KR100984264B1

KR100984264B1 - 결핵균 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 및 방법

Info

Publication number: KR100984264B1
Application number: KR1020037004251A
Authority: KR
Inventors: 츠치야시게오; 마스다노리요시; 마루야마타카히로; 마츠바타카오; 이시구로타카히코
Original assignee: 토소가부시키가이샤
Priority date: 2001-07-25
Filing date: 2002-07-24
Publication date: 2010-09-30
Also published as: DE60236659D1; WO2003010309A1; EP1411117B1; TWI243855B; KR20040017796A; ATE470710T1; US7105319B2; CN1464906A; CN100351374C; EP1411117A4; EP1411117A1; US20040087782A1

Abstract

결핵균의 항원 단백질 pab를 코드하는 pab 유전자 또는 이들 유전자에서 유래하는 RNA를 특이적으로 절단하거나, 증폭하거나, 이들의 검출 및 동정을 고감도로 행하기 위해서 유용한 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것. 또, 결핵균의 pab 유전자에서 유래하는 RNA를 특이적으로 증폭하거나, 검출 및 동정을 고감도로 행하기 위해서 유효한 올리고뉴클레오티드의 조합, 또는 그것을 이용한 결핵균의 검출법을 제공한다.

Description

결핵균 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 및 방법{OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTING TUBERCLE BACILLUS AND METHOD THEREFOR}

본 발명은, 임상검사에 있어서의 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)검출용의 올리고뉴클레오티드 및 결핵균의 검출법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는, RNA나 DNA의 절단, 증폭 그리고 검출이라고 하는 조작을 행하는 유전자 진단용의 시약으로서, 또 RNA의 역전사(逆轉寫)나 번역을 저해하기 위한 시약으로서 유용하다. 특히, 본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드의 서열은, 결핵균의 정량이나 진단용의 시약 등으로 유용하다.

결핵은 현저히 감소해 왔음에도 불구하고, 최근 들어 고령자의 이환(罹患)율이 높아지며, 결핵감염을 경험하지 않은 약년층에서, 일단 감염되면 집단감염을 일으키는 등 심각한 문제가 되고 있다. 지금까지의 결핵균의 검사법으로서는, 도말검사나 배양검사가 기본이었다. 그러나, 결핵균의 발육은 느려서 결과를 얻는데에 4주간 이상을 필요로 하고 있다.

최근, 결핵균군을 검출하는 유전자 검출용 키트가 판매되고 있다. DNA 증폭을 행하는 것으로서는, PCR법으로 16SrRNA를 코드(code)하는 게놈DNA를 증폭해서, 특이 DNA 프로브(probe)를 하이브리다이즈(hybridize)해서 검출하는 것이나, 결핵균의 항원 단백질인 protein antigen b(이하 pab라 한다)를 코드하는 서열 기지(旣知)의 pab 유전자(Inf. and Immun. 57, 2841-2488, 1989년)를 ligase chain reaction(LCR법)으로 증폭하고, EIA에 의해 검출하는 것 등이 알려져 있다. (미국특허 제 5631130호). 이들 검출법은 자동화 또는 반자동화되어 있지만, 검사 소요시간이 4~6시간 정도로 긴급을 요하는 치료용으로서는 불충분하다. 또, DNA 증폭법으로는 생균, 사균의 구별이 되지 않아, 항생물질 등의 치료효과를 관찰기에는 부적절하다. RNA의 특정서열 증폭법으로서는, 역전사-폴리머라아제 체인 반응(RT-PCR)법이 알려져 있다. 이 방법은, 역전사 공정에서 표적 RNA의 cDNA를 합성하고, 계속해서 cDNA의 특정서열의 양끝부분에 상보(相補)적인 및 상동(相同)인 한쌍의 프라이머(안티센스 프라이머는 역전사 공정과 공용이어도 된다)와 열내성DNA 폴리머라아제의 존재하에, 열변성, 프라이머·아닐, 신장 반응으로 이루어지는 사이클을 반복해서 행함으로써 특정DNA 서열을 증폭하는 방법이다. 그러나, RT-PCR법은, 2단계의 조작(역전사 공법 및 PCR 공법), 및 급격한 승온·강온(降溫)을 반복하는 조작이 필요하며, 그것을 자동화에 대한 장해로 들 수 있다.

이상과 같이, 현재 이용되고 있는 검사법은 실제의 의료현장에서 필요로 하는 신속한 검출이나 치료효과의 확인을 위한 용도에 반드시 부응할 수 있는 것은 아니며, 생균만을 검출함과 동시에, 그러한 고감도, 신속한 검출법의 출현이 요망되고 있다. 또, 검사를 보 간편하게 하기 위해서는, 자동화된 검사장치의 개발이 요구되고 있다.

고감도의 검출법으로서는 표적 핵산을 증폭하는 방법의 이용이 가능하다. 특정 RNA 서열의 증폭법으로서는, 역전사 효소 및 RNA 폴리머라아제의 협주적 작용에 의해 특정 RNA 서열을 증폭하는 NASBA법이나 3SR법 등이 알려져 있다. 이 방법은, 표적 RNA를 주형(鑄型)으로 하고, 프로모터 서열을 포함하는 프라이머, 역전사 효소, 및 리보뉴클레아제H에 의해, 프로모터 서열을 포함하는 2개쇄DNA를 합성하고, 해당 2개쇄DNA를 주형으로서 RNA 폴리머라아제에 의해, 표적 RNA의 특정 염기서열을 포함하는 RNA를 합성하고, 이 RNA가 연속해서 프로모터 서열을 포함하는 2개쇄DNA 합성의 주형이 되는 연쇄반응을 행하는 것이다. 이와 같이 NASBA법이나 3SR법은 일정 온도에서의 핵산 증폭이 가능하며, 자동화에 적합한 방법이라고 생각된다.

그러나, 이들 증폭법은 비교적 저온(가령 41℃)에서 반응을 행하기 때문에, 표적 RNA가 분자구조를 형성하여, 프라이머의 결합을 저해해서, 반응효율을 저하시킬 가능성을 생각할 수 있다. 따라서, 증폭반응 전에 표적 RNA의 열변성을 행함으로써, 표적 RNA의 분자내 구조를 파괴하여, 프라이머의 결합효율을 향상시키기 위한 조작이 필요했다. 또한, 저온에서 RNA의 검출을 행할 경우에도, 상기와 같은 분자구조를 형성한 RNA에 대해서 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 필요했다.

