
【００１３】
一般に、相互に相補的に結合した２本鎖核酸の水溶液に熱を加えていくと、やがて１本鎖に変性することが知られている。この際、２本鎖核酸の５０％が１本鎖に開裂する温度をＴｍと呼んでおり、２本鎖核酸の安定性の指標とされている。Ｔｍ値は、相補結合を形成する配列の長さ、および該配列に含まれるグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の割合などに依存している事が知られており、任意のＴｍ値を有するプローブを設計することが可能である。従って、本発明に使用する、異なるＴｍ値を有するプローブも任意に作製することが可能である。
【００１４】
プローブの作製に当たっては、Ｔｍ値が可能な限り大きく異なるようにすることが好ましい。本発明における「異なる」の意味は、本発明の実施に際して使用する蛍光強度の測定に用いる装置の検出感度や、本発明の実施に際して採用する温度変化の様式及び温度を変化させるに際しての温度上昇率（単位時間当たりの温度の上昇幅）等において、それぞれＴｍ値が区別して検出し得ることを意味する。一般的には、より検出感度の高い測定装置を使用し、連続的に、時間をかけてゆっくりと温度を変化させるのであれば、Ｔｍ値の相違は小さくとも十分に区別して検出することが可能であり、その一例を示せば、後の実施例に記載したように３℃程度の相違でも十分である。逆に、検出感度の低い装置を使用したり、断続的（例えば５℃きざみ）に温度を変化させたり、より短時間の間に温度変化を行う等するのであれば、大きくＴｍ値が異なるプローブを使用するべきである。
【００１５】
本願発明の標的核酸としては、１本鎖および２本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡを用いることができる。例えば、１本鎖ＲＮＡとして、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡなどが例示できる。また、１本鎖ＤＮＡは、Ｍ１３ベクター上に挿入してファージ生産させ、該ファージより核酸抽出するなどして得ることが可能であり、また２本鎖核酸は熱変性あるいはアルカリ変性し、必要に応じて１本鎖核酸を分離するなどして使用可能であるが、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法に代表される特定ＲＮＡ配列の増幅法によって標的核酸を増幅し、生産された１本鎖ＲＮＡ産物として用いることが好ましい。前記特定ＲＮＡ配列増幅法は、少なくとも一方にプロモーター配列を含む１組のプライマー、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメレース（必要に応じてリボヌクレエースＨを添加しても良い）のそれぞれが機能する条件で、標的核酸を鋳型としてプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレースにより、特定ＲＮＡ配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応により特定ＲＮＡ配列の増幅を行うものである。前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡは、標的核酸がＲＮＡの場合にはＲＮＡを鋳型として逆転写酵素のＤＮＡ合成により生成されるが、２本鎖ＤＮＡを標的核酸とする場合も既知の遺伝子工学的手法を用いることによって生成できることはいうまでもない。前記ＲＮＡ増幅法の産物は、変性処理することなく、引き続いてＴｍの測定に用いることができる。
【００１６】
本発明で用いるプローブは、同一の蛍光物質で標識されたものである。特に好ましくは、標的核酸と２本鎖を形成することによって蛍光強度が変化するように構成したものを使用する。このようなものとして、オリゴヌクレオチドにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたインターカレーター標識プローブが例示できる。標的核酸と２本鎖を形成することによって蛍光強度が変化するように構成した標識したプローブでは、検出される蛍光シグナル自体が標的核酸と２本鎖を形成している場合としていない場合で変化するため、標的核酸と結合したプローブと未結合のプローブを分離する必要がなく、従って温度を変化させつつ、Ｔｍ値を測定することが可能である。一方、標的核酸と２本鎖を形成しても蛍光強度が変化しないように構成した標識したプローブを使用する場合には、温度を保った状態で標的核酸と結合したプローブ又は未結合のプローブのいずれか一方（両方でも良い）を分離し、検出を行えば良い。分離のためには、例えば固相に結合したオリゴヌクレオチド等を用いて標的核酸を固相にトラップし、トラップされた標的核酸とプローブがハイブリダイズ可能な状態で液相を分離する操作を行うことが例示できる。以後は、主としてインターカレーター標識プローブを使用する場合について説明する。
【００１７】
前記ＲＮＡ増幅法と前記インターカレーター標識プローブを用いた場合、前記インターカレーター標識プローブは反応の任意の時点で添加することが可能である。例えば、インターカレーター標識プローブをあらかじめＲＮＡ増幅反応液中に添加し、ＲＮＡ増幅反応を実施し、同時に蛍光強度を経時的に測定することによって増幅産物量をモニターすることも可能である。引き続いて、蛍光強度を経時的に測定しながら、前記ＲＮＡ増幅反応の産物を徐々に加熱するか、加熱して一旦変性状態とした後に徐々に冷却するか、あるいは加熱して一旦変性状態とした後に急冷し、続いて徐々に加熱するなどの温度制御を行うことによって核酸の融解曲線を得ることができる。
