JP2001046099A

JP2001046099A - 増強された核酸増幅法

Info

Publication number: JP2001046099A
Application number: JP2000172002A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Ishizuka; 哲也石塚; Norihiko Ishiguro; 敬彦石黒; Juichi Saito; 寿一斉藤; Tomomi Sakai; 智美酒井
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2001-02-20

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】概ね一定温度で、簡便かつ迅速に、試料中に元
来存在した特定ＲＮＡ配列を飛躍的に増幅させる方法を
提供する。【解決手段】特定核酸を含むと予想される試料中の特定
核酸分析において、試料中の特定ＲＮＡ配列を鋳型とし
て、特定ＲＮＡ配列と相補的および相同的配列を含み、
該配列を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによってＲＮＡ転写
産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が更に２本鎖ＤＮＡの
鋳型となるＲＮＡ増幅工程において、ＲＮＡポリメレー
スの基質としてアデノシン三リン酸、ウリジン三リン
酸、シチジン三リン酸、グアノシン三リン酸に加え、イ
ノシン三リン酸を添加することにより増幅反応の効率を
向上させる特定核酸増幅方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等
の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩基配
列を含む標的ＲＮＡの増幅方法に関するものであり、更
には、標的ＲＮＡを増幅し、定性的又は定量的に分析す
る方法に関するものである。本発明は遺伝子診断等の臨
床診断分野での利用に有用であり、更には、食品中、室
内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性
又は定量を行う際に有用である。

【０００２】

【従来の技術】一般的に、ウイルス感染症の診断では、
臨床試料中の核酸（ウイルス核酸）が極微量であること
が多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現する
ために信号強度を向上し高感度化する目的で、標的核酸
を増幅する方法がとられる。例えば核酸中の特定のDNA
配列を増幅する方法として、ポリメレースチェインリア
クション（ＰＣＲ）法が知られている。この方法は、特
定のDNA配列の両末端部に相補的なプライマー及び相同
なプライマーからなる一組のプライマーと熱耐性DNAポ
リメレースを用いて、熱変性、プライマー・アニール、
伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことにより特
定のDNA配列を増幅するものである。

【０００３】特定塩基配列を含むＲＮＡ（標的ＲＮＡ）
の増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られ
ている。この方法は、標的ＲＮＡに対してプロモーター
配列を含むプライマーと逆転写酵素及びリボヌクレエー
スHを用いて、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを
生成し、ＲＮＡポリメレースにより、特定塩基配列を含
むＲＮＡを生成し、以後は、該生成されたＲＮＡを前記
プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする
連鎖反応を生じさせるものである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般に、ＰＣＲでＲＮ
Ａを増幅する場合、ＰＣＲに先だってＲＮＡを鋳型とす
る逆転写反応を行い、一旦ｃＤＮＡを合成する、いわゆ
るＲＴ−ＰＣＲ法を行わなければならず、実質的に２段
階の工程が要求されることとなる。またＰＣＲは急激な
昇温、降温を必要とするため、特殊なインキュベーター
を必要とし、大量処理を目的とした自動化への適用が容
易ではないという課題もある。

【０００５】一方、前記したようなＲＮＡの増幅法は、
比較的一定温度での反応が可能であるため自動化への適
用が容易である。しかし、試料中に存在する極微量の標
的ＲＮＡをより高感度かつ再現性良く検出するために
は、増幅効率を更に向上させる必要がある。

【０００６】本発明は、更に効率が向上された、試料中
の標的ＲＮＡの増幅方法を提供するものである。また本
発明は、試料中の標的ＲＮＡを更に効率的に増幅しつ
つ、増幅されたＲＮＡを分析する、標的ＲＮＡの分析方
法である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＲＮＡポ
リメレースを用いるＲＮＡの増幅工程において、その基
質であるリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン
酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノシ
ン三リン酸）に加え、更にイノシン三リン酸（以下、
「ＩＴＰ」と略する）を特定量添加することで、増幅効
率を向上し得ることを見出し本発明を完成するに至っ
た。

【０００８】本願請求項１の発明は、特定塩基配列を含
む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列
を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的
な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成
し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は
前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産
物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記
２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程に
おいて、ＲＮＡポリメレースの基質としてアデノシン三
リン酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸、グアノ
シン三リン酸に加え、ＩＴＰを添加することを特徴とす
る標的ＲＮＡの増幅方法である。

【０００９】本願請求項２の発明は、請求項１の発明に
係り、ＲＮＡポリメレースとしてファージＳＰ６のＲＮ
Ａポリメレースを用い、ＩＴＰを終濃度が０．５ｍＭ〜
２ｍＭの範囲となるように添加することを特徴とする。
本願請求項３の発明は、請求項２の発明に係り、添加す
るＩＴＰの終濃度と、それ以外のリボヌクレオシド三リ
ン酸（アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、シチジ
ン三リン酸及びグアノシン三リン酸）の終濃度の比率が
０．５対１．０〜１．５対１．０の範囲であることを特
徴とする。