그래서 본원 발명은, 결핵균의 항원 단백질 pab를 코드하는 pab 유전자 또는 이들 유전자에서 유래하는 RNA를 특이적으로 절단하거나, 증폭하거나, 이들 검출 및 동정(同定)을 고감도로 행하기 위해서 유용한 올리고뉴클레오티드의 제공을 제 1의 목적으로 한다. 또, RNA의 역전사나 번역을 저해하기 위한 약제로서 유용한 올리고뉴클레오티드의 서열을 제공한다. 또한, 본원 발명은 상기 pab유전자에서 유래하는 RNA를 비교적 저온(가령, 41℃)에서 특이적으로 증폭하거나, 이들의 검출 및 동정을 고감도로 행하기 위해서 유용한 올리고뉴클레오티드의 적절한 조합의 제공을 제 2의 목적으로 한다.

상기 제 1의 목적을 달성하기 위해 이루어진 제 1태양의 발명은, 결핵균의 유전자 요소인 pab 유전자(항원 단백질 pab를 코드한다) 또는 이 유전자에서 유래하는 RNA를 절단, 검출 또는 증폭하기 위해 유용한 올리고뉴클레오티드로, pab 유전자 또는 이 유전자에서 또는 해당 유전자에서 유래하는 RNA와 특이적으로 결합 가능하다. 서열번호 1부터 20에 나타낸 어느 하나의 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드와 상보적인 올리고뉴클레오티드이다.

상기 제 1의 목적을 달성하기 위한 제 2태양의 발명은, 상기 제 1태양의 발명에 관계되고, 상기 올리고뉴클레오티드가 DNA 신장반응을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 한다. 상기 제 1의 목적을 달성하기 위한 제 3태양의 발명은, 상기 제 1태양의 발명에 관계되고, 상기 올리고뉴클레오티드의 일부가 수식되며, 또는 검출 가능한 표식물질에 의해 표식된 올리고뉴클레오티드 프로브인 것을 특징으로 한다. 그리고 상기 제 1의 목적을 달성하기 위한 제 4태양의 발명 은, 상기 제 1태양의 발명에 관계되고, 상기 올리고뉴클레오티드의 염기의 일부가 올리고뉴클레오티드 프로브로서의 기능을 손상시키지 않는 범위에서 변환된 합성 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다.

상기 제 1의 목적을 달성하기 위해 이루어진 제 1태양의 발명은, 결핵균의 pab 유전자에서 유래하는 RNA의 특정서열을 주형으로서, 이 특정서열에 상동적인 서열을 갖는 제 1 프라이머 및 이 특정서열에 상보적인 서열을 갖는 제 2프라이머(여기서는 제 1 또는 제 2프라이머의 어느 한쪽의 프라이머는, 5'측에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 갖는다)를 사용해, RNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해 cDNA를 생성함으로써 RNA-DNA 2개쇄를 형성하고, 리보뉴클레아제H에 의해 RNA-DNA 2개쇄의 RNA를 분해하여 1개쇄DNA를 생성하고, 이 1개쇄DNA를 주형으로서 DNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해, 상기 특정서열 또는 상기 특정서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA를 전사 가능한 프로모터 서열을 갖는 2개쇄DNA를 생성하고, 그리고 이 2개쇄DNA가 폴리머라아제 존재하에서 RNA 전사산물을 생성하고, 이 RNA 전사산물이 연속해서 상기 RNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의한 cDNA합성의 주형이 되는 바와 같은 RNA 증폭 행정(行程)에 있어서, 제 1프라이머로서 열번호 28부터 33에 나타낸 어느 하나의 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는 제 1 프라이머와 , 서열번호 34부터 41에 나타낸 어느 하나의 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는, 증폭될 결핵균 pab 유전자의 RNA 서열의 일부를 상보적인 서열을 갖는 제 2프라이머(여기에서 제 1 또는 제 2프라이머의 어느 한 쪽은, 그 5'측에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 포함한다)를 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 제 2의 목적을 달성하기 위한 제 2태양의 발명은, 상기 제 1태양의 발명에 관계되고, 상기 RNA 증폭 행정에 있어서, 증폭에 의해 생기는 RNA 전사산물과 특이적으로 결합 가능하며, 또, 인터칼레이터(intercalater)성 형광색소로 표식된 올리고뉴클레오티드의 존재하에 실시하여, 반응액의 형광특성 변화를 측정함으로써 이루어진다(단, 이 표식된 올리고뉴클레오티드는, 상기 제 1 및 제 2 프라이머와는 다른 서열이다). 상기 제 2의 목적을 달성하기 위한 제 3태양의 발명은, 상기 제 2태양의 발명에 관계되고, 상기 올리고뉴클레오티드가, RNA 전사산물의 적어도 일부의 서열과 상보 결합하도록 설계되며, 복합체를 형성하고 있지 않은 경우와 비교해서 형광특성이 변화하는 것을 특징으로 한다. 그리고 상기 제 2의 목적을 달성하기 위한 제 4태양의 발명은, 상기 제 3태양의 발명에 관계되고, 상기 올리고뉴클레오티드가, 서열번호 42부터 44에 나타낸 어느 하나의 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는, 또는 그 상보 서열인 것을 특징으로 한다.

도 1은 MP-1R부터 MP-20R의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 41℃에서 결핵균 pab 유전자의 표준 RNA에 대한 결합 시험을 행한 후의 시료의 요소변성 6% 폴리아크릴 아미드 전기영동(電氣泳動) 사진이다(흑백 반전). 화살표로 나타낸 것이 특이 밴드의 위치이다. 레인 1부터 20이 각각 MP-1R부터 MP-20R을 이용해서 결합시험을 행했을 때의 결과이며, 레인N은 Nega(올리고뉴클레오티드 대신 희석액을 사용한 것)이다. 또 분자량 마커는 RNA Marker(0.1~1kb와 0.2~10kb)를 사용한 (레인 M1, M2).