【００１８】
Ｔｍ値は、該融解曲線の変曲点と変曲点の中点から求めることが可能であり、該中点は融解曲線の微分値（絶対値）をとった場合の最大値として求めることもできる。この場合、得られたＴｍ値と前記プローブのＴｍの設計値を比較することによって観察された蛍光増加が特異的なＲＮＡ増幅産物に由来するものかどうかを確認することも可能である。
【００１９】
前記工程に従えば、同一のインターカレーター性蛍光色素で標識された複数種類の核酸プローブを用いてＴｍ値を識別することにより同一容器内で同時に複数種類の核酸を検出できる。すなわち、少なくとも２種の標的核酸のそれぞれが増幅し得る条件で前記特定ＲＮＡの増幅を行い、該増幅反応の反応前あるいは反応後に、それぞれの増幅産物に対し相互に異なるＴｍ値にて相補的に結合し得る配列を有し、同一のインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを添加し、引き続いて、蛍光強度を経時的に測定しながら前記に記載のように温度を変化させる。これにより、融解曲線が得られ、該融解曲線を前記記載のように解析することで前記プローブのそれぞれのＴｍ値における微分値のピークの有無を判別し、標的核酸の有無を判断することができる。なお、本発明の方法に使用できる蛍光分光光度計としては、温度制御および温度モニターしながら蛍光強度を測定できる機能を有するものであれば特に限定しない。このような装置として、ライトサイクラー クイックシステム３３０（ロシュ・ダイアゴノスティックス（株）製）などが例示できる。
【００２０】
【発明の実施形態】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１ 標的ＲＮＡの増幅およびＴｍ値の測定
（１）使用した標準ＲＮＡは、ｉｎｖＡ（サルモネラの侵入性因子関連遺伝子配列を含む１９５４塩基のＲＮＡ）、ＶＴ２（大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素２型遺伝子配列を含む１３６１塩基のＲＮＡ）、ｔｄｈ２（腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒遺伝子配列を含む６１６塩基のＲＮＡ）である。
【００２１】
これらの配列の標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１００００コピー／１０μｌになるように各々調製しＲＮＡ試料とした。
【００２２】
（２）以下の組成のｉｎｖＡ、ＶＴ２、ｔｄｈ２増幅用反応液（それぞれ２０μｌ）を０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これらに上記ＲＮＡ試料５μｌをそれぞれ添加した。なお、第一のオリゴヌクレオチド（Ｔ７ＲＮＡポリメレース・プロモーター配列含有センスプライマー）、第二のオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライマー）、第三のオリゴヌクレオチド（標準ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末端にアミノ基（ＮＨ２）を結合して修飾）及びインターカレーター標識プローブは、ｉｎｖＡ用が配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０であり、ＶＴ２用が配列番号２、配列番号５、配列番号８及び配列番号１１であり、ｔｄｈ２用が配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１２である。
【００２３】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．７ｍＭ 塩化マグネシウム
１２０ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド（配列番号１、２及び３）
１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド（配列番号４、５及び６）
０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド（配列番号７、８及び９）
１３％ ＤＭＳＯ
２５ｎＭ インターカレーター標識プローブ（配列番号１０、１１及び１２）
容量調整用蒸留水
（３）なお、上記各標準ＲＮＡに相補的なインターカレーター標識プローブは、石黒ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４（２４）４９９２−４９９７（１９９６））に従い、インターカレーター蛍光色素としてオキサゾールイエローを結合させたものを使用した。またｉｎｖＡ用のもの（配列番号１０）は５’端から１３番目の「Ａ」のリンに、ＶＴ２用のもの（配列番号１１）は５’端から１２番目の「Ｔ」のリンに、そしてｔｄｈ２用のもの（配列番号１２）は５’端から１６番目の「Ｇ」のリンにリンカーを介してオキサゾールイエローを結合したものである。