【００１０】本願請求項４の発明は、請求項１の発明に
係り、少なくとも、トリス塩酸緩衝液（ｐH８．５〜
８．９）の終濃度が２０ｍＭ〜５０ｍＭ、塩化マグネシ
ウムの終濃度が１２ｍＭ〜２０ｍＭ、リボヌクレオシド
三リン酸（アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、シ
チジン三リン酸及びグアノシン三リン酸）の終濃度が
３．５ｍＭ〜５ｍＭ、ＲＮＡポリメレースとしてファー
ジＴ７のＲＮＡポリメレースを含み、イノシン三リン酸
を終濃度が１．０ｍＭ〜２．７ｍＭの範囲となるように
添加することを特徴とする。本願請求項５の発明は、請
求項４の発明に係り、添加するＩＴＰの終濃度と、それ
以外のリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン
酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノシ
ン三リン酸）の終濃度の比率が０．３対１．０〜０．７
対１．０の範囲であることを特徴とする。

【００１１】本願請求項６の発明は、請求項１の発明に
係り、少なくとも、トリス塩酸緩衝液（ｐH８．５〜
８．９）の終濃度が５０ｍＭ〜８０ｍＭ、塩化マグネシ
ウムの終濃度が１２ｍＭ〜２０ｍＭ、リボヌクレオシド
三リン酸（アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、シ
チジン三リン酸及びグアノシン三リン酸）の終濃度が
２．０ｍＭ〜３．５ｍＭ、ＲＮＡポリメレースとしてフ
ァージＴ７のＲＮＡポリメレースを含み、イノシン三リ
ン酸を終濃度が３．２ｍＭ〜４．４ｍＭの範囲となるよ
うに添加することを特徴とする。本願請求項７の発明
は、請求項６の発明に係り、添加するＩＴＰの終濃度
と、それ以外のリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン
三リン酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグ
アノシン三リン酸）の終濃度の比率が１．０対１．０〜
１．０対１．５の範囲であることを特徴とする。

【００１２】本願請求項８の発明は、請求項１の発明に
係り、前記ＲＮＡ増幅工程が、特定塩基配列に相補的な
配列を有するプライマー及び特定塩基配列に相同的な配
列を有するプライマー（ここで一方のプライマーは、
５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有す
るプロモータープライマーである）を用い、標的ＲＮＡ
を鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより１
本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメレースを用いることで、特定塩基
配列又は特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡを
転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生
成すること、そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレ
ース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産
物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
る１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型となるものであることを特徴
とする。

【００１３】本願請求項９の発明は、請求項１の発明に
関連し、その増幅工程をインターカレーター性蛍光色素
で標識されたプローブの存在下で実施し、反応液の蛍光
強度を経時的に測定することからなる標的核酸の分析方
法である。そして本願請求項１０の発明は、請求項９の
発明に係り、前記インターカレーター性蛍光色素で標識
されたプローブが、ＲＮＡ転写産物との相補結合によっ
て、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が
変化するものであることを特徴とする。

【００１４】本発明は、ＲＮＡポリメレースがＤＮＡを
鋳型としてＲＮＡを生成する際に、ＩＴＰが存在すると
ＲＮＡ生成効率が向上するという知見に基づくものであ
る。

【００１５】本発明は、例えば以下（Ａ）〜（Ｉ）の試
薬を用意し、標的ＲＮＡを含むと予想される試料にこれ
らを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加する
か、又はこれらを一度に添加する操作により実施するこ
とが可能である（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加する
ことを要しない）。

【００１６】（Ａ）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定塩基配列
の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖
オリゴヌクレオチド、（Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レース、（Ｃ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（Ｄ）リボヌクレエースHまたは同等のＲＮＡ分解活性
を有する酵素、（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ
依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）
該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）前記１本
鎖ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基
配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド、（Ｆ）
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、（G）ＤＮＡ依存性
ＲＮＡポリメレース、（Ｈ）リボヌクレオシド三リン酸
（アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、シチジン三
リン酸、グアノシン三リン酸）、（Ｉ）ＩＴＰ。

【００１７】また例えば、また、上記試薬（Ａ）及び試
薬（Ｅ）の、第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチド
の組み合わせを用いる以外に、以下の試薬（Ｊ）及び試
薬（Ｋ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドの
組み合わせを用いてもよい。

【００１８】（Ｊ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依
存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該
プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ
中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有
する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、（Ｋ）標的ＲＮ
Ａ中の特定塩基配列の５’側末端配列と同一の塩基配列
を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド。

【００１９】上記において特定塩基配列とは、上記
（Ａ）および（Ｅ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌク
レオチドを使用した場合、５’末端が（Ｅ）の第２の１
本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列で始ま
り、３’末端が（Ａ）の第１の１本鎖オリゴヌクレオチ
ドと相補的な配列で終わる、標的ＲＮＡ中に存在する塩
基配列部分である。また上記（Ｊ）及び（Ｋ）の第１及
び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合に
は、５’末端が（Ｋ）の第２の１本鎖オリゴヌクレオチ
ドと同一な配列で始まり、３’末端が（Ｊ）の第１の１
本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列に相補的
な配列で終わる、標的ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分
である。特定塩基配列は任意に決定することができる
が、標的ＲＮＡを他の核酸から区別し得る程度に特異的
な配列部分を含むようにすることが重要である。

【００２０】試薬（Ａ）は、特定塩基配列の３’末端に
相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド
である。該試薬は標的ＲＮＡに相補結合し、後述する試
薬（Ｂ）及び（Ｃ）の共存下で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレースによる標的ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成
が行われる際に、該ｃＤＮＡの５’側末端に特定塩基配
列の３’末端と相補的な配列が位置するようにするため
のものである。