도 2는 실시예 2에 있어서, 표 2의 조합(a)~(m)의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNA 증폭 반응시켰을 때의 전기영동 사진이다. 도면에서, P는 초기 RNA량 10³ 복사/시험을 RNA 시료로서 사용한 경우이며, N은 음성 제어(RNA 시료 대신 희석액만을 사용한 것)이다. 또 분자량 마커는 φX174/HaeⅠⅡdigest(Marker 4)를 사용했다(레인M).

도 3은 실시예 3에서 행한 초기 RNA량 10¹복사/시험에서 10⁵복사/시험에 있어서, 반응시간과 RNA의 생성과 함께 증대하는 형광 증가비의 그래프(A) 및 초기 RNA량의 대수값과 개시시간 사이에서 얻어진 검량선(B)이다. 초기 복사수 10²복사/시험의 RNA를 반응 약 15분에 검출할 수 있으며, 초기 RNA량과 개시시간 사이에 상관관계가 있는 것이 보여졌다.

상술한 바와 같이, 제 1의 목적으로서, 본원 발명은 결핵균의 항원 단백질 pab를 코드하는 pab 유전자 또는 이들 유전자에서 유래하는 RNA를 특이적으로 절단하거나, 증폭하거나, 이들 검출 및 동정을 고감도로 행하기 위해서 유용한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본원 발명에 관계되는 상기 올리고뉴클레오티드는, 상기한 RNA 증폭에 있어 서, 표적 RNA의 분자내 구조가 프리(free)한 영역에 대해서 특이적으로 상보적 결합을 형성하는 올리고뉴클레오티드이며, 상기와 같은 열변성을 행하는 일없이 표적 RNA와 특이적으로 결합하는 것이다. 이와 같이 본원 발명은, 비교적 저온이면서 일정온도(35℃부터 50℃, 바람직하게는 41℃)에서, 결핵균 RNA의 분자내 구조 프리영역에 대해 결합하는 올리고뉴클레오티드이며, 결핵균 RNA를 특이적으로 절단, 증폭, 또는 검출 등을 하기 위해서 유용한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 보다 구체적으로는, 본원 발명은 상기 표적 RNA를 특정 위치에서 절단하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브, PCR법에 의해 상기 표적 DNA를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, NASBA법 등에 의해 상기 표적 RNA를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, 그리고 이러한 증폭 없이, 또는 이러한 증폭 후에 표적 핵산을 검출 등을 하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브로서 이용함으로써, 신속하면서 고감도의 검출을 달성하기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

서열번호 1부터 20은 결핵균에 유래하는 RNA를 절단, 증폭 또는 검출하기 위해 유용한 본원 발명의 올리고뉴클레오티드의 일례를 나타내는 것이다. 여기서, 결핵균에 유래하는 RNA란, 이들 유전자를 주형으로서 제조되는 RNA도 포함한다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 서열번호 1부터 20으로 각각 기재된 모든 염기서열을 포함하는 것이어도 좋으나, 결핵균에 유래하는 RNA와의 특이적인 결합에는 10염기 정도면 충분한 것이므로, 각각 기재된 염기서열 중 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드이면 된다.

본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 가령 RNA 절단용의 프로브로서 사용할 수 있다. 표적 RNA를 특정 위치에서 절단하고자 할 경우, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 1개쇄의 표적 RNA와 하이브리다이즈시켜, RNA-DNA의 이중쇄 부분의 RNA만을 절단하는 효소를 작용시키면 된다. 해당 효소로서는, 통상 리보뉴클레아제H 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 효소를 사용하면 된다.

본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 가령 핵산 증폭용의 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 사용할 수 있다. 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 핵산 증폭법을 실시하면, 표적핵산 즉 결핵균의 핵산만을 증폭 가능하다. 증폭법으로서는 PCR법, LCR법, NASBA법, 3SR법 등을 예시할 수 있는데, 그중에서도 LCR법, NASBA법, 3SR법 등의 일정온도에서 실시할 수 있는 핵산 증폭법이 바람직하다. 이 증폭산물을 다양한 방법에 의해 검출 등을 함으로써, 결핵균의 검출이 가능해진다. 이 경우, 증폭에서 사용한 올리고뉴클레오티드 이외의 상기 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용해도 되고, 증폭된 특정 서열의 단편을 전기영동에 의해 확인해도 된다.

본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 가령 그 일부를 수식 또는 검출 가능한 표식물질에 의해 표식함으로써, 프로브로서 사용할 수 있다. 표적핵산을 검출하고자 할 경우, 검출 가능한 표식물질에 의해 표식된 본원 발명의 올리고뉴클레오티드를 1개쇄의 표적핵산과 하이브리다이즈시키고, 하이브리다이즈한 프로브에 대해서 상기 표식 등을 검출하면 된다. 표식의 검출 등은, 표식물질에 적합한 방법을 채용하면 되고, 가령, 올리고뉴클레오티드의 표식에 인터칼레이터성 형광색소를 사용한 경우에는, 표적핵산과 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 2개쇄 핵산에 인터칼레이 션함으로써, 형광강도가 증가하는 성질의 색소 등을 사용하면, 표적핵산과 하이브리다이즈하고 있지 않은 프로브를 제거하는 일없이, 하이브리다이즈한 프로브만을 검출하는 것을 용이하게 실시할 수 있다. 통상의 형광색소 등을 표식으로서 사용한 경우에는, 표적핵산과 하이브리다이즈하고 있지 않은 프로브를 제거한 후에 검출하면 된다. 또, 검출에 있어서는, 시료 중에 표적핵산을 PCR법, NASBA법, 3SR법이라고 하는 다양한 핵산 증폭법에 의해 검출 가능한 양까지 증폭시키는 것이 바람직하고, 그 중에서도 NASBA법, 3SR법 등의 일정온도 핵산 증폭법이 가장 바람직하다. 한편, 상기 올리고뉴클레오티드를 표식한 프로브를 증폭할 때에 반응액 중에 공존시킬 경우는, 프로브가 뉴클레오티드 프라이머로서 기능하지 않도록, 가령 3'말단에 글리콜산을 부가하는 등의 수식을 행하는 것이 특히 바람직하다.

제 2의 목적으로서, 상술한 바와 같이 본원 발명은 결핵균의 항원 단백질 pab 유전자에서 유래하는 RNA를 비교적 저온(가령 41℃)에서 특이적으로 증폭하거나, 이들 검출 및 동정을 고감도로 행하기 위해서 유용한 올리고뉴클레오티드의 적절한 조합의 제공, 또는 결핵균 pab 유전자의 검출법을 제공한다.