【００２４】
（４）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液５μｌを添加した。
【００２５】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ソルビトール
３．６μｇ牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製）
１Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＨ
容量調整用蒸留水
（５）引き続き上記ＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温し、ＲＮＡ増幅反応を行った。
【００２６】
（６）上記溶液を試料室内が温度調整できる蛍光分光光度計にセットし、蛍光強度を経時的に測定するとともに（励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）、上記反応液を９５℃で１秒間加熱後、４１℃に冷却し、４１℃から８５℃まで０．１℃／秒で温度を上昇させた。得られた蛍光強度の変化（融解曲線）からＴｍ値を求めた。
【００２７】
（７）各標準ＲＮＡを用いた場合の融解曲線を図１に、該融解曲線の微分値のグラフを図２に示した。前記３種類の（前記プローブを含む）増幅産物のそれぞれは固有のＴｍ値において微分値のピークが認められ、いずれも重なり合わないことが確認された。またこのようにＴｍ値が別個に検出できたことから、各遺伝子増幅産物、強いてはその増幅の鋳型となった各標準ＲＮＡの存在を確認することができた。
【００２８】
実施例２ ３種の標的ＲＮＡの同時増幅および検出
（１）実施例１で使用した標準ＲＮＡ（ｉｎｖＡ、ＶＴ２及びｔｄｈ２）を使用した。これらの配列の標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で１００００コピー／１０μｌになるように調製し、ＲＮＡ試料とした。
【００２９】
（２）以下の組成の（ｉｎｖＡ、ＶＴ２、ｔｄｈ２同時増幅条件の）反応液２０ｕｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲチューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３０】
反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．７ｍＭ 塩化マグネシウム
１２０ｍＭ 塩化カリウム
６Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
各１．０μＭの第一のオリゴヌクレオチド（実施例１と同じ）
各１．０μＭの第二のオリゴヌクレオチド（実施例１と同じ）
各０．１６μＭの第三のオリゴヌクレオチド（実施例１と同じ）
１３％ ＤＭＳＯ
各２５ｎＭ インターカレーター標識プローブ（実施例１と同じ）
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液５μｌを添加した。
【００３１】
酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
１．７％ソルビトール
３．６μｇ牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製）
８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造製）
１Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＨ
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温し、ＲＮＡ増幅を行った。
【００３２】
（５）上記溶液を試料室内が温度調整できる蛍光光度計にセットし、蛍光強度を経時的に測定する（励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ）とともに、９５℃で１秒間加熱後、４１℃に冷却し、４１℃から８５℃まで０．１℃／秒で温度を上昇させた。得られた蛍光強度の変化（融解曲線）からＴｍ値を求めた。
【００３３】
前記３種の標準ＲＮＡを同時増幅して得られたＲＮＡ産物の融解曲線について、一次微分の負の値をとったグラフを図３に、実施例１および実施例２の結果（図２及び図３）から得られたＴｍ値を表１に示した。前記３種類の同時増幅産物をＴｍ値における微分値のピークでそれぞれ識別することができた。以上から、本発明により、同一のインターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブを用い、複数項目を同一容器内で同時検出可能であることが示された。またこのようにＴｍ値が別個に検出できたことから、各遺伝子増幅産物、強いてはその増幅の鋳型となった各標準ＲＮＡの存在を確認することができた。
【００３４】