【００２１】試薬（Ｂ）はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ースであり、試薬（Ｃ）はその基質となるデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸である。試薬（Ａ）〜（Ｃ）の共
存下で、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’末端に相補
的な配列を５’末端に持つｃＤＮＡが合成される。この
ｃＤＮＡは、鋳型となったＲＮＡと、ＤＮＡ−ＲＮＡ２
本鎖を形成した状態である。

【００２２】試薬（Ｄ）は、上記ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖
中のＲＮＡを切断する活性を有するリボヌクレエースＨ
であるが、同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素を用いる
こともできる。トリ筋芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（以
下、ＡＭＶ逆転写酵素）に代表される逆転写酵素は、Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有して
おり、この種の酵素を用いることが例示できる。

【００２３】試薬（Ｅ）は、５’末端側から順に（１）
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、
（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特
定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第
２の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第２のオリゴヌ
クレオチドにおいて、（３）の部分は試薬（Ａ）〜
（Ｄ）が共存することで合成されるｃＤＮＡの３’末端
に結合する。従って試薬（Ｃ）と（Ｆ）の共存により、
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端から該ｃＤＮＡを
鋳型として、また同時に該ｃＤＮＡの３’末端から該第
２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、ＤＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメレースによりそれぞれの相補鎖が合成され、
転写可能なプロモーター配列を有する完全な２本鎖ＤＮ
Ａが合成される。

【００２４】試薬（Ｆ）はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ースである。ＡＭＶ逆転写酵素に代表される逆転写酵素
には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性を有するも
のがあり、この種の酵素を用いてもよい。

【００２５】試薬（Ｇ）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
レースであり、試薬（Ｈ）と（Ｉ）はその基質となるリ
ボヌクレオシド三リン酸及びＩＴＰである。試薬
（Ｃ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の共存により合成される２本
鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモ
ーター領域を末端に有する。このため、試薬（Ｇ）及び
（Ｈ）の共存下では該ＤＮＡ合成後、直ちに特定塩基配
列からなる１本鎖ＲＮＡの合成が開始される。ここで、
前述の通り、試薬（Ｉ）を共存させることにより該ＲＮ
Ａの合成量を飛躍的に増大することができる。試薬
（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースとして
は、具体的に例えばＴ７ＲＮＡポリメレースやＴ３
ＲＮＡポリメレース、ＳＰ６ＲＮＡポリメレース等を
例示することができる。

【００２６】試薬（Ｇ）〜（Ｉ）の共存により合成され
る１本鎖ＲＮＡは特定塩基配列からなるＲＮＡである
（一部ＩＴＰに置換されている）。従って、これらが合
成されて試薬（Ａ）〜（Ｆ）と共存することにより、上
述した一連の反応が繰り返し生じることとなる。このよ
うに、本発明では試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡ
をもとにして前記の如きプロモータ領域を末端にもつ２
本鎖ＤＮＡが合成され、これが特定塩基配列からなる１
本鎖ＲＮＡの合成源となる。合成された１本鎖ＲＮＡは
新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与し、結果として時間の
経過とともに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ量は飛
躍的に増大する。

【００２７】本発明の分析方法は、例えば前記のような
ＲＮＡの増幅工程において、試薬（Ｌ）を添加し、反応
液の蛍光強度を測定する工程を含む、標的ＲＮＡの分析
方法である。

【００２８】（Ｌ）前記特定塩基配列に相補的な配列を
有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な
蛍光信号を発するように標識された第３の一本鎖オリゴ
ヌクレオチド。

【００２９】この第３のオリゴヌクレオチドは、例えば
インターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡであ
れば良い。該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列の特異的分析
のため、６〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは１０
〜３０ヌクレオチドとすることが好ましい。むろん該Ｄ
ＮＡ部分は、特定塩基配列中に存在する配列であって、
標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列部分と相補
的な配列であることが重要である。また、ＤＮＡ部分は
合成された特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡと相補結
合を形成した場合に、既に添加されている試薬（Ｃ）に
おけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースが作用してその
３’末端からの伸長が生じないように、該３’末端が特
定塩基配列と非相補的な配列が付加されているか、また
は、その３’末端が化学的に修飾されていることが好ま
しい。

【００３０】インターカレーター性蛍光色素は、ＤＮＡ
部分が他の核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にイ
ンターカレーションして蛍光特性が変化するものであ
る。この目的のためには、インターカレーター性蛍光色
素を、２本鎖部分へのインターカレションを妨げない程
度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合するこ
とが例示できる。かかるリンカーとしては、インターカ
レーター性蛍光色素が２本鎖部分にインターカレーショ
ンすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特
に両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択さ
れるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行
う上で簡便で好ましい。また、例えば、市販の試薬セッ
ト（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ，商品名、Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ製）等を使用することもできる。

【００３１】インターカレーター性蛍光色素としては、
２本鎖にインターカレーションすることで、例えば発す
る蛍光波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化す
るものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観
点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する
性質を有するものが特に好ましい。より具体的には特に
蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、オキサゾ
ールイエロー又はそれらの誘導体を特に好ましいインタ
ーカレーター性蛍光色素として例示できる。

【００３２】インターカレーター性蛍光色素をリンカー
を介してＤＮＡに結合させる位置は、ＤＮＡの５’末
端、３’末端又は中央部等、インターカレーター性蛍光
色素の２本鎖へのインターカレーションが妨げられず、
かつ、ＤＮＡ部分とＲＮＡとの相補結合を阻害しない限
り特に制限はない。