상기 제 2의 목적에 관계되는 본 발명은, 시료중의 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA를 증폭하기 위한 핵산 증폭행정이나, 핵산 증폭행정에 의해 생성된 RNA 전사산물의 검출법을 제공한다. 본 발명의 증폭행정은, PCR법, NASBA법, 3SR법을 포함하지만, 그중에서도 역전사 효소 및 RNA 폴리머라아제의 협주적 작용에 의해 (역전사 효소 및 RNA 폴리머라아제가 협주적으로 작용하는 등의 조건하에서 반응시켜) 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA 서열을 증폭하는 NASBA법, 3SR법 등의 일정온도 핵산 증폭법이 바람직하다.

가령 NASBA법은, 시료 중에 존재하는 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA의 특정서열을 주형으로서, RNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해 cDNA를 합성하고, 리보뉴클레아제H에 의해 RNA-DNA 2개쇄의 RNA를 분해해서 1개쇄DNA를 생성하고, 이 1개쇄DNA를 주형으로서 DNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해, 상기 특정서열 또는 상기 특정서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA를 전사 가능한 프로모터 서열을 갖는 2개쇄DNA를 생성하고, 그리고 이 2개쇄DNA가 RNA 폴리머라아제의 존재하에 RNA 전사산물을 생성하고, 이 RNA 전사산물이 연속해서 상기 RNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의한 cDNA 합성의 주형이 되도록 하는 RNA 증폭행정이지만, 본 발명은 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA에 상동적인 서열을 갖는 서열번호 28부터 33에 나타낸 어느 하나의 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는 제 1프라이머와, 서열번호 34부터 41에 나타낸 어느 하나의 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는, 증폭될 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA 서열의 일부와 상보적인 서열을 갖는 제 2프라이머(여기에서 제 1 또는 제 2프라이머의 어느 한 쪽은, 그 5'말단측에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 포함한다)를 사용하는 것을 특징으로 한다.

또, RNA 의존성 DNA 폴리머라아제, DNA 의존성 DNA 폴리머라아제, 리보뉴클레아제H는 특히 한정하지 않지만, 이들의 활성 모두를 갖고 있는 AMV 역전사 효소가 바람직하다. 또, RNA 폴리머라아제에 대해서도 특히 한정하는 것은 아니지만, T7 파지(phage)RNA 폴리머라아제, SP6 파지 RNA 폴리머라아제가 바람직하다.

상기 증폭행정에서는, 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA 서열 중에서 특정서열로 하는 영역5' 말 영역과 중복(1~10염기)해서 인접하는 영역에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드를 첨가하고, 상기 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA를 특정서열의 5'말 영역에서 절단(리보뉴클레아제H에 의한 )해서 핵산 증폭 초기의 주형으로 함으로써, 특정서열이 5'말단에 위치해 있지 않은 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA도 증폭할 할 수 있다. 이 절단을 위해서는, 가령, 서열번호 22부터 27의 올리고뉴클레오티드(단, 상기 증폭행정에 있어서 제 2프라이머로 사용한 것 이외의 올리고뉴클레오티드)를 사용할 수 있다. 또, 상기 절단용 올리고뉴클레오티드는, 3'말단으로부터 신장 반응을 억제하기 위해 3'말의 수산기가 화학적으로 수식(가령 아미노화)된 것임이 바람직하다.

이상의 핵산 증폭 방법으로 얻어진 증폭산물은 기지의 핵산검출 방법으로 검출할 수 있지만, 적합한 태양으로는 상기 핵산증폭을 인터칼레이터성 형광색소로 표식된 올리고뉴클레오티드의 존재하에 실시하여, 반응액의 형광특성의 변화를 측정하는 것이 바람직하다. 이 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드 중의 링커(linker)를 개재해서 인터칼레이터성 형광색소를 결합시킨 것으로, 표적핵산(상보적 핵산)과 2개쇄를 형성하면 인터칼레이터 부분이 2개쇄 부분에 인터칼레이트해서 형광특성이 변화하기 때문에, 분리 분석을 필요로 하지 않는 것을 특징으로 한다(Ishiguro, T.들 (1996) Nucleic Acids Res. 24(24) 4992-4997).

이 올리고뉴클레오티드의 서열은, 증폭산물이 적어도 일부에 대해서 상보적인 서열을 가지면 특히 한정되지 않지만, 서열번호 42부터 44에 나타낸 서열중의 적어도 연속된 10염기로 이루어지는 서열, 또는 그 상보 서열인 것이 바람직하다. 또, 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 신장 반응을 억제하기 위해서 이 올리고뉴클레오티드의 3'말의 수산기는 화학적으로 수식(가령 글리콜산 부가)하는 것이 바람직하다.

이것에 의해, 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA 중의 특정서열과 같은 서열로 이루어지는 RNA를 1튜브 내에서, 일정온도, 1단계로 증폭하고, 검출하는 것이 가능해져, 자동화로의 적용도 용이해진다.

이하, 본원 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

결핵균의 pab-RNA에 대해서 41℃에서 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선택했다. 또, pab-RNA는, pab의 염기서열을 포함하는 2개쇄DNA를 주형으로 한 인비트로(in vitro) 전사에 의해 합성, 정제된 RNA이다.

(1) 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 pab-RNA의 염기번호 111~1436(RNA의 염기번호는 Inf. and Immun. 57, 2481-2488, 1989년에 따름)을 포함하는 표준 RNA(서열번호 21)을 260nm의 자외부 흡수에 의해 정량후, RNA 희석액(10mM Tris-염산 완충액(pH8.0), 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5U/μL RNase inhibitor(다카라주조(寶酒造)(주)제)를 사용해 1.53pmol/μL이 되도록 희석했다.

(2) 이하의 조성의 반응액 14μL을 PCR용 튜브(용량 05/mL;Gene Amp Thin-Walled Reaction Tube, 퍼킨 엘마(Perkin-Elmer)제)에 나눠 담았다.