【表１】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明によれば、同一の蛍光色素を標識として使用しつつ、同時に２種類以上の核酸を検出することが可能となる。この結果、相互に区別し得る蛍光色素を予め選択し、オリゴヌクレオチドに結合させ、複数のプローブを調製しておく必要がなく、プローブの調製に長時間を要するという課題や、実際の操作において検出しようとする核酸の種類が増加した場合に、迅速に対応できないという課題を解決することができる。
【００３６】
本発明は、Ｔｍ値から標的核酸を検出するものである。そのため、同一の蛍光色素を標識として使用するにもかかわらず、標的核酸種数と同数の反応液を準備する必要はなく、結果的に増幅反応及び検出を行うための装置に高い処理能力が要求される等という課題や、検出に要する試料量が増加するという課題が生じることはない。
【００３７】
本発明において、インターカレーター標識プローブを用いれば、Ｔｍ値の検出の際に標的核酸と結合したプローブと未結合のプローブを分離する必要もなくなる。従って、インターカレーター標識プローブを用いる本発明の形態は、特に自動化に適した測定法を提供するために好適である。即ち、複数の反応液に対する複数の温度変化機構や複数の検出機構（光学系等）を設ける必要なしに、複数の標的核酸を同時に検出することが可能になる。このように本発明は、装置の簡便化、低コスト化、および自動化にとって有効なものである。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】各標準ＲＮＡを個別に増幅し、それぞれの（インターカレーター標識プローブ含有）ＲＮＡ増幅産物の温度を変化させて、蛍光強度を測定した融解曲線である。
【図２】図１に示した融解曲線について、一次微分の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）をとり、該微分値のピーク（Ｔｍ値）を示した。
【図３】３種類の標準ＲＮＡを１本のチューブ内で同時に増幅し、その増幅産物の温度を変化させて蛍光強度を測定した融解曲線について、一次微分の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）をとり、該微分値のピーク（Ｔｍ値）を示した。
Claims (5)
- 試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、前記核酸のそれぞれに対して異なるＴｍ値で相補的２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、同一の蛍光物質で標識された核酸プローブと前記核酸との２本鎖を形成させ、該２本鎖のＴｍ値を識別することによって、前記核酸のそれぞれを同一容器内で同時に検出することを特徴とする核酸の検出方法。
- 前記蛍光物質で標識された核酸プローブが前記核酸と相補的２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成されていることを特徴とする請求項第１に記載の核酸の検出方法。
- 試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、
（１）前記核酸のそれぞれに対して相補的な２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、該２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブを試料に添加する工程、
（２）該試料の温度を連続的に変化させ、温度変化に伴う蛍光強度を測定する工程、
（３）該蛍光強度の変化からＴｍ値をもとめ、該Ｔｍ値より前記核酸のそれぞれを同時に検出する工程、からなることを特徴とする請求項第２に記載の核酸の検出方法。 - 試料中に含まれる少なくとも２種の核酸を検出する方法であって、
（１）前記核酸のそれぞれを鋳型として、プロモーター配列を末端に有する２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型として転写を行うことによって前記核酸のそれぞれに由来するＲＮＡ産物を生産し、さらに該ＲＮＡ産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡが合成される反応が連鎖的に起こる条件で核酸増幅を実施する工程、
（２）該核酸増幅の反応前あるいは反応後に、前記ＲＮＡ産物のそれぞれに対して相補的な２本鎖を形成し得る塩基配列を有し、該２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブであって相互に異なるＴｍ値を有する核酸プローブを添加する工程、
（３）前記核酸増幅産物の温度を連続的に変化させ、温度変化に伴う蛍光強度を測定する工程、
（４）該蛍光強度の変化からＴｍ値をもとめ、該Ｔｍ値より前記核酸のそれぞれを同時に検出する工程、からなることを特徴とする請求項第３に記載の核酸の検出方法。 - 前記２本鎖を形成することにより蛍光強度が変化するように構成された核酸プローブが、オリゴヌクレオチドにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合させたものであることを特徴とする請求項第２から第４のいずれかに記載の核酸の検出方法。
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