【００３３】プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを
鋳型として試薬（Ｇ）〜（Ｉ）により合成される１本鎖
ＲＮＡ量は経時的に増加する。そこで、試薬（Ｌ）を、
上記標的ＲＮＡを含むと予想される試料に、少なくとも
試薬（Ａ）〜（Ｉ）とともに共存させ、増加する特定塩
基配列からなる１本鎖ＲＮＡを、蛍光信号として測定す
る。ここで、合成された1本鎖ＲＮＡと試薬（Ｌ）の第
３のオリゴヌクレオチドが相補結合を形成し、蛍光信号
を発した場合であっても、このＲＮＡは試薬（Ａ）〜
（Ｃ）共存下でのＤＮＡ合成における鋳型として機能す
ることが明らかとなった。即ち本発明では、各試薬の共
存状態においてＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、２本鎖ＤＮ
Ａの合成、２本鎖ＤＮＡからのＲＮＡ合成という一連の
現象が、第３のオリゴヌクレオチド共存下で生じ、ＲＮ
Ａの増加に比例して蛍光強度が増加する。

【００３４】本発明で、上記試薬（Ａ）及び（Ｅ）に代
えて試薬（Ｊ）及び（Ｋ）を用いるのであれば、前記試
薬（Ｌ）に代えて以下の（Ｍ）を用いることにより、特
定核酸を分析することが可能である。

【００３５】（Ｍ）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列に同一
な配列を有し、該配列と相補的配列を有する核酸と結合
した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識され
た第３の１本鎖オリゴヌクレオチド。

【００３６】試薬（Ｊ）は、５’側末端から順に（１）
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、
（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）前
記１本鎖ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相
補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドで
ある。該試薬の（３）の部分は特定塩基配列中の３’側
末端に相補結合し、試薬（Ａ）を用いた場合と同様に、
試薬（Ｂ）および（Ｃ）および（Ｄ）の存在下で、標的
ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。試薬（Ｋ）
は、該ｃＤＮＡの特定塩基配列中の５’側末端に相補的
配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬
（Ｋ）は、該ｃＤＮＡの特定塩基配列中の５’側末端に
相補的結合をした後、試薬（Ｃ）および試薬（Ｆ）の共
存により、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有
する２本鎖ＤＮＡが合成される。更に該２本鎖ＤＮＡ
は、試薬（Ｇ）〜（Ｈ）の共存により、特定塩基配列に
相補的な第２の１本鎖ＲＮＡが合成される。更に試薬
（Ｉ）を共存させることにより、該１本鎖ＲＮＡの合成
量は飛躍的に増大する。

【００３７】更に、該第２のＲＮＡの３’側末端は試薬
（Ｋ）と相補結合し、試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で、
該第２のＲＮＡの第２のｃＤＮＡが合成される。該第２
のｃＤＮＡは試薬（Ｊ）の（３）部分と相補結合し、試
薬（Ｃ）および試薬（Ｆ）によりプロモーター配列を含
有する２本鎖ＤＮＡが合成され、試薬（Ｇ）〜（Ｉ）に
より該第２のＲＮＡが合成される。合成された特定塩基
配列に相補的な該第２のＲＮＡは、新たな２本鎖ＤＮＡ
の合成源となり、一連の反応が繰り返し生じることによ
り、結果として該第２のＲＮＡの量は飛躍的に増大す
る。

【００３８】ここで得られた該第２のＲＮＡは、標的Ｒ
ＮＡ中の特定塩基配列と相補的な配列を有する。特定塩
基配列と同一な配列を有し、かつインターカレーター性
蛍光色素で標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチド
である試薬（Ｍ）を共存させることにより、合成された
該第２のＲＮＡ量に比例して蛍光強度が増加する。

【００３９】本願発明における蛍光信号の測定は、好ま
しくは試薬（Ａ）〜（Ｉ）および試薬（Ｌ）または試薬
（Ｍ）の添加直後から、又は、添加後所定時間経過後か
ら経時的に行う。試薬試薬（Ｌ）又は試薬（Ｍ）の第３
のＤＮＡは、１本鎖ＲＮＡの合成過程において、合成さ
れたＲＮＡと結合・解離を繰り返すが、結合時に測定さ
れる蛍光信号は各測定時における該ＲＮＡの存在量を反
映するため、１本鎖ＲＮＡの増加する様子を経時的に追
跡することが可能である。なお、測定自体は連続的なも
のであっても一定時間毎の間欠的なものであっても良
い。また、蛍光信号の測定装置は、本願発明の一部を構
成しないが、１本以上の反応管中の蛍光信号を連続的ま
たは一定時間毎の間欠的に測定できるものであれば如何
なる装置を用いても良い。

【００４０】蛍光信号の測定時間は、一定量の標的ＲＮ
Ａを含んだ試験区の蛍光強度が増加する時間が標的ＲＮ
Ａを含まない試験区と有為に差の見られる時間を含み、
一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度がほぼ一
定になるまでの時間で、概ね４時間、好適条件では１時
間である。