반응액의 조성(각 농도는 최종 반응액량 15μL에 있어서의 농도)

60mM Tris - 염산 완충액(pH 8.6)

17mM 염화 마그네슘

90mM 염화 칼륨

39U RNase inhibitor(다카라주조(寶酒造)(주)제)

1mM DTT

0.066μM 표준 RNA

용량 조정용 증류수

0.2μM 올리고뉴클레오티드(이하의 올리고뉴클레아티드 중, 어느 하나를 사용했다.)

MP-1R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 216부터 236에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호1)

MP-2R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 268부터 288에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호2)

MP-3R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 319부터 339에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호3)

MP-4R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 455부터 476에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호4)

MP-5R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 484부터 504에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호5)

MP-6R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 498부터 517에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호6)

MP-7R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 535부터 554에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호7)

MP-8R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 675부터 697에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호8)

MP-9R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 712부터 731에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호9)

MP-10R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 724부터 743에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호10)

MP-11R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 757부터 778에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호11)

MP-12R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 790부터 809에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호12)

MP-13R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 937부터 956에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호13)

MP-14R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 961부터 982에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호14)

MP-15R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 1011부터 1030에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호15)

MP-16R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 1071부터 1093에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호16)

MP-17R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 1103부터 1123에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호17)

MP-18R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 1166부터 1185에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호18)

MP-19R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 1256부터 1278에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호19)

MP-20R(결핵균 pab 유전자의 염기번호 1270부터 1290에 상보적인 올리고뉴클레오티드, 서열번호20)

(3) 상기의 반응액을 41℃에서 5분간 보온 후 8U/μL의 AMV 역전사 효소(다카라주조(寶酒造)(주)제, 본 효소는 DNA/RNA 2개쇄의 RNA를 절단하는 효소이다)를 포함하는 용액 1μL 첨가했다.

(4) 연속해서 PCR 튜브를 41℃에서 10분간 보온했다.

(5) 반응 후의 절단 단편을 확인하기 위해, 요소변성 폴리아크릴 아미드겔(아크릴 아미드 농도 6%, 요소 7M) 전기영동을 실시했다. 전기영동 후의 염색은 SYBR Green II(다카라주조(寶酒造)(주)제)에 의해 행한, 표적 RNA의 특정부위에 올리고뉴클레오티드가 결합하면, AMV 역전사 효소의 리보뉴클레아제H 활성에 의해, DNA/RNA 2개쇄의 RNA가 절단되어, 특정 밴드가 검출된다.

전기영동 결과를 (흑백 반전)을 도 1에 나타냈다. 올리고뉴클레오티드가 표준 RNA에 특이적으로 결합한 경우, 표준 RNA는 그 영역에서 분해되어, 특정의 쇄길이의 분해산물을 발생시킨다. 표 1에는 올리고뉴클레오티드가 표준 RNA에 특이적으로 결합한 경우의 위치라고 기대되는 밴드의 쇄길이를 나타냈다. MP-1R, MP-2R, MP-4R, MP-6R, MP-7R, ,MP-8R, MP-9R, MP-12R, MP-13R, MP-14R, MP-15R, MP-17R, MP-18R의 경우에서 특정의 밴드가 확인되었다. 이로써, 이들 올리고뉴클레오티드는 41℃ 일정한 상태로 결합균 pab 유전자 RNA에 강하게 결합되어 있는 것이 보여졌다. 또, 표 1에서의 염기번호는 결핵균 pab 유전자의 염기서열번호이다. 또 표에서의 ○는 특이 밴드만이 인정되는 것, ×는 특이 밴드가 보여지지만, 비(非)특이 밴드도 보여지는 것을 각각 나타낸다.

표 1

올리고뉴클레오티드명	염기위치	추정절단밴드 쇄길이(염기)	결과
MP-1R	216-236	111, 1200	○
MP-2R	268-288	163, 1148	○
MP-3R	319-339	214, 1097	×
MP-4R	455-476	350, 960	○
MP-5R	484-504	379, 932	×
MP-6R	498-517	393, 919	○
MP-7R	535-554	430, 882	○
MP-8R	675-697	570, 739	○
MP-9R	712-731	607, 705	○
MP-10R	724-743	619, 693	×
MP-11R	757-778	652, 658	×
MP-12R	790-809	685, 627	○
MP-13R	937-956	832, 343	○
MP-14R	961-982	856, 454	○
MP-15R	1011-1030	906, 406	○
MP-16R	1071-1093	966, 343	×
MP-17R	1103-1123	998, 313	○
MP-18R	1166-1185	1061, 251	○
MP-19R	1256-1278	1151, 158	×
MP-20R	1270-1290	1165, 146	×

이상의 설명과 같이, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, RNA가 분자내 구조 를 형성해, 프라이머나 프로브의 결합을 저해할지도 모르는, 비교적 저온이면서 일정온도(35℃에서 50℃, 바람직하게는 41℃)의 조건하에서도, 결핵균의 유전자 요소인 pab 유전자에서 유래하는 RNA와 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 따라서, 표적 RNA를 열변성하는 일없이, 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 결합시키는 것이 가능하게 된다. 이와 같이 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 결해균 pab 유전자에서 유래하는 RNA를 절단, 증폭 또는 검출하기 위해, 즉 RNA의 증폭에서 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머나 올리고뉴클레오티드 프로브로서 유용하다.

이상 이외에도, 본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 결핵균 pab 유전자를 증폭, 또는 검출하기 위해서도 유용하다. 또한, 2개쇄DNA를 PCR법 등으로 증폭하거나, RNA를 전사해서 얻어지는 cDNA를 검출하기 위해서는, 상기한 구체적인 올리고뉴클레오티드와 상보적인 올리고뉴클레오티드도 유용하다.

본원 발명의 올리고뉴클레오티드는, 서열표에 기재한 염기서열(20염기부터 23염기)의 것으로 한정되지 않고, 이들 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상부터의 올리고뉴클레오티드이면 된다. 이들은 비교적 저온(바람직하게는 41℃)의 조건하에서, 프라이머 또는 프로브의 표적 핵산으로의 특이성을 확보하기 위해서는 10염기 정도의 염기서열이면 충분하다는 점으로부터 명백하다.

실시예 2

결핵균 pab 유전자 유래의 RNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 사용해서 RNA 증폭반응을 행했다.