【００４１】

【発明の実施形態】以下、本発明を実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。

【００４２】実施例１標的核酸増幅におけるＩＴＰ添加（終濃度０．１ｍＭ〜
２．０ｍＭ）の効果を検討した。

【００４３】（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基
番号１１３〜２６７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓ
ｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２
８）を標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収に
より定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｕ
／μｌＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１０
⁶、１０⁴コピー／４μｌとなるよう希釈した。コントロ
ール試験区（Ｎｅｇａ）には、前記ＲＮＡ希釈液のみを
用いた。

【００４４】（２）以下の組成の反応液１５．２μｌを
市販の０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎ
ｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏ
ｎＴｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これ
に上記ＲＮＡ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル１０
０μｌを重層した。

【００４５】反応液の組成５９．２ｍＭＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐH８．１）１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム１２３．７ｍＭ酢酸カリウム１５．８％ソルビトール１９．７ｍＭＤＴＴ各１．０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ各２．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ各種濃度（０．２ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、３．
０ｍＭ、４．０ｍＭ）のＩＴＰ０．４μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号１）０．４μＭのＳＰ６プロモーター配列を有する第２のオ
リゴヌクレオチド（配列番号２；該配列中の５’端１番
目の「Ａ」から１７番目の「Ａ」までの部分はＳＰ６プ
ロモータ配列であり、また１８番目の「Ｇ」から２５番
目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である）０．０４９μＭのインターカレーター性蛍光色素（図
１）で標識された第３のオリゴヌクレオチド（配列番号
３；該配列中の５’端から５番目の「Ｃ」と６番目の
「Ｇ」の間にインターカレーター性蛍光色素が標識され
ており、またその３’末端はグリコール酸で修飾されて
いる、以後、ＹＯ−２７１と略する）６０ユニットリボヌクレエースインヒビター（宝酒
造（株）製）３．９％ＤＭＳＯ容量調製用蒸留水（３）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、以下の
組成の酵素液１０．８μｌを添加した。

【００４６】酵素液の組成８３．３ｍＭＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）１８．５ｍＭ酢酸マグネシウム１７４．１ｍＭ酢酸カリウム２２．２％ソルビトール４２ユニットＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）１７１ユニットＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒
造（株）製）３μｇ牛血清アルブミン容量調製用蒸留水（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波
長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ
内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。

【００４７】酵素液添加時の時刻を０分として、サンプ
ルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラン
ドの蛍光強度値）の経時変化を図２（ＲＮＡサンプル濃
度１０⁶コピー／テスト、ＩＴＰ終濃度０．１ｍＭ〜
１．０ｍＭ）、図３（ＲＮＡサンプル濃度１０⁴コピー
／テスト、ＩＴＰ終濃度１．０ｍＭ〜２．０ｍＭ）に示
した。

【００４８】これらのことから、ＲＮＡポリメレースと
してＳＰ６ＲＮＡポリメレースを用いた場合、終濃度
が０．５ｍＭ〜２ｍＭとなるＩＴＰを反応系内に添加す
ることによって特定核酸の増幅効率は飛躍的に向上する
ことが示された。また、陰性（Ｎｅｇａ）のときには蛍
光強度の増加が見られていないことから、蛍光強度の増
加は特定塩基配列の増加を反映していることが示され
た。

【００４９】実施例２標的核酸増幅におけるＩＴＰ添加（終濃度０．５ｍＭ〜
３．０ｍＭ）の効果を検討した。

【００５０】（１）前記ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを
標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定
量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１０⁶コ
ピー／２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試
験区（Ｎｅｇａ）には、希釈液のみを用いた。

【００５１】（２）以下の組成の反応液２１．０μｌを
市販の０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎ
ｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏ
ｎＴｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これ
に上記ＲＮＡ試料２．５μｌを添加後、ミネラルオイル
１００μｌを重層した。

【００５２】反応液の組成４７．６ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH８．５）１７．１ｍＭ塩化マグネシウム１８５．７ｍＭ塩化カリウム１．４ｍＭＤＴＴ各０．７ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ各５．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ０．７、１．４、２．１、２．９、３．６、３．９又は
４．３ｍＭのＩＴＰ１．１μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号４）１．１μＭのＴ７プロモータ配列を有する第２のオリゴ
ヌクレオチド（配列番号５；該配列中の５’端１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
タ配列であり、また２３番目の「Ｇ」から２８番目の
「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である）０．０４９μＭのインターカレーター性蛍光色素（図
１）で標識された第３のオリゴヌクレオチド（配列番号
６；該配列中の５’端１４番目の「Ａ」と１５番目の
「Ｃ」の間にインターカレーター性蛍光色素が標識され
ており、またその３’末端はグリコール酸で修飾されて
いる、以後ＹＯ−ＨＣ１ｂと略する）４０ユニットリボヌクレエースインヒビター（宝酒
造（株）製）２１．４％ＤＭＳＯ容量調製用蒸留水（３）上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、以下の
組成の酵素液６．５μｌを添加した。

【００５３】酵素液の組成３０．８ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH８．５）７．８％ソルビトール２９ユニットＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）１４２ユニットＴ７ＲＮＡポリメレース（東洋紡
（株）製）３μｇ牛血清アルブミン容量調製用蒸留水（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付蛍光分光光度計を用い、４１℃に保温して、励起波
長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ
内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。

【００５４】酵素液添加時の時刻を０分として、サンプ
ルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラン
ドの蛍光強度値）の経時変化を図４（ＲＮＡサンプル濃
度１０⁶コピー／テスト、ＩＴＰ終濃度０．５ｍＭ〜
３．０ｍＭ）に示した。

【００５５】これより、Ｔ７ＲＮＡポリメレースを用
いた場合、ＩＴＰを終濃度が０．５ｍＭとなるように添
加した場合より１．０ｍＭ〜２．７ｍＭとなるように添
加した場合の方が特定核酸の増幅効率は飛躍的に向上す
ることが示された。また、陰性（Ｎｅｇａ）の場合には
蛍光強度の増加が見られていないことから、特定塩基配
列のＲＮＡを検出していることが示された。

【００５６】実施例３インターカレーター性蛍光色素（図１）で標識された第
３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチ
ドによる特異産物の検出を検討した。

【００５７】（１）前記標準ＲＮＡ（ＨＣＶ−ＲＮＡ）
と合成ＲＮＡ（ＷＱ−ＲＮＡ、配列番号７）を、ＲＮＡ
希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い、１０⁵コピー／４μｌと
なるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）に
は、希釈液のみを用いた。

【００５８】（２）以下のＲＮＡサンプル、インターカ
レーター性蛍光色素（図１）で標識されたオリゴヌクレ
オチドの組み合わせになるように（３）で溶液を調整し
た。

【００５９】ＲＮＡサンプル蛍光色素標識オリゴヌクレオチドＨＣＶＲＮＡ第３オリゴヌクレオチド（ＹＯ−２７１）ＷＱ−ＲＮＡ第３オリゴヌクレオチド（ＹＯ−２７１）Ｎｅｇａ第３オリゴヌクレオチド（ＹＯ−２７１）ＷＱ−ＲＮＡ第４オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＷＴ）ＨＣＶＲＮＡ第４オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＷＴ）Ｎｅｇａ第４オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＷＴ）（３）以下の組成の反応液１５．２μｌを市販の０．５
ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；ＧｅｎｅＡｍｐ
Ｔｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これに上記ＲＮ
Ａ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル１００μｌを重
層した。

【００６０】反応液の組成５９．２ｍＭＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐH８．１）１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム１２３．７ｍＭ酢酸カリウム１５．８％ソルビトール１９．７ｍＭＤＴＴ各１．０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ各２．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ２．５ｍＭのＩＴＰ０．４μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号１）０．４μＭのＳＰ６プロモータ配列を有する第２のオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２）０．０４９μＭのインターカレーター性蛍光色素（図
１）で標識された第３のオリゴヌクレオチド（ＹＯ−２
７１）又はインターカレーター性蛍光色素（図１）で標
識された、ＹＯ−２７１とは異なる第４のオリゴヌクレ
オチド（配列番号８；該配列中の５’端１０番目の
「Ａ」と１１番目の「Ｇ」の間にインターカレーター性
蛍光色素が標識されており、その３’末端はグリコール
酸で修飾されている、以後ＹＯ−ＷＴと略する）６０ユニットリボヌクレエースインヒビター３．９％ＤＭＳＯ容量調製用蒸留水（４）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、以下の
組成の酵素液１０．８μｌを添加した。

【００６１】酵素液の組成８３．３ｍＭＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）１８．５ｍＭ酢酸マグネシウム１７４．１ｍＭ酢酸カリウム２２．２％ソルビトール４２ユニットＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）１７１ユニットＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒
造（株）製）３μｇ牛血清アルブミン容量調製用蒸留水（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波
長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ
内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。

【００６２】酵素液添加時の時刻を０分として、各サン
プルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラ
ンドの蛍光強度値）の経時変化を求めた結果を図５に、
増幅後のサンプルの４％アガロース電気泳動の結果を図
６に示した。図５より標的ＲＮＡと、その相補的な蛍光
色素で標識したオリゴヌクレオチド（ＨＣＶとＹＯ−２
７１、ＷＱとＹＯ−ＷＴ）を用いた時のみ、蛍光増加が
観測された。図６より、ＲＮＡ試料が存在していたサン
プル（レーン１、２、４、５）は特異的なバンドが検出
された。以上のことより、ＩＴＰ添加した際にも、得ら
れた蛍光強度は特異的産物の増幅のみを反映しているこ
とが示された。

【００６３】実施例４実施例２の反応条件を更に最適化した条件において、標
的核酸増幅における添加ＩＴＰ濃度（終濃度２．８ｍＭ
〜４．４ｍＭ）の最適値を検討した。

【００６４】（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基
番号１〜１４８７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃ
ｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２
８）を含む全長１５４９ｍｅｒのリコンビナントのＲＮ
Ａを標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収によ
り定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μ
ｌＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭＤ
ＴＴ）を用い１０⁵コピー／５μｌとなるよう希釈し
た。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には、前記ＲＮＡ
希釈液のみを用いた。

【００６５】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
市販の０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎ
ｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏ
ｎＴｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に分注し、これ
に上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。