(1) 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 pab-RNA의 염기번호 111~1436을 포함하는 표준 RNA(1326mer)(서열번호 21)를 RNA 희석액(10mM Tris-IICI(pH8.0), 1mM EDTA, 0.5U/μL RNase Inhibitor(다카라주조(寶酒造)제, 5mM DTT)를 사용하고, 10³복사/5μL가 되도록 희석했다. 제어 시험구(음성)에는 희석액만을 사용했다.

(2) 이하의 조성의 반응액 20μL을 0.5mL용 PCR 튜브(Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨 엘마(Perkin-Elmer제)에 나눠 담고, 이것에 상기 RNA 시료 5μL를 첨가했다.

반응액의 조성(각 농도는 최종 반응액량 30μL에 있어서의 농도)

60mM Tris - 염산 완충액(pH 8.6)

17mM 염화 마그네슘

90mM 염화 칼륨

39U RNase Inhibitor(다카라주조(寶酒造)(주)제)

1mM DTT

각 0.25mM의 dATP, dCTP, d GTP, d TTP

3.6mM ITP

각 3.0mM의 ATP, CTP, GTP, UTP

0.16μM의 제 1올리고뉴클레오티드

1.0μM의 제 2올리고뉴클레오티드

1.0μM의 제 3올리고뉴클레오티드

13% DMSO

용량 조정용 증류수

(3) 제 1, 제 2, 제 3 올리고뉴클레오티드로서, 표 2의 설명에 나타낸 서열의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNA 증폭반응을 행했다. 또, 제 1, 제 2, 제 3올리고뉴클레오티드의 조합이 표 2에 나타낸 조합이 되도록 용액을 제조했다.

(4) 상기의 반응액을 41℃에서 5분간 보온 후, 이하의 조성의 효소액 5μL을 첨가했다.

효소액의 조성(각 수치는 최종 반응액량 30μL에 있어서의 값)

1.7% 솔비톨

3μg 생혈청 알부민

142 U T 7RNA 폴리머라아제(기부코제)

8U AMV 역전사 효소(다카라주조제)

용량 조정용 증류수

(5) 연속해서 PCR 튜브를 41℃에서 30분간 보온했다.

(6) 반응 후의 RNA 증폭부분을 확인하기 위해, 아가로스겔(아가로스겔 농도 4%) 전기영동을 실시했다. 전기영동 후의 염색은 SYBR Green II(다카라주조제)에 의해 행했다. 표적 RNA의 특정부분에 올리고뉴클레오티드 프로브가 결합하면 제 2올리고뉴클레오티드와 제 3올리고뉴클레오티드에 삽입된 부분의 RNA가 증폭되어, 특정 밴드가 관찰된다.

전기영동 결과의 사진을 도 2에 나타냈다. 이 반응에서 증폭되는 특정 밴드 의 쇄길이는 표 2에 나타낸 바와 같으며, 이것에 의해 표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용한 RNA 증폭 반응에 있어서, 조합(c), (h), (m)으로 밴드를 확인할 수 있기 때문에, 이들 조합에서 사용한 올리고뉴클레오티드는 결핵균의 검출에 유효하다는 것이 보여졌다.

표 2

조합	제1올리고뉴클레오티드	제2올리고뉴클레오티드	제3올리고뉴클레오티드	증폭 산물 길이(염기수)
(a)	MP-4S	MP-4F	MP-9R	270
(b)	MP-4S	MP-4F	MP-12R	348
(c)	MP-13S	MP-13F	MP-17R	182
(d)	MP-1S	MP-1F	MP-3R	118
(e)	MP-4S	MP-4F	MP-10R	282
(f)	MP-4S	MP-4F	MP-11R	317
(g)	MP-6S	MP-6F	MP-10R	241
(h)	MP-6S	MP-6F	MP-11R	276
(i)	MP-9S	MP-9F	MP-16R	377
(j)	MP-12S	MP-12F	MP-16R	299
(k)	MP-13S	MP-13F	MP-16R	152
(l)	MP-13S	MP-13F	MP-20R	349
(m)	MP-6S	MP-6F	MP-9R	229

표 2는 본 실험계에서 사용한 제 1, 제 2, 제 3올리고뉴클레오티드의 조합, 및 그 조합을 사용해서 RNA 증폭 반응시켰을 때에 증폭되는 특정 밴드의 쇄길이를 나타낸다. 제 1올리고뉴클레오티드의 염기서열 중, 3' 미만의 수산기는 아미노화되어 있다. 제 2올리고뉴클레오티드의 염기 서열 중, 5'미만의 제 1번째의 「A」부터 28번째의 「A」까지의 영역은 T7폴리메레아제의 프로모터 서열을 부가했다. 또 염기 번호는 결핵균 pab 유전자의 염기 서열번호이다.

제 1올리고뉴클레오티드

MP-1S(서열번호 22, 염기 번호 213부터 236)

MP-4S(서열번호 23 염기 번호 453부터 476)

MP-6S(서열번호 24, 염기 번호 494부터 517)

MP-9S(서열번호 25, 염기 번호 708부터 731)

MP-12S(서열번호 26, 염기 번호 786부터 809)

MP-13S(서열번호 28, 염기 번호 933부터 956)

제 2올리고뉴클레오티드

MP-1F(서열번호 27, 염기 번호 228부터 250)

MP-4F(서열번호 29, 염기 번호 468부터 490)

MP-6F(서열번호 30, 염기 번호 509부터 531

MP-9F(서열번호 31, 염기 번호 723부터 745)

MP-12F(서열번호 32, 염기 번호 800부터 823)

MP-13F(서열번호 33, 염기 번호 948부터 970)

제 3올리고뉴클레오티드

MP-3R(서열번호 34, 염기 번호 319부터 339)

MP-9R(서열번호 35, 염기 번호 712부터 731)

MP-10R(서열번호 36, 염기 번호 724부터 743)

MP-11R(서열번호 37, 염기 번호 757부터 778)

MP-12R(서열번호 38, 염기 번호 790부터 809)

MP-16R(서열번호 39, 염기 번호 1071부터 1093)

MP-17R(서열번호 40, 염기 번호 1103부터 1123)

MP-20R(서열번호 41, 염기 번호 1270부터 1290)

실시예 3

본원 발명에 의한 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용하고, 결핵균 pab 유전자에서 유래하는 RNA의 다양한 초기 복사수에 있어서의 검출을 행했다.