【００６６】反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反
応系の最終濃度）６０．０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH８．６）１３．０ｍＭ塩化マグネシウム９０．０ｍＭ塩化カリウム１．０ｍＭＤＴＴ各０．２５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ各３．０ｍＭＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ２．８、３．２、３．６、４．０、４．４ｍＭのＩＴＰ１．０μＭ第１のオリゴヌクレオチド（配列番号１）１．０μＭ第２のオリゴヌクレオチド（配列番号９；
該配列中の５’端１番目の「Ａ」から２８番目の「Ａ」
までの部分はＴ７ポリメレースのプロモータ配列として
付加した配列である。）０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチド（配列番号１
０；標的ＲＮＡを特定配列の５'末端で切断するための
オリゴヌクレオチド、特定配列の５'末端に重複して隣
接する領域に対して相補的な配列を有し、標的ＲＮＡと
ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成した後、逆転写酵素のＲ
ＮａｓｅＨ活性によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮ
Ａを切断するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチドプライマーとして機能しないように３'末端はア
ミノ化処理されている）２５．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素（図１）
で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（ＹＯ−２７
１）（配列番号３；３’末端はグリコール酸で修飾され
ている）３９ユニットリボヌクレエースインヒビター（宝酒
造（株）製）１５．０％ＤＭＳＯ容量調製用蒸留水（３）上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、以下の
組成で、かつ、予め４１℃で２分間保温した酵素液４．
２μｌを添加した。

【００６７】酵素液の組成（反応時の最終濃度）１．７％ソルビトール８ユニットＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）１４２ユニットＴ７ＲＮＡポリメレース（ＧＩＢ
ＣＯ社製）３μｇ牛血清アルブミン容量調製用蒸留水（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機
能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃に保温して、励起
波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍
光強度を経時的に測定した。

【００６８】酵素添加時の時刻を０分として、サンプル
の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランド
の蛍光強度値）の経時変化を図７に示した。また、蛍光
強度比が１．２を超えた時間を立上り時間とし、立上り
時間とＩＴＰ濃度との関係を図８に示した。

【００６９】図７、図８より、立上り時間が最も早くな
るＩＴＰの最終濃度は３．２ｍＭから４．４ｍＭに最適
値があることが示された。このように、好適な条件で
は、ＩＴＰを添加することによって、１０⁵コピー／テ
ストのＲＮＡが１７分で検出され、高効率な増幅系の構
築ができたことが示された。陰性（Ｎｅｇａ）のときに
は蛍光強度の増加が見られていないことから、特定塩基
配列のＲＮＡを検出していることが示された。

【００７０】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡに
ついて、反応液を急激に昇温・降温するという操作を繰
り返すことなく、概ね一定温度で、反応開始時に行う１
段階の手動操作のみで、かつ、迅速に試料中に元来存在
した特定ＲＮＡ配列を増幅する方法において、ITPを添
加することによって増幅効率を飛躍的に向上させること
が可能となる。

【００７１】また、本発明では、試料中の標的ＲＮＡを
もとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモ
ーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これ
が多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成され
た１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレータ
ー性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖
ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工
程において、蛍光強度が増加する過程を解析することに
より、簡便かつ、迅速に初期ＲＮＡ量を決定する方法を
提供することができる。

【００７２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 増強された核酸増幅法 <130> PA211-0195 <160> 10 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第１のオリゴヌクレオチド <400> 1 gcctttcgcg acccaaca 18 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第２のオリゴヌクレオチド <400> 2 atttaggtga cactatagaa tacaacctcc cgggagagcc atagtggtct 50 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第３のオリゴヌクレオチド <400> 3 ctcgcggggg ctg 13 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第１のオリゴヌクレオチド <400> 4 cctcccggga gagccatagt ggtc 24 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第２のオリゴヌクレオチド <400> 5 aattctaata cgactcacta tagggagagc ctttcgcgac ccaacact 48 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第３のオリゴヌクレオチド <400> 6 gtgcccccgc gagactgcta 20 <210> 7 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトＣ型肝炎ウイルス合成ＲＮＡ（ＷＱ−ＲＮＡ） <400> 7 gaauacaacc ucccgggaga gccauagugg ucugcgacug ucaucuaucu acacugucca 60 cuggaugcac ucuaucccau ucaguguugg gucgcgaaag gc 102 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第４のオリゴヌクレオチド <400> 8 gaatgggata gagtgcatcc agtg 24 <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 第２のオリゴヌクレオチド <400> 9 aattctaata cgactcacta tagggagacc tcccgggaga gccatagtgg tct 53 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 切断用オリゴヌクレオチド <400> 10 ccgggagggg gggtcctgga ggctgcacaa cactcatact aacgccatgg ５０

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１〜４で用いたインターカレーター性蛍
光色素で標識されたオリゴヌクレオチドのインターカレ
ーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ_１〜Ｂ₃は
核酸塩基を示す。

【図２】実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０⁶コピー／
３０μｌにおいて、ＩＴＰの終濃度を０．１ｍＭ〜１．
０ｍＭとした際の反応時間と蛍光強度比のグラフであ
る。ＮｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用
いたサンプルのことである。

【図３】実施例１で行った初期ＲＮＡ量１０⁴コピー／
３０μｌにおいて、ＩＴＰの濃度を１．０〜２．０ｍＭ
とした際の反応時間と蛍光増加率のグラフである。Ｎｅ
ｇａはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた。

【図４】実施例２で行った初期ＲＮＡ量１０⁶コピー／
３０μｌにおいて、ＩＴＰの濃度を０．５ｍＭ〜３．０
ｍＭとした際の反応時間と蛍光増加率のグラフである。
ＮｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
サンプルのことである。

【図５】実施例３で行った、２種類のＲＮＡ試料（ＨＣ
ＶとＷＱ）のそれぞれに相補的な、蛍光性色素で標識し
たオリゴヌクレオチド（ＹＯ−２７１とＹＯ−ＷＴ）に
よる特異産物の検出の反応時間と蛍光強度比のグラフで
ある。初期ＲＮＡ量は１０⁵コピー／３０μｌで実施し
た。表中のＮｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液を
用いたサンプルのことを表している。特異的な組み合わ
せ（ＨＣＶとＹＯ−２７１、ＷＱとＹＯ−ＷＴ）のみ蛍
光増加が見られた。

【図６】実施例３で反応させた後のサンプルの４％アガ
ロースゲル電気泳動の結果を示す、階調反転写真であ
る。ＲＮＡ試料が存在していたサンプル（レーン１、
２、４、５）では特異的なバンドが検出された。レーン
７、８はＨＣＶ−ＲＮＡ（１５５ｂｐ）とＷＱ−ＲＮＡ
（１０２ｂｐ）の標品である。分子量マーカーにはφＸ
１７４／ＨａｅＩＩＩを使用した。

【図７】実施例４で行った初期ＲＮＡ量１０⁵コピー／
３０μｌにおいて、ＩＴＰの終濃度を２．８ｍＭ〜４．
４ｍＭとした際の反応時間と蛍光増加率のグラフであ
る。ＮｅｇａとはＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用
いたサンプルのことである。

【図８】実施例４で行った初期ＲＮＡ量１０⁵コピー／
３０μｌにおいて、ＩＴＰの終濃度を２．８ｍＭ〜４．
４ｍＭとした際の立上り時間（蛍光強度比：Ｎｅｇａと
はＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたサンプルの
ことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを
鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列
又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを
転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレース
によって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補
的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該Ｒ
ＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する
工程からなるＲＮＡ増幅工程において、ＲＮＡポリメレ
ースの基質としてアデノシン三リン酸、ウリジン三リン
酸、シチジン三リン酸、グアノシン三リン酸に加え、イ
ノシン三リン酸を添加する、前記標的ＲＮＡの増幅方
法。
【請求項２】前記増幅工程において、ＲＮＡポリメレー
スとしてファージＳＰ６のＲＮＡポリメレースを用い、
イノシン三リン酸を終濃度が０．５ｍＭ〜２ｍＭの範囲
となるように添加することを特徴とする、請求項１に記
載の増幅方法。
【請求項３】添加するイノシン三リン酸の終濃度と、そ
れ以外のリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン
酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノシ
ン三リン酸）の終濃度の比率が０．５対１．０〜１．５
対１．０の範囲であることを特徴とする請求項２に記載
の増幅方法。
【請求項４】前記増幅工程において、少なくとも、トリ
ス塩酸緩衝液（ｐH８．５〜８．９）の終濃度が２０ｍ
Ｍ〜５０ｍＭ、塩化マグネシウムの終濃度が１２ｍＭ〜
２０ｍＭ、リボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リ
ン酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノ
シン三リン酸）の終濃度が３．５ｍＭ〜５．０ｍＭ、Ｒ
ＮＡポリメレースとしてファージＴ７のＲＮＡポリメレ
ースを含み、イノシン三リン酸を終濃度が１．０ｍＭ〜
２．７ｍＭの範囲となるように添加することを特徴とす
る、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項５】添加するイノシン三リン酸の終濃度と、そ
れ以外のリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン
酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノシ
ン三リン酸）の終濃度の比率が０．３対１．０〜０．７
対１．０の範囲であることを特徴とする請求項４に記載
の増幅方法。
【請求項６】前記増幅工程において、少なくとも、トリ
ス塩酸緩衝液（ｐH８．５〜８．９）の終濃度が５０ｍ
Ｍ〜８０ｍＭ、塩化マグネシウムの終濃度が１２ｍＭ〜
２０ｍＭ、リボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リ
ン酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノ
シン三リン酸）の終濃度が２ｍＭ〜３．５ｍＭ、ＲＮＡ
ポリメレースとしてファージＴ７のＲＮＡポリメレース
を含み、イノシン三リン酸を終濃度が３．２ｍＭ〜４．
４ｍＭの範囲となるように添加することを特徴とする、
請求項１に記載の増幅方法。
【請求項７】添加するイノシン三リン酸の終濃度と、そ
れ以外のリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン
酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸及びグアノシ
ン三リン酸）の終濃度の比率が１．０対１．０〜１．０
対１．５の範囲であることを特徴とする請求項６に記載
の増幅方法。
【請求項８】前記ＲＮＡ増幅工程は、特定塩基配列に相
補的な配列を有するプライマー及び特定塩基配列に相同
的な配列を有するプライマー（ここで一方のプライマー
は、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を
有するプロモータープライマーである）を用い、標的Ｒ
ＮＡを鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
り１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースを用いることで、特定
塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮ
Ａを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ
を生成すること、そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリ
メレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転
写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース
による１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型となるものであることを
特徴とする、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項９】請求項１に記載の増幅工程をインターカレ
ーター性蛍光色素で標識されたプローブの存在下で実施
し、反応液の蛍光強度を経時的に測定することからな
る、標的核酸の分析方法。
【請求項１０】前記インターカレーター性蛍光色素で標
識されたプローブが、ＲＮＡ転写産物との相補結合によ
って、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性
が変化するものであることを特徴とする、請求項９に記
載の分析方法。