실시예 2와 동일한 결핵균의 pab 유전자에서 유래하는 pab-RNA의 표준 RNA를 RNA희석액(10mT Tris-HCL(pH8.0), 1mM EDTA, 0.5U/μL RNase Inhibitor(다카라 주조제), 5mM DTT)을 사용해서, 10¹복사/5μL부터 10⁵복사/5μL까지 되도록 희석했다. 제어 시험구(음성)에는 희석액만을 사용했다.

이하의 조성 반응액 20μL을 PCR용 튜브(용량 0.5ml;Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, 퍼킨엘머제)에 나눠 담고, 이것에 상기 RNA 시료 5μL을 첨가했다.

60mM Tris - 염산 완충액(pH 8.6)

17mM 염화마그네슘

150mM 염화칼륨

39U RNase Inhibitor

1mM DTT

각 0.25mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP

3.6mM ITP

각 3.0mM의 ATP, CTP,GTP, UTP

0.16μM의 제 1올리고뉴클레오티드(MP-13S, 서열번호 6, 3'미만의 수산기는 아미노화되어 있다.)

1.0μM의 제 2올리고뉴클레오티드(MP-13F, 서열번호33)

1.0μM의 제 3올리고뉴클레오티드(MP-17R, 서열번호40)

25nM의 인터칼레이터성 형광색소로 표식된 올리고뉴클레오티드(YO-Pab1076-S-G, 서열번호 42, 5'미만부터 10번째의 「A」와 11번째의 「T」사이의 인에서 인터칼레이터성 형광색소가 표식되어 있다. 또 3'미만의 수산기는 글리콜기로 수식되어 있다.)

13% DMSO

용량 조정용 증류수

(3) 상기의 반응액을 41℃에서 5분간 보온 후, 이하의 조성으로, 또, 미리 41℃에서 2분간 보온한 효소액 5μL를 첨가했다.

효소액의 조성(각 농도는 최종 반응액량 30μL에 있어서의 농도)

0.7% 솔비톨

3μg 소혈청 알부민

142U T 7RNA 폴리머라아제(기부코제)

8U AMV 역전사 효소(다카라 주조제)

용량 조정용 증류수

(4) 연속해서 PCR 튜브를 직접 측정가능한 온도 조절기 부착 형광분광 광도계를 사용해, 41℃에서 보온하고, 여기파장 470nm, 형광파장 510nm로, 반응용액을 경 시적(經時的)으로 측정했다.

효소 첨가시의 시각을 0분으로 하고, 시료의 형광 증가비(소정 시각의 형광 강도값÷배경의 형광 강도값)의 경시 변화를 도 3(A)에 나타냈다. 또, 초기 RNA량의 수치값과 개시 시간(형광 증가비가 음성인 평균값에 표준 편차의 3배를 더한 값:1.2가 되기까지의 시간)의 관계의 결과를 도 3(B)에 나타냈다. 또, 초기 RNA량은 10¹복사/시험부터 10⁵복사/시험이다.

도 3(A)로부터, 10²복사가 약 15분 검출되었다. 표적 RNA의 초기 농도에 의존한 형광 프로파일과 검량선이 얻어지고, 미지 시료 중에 존재하는 결핵균 pab 유전자 유래의 RNA의 정량이 가능한 것이 보여졌다. 이상으로, 본 방법에 의해, 결핵균의 신속·고감도의 검출이 가능한 것이 보여졌다.

이상의 설명과 같이, 본 발명에 의하면, 시료 중의 RNA가 분자내 구조를 형성해, 프라이머나 프로브의 결합을 저해할지도 모르는, 비교적 저온이면서 일정온도(35℃에서부터 50℃, 바람직하게는 41℃)의 조건하에서도, 결핵균 pab 유전자 유래의 RNA에 특이적으로 결합해, 표적 RNA를 신속하게 증폭하고, 또 검출 등을 하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머나 올리고뉴클레오티드 프로브의 조합으로서 유용하다.

본원 발명의 조합에 있어서의 올리고뉴클레오티드의 염기 길이는, 구체적으로 기재한 길이로 한정되지 않고, 이들 서열 중의 적어도 연속된 10염기 이상으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이것은, 비교적 저온(바람직하게는 41℃)의 조건하에서, 프라이머 또는 프로브의 표준적 핵산으로의 특이성을 확보하기 위해서는 10염기 정도의 염기 서열이면 충분하다는 점으로부터 명백하다.

SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> Oligonucleotides and Process for Detecting Mycobacterium tuberculosis <130> TYS-K851 <160> 43 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-1R <400> 1 gtggtttcga gccacagccc g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-2R <400> 2 ggggtagtcg cgacagtacc g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-3R <400> 3 gggtagagca gcgtgctacc g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-4R <400> 4 gataggcgtc ggaggcccca at 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-5R <400> 5 ttgtgcgcgg ccatatcacc t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-6R <400> 6 gttcatcagc cccttgtgcg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-7R <400> 7 tgtagttgac ctgctgagcg 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-8R <400> 8 cggaactacc gcggtgccgg gca 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-9R <400> 9 agaaggtgtc accggacccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-10R <400> 10 actgggtgaa caagaaggtg 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-11R <400> 11 cttgccccag ccctcgggat ct 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-12R <400> 12 ggaagtcgac ggtggtgccg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-13R <400> 13 tattgcctag ttgggcctcg 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-14R <400> 14 gtcgggcaac aagaaattgc ca 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-15R <400> 15 cggggttttc gatgcgaagc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-16R <400> 16 gtagttgatg atcgggtagc cgt 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-17R <400> 17 cttttgccgg ttgttgacga t 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-18R <400> 18 ttgttgccgt cggtgatcgc 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-19R <400> 19 ggctagctgg aaatcgtcgc gat 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MP-20R <400> 20 ggtggtcaac gaggctagct g 21 <210> 21 <211> 1326 <212> RNA <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <223> Standard RNA for Mycobacterium tuberculosis pab gene <400> 21 gacgccaagc gcggaaauug aagagcacag aaagguaugg cgugaaaauu cguuugcaua 60 cgcuguuggc cguguugacc gcugcgccgc ugcugcuagc agcggcgggc uguggcucga 120 aaccaccgag cgguucgccu gaaacgggcg ccggcgccgg uacugucgcg acuacccccg 180 cgucgucgcc ggugacguug gcggagaccg guagcacgcu gcucuacccg cuguucaacc 240 uguggggucc ggccuuucac gagagguauc cgaacgucac gaucaccgcu cagggcaccg 300 guucuggugc cgggaucgcg caggccgccg ccgggacggu caacauuggg gccuccgacg 360 ccuaucuguc ggaaggugau auggccgcgc acaaggggcu gaugaacauc gcgcuagcca 420 ucuccgcuca gcaggucaac uacaaccugc ccggagugag cgagcaccuc aagcugaacg 480 gaaaaguccu ggcggccaug uaccagggca ccaucaaaac cugggacgac ccgcagaucg 540 cugcgcucaa ccccggcgug aaccugcccg gcaccgcggu aguuccgcug caccgcuccg 600 acggguccgg ugacaccuuc uuguucaccc aguaccuguc caagcaagau cccgagggcu 660 ggggcaaguc gcccggcuuc ggcaccaccg ucgacuuccc ggcggugccg ggugcgcugg 720 gugagaacgg caacggcggc auggugaccg guugcgccga gacaccgggc ugcguggccu 780 auaucggcau cagcuuccuc gaccaggcca gucaacgggg acucggcgag gcccaacuag 840 gcaauagcuc uggcaauuuc uuguugcccg acgcgcaaag cauucaggcc gcggcggcug 900 gcuucgcauc gaaaaccccg gcgaaccagg cgauuucgau gaucgacggg cccgccccgg 960 acggcuaccc gaucaucaac uacgaguacg ccaucgucaa caaccggcaa aaggacgccg 1020 ccaccgcgca gaccuugcag gcauuucugc acugggcgau caccgacggc aacaaggccu 1080 cguuccucga ccagguucau uuccagccgc ugccgcccgc gguggugaag uugucugacg 1140 cguugaucgc gacgauuucc agcuagccuc guugaccacc acgcgacagc aaccuccguc 1200 gggccaucgg gcugcuuugc ggagcaugcu ggcccgugcc ggugaagucg gccgcgcugg 1260 cccggccauc cggugguugg gugggauagg ugcggugauc ccgcugcuug cgcuggucuu 1320 ggugcu 1326 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-1S <400> 22 gtggtttcga gccacagccc gccg 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-4S <400> 23 gataggcgtc ggaggcccca atgt 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-6S <400> 24 gttcatcagc cccttgtgcg cggc 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-9S <400> 25 agaaggtgtc accggacccg tcgg 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-12S <400> 26 ggaagtcgac ggtggtgccg aagc 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-13S <400> 27 tattgcctag ttgggcctcg ccga 24 <210> 28 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-1F <400> 28 aattctaata cgactcacta tagggagacg aaaccaccga gcggttcgcc t 51 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-4F <400> 29 aattctaata cgactcacta tagggagaac gcctatctgt cggaaggtga t 51 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-6F <400> 30 aattctaata cgactcacta tagggagact gatgaacatc gcgctagcca t 51 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-9F <400> 31 aattctaata cgactcacta tagggagaac accttcttgt tcacccagta c 51 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-12F <400> 32 aattctaata cgactcacta tagggagatc gacttcccgg cggtgccggg t 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-13F <400> 33 aattctaata cgactcacta tagggagata ggcaatagct ctggcaattt c 51 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-3R <400> 34 gggtagagca gcgtgctacc g 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-9R <400> 35 agaaggtgtc accggacccg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-10R <400> 36 actgggtgaa caagaaggtg 20 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> MP-11R <400> 37 cttgccccag ccctcgggat ct 22 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> 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시료 중에 존재하는 결핵균의 유전자 요소인 pab 유전자에서 유래하는 RNA의 특정 서열을 주형으로 하여, 이 특정 서열에 상동적인 서열을 갖는 제 1프라이머 및 이 특정 서열에 상보적인 서열을 갖는 제 2프라이머(여기서 제 1 또는 제 2프라이머의 어느 한 쪽의 프라이머는 5'측에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 부가한 서열을 갖는다)를 사용하여, RNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해 cDNA를 합성하고, 리보뉴클레아제 H에 의해 RNA-DNA 2개쇄의 RNA를 분해하여 1개쇄 DNA를 생성하고, 이 1개쇄 DNA를 주형으로 하여 DNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의해, 상기 특정 서열 또는 상기 특정 서열에 상보적인 서열로 이루어지는 RNA를 전사 가능한 프로모터 서열을 갖는 2개쇄 DNA를 생성하고, 그리고 이 2개쇄 DNA가 RNA 폴리머라아제의 존재하에 RNA 전사산물을 생성하고, 이 RNA 전사산물이 연속해서 상기 RNA 의존성 DNA 폴리머라아제에 의한 cDNA 합성의 주형이 되도록 하는 RNA 증폭 공정을 이용한 검출법에 있어서, 증폭된 결핵균의 pab 유전자의 RNA 서열의 일부와 상동적인 서열을 갖는 제1 프라이머와, 결핵균 pab 유전자의 RNA 서열의 일부와 상보적인 서열을 갖는 제2 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 결핵균의 pab 유전자의 증폭방법으로서, 상기 제1 프라이머가 서열목록의 서열번호 46으로 표시되는 서열 로 이루어지고, 상기 제2 프라이머가 서열목록의 서열번호 40으로 표시되는 서열 로 이루어진 것을 특징으로 하는 결핵균의 pab 유전자의 증폭방법.
제 5항에 있어서, 상기 RNA 증폭 방법에 있어서, 증폭에 의해 생기는 RNA 전사산물과 특이적으로 결합 가능하며, 또 인터칼레이터성 형광색소로 표식된 올리고뉴클레오티드 (이 표식된 올리고뉴클레오티드는, 상기 제 1 및 제 2프라이머와는 다른 서열이다)의 존재하에 실시하고, 반응액의 형광특성의 변화를 측정하는 것으로 이루어지는 증폭방법.
제 6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가, RNA 전사산물의 적어도 일부의 서열과 상보 결합하도록 설계되어, 복합체를 형성하고 있지 않은 경우와 비교해서 형광특성이 변화하는 것임을 특징으로 하는 증폭방법.
제 7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가, 서열목록의 서열번호 42로 표시되는 서열 또는 그 상보 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 증폭방법.